JP6926731B2 - 検出チップ、検出キット、検出システムおよび被検出物質の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出チップ、検出キット、検出システムおよび被検出物質の検出方法に関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を検出し、その量を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。

被検出物質の検出またはその量の測定を高感度に行う方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」という）が知られている。ＳＰＦＳは、所定の条件で光を金属膜などに照射すると生じる、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」という）を利用して物質を検出し、その量を測定する（以下、単に「検出する」というときは、その量の測定をも意味する）。

図９は、ＳＰＦＳによる従来の物質測定の概要を示す模式図である。ＳＰＦＳによる従来の物質測定では、液体収容部３１２と基板であるプリズム３１６とを有し、プリズム３１６の表面に金属膜３１８を形成し、さらに金属膜３１８上に被検出物質３７２に特異的に結合できる第１の捕捉体（例えば１次抗体）３７４を固定化した、検出チップを用いる。プリズム３１６よりも金属膜３１８側の液体収容部３１２である検出場に被検出物質３７２を含む試料液を提供する（図９Ａ）と、被検出物質３７２は検出場において第１の捕捉体３７４に捕捉される。その後、蛍光物質３７６で標識された第２の捕捉体（例えば２次抗体）３７８を検出場に提供する（図９Ｂ）と、検出場に結合した被検出物質３７２は蛍光物質３７６で標識される。この状態で金属膜３１８にプリズム３１６側（検出場とは反対側）から励起光αを照射する（図９Ｃ）と、被検出物質３７２を標識する蛍光物質３７６は、ＳＰＲにより増強された電場３９０により励起され、蛍光を放出する。この蛍光を検出することで、被検出物質３７２を検出し、その量を測定することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度での被検出物質の検出および測定を可能とする。

特許文献１には、上記ＳＰＦＳによる物質測定において、金属膜３１８の検出場側にナノサイズの凹凸構造を設けた局在型表面プラズモン共鳴センサ用チップが記載されている。特許文献１によれば、局在型表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon Resonance：以下「ＬＳＰＲ」と略記する）による電場増強領域は基板表面から数十ｎｍであり、上記凹凸構造を設けない伝播型表面プラズモン共鳴による電場増強領域（基板表面から２００ｎｍ程度）よりも狭くできるため、浮遊する物質によるノイズの低減が可能であるとされている。

特開２０１５−０３８５１５号公報

特許文献１にも記載のように、従来のＳＰＲによる電場増強領域は基板（金属膜）の表面から２００ｎｍ程度であるため、蛍光物質も基板の表面から２００ｎｍ以下に位置するように、蛍光物質の粒子径および１次抗体のサイズなどを設計する必要があり、使用される蛍光物質および１次抗体の種類などが制限されていた。これに対し、電場増強領域を広げれば、より多種多様な蛍光物質および１次抗体が使用可能となり、ＳＰＦＳによる検出および測定可能な物質がより多くなったり、ＳＰＦＳによる検出および測定がより容易になったりすると期待される。また、細胞の大きさは通常数十μｍ程度であるため、細胞の表面に付着したタンパク質などの検出および測定には、ＳＰＦＳを用いることはできなかった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、電場増強領域をより広げて、基板の表面からより離れた領域までＳＰＦＳで検出および測定可能な検出チップおよび検出キット、当該検出チップを用いて被検出物質を検出可能な検出システム、ならびに当該検出チップを用いた被検出物質の検出方法を提供することを、その目的とする。

上記課題を解決するための本発明の一態様は、液体収容部と、対向する２つの面の一方の面が上記液体収容部の内部に面して配置され、かつ、光照射により局在型表面プラズモン共鳴を生じるＬＳＰＲ構造体を上記２つの面の他方の面、または前記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に有する光透過性の基板と、を有する検出チップに関する。

上記課題を解決するための本発明のさらに別の態様は、凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体の上記凸条または凸部の高さの平均が互いに異なる複数の上記検出チップ、またはナノサイズの粒子であるＬＳＰＲ構造体の上記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）が互いに異なる複数の上記検出チップ、を含む検出キットに関する。

上記課題を解決するための本発明のさらに別の態様は、上記検出チップと、上記ＬＳＰＲ構造体に局在型表面プラズモン共鳴を生じさせる励起光を上記液体収容部側から上記基板を通して上記ＬＳＰＲ構造体に照射する光源と、上記励起光の照射により蛍光物質により被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出部と、を有する検出システムに関する。

上記課題を解決するための本発明のさらに別の態様は、蛍光物質により標識された被検出物質を上記液体収容部内に収容した上記検出チップを用いて、局在型表面プラズモン共鳴を生じさせる励起光を上記液体収容部側から上記基板を通して上記ＬＳＰＲ構造体に照射する工程と、上記励起光の照射により上記蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む、被検出物質の検出方法に関する。

本発明によれば、電場増強領域をより広げて、基板の表面からより離れた領域までＳＰＦＳで検出および測定可能な検出チップおよび検出キット、当該検出チップを用いて被検出物質を検出可能な検出システム、ならびに当該検出チップを用いた被検出物質の検出方法が提供される。

図１は、本発明の第１の実施形態に係る検出システムの構成を示す模式図である。 図２Ａは、複数の凸条または凸部を含んでなる１次元の凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体を示す模式図であり、図２Ｂは、複数の凸条または凸部を含んでなる２次元の凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体を示す模式図である。 図３は、ナノサイズの粒子が集合してなるＬＳＰＲ構造体を示す模式図である。 図４は、本発明の第１の実施形態に係る検出システムを用いた被検出物質の検出方法を行う際の、検出システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。 図５Ａは、図４にフローチャートを示す被検出物質の検出方法において、液体収容部内を浮遊する被検出物質が検出される際の様子を示す模式図であり、図５Ｂは、図４にフローチャートを示す被検出物質の検出方法において、細胞またはエクソソームに付着した被検出物質が検出される際の様子を示す模式図である。 図６は、本発明の第２の実施形態に係る検出システムの構成を示す模式図である。 図７は、本発明の第２の実施形態に係る検出システムを用いた被検出物質の検出方法を行う際の、検出システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。 図８は、本発明の実施例における増強電場の分布のシミュレーション結果を示す図である。 図９は、ＳＰＦＳによる従来の物質測定の概要を示す模式図である。

［第１の実施形態］
（検出システム）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る検出システム１００の構成を示す模式図である。検出システム１００は、液体収容部１１２および光透過性の基板１１６を有する検出チップ１１０を配置するチップホルダー１２０、光源ユニット１３０、検出ユニット１４０、および制御部１５０を有する。検出システム１００は、チップホルダー１２０の所定の位置に検出チップ１１０を装着した状態で、検出チップのＬＳＰＲ構造体１１８でＬＳＰＲが発生するようにＬＳＰＲ構造体１１８に励起光αを照射して、ＬＳＰＲ構造体１１８より液体収容部１１２側に、ＬＳＰＲに基づく増強電場を発生させる。当該増強電場により液体収容部１１２に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質を検出し、その量を測定する。

検出チップ１１０は、液体収容部１１２および光透過性の基板１１６を有する。

液体収容部１１２は、液体を一時的に貯留可能な空間（ウェル）であってもよいし、液体を流通させることが可能な流路であってもよい。検出および測定の効率を高める観点からは、液体収容部１１２は流路であることが好ましい。

液体収容部１１２は、たとえば、側面の一部に基板１１６を配置可能であればよい。図１に示す検出システム１００では、液体収容部１１２は、内面に溝が形成された蓋部材であって、基板１１６と組み合わせたときに、基板１１６を底面として、蓋部材を側面および上面とした流路が形成される構成である。なお、液体収容部１１２は、両端部もしくは一方の端部に開口を有する流路、または有底の凹部から構成されるウェルであって、側面の一部に基板１１６を配置可能な開口が形成された構成であってもよい。また、液体収容部１１２は、両端部もしくは一方の端部に開口を有する流路、または有底の凹部から構成されるウェルであって、内部に基板１１６を配置可能な構成であってもよい。

液体収容部１１２は、側面の他の一部に、励起光αを透過可能な材料で形成された励起光透過部１１３を有する。励起光透過部１１３は、光源ユニット１３０からの励起光αを検出チップ１１０内に配置された基板１１６に導くための透過窓である。励起光透過部１１３は、液体収容部１１２の側面のうち、ＬＳＰＲ構造体１１８と基板１１６との界面（以下、単に「入射面」という）１１８ａ（図５Ａ、図５Ｂ参照）への入射光の照射により検出チップ１１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下、単に「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となる角度（以下、単に「増強角」ともいう）で励起光αが入射面１１８ａに入射可能となる領域に形成されればよいが、液体収容部１１２の全体が励起光αを透過可能な材料からなる励起光透過部１１３であってもよい。

図１に示す検出システム１００では、励起光透過部１１３は、図面奥手から手前側に液体を流通させる流路である液体収容部１１２（図１には断面図が示される）に対して、液体の流通方向に対して側方から斜めに励起光αを入射させる位置に配置される。なお、励起光透過部１１３は、液体収容部１１２に対して、液体の流通方向と同じ方向（または逆の方向）に斜めに励起光αを入射させてもよい。

液体収容部１１２は、側面のさらに他の一部に、増強電場により励起した蛍光物質が発する蛍光βを透過可能な材料で形成された蛍光透過部１１４を有する。蛍光透過部１１４は、蛍光βを検出チップ１１０外の検出ユニット１４０に導くための透過窓である。蛍光透過部１１４は、たとえば、液体収容部１１２の側面のうち配置された基板１１６と対向する領域に形成されればよいが、液体収容部１１２の全体が蛍光βを透過可能な材料からなる蛍光透過部１１４であってもよい。

液体収容部１１２のうち、基板１１６と蛍光透過部１１４との間の領域が、物質を検出および測定する検出場１１９となる。

蛍光透過部１１４および励起光透過部１１３は、たとえば、樹脂およびガラスなどの光に対して透明な材料から形成することができる。

液体収容部１１２の形状および大きさは、特に限定されず、たとえば検出場１１９における内径（基板１１６と蛍光透過部１１４との間の間隔）が数μｍ〜数ｃｍ程度であればよい。

基板１１６は、励起光αを透過可能な誘電体からなる、対向する２つの面を有する光透過性かつ誘電性の基板である。基板１１６は、上記対向する２つの面の一方の面が液体収容部１１２の内部に面して配置される。なお、液体収容部１１２の内部に面して配置されるとは、基板１１６の上記一方の面が液体収容部１１２の内部側に配置されることを意味する。上記一方の面は、液体収容部１１２の内部に接して配置されることが好ましいが、励起光αおよび電場振幅を透過する材料を液体収容部１１２の内部との間に挟んで配置されてもよい。ただし、後者の場合でも、基板１１６と液体収容部１１２の内部との間の距離は小さいことが好ましく、たとえば１μｍ以下であることが好ましい。上記一方の面は、平面であることが好ましい。

基板１１６は、たとえば、樹脂およびガラスなどの光に対して透明な材料から形成することができる。基板１１６は、プリズムであってもよい。

後述する第２の実施形態とは異なり、基板１１６は、上記一方の面に、被検出物質と特異的に結合する捕捉体（第１の捕捉体）が固定化されている必要はないが、上記一方の面に第１の捕捉体が固定化されていてもよい。

基板１１６は、上記対向する２つの面の他方の面に、励起光αの照射によりＬＳＰＲを生じる構造体（以下、単に「ＬＳＰＲ構造体」という。）１１８を有する。ＬＳＰＲ構造体１１８は、上記他方の面、または上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域において、検出場１１９に対応する領域の少なくとも一部に形成されている。

ＬＳＰＲ構造体１１８は、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、複数の凸条または凸部を含んでなる凹凸構造を有する構造体でもよいし、図３に示すように、ナノサイズの粒子が集合した構造体でもよい。ＬＳＰＲ構造体１１８は、上記他方の面に形成されるとき、上記他方の面の全体に形成されていてもよいし、一部のみに形成されていてもよい。

また、ＬＳＰＲ構造体１１８は、上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に形成されるとき、上記凹凸構造またはナノサイズの粒子の少なくとも一部が、上記一方の面の表面よりも前記他方の面側に存在していればよい。たとえば、上記凹凸構造またはナノサイズの粒子は、その全部が基板１１６内部の上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に位置するように配置されてもよいし、その一部が基板１１６内部の上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に位置するように配置されてもよいし、その全部が前記他方の面より前記基板１１６の外側に位置するように配置されてもよい。

上記凹凸構造またはナノサイズの粒子は、その全部が基板１１６内部の上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に位置するように配置されるとき、上記凹凸構造の高さまたは粒子の粒子径が基板１１６の幅方向の長さ（上記一方の面と他方の面との間の距離）と略同一であってもよいし、上記凹凸構造の高さまたは粒子の粒子径が基板１１６の幅方向の長さよりも小さくてもよい。上記凹凸構造またはナノサイズの粒子は、上記凹凸構造の高さまたは粒子の粒子径が基板１１６の幅方向の長さよりも小さいとき、基板１１６の内部の上記一方の面により近い位置に配置されてもよいし、上記他方の面により近い位置に配置されてもよい。

上記凹凸構造またはナノサイズの粒子は、その一部が基板１１６内部の上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に位置するように配置されるとき、その一部が上記一方の面または他方の面（またはその両方）より外部に位置するように配置されてもよい。

ＬＳＰＲ構造体１１８は、励起光αを照射されるとＬＳＰＲを生じ、増強電場を生じる。上記増強電場は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面側（励起光αの照射とは反対側）には数十ｎｍ程度の範囲に生じるのみであるが、ＬＳＰＲ構造体１１８の裏面側（励起光αの照射と同じ側：入射面１１８ａ側）には１００，０００ｎｍ（１００μｍ）の範囲にまで生じる。そのため、検出場１１９をＬＳＰＲ構造体１１８の裏面側に配置することで、従来よりも広い範囲において被検出物質の検出が可能となる。なお、ＬＳＰＲによらない伝播型表面プラズモン共鳴による増強電場は、構造体の表面から２００ｎｍ程度の範囲にしか生じない。そのため、ＬＳＰＲ構造体１１８により生じるＬＳＰＲによる増強電場を用いてＬＳＰＲ構造体１１８の裏面側で被検出物質を検出すると、従来よりも広い範囲での被検出物質の検出が可能となる。

上記凹凸構造は、図２Ａに示すような１次元の凹凸構造であってもよいし、図２Ｂに示すような２次元の凹凸構造であってもよい。上記１次元の凹凸構造は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面に形成された複数の凸条を有する。上記複数の凸条は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面に所定の間隔で互いに略平行に配置されることが好ましい。なお、凸条の配列方向は特に限定されない。上記２次元の凹凸構造は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面に形成された複数の凸部を有する。上記複数の凸条は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面に略周期的に配列されることが好ましい。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。上記凸条および凸部の形状は特に限定されず、ＬＳＰＲ構造体１１８の断面形状が、略矩形波形状、略正弦波形状、および略鋸歯形状などとなるような形状が含まれる。

上記凸条または凸部は、高さが５ｎｍ以上であることが好ましい。高さが５ｎｍ以上の凸条または凸部は、ＬＳＰＲによる増強電場をより広くし、かつ形成された電場をより強くすることが可能である。なお、「凸条または凸部の高さ」とは、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、ＬＳＰＲ構造体１１８の底部（ＬＳＰＲ構造体１１８のうち基板１１６からの高さが最も低い部分）と、凸条または凸部の先端部（ＬＳＰＲ構造体１１８のうち基板１１６からの高さが最も高い部分）との間の距離ｈを意味する。上記観点からは、凸条または凸部の高さは５０ｎｍ以上であることがより好ましく、１００ｎｍ以上であることがさらに好ましい。凸条または凸部の高さの上限は特にないものの、１５００ｎｍ以下であることが好ましい。上記高さは、ＬＳＰＲ構造体１１８が形成された基板１１６を収束イオンビーム装置（ＦＩＢ）で切断し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像を用いて形成された断面を撮像した画像をもとに、公知の画像解析ソフトを用いて測定することができる。

凸条または凸部の間の間隔は、５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であることが好ましい。上記間隔が１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下だと、ＬＳＰＲによる増強電場をより広くし、かつ形成された電場をより強くすることが可能である。上記観点からは、凸条または凸部の間の間は５０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下であることがより好ましく、５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。なお、「凸条または凸部の間の間隔」とは、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、凸条または凸部の配列方向における上記凸条または凸部の中心間距離ｐを意味する。上記間隔は、ＳＥＭを用いてＬＳＰＲ構造体１１８を表面側から撮像した画像をもとに、公知の画像解析ソフトを用いて測定することができる。

上記凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体１１８の平均厚みは、特に限定されないが、３０ｎｍ以上７０ｎｍ以下であることが好ましい。

上記ナノサイズの粒子の集合体は、図３に示すようにナノサイズの粒子が集合した構造であればよい。上記ナノサイズの粒子は、ＬＳＰＲ構造体１１８の表面に略周期的に配列されることが好ましい。上記ナノサイズの粒子の形状は特に限定されないが、略球形であることが好ましい。

上記ナノサイズの粒子は、平均粒子径が５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。平均粒子径が５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である粒子は、ＬＳＰＲによる増強電場をより広くし、かつ形成された電場をより強くすることが可能である。上記観点からは、上記ナノサイズの粒子の平均粒子径は５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることがより好ましく、５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。上記平均粒子径は、ＳＥＭを用いてＬＳＰＲ構造体１１８を表面側から撮像した画像をもとに、公知の画像解析ソフトを用いて測定することができる。

上記ナノサイズの粒子の集合体は、上記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）と上記ナノサイズの粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）との比（Ｂ／Ａ）が０．３以上３．０以下であることが好ましい。上記Ｂ／Ａが０．３以上３．０以下であるナノサイズの粒子の集合体は、ＬＳＰＲによる増強電場をより広くし、かつ形成された電場をより強くすることが可能である。上記観点からは、上記Ｂ／Ａは０．５以上２．０以下であることがより好ましく、０．８以上１．３以下であることがさらに好ましい。ナノサイズの粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）は、ＬＳＰＲ構造体１１８が形成された基板１１６を収束イオンビーム装置（ＦＩＢ）で切断し、ＳＥＭで撮像を用いて形成された断面を撮像した画像をもとに、公知の画像解析ソフトを用いて測定した、隣接するナノサイズの粒子間の距離の最小値とすることができる。

なお、上記説明では、ＬＳＰＲ構造体１１８が有する上記凹凸構造またはナノサイズの粒子の全部が前記他方の面より前記基板１１６の外側に位置するように配置された構造を例示したが、同様の凹凸構造またはナノサイズの粒子がその他の位置に配置されてもよい。

ＬＳＰＲ構造体１１８は、ナノサイズの構造体としたときにＬＳＰＲを生じ得る材料から形成されればよい。ＬＳＰＲ構造体１１８の材料の例には、金、銀、銅、亜鉛、アルミニウムおよびガリウム、これらの合金、これらの酸化物、ならびにこれらを含む酸化物半導体、ならびに窒化チタン（ＴｉＮ）および酸化インジウム（Ｉｎ_２Ｏ_３）などが含まれる。これらの材料のうち、増強電場をより広くし、かつ形成された電場をより強くする観点からは、金、銀、酸化亜鉛、窒化チタンまたは酸化インジウムを主成分として含むことが好ましい。なお、主成分として含むとは、ＩＣＰを用いて定量したときに当該材料がＬＳＰＲ構造体の全質量に対して５０質量％以上であることを意味する。

なお、基板１１６とＬＳＰＲ構造体１１８との間には、金属酸化物などによる他の層が挟まれていてもよい。

ＬＳＰＲ構造体１１８は、公知の方法で製造することができる。

上記凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体１１８は、基板１１６の表面に金属膜を形成した後、金属膜に凹凸形状を付与して形成してもよいし、凹凸形状を付与された基板１１６の表面に、金属膜を形成してもよい。上記金属膜は、スパッタリング、蒸着およびめっきなどを含む公知の方法で形成することができる。

上記ナノサイズの粒子の集合体であるＬＳＰＲ構造体１１８は、たとえば、Langmuir-Blodgett法（ＬＢ法）で形成することができる。ＬＢ法では、長鎖カルボン酸などの両親媒性分子および上記ナノサイズの粒子をトルエンなどの揮発性かつ水に不溶な溶媒で希釈し、さらに水を添加して水と溶媒との界面に上記ナノサイズの粒子の単分子膜であるLangmuir膜（Ｌ膜）を形成する。その後、上記Ｌ膜が形成された液体に浸漬した基板１１６を引き抜いて、Ｌ膜を基板１１６上に移し取ったLangmuir-Blodgett膜（ＬＢ膜）を形成する。溶媒で希釈する上記ナノサイズの粒子の平均粒子径によって、集合体における上記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）を調整することが可能である。溶媒中のナノサイズの粒子上記の濃度または基板１１６を引き抜く速度によって、集合体における上記ナノサイズの粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）を調整することが可能である。基板１１６は、水を添加する前に溶媒中に浸漬しておくことが望ましい。

その後、上記凹凸構造またはナノサイズの粒子の集合体を形成した金属膜と接するように、さらに基板の材料を付与して成形する等の方法で、上記凹凸構造またはナノサイズの粒子の集合体が上記一方の面と前記他方に面とに挟まれた領域に配置された基板１１６とすることもできる。

光源ユニット１３０は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、液体収容部１１２側から基板１１６を通してＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに照射する。光源ユニット１３０は、入射面１１８ａにおける照射スポットが略円形となるように励起光αを出射することが好ましい。光源ユニット１３０は、例えば、励起光αの光源１３２、ビーム整形光学系、Automatic Power Control（ＡＰＣ）機構、温度調整機構（いずれも不図示）、角度調整機構１３４、および光源制御部１３６を含む。

光源１３２の種類は特に限定されないが、レーザーダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード、および水銀灯などとすることができる。検出および測定の効率を高める観点からは、光源１３２は、レーザー、特にはビーム状のレーザーを出射する光源であることが好ましい。光源１３２から出射される光がビームでない場合は、光源１３２から出射される光は、レンズ、鏡またはスリットなどによりビームに変換されることが望ましい。また、光源１３２から出射される光が単色光でない場合は、光源１３２から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換されることが望ましい。さらに、光源１３２から出射される光が直線偏光でない場合は、光源１３２から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換されることが望ましい。

ビーム整形光学系は、たとえば、コリメーター、バンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、およびズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源１３２から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源１３２から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源１３２からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源１３２から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、上記照射スポットにＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、上記照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源１３２の出力が一定となるように光源１３２を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源１３２の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源１３２からの出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源１３２の温度を一定に保つことにより、光源１３２からの出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１３４は、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａ（ＬＳＰＲ構造体１１８と基板１１６との界面）に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１３４は、基板１１６を介して入射面１１８ａの所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１２０とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１３４は、光源ユニット１３０を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても入射面１１８ａ上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。

前述のとおり、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、より高い強度の蛍光βを測定することが可能となる。基板１１６の材料および形状、ＬＳＰＲ構造体１１８の形状および材料、液体収容部１１２中の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、液体収容部１１２中内の蛍光物質の種類および量、基板１１６の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、検出および測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。

光源制御部１３６は、光源ユニット１３０に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１３０からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１３６は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

検出ユニット１４０は、照射スポット（ＬＳＰＲ構造体１１８）への励起光αの照射によって生じた蛍光βを検出する。また、必要に応じて、検出ユニット１４０は、照射スポット（ＬＳＰＲ構造体１１８）への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。検出ユニット１４０は、たとえば、第１レンズ１４２、光学フィルター１４３、第２レンズ１４４、位置切替部１４６および検出部１４８を含む。

第１レンズ１４２は、たとえば、集光レンズであり、検出場１１９近傍から出射される光を集光する。第２レンズ１４４は、たとえば、結像レンズであり、第１レンズ１４２で集光された光を検出部１４８の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１４３は、両レンズの間に配置されている。

光学フィルター１４３は、蛍光成分のみを検出部１４８に導き、高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１４３の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターなどが含まれる。光学フィルター１４３は、たとえば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとすることができる。

位置切替部１４６は、光学フィルター１４３の位置を、第１レンズ１４２および第２レンズ１４４間の光路上または光路外に切り替える。具体的には、検出部１４８が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１４３を光路上に配置し、検出部１４８がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１４３を光路外に配置する。

検出部１４８は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する受光センサである。検出部１４８は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。検出部１４８は、たとえば、光電子増倍管（ＰＭＴ）およびアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などとすることができる。

検出システム１００は、検出チップ１１０の液体収容部１１２内に各種液体を導入し、または検出チップ１１０の液体収容部１１２内から各種液体を排出するピペットなどの送液ユニット、ならびに、被検出物質と第１の捕捉体との結合（１次反応）、被検出物質と第２の捕捉体との結合（２次反応）および洗浄などを効率的に行うために液体収容部１１２内の液体を撹拌する加振部（いずれも不図示）などを有してもよい。送液ユニットおよび加振部などは、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない位置に配置される。

制御部１５０は、光源ユニット１３０、角度調整部１３４、位置切替部１４６、および検出部１４８など、ならびに送液ユニットおよび加振部などを制御する。制御部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

（検出方法）
検出システム１００は、被検出物質の検出および測定に用いることができる。図４は、本実施形態に係る検出システム１００を用いた被検出物質の検出方法を行う際の、検出システム１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、検出システム１００の所定の位置に検出チップ１１０を設置する。その後、制御部１５０は、送液ユニットを制御して、液体収容部１１２内に測定用緩衝液を導入させる。

次いで、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１２０）。具体的には、制御部１５０は、光源ユニット１３０および角度調整部１３４を制御して、励起光αをＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａのうち検出場１１９に対応する位置に照射させながら、入射面１１８ａに対する励起光αの入射角を走査する。同時に、制御部１５０は、検出部１４８を制御して、プラズモン散乱光γを検出させる。このとき、制御部１５０は、位置切替部１４６を制御して、光学フィルター１４３を光路外に移動させる。制御部１５０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光γの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１５０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。最後に、制御部１５０は、角度調整部１３４を制御して、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに対する励起光αの入射角を増強角に設定する。

増強角は、基板１１６の材料および形状、ＬＳＰＲ構造体１１８の形状および材料、ならびに液体収容部１１２中の液体の屈折率などにより決定されるが、液体収容部１１２の液体の種類および量、基板１１６の形状誤差などの各種要因によってもわずかに変動する。このため、検出を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、たとえば０.１°程度のオーダーで決定することができる。なお、操作を簡略化したいときは、増強角の設定（工程Ｓ１２０）を省略してもよい。また、ＬＳＰＲ構造体１１８がナノサイズの粒子の集合体であるときも、増強角の設定（工程Ｓ１２０）を省略することができる。

次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部１５０は、光源ユニット１３０を制御して、励起光αをＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａのうち検出場１１９に対応する位置に照射させる。これと同時に、制御部１５０は、検出部１４８を制御して、蛍光βと同じ波長の背景光の光量を検出させる。このとき、制御部１５０は、位置切替部１４６を制御して、光学フィルター１４３を光路上に移動させる。制御部１５０は、測定された背景光の光量をブランク値として記録する。

次いで、検出チップ１１０の液体収容部１１２内に蛍光物質により標識された被検出物質を含む検体を導入する（工程Ｓ１４０）。

検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、鼻孔液、唾液、および精液などの体液、組織抽出液、ならびにこれらの希釈液が含まれる。被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、および脂質、ならびにこれらの修飾分子が含まれる。これらのうち、本実施形態に係る検出システム１００を用いた被検出物質の検出方法は、タンパク質および脂質の測定により好適に用いることができる。被検出物質は検体内を浮遊していてもよいが、細胞またはエクソソームの表面などに付着していてもよい。

被検出物質は、蛍光物質により標識されている。蛍光物質による標識は、蛍光物質を担持させた、被検出物質に特異的に結合する捕捉体（第２の捕捉体）を、被検出物質と結合させて行うことができる。

第２の捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する物質であればよく、被検出物質に特異的な生体分子（たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、核酸アプタマーなど）であってもよく、その断片などであってもよい。であってもよく、その断片などであってもよい。また、第２の捕捉体は、１分子からなるものであってもよく、２以上の分子が結合した複合体であってもよい。

また、第２の捕捉体に結合している蛍光物質は、金属膜表面に発生する局在場光によって励起され、蛍光を発する物質であれば、特に限定されず、公知の各種蛍光物質（例えばローダミン骨格を含む蛍光物質）でありうる。蛍光物質の具体例には、バイオティウム（Ｂｉｏｔｉｕｍ）社製の蛍光色素（例えばＣＦ Ｄｙｅ（商品名）３５０、４０５Ｍ、５３２、５４３、５５５、５６８、５９４、６４２、６５０、６６７、６６３、６８１、６８０、７５５、７７０）などが含まれる。

なお、蛍光物質は、レーザー回折・散乱法により測定された体積平均粒子径が２００ｎｍ以上の物質であってもよい。

また、第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数は、８個以上２２個以下であることが好ましく、１３個以上１６個以下であることがより好ましい。「第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数」とは、液体収容部１１２内に提供する、複数の第２の捕捉体に、それぞれ結合している蛍光物質の数の平均値である。

第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の量は、第２の捕捉体に蛍光物質を結合させる際の第２の捕捉体と蛍光物質との仕込み比や、反応時間、反応時の温度により、調整可能であるが、仕込み比で調整することが好ましい。液体収容部１１２に提供する、第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数（平均値）は、吸光光度計により、蛍光物質が結合している第２の捕捉体について吸光度を測定し、第２の捕捉体の量および蛍光物質の量をそれぞれ算出して、第２の補足体の量に対する蛍光物質の量の比率を算出して、得ることができる。

蛍光物質による被検出物質の標識は、検体を液体収容部１１２内に導入する前に行ってもよいし、検体および第２の捕捉体を液体収容部１１２に別個に導入（または第２の捕捉体を含む検体を液体収容部１１２に導入）して液体収容部１１２内で行ってもよい。液体収容部１１２内で蛍光物質による標識を行うときは、制御部１５０は、被検出物質と第２の捕捉体との結合を促進するため、加振部を制御して、検出チップ１１０を振動させて液体収容部１１２の内部の液体を撹拌させてもよい。いずれにせよ、工程Ｓ１４０では、蛍光物質により標識された被検出物質を含む検体が液体収容部１１２内に存在する状態となればよい。

次いで、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１５０は、光源ユニット１３０を制御して、励起光αをＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａのうち検出場１１９に対応する位置に照射させる。これと同時に、制御部１５０は、検出部１４８を制御して、蛍光βと同じ波長の光の光量を検出させる。このとき、制御部１５０は、位置切替部１４６を制御して、光学フィルター１４３を光路上に移動させる。制御部１５０は、測定された光量を蛍光値として記録する。

最後に、被検出物質の量を算出する（工程Ｓ１６０）。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ１５０で得られた蛍光値から工程Ｓ１３０で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。

以上の手順により、検体に含まれる被検出物質を検出し、その量を測定することができる。

（効果）
本実施形態では、増強電場１９０がＬＳＰＲ構造体１１８の裏面（励起光αを照射した面：入射面１１８ａ）から数十万ｎｍ（数百μｍ）の範囲にまで生じるため、図５Ａに示すように、液体収容部１１２内を浮遊する被検出物質１７２（蛍光物質１７６で標識されている）も検出および測定可能である。そのため、被検出物質を基板１１６に固定する必要がなく、より簡素な手続きで被検出物質の検出およびその量の測定を行うことができる。また、増強電場１９０は従来の表面プラズモン共鳴を用いた場合よりも広い範囲で生じるため、図５Ｂに示すように、細胞またはエクソソーム１８０に付着した、細胞内で発現して細胞から放出されるタンパク質または脂質、および抗原提示細胞であるマクロファージなどの表面に提示されたタンパク質などの被検出物質１７２（蛍光物質１７６で標識されている）の存在および量を測定することも可能である。細胞またはエクソソーム１８０は、基板に付着していてもよいし、液体収容部１１２内を浮遊していてもよい。

［第２の実施形態］
（検出システム）
図６は、本発明の第２の実施形態に係る検出システム２００の構成を示す模式図である。検出システム２００は、液体収容部１１２および光透過性の基板１１６を有する検出チップ２１０を配置するチップホルダー１２０、光源ユニット１３０、検出ユニット１４０、および制御部１５０を有する。検出システム２００は、チップホルダー１２０の所定の位置に検出チップ２１０を装着した状態で、検出チップのＬＳＰＲ構造体１１８でＬＳＰＲが発生するように検出チップ２１０に励起光αを照射して、ＬＳＰＲ構造体１１８より液体収容部１１２側に、ＬＳＰＲに基づく増強電場を発生させる。当該増強電場により液体収容部１１２に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質の検出およびその量の測定を行う。

検出システム２００は、検出チップ２１０の構成および検出方法が第１の実施形態と相違する。そこで、第１の実施形態に係る検出システム１００と同じ構成要素については同一の符号を付し、説明を省略する。

検出チップ２１０は、液体収容部１１２および光透過性の基板２１６を有する。

液体収容部１１２は、第１の実施形態に係る液体収容部１１２と同様の構成とすることができる。

基板２１６は、励起光αを透過可能な誘電体からなる、対向する２つの面を有する光透過性かつ誘電性の基板である。基板２１６は、上記対向する２つの面の一方の面が液体収容部１１２の内部に面して配置される。基板２１６は、たとえば、樹脂およびガラスなどの、光に対して透明な材料から形成することができる。基板２１６は、プリズムであってもよい。

第２の実施形態では、基板２１６は、上記一方の面に、被検出物質と特異的に結合する捕捉体（第１の捕捉体）が固定化された捕捉領域２１７を有する。第１の捕捉体は、検体中の被検出物質と特異的に結合するための認識部位を有する物質である。基板２１６に第１の捕捉体が固定されていると、液体収容部１１２に検体を導入したときに、第１の捕捉体に被検出物質が選択的に結合して、被検出物質が検出場１１９に対応する基板２１６の上記一方の面の領域（捕捉領域２１７）に捕捉される。第１の捕捉体の種類は、被検出物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第１の捕捉体の例には、被検出物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などが含まれる。

基板２１６は、上記対向する２つの面の他方の面に、励起光αの照射によりＬＳＰＲを生じるＬＳＰＲ構造体１１８を有する。ＬＳＰＲ構造体１１８は、上記他方の面において、検出場１１９に対応する領域の少なくとも一部に形成されている。ＬＳＰＲ構造体１１８は、第１の実施形態に係るＬＳＰＲ構造体１１８と同様の構成とすることができる。

検出精度を向上させる観点からは、基板２１６の上記一方の面（捕捉領域２１７が配置されている面）は、略平面であることが好ましい。すなわち、第２の実施形態でように捕捉領域２１７が基板２１６の上記一方の面上に配置されている場合は、基板２１６の上記一方の面は平面であることが好ましい。

（検出方法）
図７は、本実施形態に係る検出システム２００を用いた被検出物質の検出方法を行う際の、検出システム２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ２１０）。次いで、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ２２０）。工程Ｓ２１０および工程Ｓ２２０は、それぞれ、第１の実施形態における工程Ｓ１２０およびＳ２２０と同様に行えばよい。本実施形態においても、ＬＳＰＲ構造体１１８がナノサイズの粒子の集合体であるときは、増強角の設定（工程Ｓ２２０）を省略することができる。

次いで、検出チップ２１０の液体収容部１１２に検体を提供し、検出チップ２１０内の基板２１６上（捕捉領域２１７）に固定された第１の捕捉体に、検体中に含まれる被検出物質を特異的に結合させる（１次反応（工程Ｓ２３０））。なお、被検出物質の結合後、液体収容部１１２内には、緩衝液などを提供し、液体収容部１１２内を洗浄して、遊離の被検出物質などを除去してもよい。

本実施形態で液体収容部１１２に提供する検体および被検出物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。またこれらの検体に含まれる被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。これらのうち、本実施形態に係る検出システム２００を用いた被検出物質の検出方法は、タンパク質および脂質の測定により好適に用いることができる。

上記１次反応後、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ２４０）。具体的には、制御部１５０は、光源制御部１３６を制御して、ＬＳＰＲ構造体１１８に向けて光源ユニット１３０から、増強角で励起光αを出射させる。同時に、制御部１５０は、検出ユニット１４０を制御して、検出部１４８で光の光量を検出し、これをブランク値として記録する。

続いて、基板２１６上の第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる（２次反応（工程Ｓ２５０））。具体的には、第２の捕捉体を含む標識液を液体収容部１１２内に提供する。本実施形態において、第２の捕捉体は、被検出物質の、第１の捕捉体が特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質である。また、当該第２の捕捉体には、蛍光物質が結合している。したがって、標識液を液体収容部１１２に提供すると、第１の捕捉体に結合している被検出物質に第２の捕捉体が特異的に結合し、被検出物質が、間接的に蛍光物質で標識される。なお、被検出物質を蛍光物質で標識後、液体収容部１１２内には、緩衝液などを提供し、液体収容部１１２内を洗浄して、遊離の第２の捕捉体などを除去してもよい。

ここで、第２の捕捉体は、第１の捕捉体が被検出物質に特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質であればよく、第２の捕捉体に結合している蛍光物質は、ＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａへの励起光αの照射により発生する増強電場によって励起され、蛍光を発する物質であればよい。第２の捕捉体および蛍光物質としては、第１の実施形態と同様の物質を使用することができる。

次いで、基板２１６上（捕捉領域２１７）に、蛍光物質で標識された被検出物質が第１の捕捉体を介して配置された状態で、基板２１６を通して励起光αを増強角でＬＳＰＲ構造体１１８の入射面１１８ａに照射する。そして、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（測定工程（工程Ｓ２６０））。具体的には、制御部１５０は、光源制御部１３６を制御して、ＬＳＰＲ構造体１１８に向けて光源ユニット１３０から励起光αを出射させる。同時に、制御部１５０は、検出ユニット１４０の検出部１４８を制御して、検出部１４８で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。

最後に、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ２７０）。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ２６０で得られた蛍光値から工程Ｓ２４０で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。

以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。

（効果）
本実施形態でも、増強電場がＬＳＰＲ構造体１１８の裏面（励起光αを照射した面：入射面１１８ａ）から数十万ｎｍ（数百μｍ）の範囲にまで生じる。そのため、従来よりも大きな粒子状物質や、細胞やエクソソームに付着した被検出物質（細胞内で発現して細胞から放出されるタンパク質または脂質、および抗原提示細胞であるマクロファージなどの表面に提示されたタンパク質など）の検出およびその量の測定を行うことも可能である。また、本実施形態では、基板に固定された第１捕捉体によって被検出物質が捕捉されるため、より高感度での検出および測定も可能である。

［その他の実施形態］
なお、上記各実施形態における基板は、ＬＳＰＲ構造体の凸条または凸部の形状、高さ、周期、もしくは、凸条もしくは凸部の間の間隔、または、ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）または粒子間距離の平均（Ｂ）が互いに異なる複数の領域を、同一の面（他方の面）に有していてもよい。上記複数の領域は、それぞれ増強角が異なり、検出および測定可能な物質も異なる。そのため、同一の基板上の上記複数の領域に配置されたＬＳＰＲ構造体の入射面に、それぞれ異なる入射角で励起光αを照射して、検体内に含まれる複数種の物質をひとつの基板で検出および測定することも可能である。特に、上記各実施形態における基板は、凸条または凸部の高さが互いに異なる複数の領域、またはナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）が互いに異なる複数の領域を、同一の面（他方の面）に有することが好ましい。

もしくは、上記基板は、ＬＳＰＲ構造体の凹凸の形状、高さ、周期、もしくは、凸条もしくは凸部の間の間隔、または、ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）または粒子間距離の平均（Ｂ）が互いに異なる複数の基板を含む検出キットとしてもよい。あるいは、上記検出チップは、ＬＳＰＲ構造体の凹凸の形状、高さ、周期、もしくは、凸条もしくは凸部の間の間隔、または、ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）または粒子間距離の平均（Ｂ）が互いに異なる基板を有する複数の検出チップを含む検出キットとしてもよい。これらの検出キットによっても、検体内に含まれる複数種の物質を検出および測定することが可能である。特に、上記検出キットは、凸条または凸部の高さが互いに異なる基板を有する複数の検出チップ、またはナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）が互いに異なる基板を有する複数の検出チップを、含むことが好ましい。

以下において、本発明の具体的な実施例を説明する。なお、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定して解釈されない。

［実施例１］
図１に記載の構成を有する物質検出システムが有する基板配置部に、プリズム中に金ナノ粒子を配置した基板を配置して、照射部から上記基板にレーザーを照射したときに、液体収容部（検出場）側に生じる増強電場を、シミュレーションソフトであるＣＯＭＳＯＬ ＭｕｌｔｉＰｈｙｓｉｃｓ ５．０（ＣＯＭＳＯＬ社製、「ＣＯＭＳＯＬ ＭｕｌｔｉＰｈｙｓｉｃｓ」は同社の登録商標）の波動光学モジュールを用いて計算によって算出した。

結果を図８に示す。金ナノ粒子の平均粒子径（Ａ）を１５０ｎｍ、粒子間距離の平均（Ｂ）を２２５ｎｍ（Ｂ／Ａは１．５０）としたとき（左図）も、金ナノ粒子の平均粒子径（Ａ）を２００ｎｍ、粒子間距離の平均（Ｂ）を２００ｎｍ（Ｂ／Ａは１．００）としたとき（右図）も、基板側に増強された電場が広く分布していた。

この結果から、基板のうち、ＬＳＰＲ構造体（金ナノ粒子）の裏面側（励起光αの照射と同じ側：入射面側）においてＬＳＰＲによる蛍光標識された被検出物質の検出が良好に行い得ることが理解できる。

［実施例２］
１．基板の作製
両親媒性化合物であるミスチリン酸、および平均粒子径が１５０ｎｍである金ナノ粒子をトルエン溶液中に投入して混合し、金ナノ粒子溶液を作製した。

全自動ＬＢ膜作成装置の膜形成部分に水を入れ水槽を形成し、プリズムを浸漬させた。水槽上部に上記トルエン溶液を滴下し、金ナノ粒子の単分子膜を形成した。ついで、浸漬させていたプリズムを引き抜いて、プリズム上に金ナノ粒子が配置された基板１を得た。

基板１の一部を収束イオンビーム装置（ＦＩＢ）で切断し、ＳＥＭで撮像を用いて形成された断面を撮像した画像をもとに、公知の画像解析ソフトを用いて、基板１上のナノサイズの粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）を測定した、

投入した金ナノ粒子の平均粒子径またはプリズムを引き抜く速度を変更して、金ナノ粒子の平均粒子径（Ａ）または金ナノ粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）が異なる基板２〜基板７を得た。

２．被検出物質
エクソソームスタンダード（コスモバイオ社）をＰＢＳで希釈し、次いでタンパク質標識キットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ」はモレキュラー プローブス， インコーポレイテッドの登録商標）を用いて標識化したＡｎｔｉ ＣＤ９、Ｍｏｕｓｅ抗体（蛍光物質で標識された抗体。以下、「色素標識抗体」という）を加え、３０分振とう撹拌して色素標識抗体をエクソソームに結合させた。

その後、ＥｘｏＣａｐ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ Ｐｌａｓｍａ（ＪＳＲライフサイエンス社製、「ＥｘｏＣａｐ」はＪＳＲ社の登録商標）を用いて、エクソソームと結合した色素標識抗体と、未反応の色素標識抗体を分離した。上記単離キットから得られたペレットを２ｍｌのＰＢＳで再分散させて、エクソソーム分散液を得た。

３．検出および測定
（試験１〜試験６）
図１に記載の構成を有する物質検出システムが有する基板配置部に基板１〜基板６をそれぞれ配置し、検出場（フローセル）に上記エクソソーム分散液を導入した。

その後、照射部から上記基板にレーザーを照射し、検出場における蛍光強度を測定部が測定した。測定結果をもとに、以下の基準で検出性を評価した。
○ 光学ブランクシグナルで得られたシグナルの１．１０倍以上のシグナルが得られた
× 光学ブランクシグナルで得られたシグナルの１．１０倍未満のシグナルが得られた

（試験７）
検出場とは反対側からレーザーを照射する以外は同様に構成した物質検出システムが有する基板配置部に基板１を配置し、検出場（フローセル）に上記エクソソーム分散液を導入して上記基板にレーザーを照射し、検出性を同様に評価した。

試験１〜試験７における金ナノ粒子の平均粒子径（Ａ）、金ナノ粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）、および検出性の評価結果を、表１に示す。

試験１〜試験６に示すように、図１に記載の構成を有する物質検出システムによって、ＬＳＰＲによる被検出物質の検出が良好に行えた。

［実施例３］
１．細胞スラリーの調製
光透過性かつ誘電性の材料からなるシャーレ内で、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製細胞培養液ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ（１Ｘ）５００ｍｌにウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｎｅ ｓｅｒｕｍ）５０ｍｌを加えたものを細胞培養液として使用した。３ｍｌの細胞培養液に、マウス骨芽由来の細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１：サイズは１０μｍ〜３０μｍ程度）を６０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように添加し、細胞添加後の細胞培養液を４０℃で２４時間保温した。

その後、上記細胞培養液にトリプシンを添加し、細胞を培養容器からはがした。さらに６０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞培養液を加えて、細胞スラリーを調整した。

２．色素標識抗体の作製
Ａｎｔｉ−ＣＤ４７、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（Ｂ６Ｈ１２）をタンパク質標識キットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）を用いて標識化した。

３．色素標識抗体の細胞への結合
上記細胞スラリーに上記作製した色素標識抗体（ＣＤ４７）を加え、３０分間振とう撹拌した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って上澄みをデカンテーションで除去し、細胞に結合しているＣＤ４７と未反応のＣＤ４７を分離した。得られた沈殿物に細胞数が６０００ｃｅｌｌ／ｍｌになるように細胞内容培地を加え、ピペッティングにて分散を行った。

４．検出および測定
図１に記載の物質検出システムが有する基板配置部に上記細胞を分散させたシャーレを配置した。

その後、照射部から上記シャーレにレーザーを照射し、蛍光強度を測定部が測定した。その結果、光学ブランクシグナルで得られたシグナルの１．１０倍以上のシグナルが得られた。図１に記載の構成を有する物質検出システムによって、細胞の表面に付着した物質などの、基板から離れた領域二存在する物質の、ＬＳＰＲによる検出が良好に行えた。

本発明によれば、従来よりも増強電場を広くしてＳＰＲＦを行うことができるので、液体収容部を浮遊する物質や、細胞の表面に付着した物質などの検出および測定をも可能となる。また、本発明によれば、より平均粒子径が大きい蛍光物質を用いたＳＰＲＦによる物質の検出および測定も可能となる。そのため、本発明は、ＳＰＲＦが適用され得る範囲を拡大することが期待される。

１００ 検出システム
１１０ 検出チップ
１１２ 液体収容部
１１３ 励起光透過部
１１４ 蛍光透過部
１１６ 基板
１１８ ＬＳＰＲ構造体
１１８ａ 入射面
１１９ 検出場
１２０ チップホルダー
１３０ 光源ユニット
１３２ 光源
１３４ 角度調整機構
１３６ 光源制御部
１４０ 検出ユニット
１４２ 第１レンズ
１４３ 光学フィルター
１４４ 第２レンズ
１４６ 位置切替部
１４８ 検出部
１５０ 制御部
１７２ 被検出物質
１７６ 蛍光物質
１８０ 細胞またはエクソソーム
１９０ 増強された電場
２００ 検出システム
２１０ 検出チップ
２１６ 基板
２１７ 捕捉領域
３１２ 液体収容部
３１６ プリズム
３１８ 金属膜
３７２ 被検出物質
３７４ 第１の捕捉体
３７６ 蛍光物質
３９０ 増強された電場

Claims (20)

1. 液体を貯留させる空間または液体を通過させる流路を構成する液体収容部と、
   前記液体収容部の側面の一部に配置された光透過性の基板であって、一方の面が前記液体収容部の前記液体を貯留または通過させる内部側に配置され、かつ、光照射により局在型表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon Resonance）を生じるＬＳＰＲ構造体を、前記内部側とは反対側の他方の面、または前記一方の面と前記他方の面とに挟まれた領域に有する光透過性の基板と、
   を有する検出チップ。
2. 前記ＬＳＰＲ構造体は、前記基板の、前記他方の面の外側に設けられた複数の凸条または凸部を含んでなる凹凸構造を有する構造体である、請求項１に記載の検出チップ。
3. 前記ＬＳＰＲ構造体は、高さが５ｎｍ以上の凸条または凸部を有する凹凸構造を有する構造体である、請求項２に記載の検出チップ。
4. 前記ＬＳＰＲ構造体は、前記凸条または凸部の高さの平均が互いに異なる複数の領域を有する、請求項２または３に記載の検出チップ。
5. 前記ＬＳＰＲ構造体は、ナノサイズの粒子の集合体である、請求項１に記載の検出チップ。
6. 前記ナノサイズの粒子は、平均粒子径（Ａ）が５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の粒子である、請求項５に記載の検出チップ。
7. 前記ＬＳＰＲ構造体は、前記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）と前記ナノサイズの粒子の粒子間距離の平均（Ｂ）との比（Ｂ／Ａ）が０．３以上３．０以下の構造体である、請求項５または６に記載の検出チップ。
8. 前記ＬＳＰＲ構造体は、前記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）が互いに異なる複数の領域を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の検出チップ。
9. 前記ＬＳＰＲ構造体は、金、銀、酸化亜鉛、窒化チタンまたは酸化インジウムからなる群から選択される金属または金属酸化物を含有する構造体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出チップ。
10. 前記基板は、前記２つの面の他方の面に、被検出物質を捕捉する第１の捕捉体を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の検出チップ。
11. 前記凹凸構造を有するＬＳＰＲ構造体の前記凸条または凸部の高さの平均が互いに異なる複数の請求項２〜４のいずれか１項に記載の検出チップを含む、検出キット。
12. 前記ナノサイズの粒子であるＬＳＰＲ構造体の前記ナノサイズの粒子の平均粒子径（Ａ）が互いに異なる複数の請求項５〜８のいずれか１項に記載の検出チップを含む、検出キット。
13. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出チップと、
    前記ＬＳＰＲ構造体に局在型表面プラズモン共鳴を生じさせる励起光を前記液体収容部側から前記基板を通して前記ＬＳＰＲ構造体に照射する光源と、
    前記励起光の照射により蛍光物質により被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出部と、
    を有する検出システム。
14. 前記光源は、レーザーを出射する光源である、請求項１３に記載の検出システム。
15. 蛍光物質により標識された被検出物質を前記液体収容部内に収容した、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出チップを用いて、
    局在型表面プラズモン共鳴を生じさせる励起光を前記液体収容部側から前記基板を通して前記ＬＳＰＲ構造体に照射する工程と、
    前記励起光の照射により前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
    を含む、被検出物質の検出方法。
16. 前記励起光は、レーザーである、請求項１５に記載の検出方法。
17. 前記基板は、前記他方の面に被検出物質を捕捉する第１の捕捉体を有し、
    前記照射する工程の前に、前記第１の捕捉体に結合した前記被検出物質に、蛍光物質により標識された第２の捕捉体を結合させる工程を含む、請求項１５または１６に記載の検出方法。
18. 前記蛍光物質により標識された被検出物質は前記液体収容部内を浮遊している、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の検出方法。
19. 前記被検出物質は、細胞またはエクソソームに付着した化合物である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の検出方法。
20. 前記被検出物質は、タンパク質または脂質である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の検出方法。
    

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