WO2021144939A1 - エクソソームの回収方法、エクソソームの分析方法および検体の分析方法 - Google Patents

エクソソームの回収方法、エクソソームの分析方法および検体の分析方法 Download PDF

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WO2021144939A1
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exosomes
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洋一 青木
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering exosomes, a method for analyzing exosomes, and a method for analyzing samples.
  • Exosomes are membrane vesicles with a diameter of about 40 nm to 150 nm that are produced by cells and released extracellularly. Exosomes are covered with a phospholipid bilayer and contain a variety of cellular components such as membrane proteins and nucleic acids such as microRNAs (miRNAs). Exosomes are thought to mediate communication between cells and organs because different exosomes are released from cells depending on the type and state of the cells.
  • miRNAs microRNAs
  • Patent Document 1 discloses an analytical method, an analytical reagent, and an analytical apparatus for detecting an exosome as a tumor marker.
  • an antibody against an antigen possessed by an exosome and an antibody against an antigen possessed by a cell secreting the exosome are used to detect the exosome based on an avidin-biotin interaction.
  • Patent Document 2 discloses an exosome analysis device and a method for capturing exosomes, in which an antibody against exosomes is immobilized in a recess of a base portion made of a compatible resin having an uneven structure and the exosome is captured in the recess. There is.
  • An object of the present invention is to provide a method for recovering exosomes, which can recover intact exosomes with a higher recovery rate than conventional detection methods while suppressing contamination with contaminants. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a method for analyzing exosomes and a method for analyzing specimens, which can analyze recovered exosome membrane proteins and / or inclusions.
  • the method for recovering an exosome includes a step of preparing a measurement chip containing a metal film and a first binding substance that binds to the exosome, which is immobilized on the metal film, and the metal film.
  • the method for analyzing exosomes includes a step of obtaining isolated exosomes by the above-mentioned method for recovering exosomes, and a step of analyzing membrane proteins and / or inclusions of the isolated exosomes.
  • the method for analyzing a sample includes a step of preparing two or more identical measurement samples from a sample that may contain exosomes and obtaining at least measurement sample 1 and measurement sample 2, a metal film, and the metal.
  • a method for analyzing a sample which comprises a step of recovering the exosome in the sample from the measurement sample 2 to obtain an isolated exosome, and a step of analyzing a membrane protein and / or inclusions of the isolated exosome.
  • the method for recovering exosomes of the present invention it is possible to recover exosomes having a specific membrane protein, which is intact and has a higher recovery rate than the conventional method, while suppressing contamination with impurities. Further, according to the method for analyzing exosomes and the method for analyzing samples of the present invention, membrane proteins and / or inclusions of exosomes can be analyzed with high sensitivity and easily from a small amount of sample.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of an exosome recovery method according to the present embodiment.
  • FIG. 2A is a schematic cross-sectional view for explaining the configuration of the measuring chip for PC-SPFS.
  • FIG. 2B is a schematic cross-sectional view for explaining the configuration of the measuring chip for GC-SPFS.
  • FIG. 3A is a schematic cross-sectional view showing an example of a measuring chip for PC-SPFS.
  • FIG. 3B is a schematic perspective view showing another example of the measuring chip for PC-SPFS.
  • FIG. 3C is a schematic cross-sectional view showing another example of the measuring chip for PC-SPFS.
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of an exosome analysis method according to the present embodiment.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a sample analysis method according to the present embodiment.
  • FIG. 6 is a calibration curve showing the relationship between the number of exosomes and the signal value.
  • Exosomes are secreted by normal cells as well as by disease-related cells such as cancer cells. Therefore, in order to use exosomes as disease markers, it is possible to distinguish between a large amount of normal cell-derived exosomes present in a sample (for example, blood) and a smaller amount of disease-related cell-derived exosomes. Method is required. Generally, the concentration of exosomes present in serum is said to be about 1.0 ⁇ 10 11 ( 1.0 ⁇ 10 8 / ⁇ l), and among them, exosomes related to diseases (for example, cancer). To detect exosomes, a method capable of detecting exosomes of 1.0 ⁇ 10 6 / ml ( 1.0 ⁇ 10 3 / ⁇ l) or less is required.
  • exosomes are detected by using surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (hereinafter, also referred to as “SPFS”). do. Since SPFS excites a fluorescent substance to emit fluorescence by an electric field enhanced by surface plasmon resonance (hereinafter, also referred to as “SPR”), it is a target (exosome in this embodiment) rather than a general fluorescence immunoassay method. Can be detected with high sensitivity.
  • SPFS surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPR surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy
  • the recovery method of the present invention is based on the SPFS system, the dilution of the sample can be automated in the SPFS device, so that the variation in the measured value that may occur due to the dilution can be suppressed, and the exosome can be produced with high reproducibility. It will be possible to collect it.
  • the SPFS system also allows the detection of exosomes followed by the dissociation and recovery of exosomes within the same SPFS device. By mechanically dissociating and recovering exosomes in the SPFS apparatus, it is possible to reduce the variation in each treatment that may occur due to the recovery operation, and to improve the reproducibility of the recovery amount and recovery rate.
  • the recovered isolated exosomes can also be further analyzed for a second time by SPFS or other methods.
  • the method for recovering exosomes of the present invention includes the following steps 1 to 6.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a measurement method using a primary reaction and a secondary reaction, which is an example of a method for measuring exosomes according to the present embodiment.
  • Step 1 Preparation of measuring tip
  • SPR is generated by combining an evanescent wave generated when a metal film is irradiated with light (excitation light in the present embodiment) and a surface plasmon.
  • a method for generating SPR a method of arranging a prism on one surface of a metal film (Kretschmann arrangement), a method of forming a diffraction grating on the metal film, and the like are known.
  • the SPFS adopting the former method is referred to as prism coupling (PC) -SPFS, and the SPFS adopting the latter method is referred to as lattice coupling (GC) -SPFS.
  • PC prism coupling
  • GC lattice coupling
  • PC-SPFS prism coupling
  • GC-SPFS lattice coupling
  • the metal film causes SPR when irradiated with excitation light.
  • the type of metal constituting the metal film is not particularly limited as long as it is a metal capable of causing SPR.
  • metals constituting the metal film include gold, silver, copper, aluminum and alloys thereof.
  • the first binding substance can bind to exosomes and is immobilized on a metal membrane to capture exosomes in a sample.
  • the first binding substance is uniformly immobilized on a predetermined region (reaction field) on the metal film.
  • the type of the first binding substance immobilized on the metal membrane is not particularly limited as long as it can bind to the exosome, that is, it binds to the first binding determinant of the exosome.
  • binding agents include antibodies that can bind to exosomes, nucleic acids that can bind to exosomes, lipids that can bind to exosomes, lectins that can bind to exosomes, and other proteins that can bind to exosomes.
  • the binding determinant possessed by an exosome is a part of the exosome that the binding substance recognizes when it binds to the exosome.
  • the binding determinant is the antigenic determinant (epitope) of the antigen
  • the binding determinant is the binding site of the corresponding receptor.
  • the first binding determinant possessed by the exosome to which the first binding substance binds is not particularly limited, but a binding determinant known as an exosome marker or a binding determinant known as a marker for cells secreting exosomes is used. included. Binding determinants known as exosome markers include CD9, CD63, CD81, CD37, CD53, CD82, CD13, CD11, CD86, ICAM-1, Rab5, Annexin V, LAMP1 and the like. Antibodies to these binding determinants are commercially available, and the antibodies can be used as the first binding substance.
  • the first binding substance that binds to a binding determinant known as an exosome marker
  • a substance that reacts with the above substance for example, an antibody
  • an exosome marker binds only to the exosome, so that the exosome in the sample can be detected. It is valid.
  • Binding determinants known as markers for cells that secrete exosomes include caveolin-1, PSMA, EpCAM, Glypican-1, Survivin, CD91, Tspan8, CD147, and EGFR. , HER2, CD44, Galactin, Integrin and the like. Antibodies to these binding determinants are also commercially available, and the antibodies can be used as the first binding substance.
  • a binding substance for example, an antibody
  • a binding determinant that binds to a binding determinant known as a cell marker that secretes exosomes
  • it binds only to a specific cell and the exosome secreted from the cell, so that the sample It is effective in detecting exosomes derived from specific cells inside.
  • the antibody When the first binding substance is an antibody, the antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a fragment of the antibody. Further, the type of the first binding substance immobilized on the metal film may be one type or two or more types. For example, when the first binding substance immobilized on the metal membrane is an antibody, the antibody is one type or two or more types of monoclonal antibody or polyclonal antibody.
  • the first binding substance is preferably selected in consideration of the combination with the second binding substance described in relation to the fluorescent label.
  • the preferred combination of the first binding substance and the second binding substance will be described later.
  • the method for immobilizing the binding substance is not particularly limited.
  • a self-assembled monolayer hereinafter referred to as “SAM”
  • a polymer film to which a binding substance for example, an antibody
  • SAMs include membranes formed with substituted aliphatic thiols such as HOOC- (CH 2 ) 11-SH.
  • materials constituting the polymer membrane include polyethylene glycol and MPC polymer.
  • a polymer having a reactive group (or a functional group convertible into a reactive group) capable of binding to a binding substance (for example, an anti-exosome antibody) is immobilized on a metal film, and the binding substance (for example, an antibody) is attached to this polymer. May be combined.
  • the measuring chip is preferably a structure in which each piece has a length of several mm to several cm, but may be a smaller structure or a larger structure that is not included in the category of “chip”.
  • FIG. 2A is a schematic cross-sectional view for explaining the configuration of the measuring chip for PC-SPFS
  • FIG. 2B is a schematic cross-sectional view for explaining the configuration of the measuring chip for GC-SPFS.
  • the size and shape of each component in these figures is not accurate.
  • these figures show an example of using an anti-exosome antibody that recognizes an antigen on an exosome as a first binding substance.
  • the measuring chip 100 for PC-SPFS has a prism 110, a metal film 120, and an anti-exosome antibody (first binding substance) 130 (layer) that recognizes an antigen on an exosome.
  • the prism 110 is made of a dielectric material transparent to the excitation light L1, and includes an incident surface 111 on which the excitation light L1 is incident, a film forming surface 112 on which the excitation light L1 is reflected, and an exit surface 113 on which the reflected light L2 is emitted.
  • the shape of the prism 110 is not particularly limited. In the example shown in FIG. 2A, the shape of the prism 110 is a prism having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film forming surface 112, the surface corresponding to one leg is the incident surface 111, and the surface corresponding to the other leg is the exit surface 113.
  • materials for prism 110 include resin and glass.
  • the material of the prism 110 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 with respect to excitation light and a small birefringence.
  • the metal film 120 is arranged on the film forming surface 112 of the prism 110.
  • the method for forming the metal film 120 is not particularly limited. Examples of methods for forming the metal film 120 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 120 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • the measuring chip 200 for GC-SPFS is a layer of a metal film 210 on which a diffraction grating 211 is formed and an anti-exosome antibody (first binding substance) 130 (which recognizes an antigen on an exosome). ).
  • the method for forming the metal film 210 is not particularly limited. Examples of methods for forming the metal film 210 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 210 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 500 nm.
  • the shape of the diffraction grating 211 is not particularly limited as long as it can generate an evanescent wave.
  • the diffraction grating 211 may be a one-dimensional diffraction grating or a two-dimensional diffraction grating.
  • a one-dimensional diffraction grating a plurality of convex portions parallel to each other are formed at predetermined intervals on the surface of the metal film 210.
  • convex portions having a predetermined shape are periodically arranged on the surface of the metal film 210. Examples of convex arrangements include square grids, triangular (hexagonal) grids, and the like.
  • Examples of the cross-sectional shape of the diffraction grating 211 include a rectangular wave shape, a sinusoidal shape, and a sawtooth shape.
  • the method of forming the diffraction grating 211 is not particularly limited. For example, after forming the metal film 210 on a flat plate-shaped substrate (not shown), the metal film 210 may be given an uneven shape. Further, the metal film 210 may be formed on a substrate (not shown) to which a concave-convex shape is previously provided. With either method, the metal film 210 including the diffraction grating 211 can be formed.
  • the electric field enhanced by the SPR is generated by the metal film 210 (diffraction grating 211). It occurs in the vicinity of the grating 211).
  • FIG. 3A to 3C are schematic cross-sectional views showing an example of a measuring chip for PC-SPFS.
  • the measuring chip 300 is composed of a prism 110 having an incident surface 111, a film forming surface 112, and an emitting surface 113, a metal film 120 formed on the film forming surface 112 of the prism 110, and a prism 110. It has a flow path lid 310 arranged on the film surface 112 or the metal film 120.
  • the entrance surface 111 and the exit surface 113 are present in front of and behind the paper surface, respectively.
  • the measuring tip 300 also has a flow path 320, a liquid injection unit 330 connected to one end of the flow path 320, and a storage unit 340 connected to the other end of the flow path 320.
  • the flow path lid 310 is adhered to the metal film 120 (or prism 110) via an adhesive layer 350 such as double-sided tape, and the adhesive layer 350 serves to define the side surface shape of the flow path 320. Also responsible. Although omitted in FIG. 3, an anti-exosome antibody (first binding substance) that recognizes an antigen on an exosome is present in a part of the metal film 120 exposed in the flow path 320 (reaction field). 130 is fixed.
  • the liquid injection section 330 is closed by the liquid injection section covering film 331, and the storage section 340 is closed by the storage section covering film 341.
  • the storage portion covering film 341 is provided with a ventilation hole 342.
  • the flow path lid 310 is made of a material that is transparent to the fluorescent L3. However, a part of the flow path lid 310 may be made of a material opaque to the fluorescent L3 as long as it does not interfere with the removal of the fluorescent L3. Examples of materials that are transparent to fluorescent L3 include resins.
  • the flow path lid 310 may be joined to the metal film 120 (or prism 110) by laser welding, ultrasonic welding, crimping using a clamp member, or the like without using the adhesive layer 350. In this case, the side surface shape of the flow path 320 is defined by the flow path lid 310.
  • a pipette tip is inserted into the liquid injection unit 330.
  • the opening of the liquid injection portion 330 comes into contact with the outer periphery of the pipette tip without a gap. Therefore, the liquid can be introduced into the flow path 320 by injecting the liquid into the liquid injection section 330 from the pipette tip, and the liquid in the liquid injection section 330 is sucked into the pipette tip to enter the flow path 320. Liquid can be removed. Further, by alternately injecting and sucking the liquid, the liquid can be reciprocated in the flow path 320.
  • FIG. 3B and 3C are schematic views showing an example of a well-shaped measuring chip, respectively.
  • FIG. 3B is a schematic view of a well-shaped measuring chip 400 having a reaction detection unit on the bottom surface (see, for example, International Publication No. 2012/157403).
  • the dielectric member 412 is a hexahedron having a substantially trapezoidal cross section (square pyramid shape), and the well member 418 is formed in a square shape according to the shape of the dielectric member 412. Then, in a state where the first binding substance that binds to the exosome to be detected is fixed in the ligand fixing region 416 on the metal thin film 414 of the sensor structure 22, the sample solution containing the exosome is supplied into the through hole 420.
  • the sensor structure 422 is agitated.
  • FIG. 3C shows a well in which the reaction detection unit is on the side wall surface (see, for example, International Publication No. 2018/021238).
  • the detection tip 500 has a well body 510 and a side wall member 520.
  • the well body 510 has an accommodating portion (well) 511 inside the well body 510.
  • the accommodating portion 511 is a bottomed recess configured to accommodate the liquid, and is opened to the outside by a first opening 512 provided at the upper part and a second opening 513 provided at the side portion.
  • the side wall member 520 has a prism 521 as an optical element, a metal film 525, and a reaction field 526.
  • the prism 521 is an optical element made of a dielectric material transparent to excitation light, and has an incident surface (not shown), a reflecting surface 523, and an emitting surface (not shown).
  • the prism 521 also functions as a side wall constituting the accommodating portion 511.
  • the type of sample is not particularly limited as long as it contains exosomes.
  • specimens include blood (serum, plasma, whole blood, dilutions thereof), urine, sweat, saliva, breast milk, semen, lymph, cerebrospinal fluid, tears, and other body fluids, as well as saline. Includes diluent diluted with water or buffer.
  • whole blood can also be used as a sample. Therefore, from the viewpoint of availability and the like, serum, plasma, whole blood or a dilution thereof is preferable as a sample.
  • the sample may be an exosome extract prepared from a body fluid.
  • exosome extract prepared from a body fluid.
  • the method for extracting exosomes is not particularly limited, and conventionally known methods for extracting exosomes can be adopted.
  • exosomes can be extracted from body fluids by ultracentrifugation, immunoprecipitation or polymer precipitation.
  • the exosome recovered by the recovery method of the present invention can be used again as a sample.
  • a surfactant may be further added to the sample.
  • a surfactant By adding a surfactant, it is possible to prevent exosome aggregation and reduce background noise and variation in measured values.
  • the surfactant is preferably a surfactant widely used in the fields of biomedical science, and includes, for example, Tween 20, sodium deoxycholate, and Triton X-100.
  • Surfactants do not destroy exosomes, but may be used in concentrations that prevent their aggregation.
  • Tween 20 it can be used at a concentration of 0.001% to 5% or less, preferably 0.005% to 1% or less, and more preferably 0.010% to 0.05% or less.
  • sodium deoxycholate it is used at a concentration of 0.001% to 0.025% or less, preferably 0.002% to 0.020% or less, and more preferably 0.003% to 0.010% or less. can do.
  • Triton X-100 it is used at a concentration of 0.001% to 0.010% or less, preferably 0.002% to 0.007% or less, and more preferably 0.003% to 0.005% or less. can do.
  • Step 2 Primary reaction
  • the sample is provided on the metal film of the measurement chip, and the exosome contained in the sample is bound to the first binding substance immobilized on the metal film (primary reaction; step S20).
  • the method of providing the sample is not particularly limited.
  • a sample may be provided on a metal membrane using a pipette with a pipette tip attached to the tip.
  • the reaction time of the primary reaction is not particularly limited, but from the viewpoint of increasing the reaction efficiency between the exosome and the first binding substance, a longer reaction time is preferable, and usually 5 minutes or more and 180 minutes or less, preferably. It is 60 minutes or more and 150 minutes or less, more preferably 100 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the surface of the metal film is washed with a buffer solution or the like to remove components that are not bound to the first binding substance (washing; step S21). Further, after cleaning, the optical blank can be measured (measurement of the optical blank; step S22).
  • Step 3 Secondary reaction
  • a labeling reagent is provided on the metal membrane of the measurement chip, and the exosome bound to the binding substance is labeled with the fluorescent substance via the second binding substance that binds to the exosome.
  • the type of labeling reagent is not particularly limited as long as the exosome bound to the first binding substance can react with the second binding substance labeled with the fluorescent substance.
  • the labeling reagent is a fluorescent substance-labeled second binding substance that binds to the second binding determinant of the exosome (secondary reaction in FIG. 1 + fluorescent labeling; step S30).
  • the labeling reagent may be a second binding agent that binds to a second binding determinant of the exosome, and another fluorescently labeled second'that binds to a second binding substance that is bound to the exosome. Contains both binding substances.
  • the method of providing the labeling reagent is not particularly limited.
  • the labeling reagent may be provided on the metal membrane using a pipette with a pipette tip attached to the tip.
  • the surface of the metal membrane is washed with a buffer solution or the like to remove the second binding substance (or other binding substance) that is not bound to the exosome. (Washing; step S31).
  • the type of the second binding substance contained in the labeling reagent is not particularly limited as long as it can be labeled with a fluorescent substance and can bind to exosomes.
  • second binding agents include antibodies that can bind to exosomes, nucleic acids that can bind to exosomes, lipids that can bind to exosomes, lectins that can bind to exosomes, and other proteins that can bind to exosomes.
  • the second binding determinant possessed by the exosome to which the second binding substance binds is not particularly limited, but a binding determinant known as an exosome marker or a binding determinant known as a marker for cells secreting exosomes is used. included. Binding determinants known as exosome markers include CD9, CD63, CD81, CD37, CD53, CD82, CD13, CD11, CD86, ICAM-1, Rab5, Annexin V, LAMP1 and the like. Antibodies to these binding determinants are commercially available, and the antibodies can be used as a second binding substance.
  • a substance that reacts with the above substance for example, an antibody
  • a binding determinant known as an exosome marker
  • it binds only to the exosome, so that even if it is not an exosome on a metal film. Even if (cells, etc.) are bound, it is effective in detecting only exosomes.
  • Binding determinants known as markers for cells that secrete exosomes include caveolin-1, PSMA, EpCAM, Glypican-1, Survivin, CD91, Tspan8, CD147, and EGFR. , HER2, CD44, Galactin, Integrin and the like. Antibodies to these binding determinants are also commercially available, and the antibodies can be used as a second binding substance.
  • a binding substance eg, an antibody
  • a binding determinant binds to a binding determinant known as a marker for cells secreting exosomes
  • it binds only to a specific cell and the exosome secreted from the cell. It is effective in detecting only exosomes derived from specific cells from various exosomes bound on a metal membrane.
  • the antibody When the second binding substance is an antibody, the antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a fragment of the antibody.
  • the type of the second binding substance contained in the labeling reagent may be one type or two or more types.
  • fluorescently labeled anti-exosome antibodies are one or more anti-exosome monoclonal antibodies or anti-exosome polyclonal antibodies.
  • the fluorescent substance-labeled anti-exosome monoclonal antibody and anti-exosome polyclonal antibody may be different from one or more anti-exosome monoclonal antibodies immobilized on the metal membrane. preferable.
  • the type of the second binding substance contained in the labeling reagent may be the same as or different from the type of the first binding substance immobilized on the metal film.
  • the first binding substance and the second binding substance may both be antibodies, one may be an antibody, and the other may be a protein other than an antibody.
  • the first binding substance immobilized on the metal membrane and the second binding substance contained in the labeling reagent each bind to the binding determinant of the exosome, but the binding of the first binding substance It is preferable that the first binding determinant and the second binding determinant to which the second binding substance binds are different. Rather than competing for the same binding determinant, the first binding substance and the second binding substance bind to different binding determinants, thereby more reliably fixing the exosome to the metal membrane and labeling with the labeling substance. It becomes possible to do. Further, since the first binding determinant to which the first binding substance binds and the second binding determinant to which the second binding substance binds are different, it is detected from the sample based on the binding of the first binding substance. The exosomes to be measured can be further narrowed down based on the binding of the second binding substance.
  • the first binding substance and the second binding substance it is preferable that at least one of the first binding determinant and the second binding determinant is a binding determinant known as an exosome marker.
  • a binding substance that binds to a binding determinant known as an exosome marker only exosomes can be detected from the substance in the sample.
  • at least one of the first binding determinant and the second binding determinant is a binding determinant known as a marker for cells secreting exosomes. Exosomes derived from specific cells can be detected by using a binding substance that binds to a binding determinant known as a marker for cells that secrete exosomes.
  • one of the first binding substance and the second binding substance is bound to a binding determinant known as an exosome marker, and the other is bound to a binding determinant known as a marker for cells secreting exosomes. It is more preferable to combine them.
  • exosomes secreted by a specific cell can be specifically detected.
  • cancer cells are known to secrete exosomes different from normal cells, and by detecting exosomes derived from cancer cells in body fluids, exosomes can be used as cancer markers.
  • the second'binding substance contained in the labeling reagent is not particularly limited as long as it can be labeled with a fluorescent substance and can bind to the second binding substance.
  • binding substances include antibodies, nucleic acids, lipids, and proteins other than antibodies that can bind to antibodies, nucleic acids, lipids, lectins, other proteins, etc. used as the second binding substance.
  • the use of a combination of second and second'binding agents such that multiple second'binding agents bind to one second binding agent directly fluorescently labels the second binding agent. It is possible to improve the measurement sensitivity by binding more fluorescent substances to exosomes than when used in the above.
  • the second binding substance when it is difficult to directly label the second binding substance with a fluorescent substance, or when the binding property of the second binding substance to the exosome is changed, reduced or lost due to the fluorescent labeling, the second binding is also performed.
  • the substance can be used to label exosomes.
  • the type of fluorescent substance for labeling the second or second binding substance is not particularly limited as long as it can be used in SPFS.
  • fluorescent materials include cyanine dyes, Thermo Scientific Alexa Fluor® dyes, and Biotium CF dyes.
  • Alexa Fluor dyes and CF dyes have high quantum efficiency with respect to the wavelength of excitation light used in SPFS. Further, since the CF dye does not cause much fading at the time of fluorescence detection, it is possible to stably perform fluorescence detection.
  • the method for labeling the binding substance with a fluorescent substance is not particularly limited, and can be appropriately selected from known methods.
  • a fluorescent substance may be bound to an amino group or a sulfhydryl group of a binding substance (for example, an anti-exosome antibody).
  • the exosome was bound to the first binding substance immobilized on the metal film, and then the exosome was labeled with a fluorescent substance using a labeling reagent, but the first binding substance immobilized on the metal film was used.
  • the exosome may be labeled with a fluorescent substance using a labeling reagent before binding the exosome to the binding substance.
  • the sample and the labeling reagent may be mixed before the sample is provided on the metal film.
  • another fluorescently labeled (2') binding substance can be added to the mixture of the sample and the labeling reagent (second binding substance).
  • the step of binding the exosome to the binding substance immobilized on the metal film and the step of labeling the exosome with a fluorescent substance may be performed at the same time.
  • the sample and the labeling reagent second binding substance or second and second binding substance
  • Step 4 Fluorescence measurement
  • fluorescence indicating the amount of exosomes is measured by SPFS (step S40). Specifically, in a state where the exosome labeled with a fluorescent substance is bound to a binding substance immobilized on the metal film, the metal film is irradiated with excitation light so that SPR occurs on the metal film, thereby fluorescing. Measure the fluorescence emitted by the substance. Usually, the measured fluorescence value is subtracted from the pre-measured optical blank value to calculate the signal value that correlates with the amount of exosomes.
  • the signal value may be converted into the amount (number / ml) or concentration ( ⁇ g / ml) of exosomes by using a calibration curve prepared in advance. Further, as described later, the amount (number / ml) and concentration ( ⁇ g / ml) of exosomes in a sample can be estimated by using the method for analyzing exosomes of the present invention without preparing a calibration curve. can.
  • the excitation light L1 is applied to the metal film 120 via the prism 110.
  • SPR occurs in the metal film 120, and the fluorescent substance 150 existing in the vicinity of the metal film 120 is excited by the enhanced electric field to emit fluorescent L3.
  • the incident angle of the excitation light L1 with respect to the metal film 120 is set so that SPR occurs in the metal film 120, but is preferably a resonance angle or an enhancement angle.
  • the "resonance angle” means an incident angle when the amount of reflected light L2 is minimized when the incident angle of the excitation light L1 with respect to the metal film 120 is scanned.
  • the "enhanced angle” is scattered light having the same wavelength as the excitation light L1 emitted above the metal film 120 (opposite the prism 110) when the incident angle of the excitation light L1 with respect to the metal film 120 is scanned. It means the incident angle when the amount of light (Prismon scattered light) is maximized.
  • the excitation light L1 is directly applied to the metal film 210 (diffraction grating 211).
  • SPR occurs in the metal film 210 (diffraction grating 211), and the fluorescent substance 150 existing in the vicinity of the metal film 210 (diffraction grating 211) is excited by the enhanced electric field to emit fluorescent L3.
  • the angle of incidence of the excitation light L1 on the metal film 210 is set so that SPR is generated in the metal film 210, but the angle at which the intensity of the enhanced electric field formed by the SPR is the strongest is preferable.
  • the optimum incident angle of the excitation light L1 is appropriately set according to the pitch of the diffraction grating 211, the wavelength of the excitation light L1, the type of metal constituting the metal film 210, and the like.
  • the type of excitation light is not particularly limited, but is usually laser light.
  • the excitation light is a laser light emitted from a laser light source having an output of 10 ⁇ W to 30 mW.
  • the irradiation energy of the excitation light 7.5 ⁇ W / mm 2 or more 30 mW / mm 2 or less, preferably 8.5 ⁇ W / mm 2 or more 10 mW / mm 2 or less, 9.5 ⁇ W / mm 2 or more 5 mW / mm 2 or less Is more preferable.
  • the irradiation energy of the excitation light By setting the irradiation energy of the excitation light to 30 mW / mm 2 or less, the fluorescence intensity is increased, the signal-to-noise ratio (S / N) is increased, and a smaller amount of exosomes can be detected. Can be improved.
  • the wavelength of the excitation light is appropriately set according to the excitation wavelength of the fluorescent substance used. Further, when the amount of light exceeds 30 mW / mm 2 , the dissociation of the antigen-antibody reaction due to the heat of irradiation proceeds, so that the signal-to-noise ratio deteriorates.
  • the fluorescence detector is preferably installed in the direction in which the fluorescence intensity is highest with respect to the measuring chip.
  • the direction in which the intensity of the fluorescence L3 is highest is the normal direction of the metal film 120, so that the detector is a measuring chip. It will be installed directly above.
  • the measuring chip 200 for GC-SPFS when the measuring chip 200 for GC-SPFS is used, the direction in which the intensity of the fluorescence L3 is highest is a direction inclined to some extent with respect to the normal of the metal film 120, so that it can be detected.
  • the vessel is installed at a position not directly above the measuring chip.
  • the detector is, for example, a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD).
  • Step 5 Dissociation reaction
  • the exosome is dissociated from the first binding substance using the dissociation solution, and the exosome is released into the dissociation solution (step S50).
  • the step of dissociation can be performed by contacting the dissociated solution with the exosome to which the first and second (and second') binding substances are bound.
  • the dissociation liquid is not particularly limited as long as it is a liquid that loosens the bond between the first binding substance and the exosome and dissociates the exosome from the first binding substance. Therefore, in this step, the second binding substance may or may not dissociate from the exosome.
  • the type of dissociation solution differs depending on the type of the first binding substance, but examples thereof include acidic solutions, basic solutions, salt solutions, surfactant solutions, etc., which can easily dissociate and damage membrane proteins.
  • An acidic solution or a salt solution is preferable because the amount is small. Further, when the membrane protein is measured again on the recovered exosomes, a salt solution having less influence on the exosomes is more preferable.
  • Examples of the acidic substance contained in the acidic solution include glycine and citric acid, and glycine is preferable.
  • the pH of the acidic solution is 1.5 to 4.0, preferably 2.0 to 3.0. When the pH is 4.0 or less, sufficient dissociation between the binding substance and the exosome is possible.
  • the salt concentration of the salt solution is 0.1 M to 5.0 M, preferably around 1 M. When the salt concentration is 0.1 M or more, the binding substance and the exosome can be dissociated.
  • sample solution 1 of exosomes having an arbitrary concentration using a commercially available exosome or the like.
  • a solution (candidate solution) that is a candidate for the dissociation solution is added to the sample solution 1 and left under the same conditions as the dissociation conditions. Then, the same operation as the treatment for recovery (for example, dilution or neutralization) is performed, steps 1 to 4 of the recovery method of the present invention are carried out, and the exosome concentration 1 is measured using SPFS.
  • the method of providing the dissociation solution is not particularly limited.
  • the dissociation solution may be provided on the metal membrane using a pipette having a pipette tip attached to the tip.
  • the dissociation solution is introduced into the flow path 320 by injecting the dissociation solution into the liquid injection section 330 from the pipette tip, and the liquid is injected and sucked alternately to flow.
  • the dissociation liquid can be reciprocated in the path 320.
  • the time for contacting the dissociation solution with the exosome bound to the first binding substance varies depending on the type and concentration of the dissociation solution, the type of the first binding substance, etc., but is usually 0.5 minutes or more and 30 minutes or more. It is minutes or less, preferably 5 minutes or more and 15 minutes or less, and more preferably 10 minutes or more and 15 minutes or less. Depending on the conditions, if the contact time is 10 minutes or more, it is possible to dissociate the binding substance and the exosome at a sufficient level.
  • Step 6 Recovery of isolated exosomes
  • the dissociation solution containing the dissociated exosomes is collected and processed (step S60) to obtain isolated exosomes. Since exosomes are free in the dissociation solution, they are collected together with the dissociation solution.
  • the exosome-free dissociation solution can be recovered by sucking the dissociation solution in the liquid injection section 330 into the pipette tip.
  • the components of the dissociation fluid can damage the exosomes in the long term or interfere with further analysis of the exosomes, thus eliminating or suppressing the effect of the dissociation fluid on the exosomes on the recovered dissociation fluid. Perform the processing for.
  • the recovered dissociation solution is neutralized with a basic solution to suppress the effect of the acid on exosomes and subsequent analysis, and the pH is 6.0 to 8.0, preferably pH 7. It is set to 0.0 to 7.4.
  • the type of basic substance contained in the basic solution used for neutralization varies depending on the type of acidic substance contained in the dissociation solution, but usually includes NaOH, carbonic acid buffer, and the like.
  • the pH of the basic solution is usually pH 9.0 to 12.0, preferably 10.0 to 11.0. When the pH is 9.0 or more, the acidic substance in the dissociation solution can be neutralized, and if the neutralization is possible, there is no problem due to the high pH.
  • the dissociation solution is a salt solution, dilute the recovered dissociation solution to suppress the effects of salts on exosomes and subsequent analysis.
  • the diluent used for dilution is not particularly limited as long as it is a solution capable of suppressing the influence of the salt substance in the dissociation solution without damaging the exosomes, but does not affect further analysis that can be performed thereafter. Is preferable.
  • Examples of the diluent include water, physiological saline, buffer and the like, and examples of the buffer include PBS and TBS.
  • the diluent is mixed with the recovered dissociation solution.
  • the dilution rate at this time can be determined according to the salt concentration of the dissociation solution, but is usually 2 to 10 times, preferably 3 to 6 times, and more preferably 5 times. If the dilution rate is 2 times or more, the influence of the salt substance in the dissociation solution can be suppressed.
  • the dilution rate can also be determined according to the concentration of recovered exosomes, the sensitivity of the analysis that can be performed next, and the like.
  • the neutralized or diluted dissociation solution can be used as an isolated exosome solution.
  • a second (and second') binding substance is bound to the isolated exosome, it may be subjected to the next analysis as it is, or the second (and second') binding substance may be used from the exosome. It may be dissociated and removed before being subjected to the next analysis.
  • the second (and second') binding substance is also dissociated from the exosome in the above dissociation step, the exosome and the second (and second') binding substance are released in the dissociation solution. Therefore, if desired, the liberated second (and second') binding material can be removed from the dissociation solution. In either case, the dissociation and removal of the second (and second') binding material can be performed either after step 5 (dissociation reaction) or after step 6 (recovery of isolated exosomes). can.
  • the method for dissociating and / or removing the second (and second') binding substance is not particularly limited as long as it can dissociate the exosome, and the type of the second (and second') binding substance.
  • a known method according to the above can be used.
  • a method for dissociating the second (and second') binding substance from the exosome a method using a dissociation solution and the like can be mentioned.
  • the method for removing the liberated second (and second') binding substance include a method using ultrafiltration, dialysis, an affinity column and the like.
  • the dissociation reaction of step 5 and the isolated exosome of step 6 are performed without carrying out the secondary reaction of step 3 and the fluorescence measurement of step 4 after the primary reaction of step 2.
  • the exosomes that are not labeled with binding substances and fluorescent labels may be recovered by carrying out the recovery of the exosomes.
  • the method for analyzing exosomes includes the steps of obtaining isolated exosomes (that is, carrying out steps 1 to 6 above) by the method for recovering exosomes of the present invention described above, and the membrane proteins of isolated exosomes and /. Alternatively, it comprises the step of analyzing the inclusions.
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of an exosome analysis method according to the present embodiment. As shown in FIG. 4, exosome analysis (step S70) can be carried out following the exosome recovery method (steps S10 to S60). Hereinafter, a method for analyzing the recovered isolated exosomes (step S70) will be described.
  • the recovered exosome membrane proteins can be analyzed under yet another condition or method.
  • the method for analyzing the membrane protein of the exosome is not particularly limited, but it is preferable to analyze the membrane protein of the isolated exosome by the SPFS method using a third binding substance that binds to a cell-specific marker or a disease marker.
  • the SPFS method means the implementation of steps 1 to 4 of the method for recovering exosomes of the present invention. Therefore, the details of the steps are the same as those of the above steps 1 to 4.
  • the sample can be diluted automatically in the SPFS device, and since a hydrophilic polymer is used, it is not easily affected by impurities and the recovery rate is stable.
  • because of its high sensitivity and wide dynamic range even if the concentration of recovered exosomes is low, it can be measured without concentration and there are few impurities.
  • the other binding substance is a substance that can bind to the exosome and is different from the first and second (and second') binding substances used for the recovery of the exosome.
  • exosomes having a certain membrane protein are recovered using the first and second (and second') binding substances, and another membrane protein is further obtained using the third binding substance. To detect.
  • Such a method enables the development of a new marker with improved disease specificity.
  • labeled antibodies having different wavelengths are not reacted at the same time, so that there is no risk of performance deterioration such as an increase in blanks due to the cross-reactivity of the antibodies.
  • the third binding substance examples include antibodies that can bind to exosomes, nucleic acids that can bind to exosomes, lipids that can bind to exosomes, lectins that can bind to exosomes, and other proteins that can bind to exosomes.
  • Caveolin-1, PSMA, EpCAM, Glypican-1, Survivin, CD91, Tspan8, CD147, EGFR, HER2 are examples of binding determinants to which the third binding substance binds. , CD44, Galactin, Integrin and the like. Antibodies to these binding determinants are commercially available, and the antibodies can be used as a third binding substance.
  • the third binding substance is an antibody
  • the antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a fragment of the antibody.
  • the third binding agent should be used as at least one of the first binding agent anchored on the metal membrane and the second binding agent with a fluorescent label. Can be done.
  • the other binding substance used together with the third binding substance is not particularly limited, and may be the same as or different from the first and second binding substances used for the recovery of exosomes.
  • nucleic acids such as DNA, mRNA, and miRNA, and proteins are known as inclusions of exosomes.
  • exosome-encapsulating nucleic acids especially miRNA, have been studied for their relationship with diseases and are expected as new disease markers.
  • the eluate is not particularly limited as long as it can destroy the phospholipid membrane of the exosome without damaging the target inclusions, and a surfactant or the like can be used.
  • a surfactant widely used in the fields of biomedicine is preferable, and examples thereof include Tween 20, sodium deoxycholate, and Triton X-100.
  • Triton X-100 can be used at a concentration of 0.1% to 10%, preferably 0.5% to 5%, and more preferably 1% to 3%.
  • the time for contacting the eluate with the exosome is not particularly limited, and is usually 0.5 to 30 minutes, preferably 3 to 10 minutes. If it is 0.5 minutes or more, the exosome membrane is sufficiently dissolved.
  • the eluted inclusions are analyzed by a known method.
  • the target inclusion is a protein
  • immunoassay is performed as it is, purification is performed by a known protein purification method to determine the amino acid sequence, molecular weight is examined by SDS-PAGE, etc., and the presence of a specific amino acid sequence is blotted. It can be analyzed by law.
  • the target inclusion is nucleic acid, it can be analyzed by a known method. For example, a method of amplifying a target nucleic acid by PCR and determining a base sequence by a sequencer, or a method of determining a base sequence by next-generation sequencing can be mentioned.
  • the analysis of the membrane protein of the isolated exosome and the analysis of the inclusions may be performed by either one, but both can also be performed.
  • the exosome recovery method of the present invention can be carried out again to recover the exosome, and the inclusions of the recovered exosome can be analyzed.
  • sample analysis method analysis method using fluorescence measurement results and recovery results of the same measurement sample
  • the sample analysis method includes the following steps.
  • Step of confirming the presence of exosomes in the sample using the measurement sample 1 A step of collecting exosomes in a sample from measurement sample 2 to obtain isolated exosomes, and a step of analyzing membrane proteins and / or inclusions of isolated exosomes.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a sample analysis method according to the present embodiment. As shown in FIG. 5, steps S20 to S40 can be carried out on the measurement sample 1, and steps S20'and steps S50 to S70, which are the same as the above steps S20, can be carried out on the measurement sample 2. In principle, each step is the same as the corresponding step of the exosome recovery method and the exosome analysis method of the present invention.
  • the method for analyzing a sample of the present invention at least two identical measurement samples are prepared from the sample.
  • the number of measurement samples is not particularly limited, but at least two measurement samples, one for confirmation of exosomes and the other for recovery of exosomes, are sufficient.
  • the method for preparing the measurement sample is not particularly limited, and the sample itself or the sample subjected to pretreatment such as dilution may be dispensed.
  • the same measurement sample means that the amount of exosomes to be collected varies between the measurement samples by 10% or less.
  • the step of preparing the measuring chip corresponds to step 1 of the method for recovering exosomes of the present invention described above. Therefore, for details of this step, refer to the method for recovering exosomes of the present invention.
  • this step at least two measuring chips, one for use in the step of confirming the presence of exosomes and the other for use in the step of obtaining isolated exosomes, are prepared.
  • the measuring chip prepared here is a chip to which the same first binding substance is bound.
  • the step of confirming the exosome in the sample includes the following steps.
  • the metal film is irradiated with excitation light so that surface plasmon resonance occurs on the metal film, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance is detected.
  • the step of recovering exosomes includes the following steps. A step of providing the measurement sample 2 on the metal film of the other measurement chip and binding the exosome contained in the measurement sample 2 to the first binding substance, The step of dissociating exosomes from the first binding substance using a dissociation solution, and A step of collecting and processing a dissociation solution containing dissociated exosomes to obtain isolated exosomes.
  • the above steps correspond to steps 2, 5 and 6, respectively, of the method for recovering exosomes of the present invention described above. Therefore, for details of each step, refer to the method for recovering exosomes of the present invention.
  • the measurement chip used in this step is a measurement chip in which the same binding substance as the step of confirming the presence of exosomes in the sample is fixed on the metal film, and the step of confirming the presence of exosomes using the measurement sample 1 and the step of confirming the presence of exosomes.
  • the step of obtaining an isolated exosome using the measurement sample 2 is the same reaction step except for the presence or absence of a step of performing a secondary reaction.
  • the membrane protein and / or inclusions of the isolated exosome can be analyzed in the same manner as the method for analyzing the exosome of the present invention, and the measurement result of the measurement sample 1 and the measurement sample 2 can be analyzed. By using the recovery result of, a new analysis becomes possible.
  • data on the membrane protein and / or inclusions of isolated exosomes obtained in the step of analysis and data such as the abundance of exosomes obtained in the step of confirming exosomes are used. It can be used to analyze exosomes contained in a sample in detail.
  • a step of preparing more than 2 measurement samples and confirming exosomes in the sample using a plurality of binding substances that bind to different binding determinants is performed multiple times. Alternatively, multiple types of exosomes having different binding determinants can be recovered individually.
  • an optical blank is measured after the exosomes are bound to the first binding substance (first reaction, that is, after step 2). do.
  • the signal is measured after binding the second binding substance to which the fluorescent substance is bound to the exosome bound to the first binding substance (secondary reaction, that is, after step 3) (measurement here). It was the signal values and S 1).
  • Further exosomes were recovered by dissociating the first binding substance, the signal of the state of only the first binding substance is measured (the signal values measured here and S 2).
  • the amount of unreacted exosomes in the sample collected after the primary reaction is determined.
  • Total exosomes amount calculated from [Delta] S 1 and the unreacted exosomes amount is the total exosomes amount that was present in the sample prior to measurement.
  • the ratio of the amount of exosomes obtained from ⁇ S 1 to the total amount of exosomes is the reaction rate of the primary reaction.
  • Exosomes amount / total exosomes amount calculated from the reaction rate [Delta] S 1 of the primary reaction
  • the value obtained by multiplying the reaction rate of the primary reaction by the dissociation rate is the recovery rate with respect to the total amount of exosomes in the sample.
  • Recovery rate reaction rate of primary reaction x dissociation rate
  • exosome recovery rate fluctuates greatly due to the influence of impurities in the sample.
  • a sample is diluted and used to avoid the effects of contaminants, it may be necessary to concentrate the extracted exosomes in order to determine the recovery rate of exosomes.
  • ultrafiltration or the like is performed to concentrate exosomes, the adsorption of exosomes on a filter or the like may cause a deviation from the actual recovery rate.
  • the exosome recovery method of the present invention is based on SPFS, the dissociation rate can be calculated by performing signal measurement twice. Further, since the recovery rate and the recovery amount can be calculated with good reproducibility by separately calculating the reaction rate, it is not necessary to perform ultrafiltration and the like, and loss of exosomes can be prevented.
  • samples 1a, 1b and 1c for measurement are prepared from one sample.
  • the samples 1a, 1b and 1c are regarded as the same.
  • sample 1a binding substance A that binds to any type of exosome is used as the first binding substance, and steps 1 to 4 of the method of the present invention are carried out to obtain sample 1a. obtaining a signal value S a. Then pull the optical blank from a signal value S a, and calculates the [Delta] S a is a signal value correlating to the total amount of exosomes in a sample 1a. In this experiment, the total amount of exosomes in the sample is estimated.
  • Example 2 For sample 1b, a binding substance B that binds only to a specific exosome having a specific membrane protein was used as the first binding substance, and steps 1 to 4 of the method of the present invention were carried out. obtaining a signal value S b of samples 1b. Next, an optical blank is subtracted from the signal value S b to calculate ⁇ S b , which is a signal value that correlates with the amount of exosomes having a specific membrane protein in sample 1b. In this experiment, the total amount of binding determinant B-positive exosomes to which binding substance B binds is estimated.
  • the binding substance B is used as the first binding substance, and steps 1 and 2 of the method of the present invention are carried out to obtain an exosome having a specific membrane protein in sample 1c. It binds to the binding substance B on the metal film. Steps 5 and 6 of the method of the invention are performed without measuring the signal of bound exosomes, and unlabeled, specific membrane protein-bearing exosomes are harvested as sample 2. In this experiment, binding determinant B-positive exosomes are recovered.
  • the binding substance B is used as the first binding substance, and steps 1 to 4 of the method of the present invention are carried out to obtain the signal value S d of the sample 2a.
  • an optical blank is subtracted from the signal value S d to calculate ⁇ S d , which is a signal value that correlates with the amount of exosomes having a specific membrane protein in sample 2a.
  • ⁇ S d is a signal value that correlates with the amount of exosomes having a specific membrane protein in sample 2a.
  • Exosomes include membrane proteins that exist regardless of their type and specific membrane proteins that exist only in specific exosomes (for example, disease-derived exosomes).
  • the amount of exosomes having a specific membrane protein present in the sample can be measured only by the SPFS method. Further, the above series of operations and calculations can be automated by the SPFS apparatus. Since the presence of exosomes having specific membrane proteins can be disease markers, the above method is considered to lead to the development of new disease markers and diagnostic methods.
  • SPFS is used to suppress contamination with contaminants, as compared with the conventional detection method. It is possible to recover intact exosomes with a high recovery rate. Furthermore, the recovered exosome membrane proteins and / or inclusions can be analyzed with good reproducibility.
  • Reference example 1 Preparation of calibration curve Prepare the measurement chip shown in Fig. 3A, and anti-CD9 monoclonal as the first binding substance in a specific region (reaction part) of the metal film (gold thin film) exposed in the flow path.
  • the antibody was immobilized.
  • standard exosomes (lyophilized) derived from LNCaP cells purchased from Cosmo Bio Co., Ltd. were hydrated and used.
  • PBS containing 1% BSA was used for dilution.
  • the sample diluent used in the SPFS apparatus contained Tween 20 as a surfactant, and the concentration of the surfactant was 0.05%.
  • Samples with different dilution rates were prepared, and the number of exosomes in the sample was measured for each sample.
  • a qNano / nanoparticle multi-analyzer manufactured by Meiwaforsis Co., Ltd. was used for the measurement.
  • the signal value that correlates with the amount of exosomes was measured by SPFS.
  • a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was sent back and forth (primary reaction).
  • the reaction time of the primary reaction was 100 minutes.
  • a labeling reagent anti-CD63 monoclonal antibody labeled with Alexa Fluor dye
  • the reaction time of the secondary reaction was 10 minutes.
  • the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • the measuring liquid was introduced into the flow path from the liquid injection part.
  • the fluorescence value was measured by SPFS. That is, the metal film was irradiated with the excitation light (laser light) from the prism side so that the incident angle of the excitation light on the metal film became the enhancement angle, and the fluorescence emitted at that time was detected.
  • the output of the excitation light used for the detection was 5 mW, and the amount of irradiation energy was 3.8 mW / mm 2 .
  • a pre-measured optical blank value was subtracted from the obtained fluorescence value to calculate a signal value that correlates with the amount of exosomes.
  • the same measurement was performed 6 times for each sample, and a calibration curve was prepared together with the measurement result by qNano.
  • the prepared calibration curve is shown in Fig. 6.
  • a measurement chip is prepared, and an anti-CD9 monoclonal antibody is fixed as a first binding substance in a specific region (reaction part) of a metal film (gold thin film) exposed in the flow path.
  • the prepared product was prepared for SPFS measurement.
  • a sample sample a hydrated standard exosome (lyophilized product) derived from LNCaP cells purchased from Cosmo Bio Co., Ltd. (hydrated, but the lyophilized product is prepared with PBS, so it is a buffer system. (Hereinafter referred to as "buffer system”), or healthy human plasma was prepared.
  • PBS containing 1% BSA was used for dilution.
  • the sample diluent used in the SPFS apparatus contained Tween 20 as a surfactant, and the concentration of the surfactant was 0.05%.
  • the signal value that correlates with the amount of exosomes was measured by SPFS.
  • a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was sent back and forth (primary reaction).
  • the reaction time of the primary reaction was 100 minutes.
  • the sample in the flow path was collected from the liquid injection section and discharged into an empty well of the cartridge, and then the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • a labeling reagent anti-CD63 monoclonal antibody labeled with Alexa Fluor dye
  • the reaction time of the secondary reaction was 10 minutes.
  • the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • the measuring liquid was introduced into the flow path from the liquid injection part.
  • the fluorescence value was measured by SPFS. That is, the metal film was irradiated with the excitation light (laser light) from the prism side so that the incident angle of the excitation light on the metal film became the enhancement angle, and the fluorescence emitted at that time was detected.
  • the output of the excitation light used for the detection was 5 mW, and the amount of irradiation energy was 3.8 mW / mm 2 .
  • the optical blank value measured in advance was subtracted from the obtained fluorescence value to calculate the signal value ⁇ S 1 that correlates with the amount of exosomes.
  • the dissociation rate ( ⁇ S 2- ⁇ S 1 ) / ⁇ S 1 was calculated.
  • the signal amount corresponding to the dissociated and recovered exosome amount was calculated by subtracting the signal amount corresponding to the exosome amount remaining in the reaction field after dissociation from the signal corresponding to the reacted exosome amount. ..
  • the dissociation rate was calculated from the ratio to the amount of signal that correlates with the amount of reacted exosomes.
  • exosomes should be recovered both when the sample is a standard exosome derived from LNCaP cells (Tables 1 and 3) and when the sample is healthy human plasma (Tables 2 and 4).
  • the dissociation solution the acidic solution (Tables 1 and 2) had a higher dissociation rate than the salt solution (Tables 3 and 4), and therefore the recovery rate was also higher.
  • a measurement chip in which an anti-CD9 monoclonal antibody was immobilized as a first binding substance in a specific region (reaction part) of a metal film (gold thin film) exposed in the flow path was prepared for SPSF measurement.
  • the sample diluent used in the SPFS apparatus contained Tween 20 as a surfactant, and the concentration of the surfactant was 0.05%.
  • the signal measurement of the above measurement sample was carried out in the same manner as in Example 1. Specifically, a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was reciprocally sent (primary reaction). The reaction time of the primary reaction was 100 minutes. Then, the inside of the flow path was washed once with a washing liquid. Next, a labeling reagent (an anti-CD63 monoclonal antibody labeled with Alexa Fluor dye was introduced into the flow path from the liquid injection section and reciprocated (secondary reaction). The reaction time of the secondary reaction was 10 minutes. After removing the labeling reagent in the flow path from the liquid injection section, the inside of the flow path was washed once with a cleaning solution.
  • the measurement solution was introduced into the flow path from the liquid injection section.
  • fluorescence was performed by SPFS.
  • the value was measured. That is, the metal film was irradiated with the excitation light (laser light) from the prism side so that the incident angle of the excitation light on the metal film became the enhancement angle, and the fluorescence emitted at that time was detected.
  • the output of the excitation light used in was 5 mW, and the irradiation energy amount was 3.8 mW / mm 2.
  • the optical blank value measured in advance was subtracted from the obtained fluorescence value, and the signal value correlated with the amount of exosomes.
  • ⁇ S 3 was calculated. Further, the recovery rate of the exosome was calculated in the same manner as in Example 1 and shown in Table 5 below. In the table below, ⁇ S 3 is a numerical value in consideration of the dilution rate.
  • Example 1 When the exosomes recovered in Example 1 were recovered again, a signal value correlating with the amount of exosomes obtained in Example 1 was obtained.
  • Example 1 Measurement of recovered exosome-derived miRNA after signal measurement
  • recovered exosomes were diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA using a 1M NaCl aqueous solution as a dissociation solution, and used as a sample for the following measurement. ..
  • miR-21 contained in exosomes was amplified by RT-PCR (using Applied Biosystem STEPONE Real-time PCR System), and miR-21 was detected under the condition of Ct value of 30.
  • Two measurement chips were prepared, and an anti-CD9 monoclonal antibody was immobilized as a first binding substance in a specific region (reaction part) of a metal film (gold thin film) exposed in each flow path. Prepared for SPFS measurement (measurement chips 1 and 2).
  • the exosome contained in the measurement sample 2 was bound to the measurement chip 2. Specifically, a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was reciprocally sent (primary reaction). The reaction time of the primary reaction was 100 minutes. The sample in the flow path was collected from the liquid injection section and discharged into an empty well of the cartridge, and then the inside of the flow path was washed once with a washing liquid. Next, after removing the cleaning liquid in the flow path from the liquid injection section, 60 ⁇ l of a 1M NaCl aqueous solution was introduced into the flow path from the liquid injection section as a dissociation solution and reciprocated (dissociation reaction). The reaction time of the dissociation reaction was 10 minutes. The dissociated liquid in the flow path was collected from the liquid injection part, discharged into an empty well of the cartridge, and exosomes were collected.
  • the signal corresponding to exosomes was measured in the same manner as in Example 2 to obtain ⁇ S2. Furthermore, exosomes were recovered again using a dissociation reaction, the concentration and number of exosomes were confirmed, and the recovery rate with respect to the initial amount of exosomes was calculated. The results are shown in Table 6. In the table below, the signal values are numerical values in consideration of the dilution rate.
  • Example 4 Measurement of recovered unlabeled exosome-derived miRNA
  • the exosome recovered in Example 4 was diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA using a 1M NaCl aqueous solution as a dissociation solution to prepare a sample for the following measurement.
  • miR-21 contained in exosomes was amplified by RT-PCR (using Applied Biosystem STEPONE Real-time PCR System), and miR-21 was detected under the condition of Ct value of 30.
  • sample sample a hydrated standard exosome (lyophilized product) derived from LNCaP cells purchased from Cosmo Bio Co., Ltd. (buffer system) was used as the sample sample. PBS containing 1% BSA was used for dilution.
  • the sample diluent in the SPFS apparatus contained Tween 20 as a surfactant, and the concentration of the surfactant was 0.05%. Samples 1 and 2 for measurement were obtained from the obtained sample samples.
  • the exosome contained in the sample was bound to the measurement chip 2.
  • a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was sent back and forth (primary reaction).
  • the reaction time of the primary reaction was 100 minutes.
  • the sample in the flow path was collected from the liquid injection section and discharged into an empty well of the cartridge, and then the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • a 1M NaCl aqueous solution was introduced into the flow path from the liquid injection section as a dissociation solution and reciprocated (dissociation reaction).
  • the reaction time of the dissociation reaction was 10 minutes.
  • the dissociated solution in the flow path was collected from the liquid injection section and discharged into an empty well of the cartridge, and unlabeled HER2-positive exosomes were collected.
  • the exosomes recovered by the dissociation reaction were diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA, and this was used as a measurement sample.
  • a measurement chip was prepared, and an anti-PSMA monoclonal antibody was immobilized as a first binding substance in a specific region (reaction part) of a metal film (gold thin film) exposed in the flow path.
  • the signal measurement of the above measurement sample was carried out.
  • the sample diluent in the SPFS apparatus contained a surfactant, and the concentration of the surfactant was 0.05%.
  • Example 7 the measurement was carried out in the same procedure as in Example 1 to obtain ⁇ S1.
  • concentration of PSMA-positive exosomes was confirmed based on the calibration curve and liquid volume prepared in Reference Example 1.
  • the number of exosomes having both HER2 and PSMA on the membrane of one exosome was calculated.
  • Table 7 the signal values are numerical values in consideration of the dilution rate.
  • the dissociation solution was a 1M NaCl aqueous solution, it was further diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA, and this was used as measurement sample 1.
  • the dissociation solution was Glycine 2.0, it was neutralized to pH 7.4 with a 1 mM NaOH aqueous solution (pH 10.7), and this was used as measurement sample 2.
  • the samples adjusted to the same dilution ratios with PBS containing 1% BSA instead of the dissociation solution were designated as control sample 1'and control sample 2'.
  • a measurement chip is prepared, and an anti-CD9 monoclonal antibody is immobilized as a first binding substance in a specific region (reaction part) of a metal film (gold thin film) exposed in the flow path for SPSF measurement.
  • the signal value correlating with the amount of exosomes was measured by SPFS.
  • a sample sample was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the liquid was reciprocally sent (primary reaction). The reaction time of the primary reaction was 100 minutes. After removing the sample in the flow path from the liquid injection part, the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • a labeling reagent an anti-CD63 monoclonal antibody labeled with Alexa Fluor dye was introduced into the flow path from the liquid injection section and reciprocally sent (secondary reaction).
  • the reaction time of the secondary reaction was 10 minutes.
  • the inside of the flow path was washed once with a cleaning solution.
  • the cleaning solution was introduced into the flow path from the liquid injection section.
  • the fluorescence value was measured by SPFS. That is, the metal film was irradiated with the excitation light (laser light) from the prism side so that the incident angle of the excitation light on the metal film became the enhancement angle, and the fluorescence emitted at that time was detected.
  • the output of the excitation light used was 5 mW, and the irradiation energy amount was 3.8 mW / mm 2.
  • the optical blank value measured in advance was subtracted from the obtained fluorescence value, and the signal value correlated with the amount of exosome was obtained. Calculated.
  • the result of the measurement sample 1 was compared with the result of the control sample 1', and the damage of the dissociation solution to the membrane protein was estimated from the amount of change in the signal.
  • the result of the measurement sample 2 was compared with the result of the control sample 2', and the damage of the dissociation solution to the membrane protein was estimated from the amount of change in the signal.
  • Tables 8 and 9. In the table below, the results were compared at the same dilution rate.
  • the signal value that correlates with the total amount of exosomes including all exosomes other than the PSMA-positive exosome was measured by SPFS.
  • the measurement sample 1 diluted with a diluted solution containing calcium chloride was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip, and the solution was reciprocally sent (primary reaction).
  • the reaction time of the primary reaction was 100 minutes. After removing the sample in the flow path from the liquid injection part, the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • a labeling reagent an anti-CD9 monoclonal antibody labeled with Alexa Fluor dye was introduced into the flow path from the liquid injection section and reciprocally sent (secondary reaction).
  • the reaction time of the secondary reaction was 10 minutes.
  • the inside of the flow path was washed once with a cleaning solution.
  • the measurement solution was introduced into the flow path from the liquid injection section. In this state, fluorescence was performed by SPFS. The value was measured.
  • the metal film was irradiated with the excitation light (laser light) from the prism side so that the incident angle of the excitation light on the metal film became the enhancement angle, and the fluorescence emitted at that time was detected.
  • the output of the excitation light used in was 5 mW, and the irradiation energy amount was 3.8 mW / mm 2.
  • the optical blank value measured in advance was subtracted from the obtained fluorescence value, and Tim4 / which correlates with the amount of exosomes.
  • ⁇ S a which is a signal value derived from CD9, was calculated.
  • Example 2 A PSMA-positive exosome sample 1b was measured in the same manner as above using a measuring chip on which an anti-PSMA monoclonal antibody was immobilized as a first binding substance, and a signal value derived from PSMA / CD9 that correlates with the amount of PSMA-positive exosomes. ⁇ S b was measured.
  • Example 3 A PSMA-positive exosome sample 1c was sent to a measurement chip on which an anti-PSMA monoclonal antibody was immobilized as a first binding substance, and only PSMA-positive exosomes were reacted with the measurement chip. Specifically, the sample 3 was introduced into the flow path from the liquid injection part by a pipette tip and reciprocated to send the liquid (primary reaction). The reaction time of the primary reaction was 100 minutes. After removing the sample in the flow path from the liquid injection part, the inside of the flow path was washed once with a washing liquid.
  • the sample recovered by the dissociation reaction was diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA, and this was used as measurement sample 2.
  • Measurement samples 2a and 2b were prepared from measurement sample 2. The measurement samples 2a and 2b are regarded as the same.
  • the signal value ⁇ S e derived from Tim4 / CD9 correlates with the amount of PSMA-positive exosomes present in the measurement sample 1 containing the original PSMA-positive exosomes.
  • the purity of the sample obtained in this example was 40%.
  • the amount of exosomes having a specific membrane protein present in the sample could be estimated only by the SPSF method without preparing a calibration curve. It was also revealed that the purity of commercially available exosomes is not high.
  • the exosome recovery method according to the present embodiment it is possible to recover intact exosomes with a higher recovery rate than the conventional method while suppressing contamination with contaminants.
  • the exosome analysis method and the sample analysis method according to still another embodiment the exosome membrane protein and / or inclusions can be analyzed with high sensitivity and easily from a small amount of sample. Therefore, the method for recovering exosomes and the method for analyzing exosomes according to the present invention are useful for the development of new disease markers and diagnostic kits.

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Abstract

本発明は、夾雑物の混入を抑制しながら、高い回収率でインタクトな、特定の膜タンパク質を有するエクソソームを回収するための方法、エクソソームの膜タンパク質及び／又は内包物を高感度且つ簡便に分析するための方法、並びに検体の分析方法を提供する。当該回収方法では、金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１結合物質を含む測定チップを準備し、金属膜上にエクソソームを含む検体を提供して、検体に含まれるエクソソームを第１結合物質に結合させ、エクソソームに結合する第２結合物質を介してエクソソームを蛍光物質で標識し、金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように金属膜に励起光を照射して、蛍光物質から放出される蛍光を検出し、解離液を用いてエクソソームを第１結合物質から解離させ、解離したエクソソームを含む解離液を処理して、単離エクソソームを得る。

Description

エクソソームの回収方法、エクソソームの分析方法および検体の分析方法
　本発明は、エクソソームの回収方法、エクソソームの分析方法および検体の分析方法に関する。
　エクソソームは、細胞により産生されて細胞外に放出される、直径４０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。エクソソームは、リン脂質二重膜で覆われており、膜タンパク質や、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の核酸といった多様な細胞成分を含む。細胞の種類や状態によって異なるエクソソームが細胞から放出されることから、エクソソームは細胞間や臓器間のコミュニケーションを仲介すると考えられている。
　近年、癌や感染症といった様々な疾患の診断マーカーとして、血液や唾液といった体液中に分泌されたエクソソームが着目されている。例えば、特許文献１には、腫瘍マーカーとなるエクソソームを検出するための分析方法、分析試薬および分析装置が開示されている。この方法では、エクソソームが有する抗原に対する抗体と、エクソソームを分泌する細胞が有する抗原に対する抗体とを使用し、アビジン－ビオチン相互作用に基づき、エクソソームを検出している。また、特許文献２には、凹凸構造を有する合性樹脂などからなるベース部の凹部にエクソソームに対する抗体を固定し、凹部にエクソソームを捕捉する、エクソソーム分析用デバイスおよびエクソソームの捕捉方法が開示されている。
国際公開第２０１３／０９４３０７号 特開２０１４－２１９３８４号公報
　上記のとおり、これまでに様々なエクソソームの検出方法が開発されてきたが、従来の方法で検出したエクソソームを回収し、さらなる分析を行うことは難しかった。具体的には、エクソソームの回収率が非常に低い、回収してもさらなる分析の感度に影響するほどの量の夾雑物が混在する、回収の過程でエクソソームが損傷されるといった問題が知られている。そこで、夾雑物の混入を抑制しながら高い回収率でインタクトな状態のエクソソームを回収するための方法が求められている。
　本発明は、夾雑物の混入を抑制しながら、従来の検出方法よりも高い回収率でインタクトなエクソソームを回収することができる、エクソソームの回収方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、回収したエクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析することができる、エクソソームの分析方法および検体の分析方法を提供することを目的とする。
　本発明の一実施形態に係るエクソソームの回収方法は、金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程と、前記金属膜上にエクソソームを含む検体を提供して、前記検体に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、解離液を用いて、前記エクソソームを前記第１の結合物質から解離させる工程と、解離した前記エクソソームを含む解離液を回収して処理し、単離エクソソームを得る工程と、を含む。
　本発明の一実施形態に係るエクソソームの分析方法は、上述したエクソソームの回収方法によって単離エクソソームを得る工程と、前記単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程と、を含む。
　本発明の一実施形態に係る検体の分析方法は、エクソソームを含み得る検体から２以上の同一の測定サンプルを調製し、少なくとも測定サンプル１および測定サンプル２を得る工程と、金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを少なくとも２つ準備する工程と、前記測定サンプル１を用いて、前記検体中のエクソソームを確認する工程と、前記測定サンプル２から前記検体中のエクソソームを回収して、単離エクソソームを得る工程と、前記単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程と、を含む、検体の分析方法である。
　本発明のエクソソームの回収方法によれば、夾雑物の混入を抑制しながら、従来の方法よりも高い回収率でインタクトな、特定の膜タンパク質を有するエクソソームを回収することができる。また、本発明のエクソソームの分析方法および検体の分析方法によれば、少量の検体から、エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を高感度且つ簡便に分析することができる。
図１は、本実施の形態に係るエクソソームの回収方法の一例を示すフローチャートである。 図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。 図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。 図３Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。 図３Ｂは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す斜視模式図である。 図３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す断面模式図である。 図４は、本実施の形態に係るエクソソームの分析方法の一例を示すフローチャートである。 図５は、本実施の形態に係る検体の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図６は、エクソソームの個数とシグナル値との関係を示す検量線である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　［エクソソームの回収方法］
　エクソソームは、正常な細胞によっても、癌細胞などの疾患関連細胞によっても分泌されるものである。よって、エクソソームを疾患のマーカーとして利用するためには、検体（例えば血液）中に存在する大量の正常細胞由来のエクソソームと、より少量の疾患関連細胞由来のエクソソームとを区別して検出することが可能な方法が必要となる。一般的に血清中に存在するエクソソームの濃度は１．０×１０１１個／ｍｌ（１．０×１０８個／μｌ）程度といわれており、その中から疾患（例えば癌）に関連するエクソソームを検出するには、１．０×１０６個／ｍｌ（１．０×１０３個／μｌ）以下のエクソソームを検出可能な方法が必要である。
　本実施の形態に係るエクソソームの回収方法では、測定感度を向上させるために、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」ともいう）を利用してエクソソームを検出する。ＳＰＦＳは、表面プラズモン共鳴（以下「ＳＰＲ」ともいう）により増強された電場により蛍光物質を励起して蛍光を放出させるため、一般的な蛍光免疫測定法よりもターゲット（本実施の形態ではエクソソーム）を高感度に検出することができる。
　検体中のエクソソームの存在および／または濃度を求めるために用いられていた従来の方法は、いずれもエクソソームの回収率の再現性が低く、また、ロスも大きかった。例えば、ＥＬＩＳＡ法などの酵素反応を検出に用いる系では、一度測定した後に解離液を流して、エクソソームを回収し、再度測定を行うことは難しかった。また、蛍光色素を検出に用いる系においては、エクソソームを回収して再度測定すること自体は可能であるが、次のような問題が発生し得る。例えば、血漿を検体として用いた場合、検体中の夾雑物の影響を避けるために検体を希釈すると、シグナルが低下してしまい、従来のＥＬＩＳＡでは感度不足が否めない。また、検体を希釈せずに分析すると、検体中の血漿成分によって測定値のバラつきが発生し得る。
　一方、本発明の回収方法はＳＰＦＳシステムに基づくものであることから、ＳＰＦＳ装置内で検体の希釈を自動化できるため、希釈によって生じ得る測定値のバラツキを抑制し、高い再現性を持ってエクソソームを回収することが可能となる。また、ＳＰＦＳシステムでは、エクソソームの検出に続いて、同じＳＰＦＳ装置内でエクソソームの解離および回収を実施することが可能である。ＳＰＦＳ装置内で機械的にエクソソームの解離および回収を実施することで、回収操作によって生じ得る処理毎のバラツキを低減し、回収量や回収率の再現性を高めることができる。回収した単離エクソソームは、さらにＳＰＦＳや他の方法で２回目の分析を行うことも可能である。
　また、ＳＰＦＳは、検体として全血も使用することができるため、血液中のエクソソームを精製することなく、少ない手順で簡便に疾患関連エクソソームを検出することができる。
　本発明者らは上記の考えのもとに、鋭意検討を重ねた結果、ＳＰＦＳで高感度に特定のエクソソームを単離・回収できることを見出し、本実施の形態に係るエクソソームの回収方法を完成させた。
　本発明のエクソソームの回収方法は、以下の工程１～６を含む。
　金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程１と、
　金属膜上にエクソソームを含む検体を提供して、検体に含まれるエクソソームを第１の結合物質に結合させる工程２と、
　第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程３と、
　蛍光物質で標識されたエクソソームが第１の結合物質に結合している状態で、金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように金属膜に励起光を照射し、蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程４と、
　解離液を用いて、エクソソームを第１の結合物質から解離させる工程５と、
　解離したエクソソームを含む解離液を回収して処理し、単離エクソソームを得る工程６。
　以下、本実施の形態に係るエクソソームの回収方法の工程１～６について、具体的に説明する。図１は、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法の一例である、１次反応および２次反応を用いる測定方法を示すフローチャートである。
　（工程１：　測定チップの準備）
　まず、金属膜と、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する（工程Ｓ１０）。ＳＰＦＳでは、金属膜に光（本実施の形態では励起光）を照射したときに生じるエバネッセント波と表面プラズモンとを結合させてＳＰＲを生じさせる。ＳＰＲを生じさせる手法としては、金属膜の一方の面上にプリズムを配置する手法（Kretschmann配置）や、金属膜に回折格子を形成する手法などが知られている。前者の手法を採用したＳＰＦＳは、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと称され、後者の手法を採用したＳＰＦＳは、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳと称される。本実施の形態に係るエクソソームの測定方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳおよびＧＣ－ＳＰＦＳのどちらを採用してもよい。
　上述のとおり、金属膜は、励起光を照射されたときにＳＰＲを生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。
　第１の結合物質は、エクソソームに結合することができ、検体中のエクソソームを捕捉するために金属膜上に固定化されている。通常、第１の結合物質は、金属膜上の所定の領域（反応場）に均一に固定化されている。金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、エクソソームに結合することができるもの、即ち、エクソソームが有する第１の結合決定基に結合するものであれば特に限定されない。結合物質の例には、エクソソームに結合できる抗体、エクソソームに結合できる核酸、エクソソームに結合できる脂質、エクソソームに結合できるレクチン、およびエクソソームに結合できるその他のタンパク質が含まれる。ここで、エクソソームが有する結合決定基とは、結合物質がエクソソームに結合する際に認識するエクソソームの一部分である。例えば、結合物質が抗体の場合、結合決定基は抗原の抗原決定基（エピトープ）であり、結合物質がリガンドの場合、結合決定基は対応する受容体の結合部位である。
　第１の結合物質が結合する、エクソソームが有する第１の結合決定基に特に限定はないが、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基や、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、アネキシン　Ｖ（Annexin V）、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する第１の結合物質に上記の物質と反応する物質（例えば抗体）を使用する場合、エクソソームにのみ結合するため、検体中のエクソソームを検出するのに有効である。
　エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体も市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。第１の結合物質としてエクソソームを分泌する細胞マーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質（例えば抗体）を使用する場合は、特定の細胞およびそこから分泌されたエクソソームにのみ結合するため、検体中の特定の細胞由来のエクソソームを検出するのに有効である。
　第１の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、金属膜に固定化される第１の結合物質が抗体の場合、当該抗体は、１種類または２種類以上のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
　尚、第１の結合物質は、蛍光標識と関連して説明する第２の結合物質との組み合わせを考慮して選択することが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質との好ましい組み合わせについては後述する。
　結合物質の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜上に、結合物質（例えば抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質（例えば抗エクソソーム抗体）に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜に固定化し、この高分子に結合物質（例えば抗体）を結合させてもよい。
　測定チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
　図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。説明の便宜上、これらの図において、各構成要素の大きさおよび形状は、正確ではない。また、これらの図では、第１の結合物質としてエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体を使用する例を示している。
　図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００は、プリズム１１０、金属膜１２０およびエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。プリズム１１０は、励起光Ｌ１に対して透明な誘電体からなり、励起光Ｌ１が入射する入射面１１１と、励起光Ｌ１が反射する成膜面１１２と、反射光Ｌ２が出射する出射面１１３とを有する。プリズム１１０の形状は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、励起光に対する屈折率が１．４～１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
　図２Ａに示されるように、金属膜１２０においてＳＰＲが生じるようにプリズム１１０を介して金属膜１２０に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜１２０近傍に生じる。このとき、金属膜１２０上のエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応したエクソソーム１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
　図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００は、回折格子２１１を形成された金属膜２１０およびエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。金属膜２１０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２１０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜２１０の厚みは、特に限定されないが、３０～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。回折格子２１１の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２１１は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。たとえば、１次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、互いに平行な複数の凸部が所定の間隔で形成されている。２次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２１１の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子２１１の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板（不図示）の上に金属膜２１０を形成した後、金属膜２１０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板（不図示）の上に、金属膜２１０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２１１を含む金属膜２１０を形成することができる。
　図２Ｂに示されるように、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じるように金属膜２１０（回折格子２１１）に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に生じる。このとき、金属膜２１０（回折格子２１１）上のエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応したエクソソーム１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
　図３Ａ～３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。Ａに示されるように、測定チップ３００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、プリズム１１０の成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、プリズム１１０の成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋３１０とを有する。図３において、入射面１１１および出射面１１３は、紙面の手前および奥にそれぞれ存在している。測定チップ３００は、さらに、流路３２０と、流路３２０の一端に接続された液体注入部３３０と、流路３２０の他端に接続された貯留部３４０も有する。本実施の形態では、流路蓋３１０は、両面テープなどの接着層３５０を介して金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接着されており、接着層３５０は流路３２０の側面形状を規定する役割も担っている。図３では省略しているが、流路３２０内に露出している金属膜１２０の一部の領域（反応場）には、エクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０が固定化されている。液体注入部３３０は、液体注入部被覆フィルム３３１により塞がれ、貯留部３４０は、貯留部被覆フィルム３４１により塞がれている。貯留部被覆フィルム３４１には、通気孔３４２が設けられている。
　流路蓋３１０は、蛍光Ｌ３に対して透明な材料で形成されている。ただし、蛍光Ｌ３の取り出しの妨げにならない限り、流路蓋３１０の一部は蛍光Ｌ３に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光Ｌ３に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋３１０は、接着層３５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接合されていてもよい。この場合は、流路３２０の側面形状は、流路蓋３１０により規定される。
　液体注入部３３０には、ピペットチップが挿入される。このとき、液体注入部３３０の開口部（液体注入部被覆フィルム３３１に設けられた貫通孔）はピペットチップの外周に隙間なく接触する。このため、ピペットチップから液体注入部３３０内に液体を注入することで流路３２０内に液体を導入することができ、液体注入部３３０内の液体をピペットチップに吸引することで流路３２０内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において液体を往復送液することもできる。
　液体注入部３３０から流路３２０内に流路３２０の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部３４０には流路３２０から液体が流入する。また、流路３２０内において液体を往復送液するときにも、貯留部３４０には液体が流入する。貯留部３４０に流入した液体は、貯留部３４０内で攪拌される。貯留部３４０内で液体が攪拌されると、流路３２０を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えばエクソソームや洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路３２０内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。
　図３Ｂおよび図３Ｃは、それぞれ、ウェル形状の測定チップの一例を示す模式図である。図３Ｂは、反応検出部が底面にあるウェル形状の測定チップ４００の模式図である（例えば、国際公開第２０１２／１５７４０３号を参照）。このチップにおいては、誘電体部材４１２が断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）であり、ウェル部材４１８が誘電体部材４１２の形状に合わせて方形に構成されている。そしてセンサ構造体２２の金属薄膜４１４上のリガンド固定領域４１６に検出対象となるエクソソームと結合する第１の結合物質を固定した状態で、エクソソームを含んだ試料溶液を貫通穴４２０内に供給し、センサ構造体４２２を撹拌する。
　また、図３Ｃは、反応検出部が側壁面にあるウェルである（例えば、国際公開第２０１８／０２１２３８号を参照）。検出チップ５００は、ウェル本体５１０および側壁部材５２０を有する。ウェル本体５１０は、その内部に収容部（ウェル）５１１を有している。収容部５１１は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第１開口５１２および側部に設けられた第２開口５１３により外部に開放されている。側壁部材５２０は、光学素子としてのプリズム５２１、金属膜５２５および反応場５２６を有している。プリズム５２１は、励起光に対して透明な誘電体からなる光学素子であり、入射面（図示せず）、反射面５２３および出射面（図示せず）を有する。プリズム５２１は、収容部５１１を構成する側壁としても機能する。金属膜５２５上には捕捉領域があり、捕捉領域は、検体中のエクソソームを捕捉するための第１の結合物質が固定化される領域である。
　検体の種類は、エクソソームを含むものである限り、特に限定されない。検体の例には、血液（血清、血漿、全血、これらの希釈物、）、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等の体液、ならびにこれら体液を生理食塩水や緩衝液などで希釈した希釈液が含まれる。本実施の形態に係るエクソソームの検出方法では、ＳＰＦＳを利用してエクソソームを検出するため、検体として全血も使用することができる。よって、入手の容易性等の観点から、血清、血漿、全血またはこれらの希釈物が、検体として好ましい。
　また、検体は、体液から調製したエクソソーム抽出物であってもよい。体液からエクソソームを抽出して検体とすることで、体液そのものでは検出の難しかった極微量のエクソソームも検出して定量することが可能となる。エクソソームの抽出方法に特に限定はなく、従来から知られているエクソソームの抽出方法を採用することができる。例えば、超遠心分離法、免疫沈降法やポリマー沈殿法で、体液からエクソソームを抽出することができる。また、本発明の回収方法で回収したエクソソームを再度検体として使用することもできる。
　検体には、界面活性剤をさらに添加してもよい。界面活性剤を添加することでエクソソームの凝集を防止し、バックグラウンドノイズや測定値のバラツキを低減することが可能となる。界面活性剤は、生物・医学の分野で広く使用されている界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００が含まれる。界面活性剤は、エクソソームを破壊することはないが、その凝集を防止する程度の濃度で使用すればよい。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０の場合、０．００１％～５％以下、好ましくは０．００５％～１％以下、より好ましくは０．０１０％～０．０５％以下の濃度で使用することができる。また、デオキシコール酸ナトリウムの場合、０．００１％～０．０２５％以下、好ましくは０．００２％～０．０２０％以下、より好ましくは０．００３％～０．０１０％以下の濃度で使用することができる。また、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の場合、０．００１％～０．０１０％以下、好ましくは０．００２％～０．００７％以下、より好ましくは０．００３％～０．００５％以下の濃度で使用することができる。
　（工程２：　１次反応）
　次に、測定チップの金属膜上に検体を提供して、金属膜に固定化された第１の結合物質に、検体に含まれるエクソソームを結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。検体を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に検体を提供すればよい。１次反応の反応時間に特に限定はないが、エクソソームと第１の結合物質との反応効率を上げるという観点からは、反応時間は長い方が好ましく、通常、５分以上１８０分以下、好ましくは６０分以上１５０分以下、より好ましくは１００分以上１２０以下である。通常は、１次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、第１の結合物質に結合していない成分を除去する（洗浄；工程Ｓ２１）。
　又、洗浄後には、光学ブランクを測定することができる（光学ブランクを測定；工程Ｓ２２）。
　（工程３：　２次反応）
　次に、測定チップの金属膜上に標識試薬を提供して、結合物質に結合したエクソソームを、エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する。標識試薬の種類は、第１の結合物質に結合したエクソソームに蛍光物質で標識された第２の結合物質が反応できれば特に限定されない。たとえば、標識試薬は、蛍光物質で標識された、エクソソームが有する第２の結合決定基に結合する第２の結合物質である（図１の２次反応＋蛍光標識；工程Ｓ３０）。あるいは、標識試薬は、エクソソームが有する第２の結合決定基に結合する第２の結合物質、およびエクソソームに結合した第２の結合物質に結合する、蛍光物質で標識された別の第２’の結合物質の両方を含む。
　標識試薬を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に標識試薬を提供すればよい。通常は、２次反応および／または３次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、エクソソームに結合していない第２の結合物質（または他の結合物質）を除去する（洗浄；工程Ｓ３１）。
　標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、蛍光物質で標識することができ、且つエクソソームに結合することができれば特に限定されない。第２の結合物質の例には、エクソソームに結合できる抗体、エクソソームに結合できる核酸、エクソソームに結合できる脂質、エクソソームに結合できるレクチン、およびエクソソームに結合できるその他のタンパク質が含まれる。
　第２の結合物質が結合する、エクソソームが有する第２の結合決定基に特に限定はないが、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基や、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、アネキシン　Ｖ（Annexin V）、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第２の結合物質として使用することができる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する第２の結合物質に上記の物質と反応する物質（例えば抗体）を使用する場合、エクソソームにのみ結合するため、たとえ金属膜上にエクソソーム以外のもの（細胞など）が結合していても、エクソソームのみを検出するのに有効である。
　エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体も市販されており、当該抗体を第２の結合物質として使用することができる。第２の結合物質としてエクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質（例えば抗体）を使用する場合は、特定の細胞およびそこから分泌されたエクソソームにのみ結合するため、金属膜上に結合した種々のエクソソームの中から特定の細胞由来のエクソソームのみを検出するのに有効である。
　第２の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、蛍光物質で標識された抗エクソソーム抗体は、１種類または２種類以上の抗エクソソームモノクローナル抗体または抗エクソソームポリクローナル抗体である。この場合、蛍光物質で標識された抗エクソソームモノクローナル抗体および抗エクソソームポリクローナル抗体は、金属膜に固定化されている１種類または２種類以上の抗エクソソームモノクローナル抗体とは異なるものであることが好ましい。
　標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類と同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、第１の結合物質および第２の結合物質が共に抗体であってもよいし、一方が抗体で、他方が抗体以外のタンパク質でもよい。
　金属膜に固定化されている第１の結合物質と、標識試薬に含まれる第２の結合物質は、それぞれがエクソソームが有する結合決定基に結合するものであるが、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とは異なることが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質とが同じ結合決定基を奪い合うのではなく、異なる結合決定基に結合することで、エクソソームの金属膜への固定および標識物質による標識をより確実に実施することが可能となる。また、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とが異なることによって、第１の結合物質の結合に基づき検体から検出したエクソソームの中から、第２の結合物質の結合に基づきさらに測定すべきエクソソームを絞り込むことができる。
　第１の結合物質および第２の結合物質について、第１の結合決定基および第２の結合決定基の少なくとも一方が、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基であることが好ましい。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質を使用することによって、検体中の物質からエクソソームのみを検出することができる。また、第１の結合決定基および第２の結合決定基の少なくとも一方が、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基であることが好ましい。エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質を使用することによって、特定の細胞由来のエクソソームを検出することができる。本発明においては、第１の結合物質および第２の結合物質の一方をエクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合するものとし、他方をエクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合するものとすることがより好ましい。このような２種の結合物質を組み合わせて使用することによって、特定の細胞の分泌するエクソソームを特異的に検出することができる。例えば、癌細胞は正常細胞とは異なるエクソソームを分泌することが知られており、体液中の癌細胞由来のエクソソームを検出することで、エクソソームを癌マーカーとして使用することが可能となる。
　標識試薬に含まれる第２’の結合物質は、蛍光物質で標識することができ、且つ第２の結合物質に結合できるものであれば特に限定されない。他の結合物質の例には、第２の結合物質として使用する抗体、核酸、脂質、レクチン、その他のタンパク質等に結合できる抗体、核酸、脂質、および抗体以外のタンパク質が含まれる。たとえば、１つの第２の結合物質に対して複数の第２’の結合物質が結合するような第２および第２’の結合物質の組み合わせを使用すると、第２の結合物質を直接蛍光標識して用いた場合よりも多くの蛍光物質をエクソソームに結合させて、測定感度を向上させることが可能となる。また、第２の結合物質を蛍光物質で直接標識するのが難しい場合や、蛍光標識によって第２の結合物質のエクソソームに対する結合性が変化、低下または失われる場合等にも、第２’の結合物質を用いてエクソソームを標識することができる。
　第２または第２’の結合物質を標識するための蛍光物質の種類は、ＳＰＦＳで使用可能なものであれば特に限定されない。蛍光物質の例には、シアニン系色素、Thermo Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）色素、およびBiotium社のＣＦ色素が含まれる。Alexa Fluor色素およびＣＦ色素は、市販されている蛍光色素の中では、ＳＰＦＳで使用する励起光の波長についての量子効率が高い。また、ＣＦ色素は、蛍光検出時における退色があまり生じないため、安定して蛍光検出を行うことができる。結合物質を蛍光物質で標識する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、結合物質（例えば抗エクソソーム抗体）のアミノ基またはスルフヒドリル基に蛍光物質を結合させればよい。
　なお、上記の説明では、金属膜に固定化された第１の結合物質にエクソソームを結合させてからエクソソームを標識試薬を用いて蛍光物質で標識したが、金属膜に固定化された第１の結合物質にエクソソームを結合させる前にエクソソームを標識試薬を用いて蛍光物質で標識してもよい。この場合は、検体を金属膜上に提供する前に、検体と標識試薬（第２の結合物質）とを混合すればよい。また、検体と標識試薬（第２の結合物質）との混合物に、さらに蛍光標識した別の（第２’）の結合物質を加えることもできる。さらに、金属膜に固定化された結合物質にエクソソームを結合させる工程とエクソソームを蛍光物質で標識する工程を同時に行ってもよい。この場合は、検体と標識試薬（第２の結合物質、または第２および第２’の結合物質）を金属膜上に同時に提供すればよい。
　（工程４：　蛍光測定）
　次に、ＳＰＦＳによりエクソソームの量を示す蛍光を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、蛍光物質で標識されたエクソソームが金属膜に固定化された結合物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射し、これにより蛍光物質から放出される蛍光を測定する。通常は、測定された蛍光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出する。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値をエクソソームの量（個数／ｍｌ）や濃度（μｇ／ｍｌ）などに換算してもよい。また、後述するように、本発明のエクソソームの分析方法を利用して、検量線を作製することなく、検体中のエクソソームの量（個数／ｍｌ）や濃度（μｇ／ｍｌ）を推定することもできる。
　図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に照射される。これにより、金属膜１２０においてＳＰＲが生じ、金属膜１２０近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜１２０でＳＰＲが生じるように設定されるが、共鳴角または増強角であることが好ましい。ここで「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、反射光Ｌ２の光量が最小となるときの入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、金属膜１２０の上方（プリズム１１０の反対側）に放出される励起光Ｌ１と同一波長の散乱光（プラズモン散乱光）の光量が最大となるときの入射角を意味する。
　図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、金属膜２１０（回折格子２１１）に直接照射される。これにより、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じ、金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜２１０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜２１０でＳＰＲが生じるように設定されるが、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光Ｌ１の最適な入射角は、回折格子２１１のピッチや励起光Ｌ１の波長、金属膜２１０を構成する金属の種類などに応じて適宜設定される。
　励起光の種類は、特に限定されないが、通常はレーザー光である。たとえば、励起光は、出力が１０μＷ～３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である。励起光の照射エネルギーとしては、７．５μＷ／ｍｍ２以上３０ｍＷ／ｍｍ２以下であり、８．５μＷ／ｍｍ２以上１０ｍＷ／ｍｍ２以下が好ましく、９．５μＷ／ｍｍ２以上５ｍＷ／ｍｍ２以下がより好ましい。励起光の照射エネルギーを３０ｍＷ／ｍｍ２以下とすることで、蛍光強度を高めてシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくし、より少量のエクソソームを検出することが可能となるため、検出限界を向上させることができる。励起光の波長は、使用する蛍光物質の励起波長に応じて適宜設定される。また、光量が３０ｍＷ／ｍｍ２を超えると、照射熱による抗原抗体反応の解離が進むため、シグナル対ノイズ比が悪くなる。
　蛍光の検出器は、測定チップに対して蛍光の強度が最も高い方向に設置されることが好ましい。たとえば、図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線方向であるので、検出器は、測定チップの直上に設置される。一方、図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線に対してある程度傾斜した方向であるので、検出器は、測定チップの直上ではない位置に設置される。検出器は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
　（工程５：　解離反応）
　次に、解離液を用いて、エクソソームを第１の結合物質から解離させ、解離液中にエクソソームを遊離させる（工程Ｓ５０）。解離する工程は、第１および第２（および第２’）の結合物質の結合したエクソソームと、解離液とを接触させることで実行することができる。解離液は第１の結合物質とエクソソームとの結合を緩めて、エクソソームを第１の結合物質から解離させる液体である限り特に限定はない。よって、本工程において第２の結合物質はエクソソームから解離しても、解離しなくてもよい。解離液の種類は第１の結合物質の種類によっても異なるが、例えば、酸性溶液、塩基性溶液、塩溶液、界面活性剤溶液などが挙げられ、解離のし易さや、膜タンパク質へのダメージが少ないことから酸性溶液または塩溶液が好ましい。また、回収したエクソソームに対して再度膜タンパク質の測定を行う場合は、よりエクソソームに対する影響の少ない塩溶液がより好ましい。
　酸性溶液に含まれる酸性物質としては、グリシンやクエン酸等が挙げられ、グリシンが好ましい。酸性溶液のｐＨは１．５～４．０であり、２．０～３．０が好ましい。ｐＨが４．０以下であれば、結合物質とエクソソームとの十分な解離が可能となる。
　塩溶液に含まれる塩類としては、ＮａＣｌやＫＣｌ等が挙げられ、ＮａＣｌが好ましい。塩溶液の塩濃度は０．１Ｍ～５．０Ｍであり、１Ｍ前後が好ましい。塩濃度が０．１Ｍ以上であれば、結合物質とエクソソームとの解離が可能となる。
　尚、選択した解離液や解離条件などがエクソソームに損傷を与えずに、インタクトなエクソソームの回収を可能にするものであるか否かは、次の実験で確認することができる。
　市販のエクソソーム等を用いて、任意の濃度のエクソソームのサンプル溶液１を用意する。サンプル溶液１に、解離液の候補となる溶液（候補溶液）を加え、解離条件と同じ条件下で放置する。その後、回収のための処理と同様の操作（例えば、希釈または中和）を行い、本発明の回収方法の工程１～４を実施して、エクソソーム濃度１をＳＰＦＳを用いて測定する。
　次に、上記サンプル溶液１と同じものを用意し、候補溶液の代わりにバッファーを、候補溶液と同量加え、解離条件と同じ条件下で放置する。その後、回収に用いた溶液と同量のバッファーを添加し、発明の回収方法の工程１～４を実施して、エクソソーム濃度２をＳＰＦＳを用いて測定する。測定した濃度１および濃度２が同等であれば、エクソソームは解離液候補溶液の影響を受けていないことが明らかであり、濃度１が濃度２よりも著しく減少している場合には、エクソソームが解離液候補溶液によって損傷されたことがわかる。
　解離液を提供する方法は、特に限定されない。例えば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に解離液を提供すればよい。図３Ａに示した測定チップにおいては、ピペットチップから液体注入部３３０内に解離液を注入することで流路３２０内に解離液を導入し、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において解離液を往復送液することもできる。
　解離液と、第１の結合物質に結合したエクソソームとを接触させる時間は、解離液の種類や濃度、さらには第１の結合物質の種類等によっても異なるが、通常、０．５分以上３０分以下であり、好ましくは５分以上１５分以下、より好ましくは１０分以上１５分以下である。条件にもよるが、接触させる時間が１０分以上であれば、十分なレベルで結合物質とエクソソームとを解離させることが可能となる。
　（工程６：　単離エクソソームの回収）
　次に、解離したエクソソームを含む解離液を回収して処理し（工程Ｓ６０）、単離エクソソームを得る。エクソソームは解離液に遊離していることから、解離液と共に回収する。図３Ａに示した測定チップにおいては、液体注入部３３０内の解離液をピペットチップに吸引することで、エクソソームの遊離した解離液を回収することができる。
　解離液の成分は、長期的にはエクソソームを損傷する可能性があったり、エクソソームのさらなる解析の妨げとなり得ることから、回収した解離液に対して、エクソソームに対する解離液の影響を除去または抑制するための処理を実施する。
　解離液が酸性溶液の場合には、酸のエクソソームおよび続く解析への影響を抑制するために、回収した解離液を塩基性溶液で中和して、ｐＨ６．０～８．０、好ましくはｐＨ７．０～７．４とする。中和に使用する塩基性溶液に含まれる塩基性物質の種類は、解離液に含まれる酸性物質の種類によっても異なるが、通常、ＮａＯＨや炭酸バッファー等が挙げられる。塩基性溶液のｐＨは、通常、ｐＨ９．０～１２．０であり、１０．０～１１．０が好ましい。ｐＨが９．０以上であれば、解離液中の酸性物質の中和が可能となり、中和ができれば特にｐＨが高いことによる問題はない。
　解離液が塩溶液の場合には、塩類のエクソソームおよび続く解析への影響を抑制するために、回収した解離液を希釈する。希釈に使用する希釈液は、エクソソームを損傷することなく、解離液中の塩物質の影響を抑制することのできる溶液である限り特に限定はないが、その後に実施し得るさらなる解析に影響しないものであることが好ましい。希釈液として、例えば、水、生理食塩水、バッファーなどが挙げられ、バッファーとしてはＰＢＳやＴＢＳ等が挙げられる。希釈液は回収した解離液と混合する。この時の希釈率は、解離液の塩濃度に応じて決定することができるが、通常、２倍～１０倍、好ましくは３～６倍、より好ましくは５倍である。希釈率が２倍以上であれば解離液中の塩物質の影響を抑制することが可能となる。また、希釈率は、回収したエクソソームの濃度や、次に実施し得る解析の感度などに応じて決定することもできる。
　上記中和または希釈した解離液を、単離エクソソーム溶液として使用することができる。
　単離したエクソソームに第２（および第２’）の結合物質が結合している場合には、そのまま次の解析に供してもよいし、第２（および第２’）の結合物質をエクソソームから解離させ、除去してから次の解析に供してもよい。また、上記の解離する工程において第２（および第２’）の結合物質もエクソソームから解離した場合には、解離液中にエクソソームと第２（および第２’）の結合物質とが遊離した状態となるため、所望により、遊離した第２（および第２’）の結合物質を解離液から除去することもできる。いずれの場合も、第２の（および第２’）結合物質の解離および除去は、工程５（解離反応）の後または工程６（単離エクソソームの回収）の後のいずれにも実施することができる。
　第２（および第２’）の結合物質を解離および／または除去する方法は、エクソソームを解離することができる方法である限り特に限定はなく、第２（および第２’）の結合物質の種類に応じた公知の方法を用いることができる。例えば、第２（および第２’）の結合物質をエクソソームから解離させる方法としては、解離液を使用する方法等が挙げられる。遊離した第２（および第２’）の結合物質を除去する方法としては、限外濾過、透析、アフィニティカラム等を用いる方法が挙げられる。
　本発明のエクソソームの回収方法においては、上記工程２の１次反応の後に、工程３の２次反応および工程４の蛍光測定を実施することなく、工程５の解離反応および工程６の単離エクソソームの回収を実施することで、結合物質および蛍光標識の付されていないエクソソームを回収してもよい。
　［エクソソームの分析方法］
　本実施の形態に係るエクソソームの分析方法は、上述した本発明のエクソソームの回収方法によって単離エクソソームを得る（即ち、上記工程１～６を実施する）工程と、単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程と、を含む。図４は、本実施の形態に係るエクソソームの分析方法の一例を示すフローチャートである。図４に示したように、エクソソームの回収方法（工程Ｓ１０～Ｓ６０）に続いて、エクソソームの分析（工程Ｓ７０）を実施することができる。
　以下、回収した単離エクソソームの分析方法（工程Ｓ７０）について、説明する。
　（単離エクソソームの膜タンパク質の分析）
　回収したエクソソームの膜タンパク質をさらに別の条件または方法で分析することができる。エクソソームの膜タンパク質の分析方法に特に限定はないが、細胞特異的マーカーまたは疾患マーカーに結合する第３の結合物質を使用して、ＳＰＦＳ法で単離エクソソームの膜タンパク質を分析することが好ましい。当該ＳＰＦＳ法とは、本発明のエクソソームの回収方法の工程１～４の実施を意味する。よって、工程の詳細については、上記工程１～４と同じである。ＳＰＦＳ法においては、サンプルの希釈をＳＰＦＳ装置内で自動で行うことができ、さらに親水性高分子を用いているため、夾雑物の影響を受けにくく、回収率が安定である。また、高感度であり、広ダイナミックレンジであるが故に、回収したエクソソームの濃度が薄くても濃縮などは行わずに測定が可能であり、不純物も少ない。
　他の結合物質は、エクソソームに結合することができる物質であり、且つエクソソームの回収に使用した第１および第２（および第２’）の結合物質とは異なるものであることが好ましい。本発明の分析方法においては、第１および第２（および第２’）の結合物質を用いてある膜タンパク質を持ったエクソソームを回収し、さらに第３の結合物質を用いて別の膜タンパク質を検出する。このような方法によって、疾患特異性を向上させた、新たなマーカーの開発が可能となる。尚、本発明の分析方法においては、異なる波長をもつ標識抗体を同時に反応させることはないため、抗体の交差性によるブランクの増加といった性能面での低下の恐れはない。
　第３の結合物質の例には、エクソソームに結合できる抗体、エクソソームに結合できる核酸、エクソソームに結合できる脂質、エクソソームに結合できるレクチン、およびエクソソームに結合できるその他のタンパク質が含まれる。第３の結合物質の結合する結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第３の結合物質として使用することができる。第３の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。
　エクソソームの膜タンパク質を分析するための２回目のＳＰＦＳにおいて、第３の結合物質は金属膜上に固定する第１の結合物質および蛍光標識を付す第２の結合物質の少なくとも１種として使用することができる。第３の結合物質と共に使用する他の結合物質に特に限定はなく、エクソソームの回収に用いた第１および第２の結合物質と同じでも、異なっていてもかまわない。
　（単離エクソソームの内包物の分析）
　回収したエクソソームの内包物を分析することができる。エクソソームの内包物としては、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸や、タンパク質が知られている。中でもエクソソーム内包核酸、特にｍｉＲＮＡは疾患との関連性が研究されており、新たな疾患マーカーとして期待されている。
　エクソソームの内包物を分析するためには、初めにエクソソームを溶出液で処理し、エクソソームの内包物を得る。溶出液は、目的の内包物を損傷することなくエクソソームのリン脂質膜を破壊することできるものである限り特に限定はなく、界面活性剤等を用いることができる。界面活性剤としては、生物・医学の分野で広く使用されている界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００が含まれる。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を０．１％～１０％、好ましくは０．５％～５％、より好ましくは１％～３％の濃度で使用することができる。
　溶出液とエクソソームとを接触させる時間にも特に限定はなく、通常、０．５分～３０分、好ましくは３分～１０分である。０．５分以上であれば、エクソソーム膜の溶解が十分である。
　次に溶出させた内包物を公知の方法で解析する。目的の内包物がタンパク質の場合、そのままイムノアッセイを行ったり、公知のタンパク質精製方法で精製し、そのアミノ酸配列を決定したり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等で分子量を調べたり、特定のアミノ酸配列の存在をブロッティング法などで分析することができる。
　目的の内包物が核酸の場合も、公知の方法で解析することができる。例えば、ＰＣＲで目的の核酸を増幅し、シークエンサーで塩基配列を決定する方法や、次世代シーケンシングで塩基配列を決定する方法が挙げられる。
　単離エクソソームの膜タンパク質の分析および内包物の分析は、いずれか一方を実施すれば良いが、両方を実施することもできる。例えば、ＳＰＦＳを用いてエクソソームの膜タンパク質を分析した後に、再度、本発明のエクソソームの回収方法を実施してエクソソームを回収し、回収したエクソソームの内包物を分析することもできる。
　［検体の分析方法（同一測定サンプルの蛍光測定結果と回収結果を用いた分析方法）］
　本実施の形態に係る検体の分析方法は、下記の工程を含む。
　エクソソームを含み得る検体から２以上の同一の測定サンプルを調製し、少なくとも測定サンプル１および測定サンプル２を得る工程、
　金属膜と、金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを少なくとも２つ準備する工程と、
　測定サンプル１を用いて検体中のエクソソームの存在を確認する工程、
　測定サンプル２から検体中のエクソソームを回収して、単離エクソソームを得る工程、および
　単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程。
　図５は、本実施の形態に係る検体の分析方法の一例を示すフローチャートである。図５に示したように、測定サンプル１について工程Ｓ２０～Ｓ４０を実施、測定サンプル２について上記工程Ｓ２０と同じ工程Ｓ２０’と、工程Ｓ５０～Ｓ７０とを実施することができる。尚、各工程は、原則として、本発明のエクソソームの回収方法およびエクソソームの分析方法の対応する工程と同じである。
　（測定サンプルの調製）
　本発明の検体の分析方法においては、検体から少なくとも２つの同一の測定サンプルを調製する。測定サンプルの数に特に限定はないが、エクソソームの確認用と、エクソソームの回収用の少なくとも２つの測定サンプルがあればよい。測定サンプルの調製方法にも特に限定はなく、検体そのもの、または希釈などの前処理を施した検体を分注すればよい。但し、調製した複数の測定サンプルの成分（特にエクソソームの種類および量）は測定サンプル間のバラツキがないことが望ましいため、検体が均一な状態で分注することが重要である。尚、本発明において、測定サンプルが同一であるとは、回収対象とするエクソソームの量の測定サンプル間のバラツキが１０％以下であることを意味する。
　（測定チップの準備）
　測定チップを準備する工程は上述した本発明のエクソソームの回収方法の工程１に対応する。よって、本工程の詳細については、本発明のエクソソームの回収方法を参照されたい。尚、本工程においては、エクソソームの存在を確認する工程で使用するための測定チップと、単離エクソソームを得る工程で使用するための測定チップの少なくとも２つを準備する。ここで準備する測定チップは、同じ第１の結合物質を結合させたチップである。
　（検体中のエクソソームの存在の確認）
　検体中のエクソソームを確認する工程は、以下の工程を含む。
　１つの測定チップの金属膜の上に測定サンプル１を提供して、測定サンプル１に含まれるエクソソームを第１の結合物質に結合させる工程と、
　第１の結合物質に結合する前または結合した後のエクソソームを、エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、
　蛍光物質で標識されたエクソソームが第１の結合物質に結合している状態で、金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように金属膜に励起光を照射し、蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程。
　上記工程は、上述した本発明のエクソソームの回収方法の工程２～４にそれぞれ対応する。よって、各工程の詳細については、本発明のエクソソームの回収方法を参照されたい。
　（エクソソームの回収）
　エクソソームを回収する工程は、以下の工程を含む。
　他の１つの測定チップの金属膜の上に測定サンプル２を提供して、測定サンプル２に含まれるエクソソームを第１の結合物質に結合させる工程と、
　解離液を用いて、エクソソームを第１の結合物質から解離させる工程と、
　解離したエクソソームを含む解離液を回収して処理し、単離エクソソームを得る工程。
　上記工程は、上述した本発明のエクソソームの回収方法の工程２、５、６にそれぞれ対応する。よって、各工程の詳細については、本発明のエクソソームの回収方法を参照されたい。
　本工程で使用する測定チップは、検体中のエクソソームの存在を確認する工程と同じ結合物質が金属膜上に固定された測定チップであり、測定サンプル１を用いるエクソソームの存在を確認する工程と、測定サンプル２を用いる単離エクソソームを得る工程とは、２次反応を行う工程の有無以外は、同じ反応工程となる。
　（単離エクソソームの分析）
　単離したエクソソームを分析する工程は、本発明のエクソソームを分析する方法と同様に、単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析することができ、測定サンプル１の測定結果と測定サンプル２の回収結果を用いることで、新たな分析が可能となる。
　本発明の検体の分析方法においては、分析する工程で得られた、単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物に関するデータと共に、エクソソームを確認する工程で得られたエクソソームの存在量などのデータを使用して、検体に含まれるエクソソームを詳細に分析することができる。検体の詳細な分析を行う際には、２を超える数の測定サンプルを準備し、異なる結合決定基に結合する複数の結合物質をそれぞれ用いて検体中のエクソソームを確認する工程を複数回実施したり、異なる結合決定基を有する複数種のエクソソームを個別に回収することもできる。詳細な手順等については後述するが、本発明の方法によって、1種のエクソソームの有する２種以上の膜タンパク質を確認したり、検量線を作製することなく、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの検体中の割合をＳＰＦＳ法のみで推定することもできる。
　［エクソソームの分析方法および検体の分析方法の用途］
　本発明のエクソソームの分析方法および検体の分析方法の具体的な用途について説明する。尚、本発明は、以下の用途に限定されるものではない。
　（１）エクソソームの回収率の推定
　本発明のエクソソームの回収方法において、エクソソームを第１の結合物質に結合させた後（１次反応、即ち工程２の後）に、光学ブランク（ＯＢ）を測定する。次に、第１の結合物質に結合したエクソソームに対して蛍光物質の結合した第２の結合物質を結合させた後（２次反応、即ち工程３の後）にシグナルを測定する（ここで測定したシグナル値をＳ１とする）。さらにエクソソームを第１の結合物質から解離させて回収し、第１の結合物質のみの状態のシグナルを測定する（ここで測定したシグナル値をＳ２とする）。シグナル値Ｓ１から光学ブランク（ＯＢ）を引いた値をΔＳ１とし、シグナル値Ｓ２から光学ブランクを引いた値をΔＳ２とすると、解離反応の解離率は下記式で表される。
　　　ΔＳ１＝Ｓ１－ＯＢ
　　　ΔＳ２＝Ｓ２－ＯＢ
　　　解離率＝（ΔＳ１－ΔＳ２）／ΔＳ１
　さらに１次反応後に回収したサンプル中の未反応エクソソームの量を決定する。ΔＳ１から求めたエクソソーム量と未反応エクソソーム量の合計が、測定前の検体中に存在した総エクソソーム量である。ΔＳ１から求めたエクソソーム量と、総エクソソーム量との比が、１次反応の反応率となる。
　　　１次反応の反応率＝ΔＳ１から求めたエクソソーム量／総エクソソーム量
　そして１次反応の反応率に解離率を乗した値が、検体中の総エクソソーム量に対する回収率となる。
　　　回収率＝１次反応の反応率×解離率
　従来のエクソソーム抽出キットなどを用いて分析用のエクソソームを回収した場合、検体中の夾雑物の影響により、エクソソームの回収率は大きく変動する。また、夾雑物の影響を避けるために検体を希釈して使用すると、エクソソームの回収率を求めるために、抽出したエクソソームを濃縮する必要が生じることがある。エクソソームの濃縮のために限外ろ過などを行うと、フィルタ等へのエクソソームの吸着により、実際の回収率とのズレが生じ得る。
　一方、本発明のエクソソームの回収方法はＳＰＦＳに基づくものであることから、シグナル測定を二回行うことで解離率を算出することができる。また、別途反応率を算出することで回収率や回収量を再現性良く算出することが可能であるため、限外ろ過などを行う必要がなく、エクソソームのロスも防止することができる。
　（２）エクソソームの有する２種以上の膜タンパク質の確認
　第１の結合物質として結合物質Ａを用いて本発明のエクソソームの回収方法を実施し、結合物質Ａに結合したエクソソームを回収し、その濃度Ａを求める。次に、第１の結合物質として結合物質Ｂを用いて、上記回収したエクソソーム（即ち、結合物質Ａに結合したエクソソーム）のさらなる回収を実施し、結合物質Ｂに結合したエクソソームを回収し、その濃度Ｂを求める。
　上記実験によって、結合物質Ａの結合する膜タンパク質Ａおよび結合物質Ｂの結合する膜タンパク質Ｂの両方を有するエクソソームが存在するのか、あるいは膜タンパク質Ａを有するエクソソームと、膜タンパク質Ｂを有するエクソソームとが混在するのかを判定することが可能となる。このような判定は、結合物質Ａを第１の結合物質、結合物質Ｂを第２の結合物質として用いた測定では判定することが難しい。
　（３）検体中の、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの割合の推定
　初めに、１つの検体から測定用のサンプル１ａ、１ｂおよび１ｃを用意する。尚、サンプル１ａ、１ｂおよび１ｃは同一とみなす。
　（実験１）サンプル１ａに対して、種類を問わずエクソソームであれば結合する結合物質Ａを第１の結合物質として使用し、本発明の方法の工程１～４を実施して、サンプル１ａのシグナル値Ｓａを得る。次にシグナル値Ｓａから光学ブランクを引き、サンプル１ａ中のエクソソームの総量に相関するシグナル値であるΔＳａを算出する。この実験で、検体中のエクソソームの総量を推定する。
　（実験２）サンプル１ｂに対して、特異的膜タンパク質を有する特定のエクソソームにのみ結合する結合物質Ｂを第１の結合物質として使用し、本発明の方法の工程１～４を実施して、サンプル１ｂのシグナル値Ｓｂを得る。次にシグナル値Ｓｂから光学ブランクを引き、サンプル１ｂ中の特異的膜タンパク質を有するエクソソームの量に相関するシグナル値であるΔＳｂを算出する。この実験で、結合物質Ｂの結合する結合決定基Ｂ陽性エクソソームの総量を推定する。
　（実験３）サンプル１ｃに対して、上記結合物質Ｂを第１の結合物質として使用し、本発明の方法の工程１および２を実施して、サンプル１ｃ中の特異的膜タンパク質を有するエクソソームを金属膜上の結合物質Ｂに結合させる。結合したエクソソームのシグナルを測定することなく、本発明の方法の工程５および６を実施し、非標識の、特異的膜タンパク質を有するエクソソームをサンプル２として回収する。この実験で、結合決定基Ｂ陽性エクソソームを回収する。
　次に上記サンプル２から２つの測定用サンプル２ａおよび２ｂを用意する。尚、サンプル２ａおよび２ｂは同一とみなす。
　（実験４）サンプル２ａに対して、結合物質Ｂを第１の結合物質として使用し、本発明の方法の工程１～４を実施して、サンプル２ａのシグナル値Ｓｄを得る。次にシグナル値Ｓｄから光学ブランクを引き、サンプル２ａ中の特異的膜タンパク質を有するエクソソームの量に相関するシグナル値であるΔＳｄを算出する。この実験で、回収した結合決定基Ｂ陽性エクソソームの量を推定する。
　（実験５）実験４で得た、特異的膜タンパク質を有する回収したエクソソームの量に相関するシグナル値であるΔＳｃを、実験２で得た、特異的膜タンパク質を有する検体中のエクソソームの量に対応するシグナル値であるΔＳｂで除することによって、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの回収率を得る。
　　　特異的膜タンパク質を有するエクソソームの回収率＝ΔＳｃ／ΔＳｂ
　（実験６）サンプル２ｂに対して、結合物質Ａを第１の結合物質として使用し、本発明の方法の工程１～４を実施して、サンプル２ｂのシグナル値Ｓｅを得る。次にシグナル値Ｓｅから光学ブランクを引き、サンプル２ｂ中のエクソソームの総量に相関するシグナル値であるΔＳｅを算出する。次に、ΔＳｄを上記回収率（ΔＳｃ／ΔＳｂ）で除することで、検体中に存在する、特異的膜タンパク質を有し、且つ結合物質Ａにも結合するエクソソームの量に相関するシグナル値であるΔＳｅを得る。この実験で、実験４で回収したエクソソームの総量を推定する。
　　　ΔＳｅ＝ΔＳｄ／（ΔＳｃ／ΔＳｂ）
　（実験７）最後に、上記ΔＳｅをΔＳａで除することによって、検体中に含まれる総エクソソーム量に対する、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの割合を得る。
　　　特異的膜タンパク質を有するエクソソームの割合＝ΔＳｅ／ΔＳａ
　エクソソームには、その種類を問わず存在する膜タンパク質と、特定のエクソソーム（例えば疾患由来のエクソソーム）のみに存在する特異的膜タンパク質とが存在する。上記実験１～５および実験結果を用いた計算によって、検体中に存在する、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの量を、ＳＰＦＳ法のみで測定することができる。また、上記一連の操作および計算は、ＳＰＦＳ装置によって自動化することも可能である。特異的膜タンパク質を有するエクソソームの存在は疾患マーカーとなり得ることから、上記方法は、新規な疾患マーカーや診断方法の開発につながると考えられる。
　尚、市販のエクソソームを用いた検量線を作製し、上記実験１および実験２を実施することによっても、検体中に存在する、特異的膜タンパク質を有するエクソソームの量を推定することは理論的には可能である。しかし、市販のエクソソームには純度の明確なものはなく、特異的膜タンパク質を有するエクソソームが存在することは明らかであっても、その量などがバッチごとに異なっているのが現状である。よって、検量線を用いた測定では、再現性の高い、正確な推定は難しかった。
　また、当該方法によって市販のエクソソームの純度を確認し、正確な検量線の作製に役立てることもできる。
　［効果］
　以上のように、本実施の形態に係るエクソソームの回収方法、エクソソームの分析方法、および検体の分析方法によれば、ＳＰＦＳを利用して、夾雑物の混入を抑制しながら、従来の検出方法よりも高い回収率でインタクトなエクソソームを回収することができる。さらに回収したエクソソームの膜タンパク質および／または内包物の分析を再現性良く実施することができる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
　参考例１
　事前準備：　検量線の作成
　図３Ａの測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した。検体サンプルとしては、コスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和して使用した。希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。なお、ＳＰＦＳ装置内で使用した検体希釈液は界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。
　希釈率の異なる検体を用意し、各検体について、検体中のエクソソームの個数を測定した。測定にはｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用した。
　さらに上記と同じ検体について、エクソソームの量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体）を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行い、ｑＮａｎｏによる測定結果と合わせて検量線を作成した。
　同様の方法にて、下記の３種類の検量線も作成した。
　第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した測定チップ、検体サンプルとしてコスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの、標識抗体として、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ９モノクローナル抗体を使用した、ＰＳＭＡ陽性エクソソームの検量線。
　第１の結合物質として抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を固定化した測定チップ、検体サンプルとしてコスモバイオ社から購入したＳＫＢＲ３細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの、標識抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ９モノクローナル抗体を使用した、ＨＥＲ２陽性エクソソームの検量線。
　第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した測定チップ、検体サンプルとしてコスモバイオ社から購入したＳＫＢＲ３細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの、標識抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体を使用した、ＨＥＲ２陽性エクソソームの検量線。
　作成した検量線を図６に示した。
　シグナル測定後のエクソソームの回収
　測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化したものをＳＰＦＳ測定用に準備した。検体サンプルとしては、コスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（水和しているが、凍結乾燥品がＰＢＳで調製されているため、バッファー系となっている。以下、「バッファー系」と記載する）、もしくは健常人血漿を用意した。希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。なお、ＳＰＦＳ装置内で用いた検体希釈液は界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。
　上記検体サンプルについて、エクソソームの量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体）を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値ΔＳ１を算出した。
　その後、液体注入部から流路内の測定液を除去した後、液体注入部から流路内に解離液として塩溶液である１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液または酸性溶液であるＧｌｙｃｉｎｅ２．０（ｐＨ２．０のグリシンバッファー溶液）を６０μｌ導入し、往復送液させた（解離反応）。解離反応の反応時間は１０分とした。流路内の解離液を回収サンプルとして液体注入部から回収し、カートリッジの空きウェルに吐出した。その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を再度測定した。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値ΔＳ２を算出した。
　次に、解離率となる（ΔＳ２－ΔＳ１）／ΔＳ１を計算した。この計算では、反応したエクソソーム量に対応するシグナルから、解離した後の反応場に残存するエクソソーム量に対応したシグナル量を差し引くことにより、解離され回収されたエクソソーム量に対応するシグナル量を算出した。さらに反応したエクソソーム量に相関するシグナル量に対するその割合から、解離率を算出した。
　また、回収した１次反応液を、上記と同様の手順で測定し、未反応のエクソソーム量に相関するシグナル値ΔＳ１’を取得し、（ΔＳ１－ΔＳ１’）／ΔＳ１より反応率を算出した。
　次に、反応率と解離率を乗することにより、初期のエクソソーム量に対する回収率を算出した。
　結果を下記表１～表４に示した。
　尚、解離液として酸性溶液を使用した実験については、測定を３回繰り返し（Ｎ１～Ｎ３）、塩溶液を使用した実験については、測定を１回（Ｎ１）とした。また、下記表において、ΔＳ１およびΔＳ２は、希釈率を考慮した数値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記の表の結果から明らかなように、検体がＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソームの場合（表１および表３）も、健常人血漿の場合（表２および表４）も、エクソソームを回収することができた。また解離液としては、酸性溶液（表１および表２）の方が塩溶液（表３および表４）よりも解離率が高く、よって回収率も高かった。
　シグナル測定後の回収エクソソームの再測定
　実施例１で酸性溶液を解離液として用いて回収したエクソソームのサンプルに対して、１ｍＭ　ＮａＯＨ溶液によってｐＨ７．４となるように中和を行った。処理後のエクソソームは測定サンプルとして以下の測定に用いた。
　流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した測定チップをＳＰＳＦ測定用に準備した。尚、ＳＰＦＳ装置内で使用する検体希釈液には界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０が含まれ、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。
　上記測定サンプルのシグナル測定を実施例１と同様に実施した。具体的には、ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値ΔＳ３を算出した。さらに実施例１と同様にエクソソームの回収率を算出し、下記表５に示した。尚、下記表において、ΔＳ３は、希釈率を考慮した数値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例１で回収したエクソソームについて、再度エクソソームの回収を行ったところ、実施例１で得られたエクソソームの量に相関するシグナル値が得られた。
　シグナル測定後の、回収エクソソーム由来ｍｉＲＮＡの測定
　実施例１において、解離液として１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を用いて回収したエクソソームを１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈し、以下の測定用のサンプルとした。非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の水溶液（濃度：１％）を溶解液としてエクソソームサンプルに添加し、エクソソームのリン脂質膜を溶解した。次に、エクソソームの内包するｍｉＲ－２１をＲＴ－ＰＣＲ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＳＴＥＰＯＮＥ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ使用）にて増幅し、Ｃｔ値が３０の条件でｍｉＲ－２１を検出した。
　非標識エクソソームの回収
　検体サンプルとしては、コスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（バッファー系）を使用した。希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。ＳＰＦＳ装置内で用いる検体希釈液は界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。得られた検体サンプルから測定用のサンプル１および２を得た。
　測定チップを２つ用意し、それぞれの流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化したものをＳＰＦＳ測定用に準備した（測定チップ１および２）。
　初めに、測定用のサンプル１と測定チップ１を用いて、実施例１と同様の手順で検体のエクソソーム量を測定し、ΔＳ１値を取得した。参考例１で作成した検量線と液量を元に、初期のエクソソームの濃度と個数を確認した。
　次に、測定用のサンプル２に含まれるエクソソームを測定チップ２に結合させた。具体的には、ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内の洗浄液を除去した後、液体注入部から流路内に解離液として１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を６０μｌ導入し、往復送液させた（解離反応）。解離反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の解離液を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、エクソソームを回収した。
　上記で回収した、エクソソームを含む解離液を検体として、実施例２と同様の方法でエクソソームに対応するシグナルを測定し、ΔＳ２を取得した。さらに解離反応を用いて再度エクソソームを回収し、エクソソームの濃度と個数を確認して、初期のエクソソーム量に対する回収率を算出した。
　結果を表６に示した。尚、下記表において、シグナル値は希釈率を考慮した数値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記表６から明らかなように、初期のエクソソーム回収率と、解離反応を用いて回収したエクソソームの回収率とは相関しており、本発明の方法によってＳＰＦＳで確認したエクソソームを回収することができた。
　回収した非標識エクソソーム由来のｍｉＲＮＡの測定
　１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を解離液として用いて実施例４で回収したエクソソームを１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈し、以下の測定用のサンプルとした。非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の水溶液（濃度：６０μｌ）を溶解液としてエクソソームサンプルに添加し、エクソソームのリン脂質膜を溶解した。次に、エクソソームの内包するｍｉＲ－２１をＲＴ－ＰＣＲ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＳＴＥＰＯＮＥ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ使用）にて増幅し、Ｃｔ値が３０の条件でｍｉＲ－２１を検出した。
　非標識エクソソームの回収と再測定
　測定チップを２つ用意し、それぞれの流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を固定化したものをＳＰＳＦ測定用に準備した（測定チップ１および２）。
　検体サンプルとしては、コスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（バッファー系）を検体サンプルとして使用した。希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。なお、ＳＰＦＳ装置内での検体希釈液には界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。得られた検体サンプルから測定用のサンプル１および２を得た。
　初めに、測定用のサンプル１と測定チップ１とを用いて、実施例１と同様の手順で検体中のＨＥＲ２陽性エクソソームの量を測定し、ΔＳ１値を取得した。参考例１で作成した検量線と液量を元に、初期のＨＥＲ２陽性エクソソームの濃度と個数を確認した。
　測定用のサンプル２を用いて、サンプルに含まれるエクソソームを測定チップ２に結合させた。ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内の洗浄液を除去した後、液体注入部から流路内に解離液として１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を導入し、往復送液させた（解離反応）。解離反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の解離液を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、非標識のＨＥＲ２陽性エクソソームを回収した。
　解離反応にて回収したエクソソームに対し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳによる１０倍希釈を行い、これを測定サンプルとして用いた。測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化したものを用いて、上記測定サンプルのシグナル測定を実施した。ＳＰＦＳ装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。
　以下、測定を実施例１と同様の手順で行い、ΔＳ１を取得した。参考例１で作成した検量線と液量を元に、ＰＳＭＡ陽性エクソソームの濃度を確認した。一つのエクソソームの膜にＨＥＲ２とＰＳＭＡの両方を有するエクソソームがどの程度存在するのかを算出した。結果を表７に示す。尚、下記表において、シグナル値は希釈率を考慮した数値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記表７の結果から明らかなように、市販のＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソームの中には、ＨＥＲ２とＰＳＭＡの両方を持つエクソソームはほぼ存在しないことが確認できた。
　参考例２
　適切な解離液の選定
　検体サンプルとして、コスモバイオ社から購入したＬＮＣａＰ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（バッファー系）を用意した。検体サンプルを解離反応時に使用する解離液（１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、またはＧｌｙｃｉｎｅ２．０）と反応させた。具体的には、６０μｌの１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液にＬＮＣａＰ細胞由来エクソソームを１μｌ入れて室温に５分間放置するか、６０μｌのＧｌｙｃｉｎｅ２．０にＬＮＣａＰ細胞由来エクソソームを１μｌ入れて室温に５分間放置した。解離液が１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液の場合は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳによりさらに１０倍に希釈し、これを測定サンプル１とした。解離液がＧｌｙｃｉｎｅ２．０の場合は、１ｍＭ　ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ１０．７）でｐＨ７．４に中和し、これを測定サンプル２とした。対照として、解離液の代わりに１％ＢＳＡを含むＰＢＳでそれぞれ同等となる希釈率に調整したサンプルを対照サンプル１’、対照サンプル２’とした。
　測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化したものをＳＰＳＦ測定用に準備した。測定サンプル１、測定サンプル２、対照サンプル１’、対照サンプル２’のそれぞれについて、エクソソームの量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。具体的には、ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体サンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に洗浄液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。
　測定サンプル１の結果と対照サンプル１’の結果を比較し、シグナルの変化量から解離液の膜タンパク質へのダメージを推定した。同様に、測定サンプル２の結果と対照サンプル２’の結果を比較し、シグナルの変化量から解離液の膜タンパク質へのダメージを推定した。結果を表８および表９に示した。尚、下記表においては、同希釈率で結果を比較した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記結果から、解離液として酸性溶液（Ｇｌｙｃｉｎｅ２．０）を使用した場合、膜タンパク質へのダメージが生じることが示唆された。一方、塩溶液（１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液）を用いた場合は膜タンパク質へのダメージが少ないことが示唆された。
　検体サンプル中の特定膜タンパク質陽性エクソソームの純度確認
　測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質としてＴｉｍ４を固定化したものをＳＰＳＦ測定用に準備した。検体サンプルとしては、ＰＳＭＡ陽性エクソソームを含む測定サンプル１を提供し、そこからＰＳＭＡ陽性エクソソームサンプル１ａ、１ｂおよび１ｃを用意した。尚、ＰＳＭＡ陽性エクソソームサンプル１ａ、１ｂおよび１ｃは同一と見なす。
　（実験１）
　ＰＳＭＡ陽性エクソソームサンプル１ａについて、ＰＳＭＡ陽性エクソソーム以外のエクソソームも全て含めた総エクソソーム量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。具体的には、ピペットチップにより、液体注入部から流路内に塩化カルシウム入りの希釈液で希釈した測定サンプル１を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ９モノクローナル抗体を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するＴｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳａを算出した。
　（実験２）
　第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した測定チップを用いて、ＰＳＭＡ陽性エクソソームサンプル１ｂを上記と同様に測定して、ＰＳＭＡ陽性エクソソームの量に相関するＰＳＭＡ／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳｂを測定した。
　（実験３）
　第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した測定チップにＰＳＭＡ陽性エクソソームサンプル１ｃを送液し、ＰＳＭＡ陽性エクソソームのみを測定チップと反応させた。具体的には、ピペットチップにより、液体注入部から流路内にサンプル３を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内の洗浄液を除去した後、液体注入部から流路内に解離液として１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を６０μｌ導入し、往復送液させた（解離反応）。解離反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の解離液を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、非標識の回収ＰＳＭＡ陽性エクソソームを得た。
　解離反応にて回収したサンプルに対し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳによる１０倍希釈を行い、これを測定サンプル２とした。測定サンプル２から測定サンプル２ａおよび２ｂを用意した。尚、測定サンプル２ａおよび２ｂは同一と見なす。
　（実験４）
　流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した測定チップを用いて、測定サンプル２ａのシグナル測定を上記と同様に実施した。ＳＰＦＳ装置内で使用する検体希釈液は界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。得られたシグナル値から光学ブランクを引き、ＰＳＭＡ／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳｃを算出した。
　（実験５）
　上記実験４で得たΔＳｃ値と上記実験２で得たΔＳｂ値との比から、回収率であるΔＳｃ／ΔＳｂを算出した。
　（実験６）
　流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質としてＴｉｍ４を固定化した測定チップを用いて、上記の測定サンプル２ｂからシグナル値を測定し、Ｔｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳｄを測定した。
　ΔＳｄを、回収率であるΔＳｃ／ΔＳｂで除することで、元々のＰＳＭＡ陽性エクソソームを含む測定サンプル１中に存在したＰＳＭＡ陽性エクソソーム量に相関する、Ｔｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値ΔＳｅを算出した。
　（実験７）
　サンプル２のＴｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳｅを、サンプル１のＴｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳａで除することで、ＰＳＭＡ陽性エクソソームを含む測定サンプル１中のＰＳＭＡ陽性エクソソームに由来するＴｉｍ４／ＣＤ９由来のシグナル値であるΔＳｅの割合を算出し、それを純度とした。
　各実験で得られたシグナル値を、使用したサンプルおよび測定チップ、並びに検出標的と共に下記表１０にまとめた。尚、下記表において、シグナル値は希釈率を考慮した数値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　本実施例で得られたサンプルの純度は４０％だった。本実施例においては、検量線を作製することなく、ＳＰＳＦ法のみで、サンプル中に存在する特異的膜タンパク質を有するエクソソームの量を推定することができた。
　また、市販のエクソソームの純度は高いものではないことも明らかとなった。
　本実施の形態に係るエクソソームの回収方法を用いることで、夾雑物の混入を抑制しながら、従来の方法よりも高い回収率でインタクトなエクソソームを回収することができる。さらに別の実施の形態に係るエクソソームの分析方法および検体の分析方法を用いることで、少量の検体から、エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を高感度且つ簡便に分析することができる。したがって、本発明に係るエクソソームの回収方法およびエクソソームの分析方法は、新規な疾患マーカーや診断キットの開発などに有用である。
　１００、２００、３００、４００、５００　測定チップ
　１１０　プリズム
　１１１　入射面
　１１２　成膜面
　１１３　出射面
　１２０　金属膜
　１３０　抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）
　１３１　抗エクソソーム抗体（第２の結合物質）
　１４０　エクソソーム
　１５０　蛍光物質
　２１０　金属膜
　２１１　回折格子
　３１０　流路蓋
　３２０　流路
　３３０　液体注入部
　３３１　液体注入部被覆フィルム
　３４０　貯留部
　３４１　貯留部被覆フィルム
　３４２　通気孔
　３５０　接着層
　４１２　誘電体部材
　４１４　金属薄膜
　４１６　リガンド固定領域
　４１８　ウェル部材
　４２０　貫通穴
　４２２　センサ構造体
　５１０　ウェル本体 
　５１１　収容部 
　５２０　側壁部材 
　５２１　プリズム 
　５２３　反射面 
　５２５　金属膜 
　５２６　反応場 
　Ｌ１　励起光
　Ｌ２　反射光
　Ｌ３　蛍光

Claims (15)

  1. 　金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程と、
    　前記金属膜の上にエクソソームを含む検体を提供して、前記検体に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、
    　前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、
    　前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、
    　解離液を用いて、前記エクソソームを前記第１の結合物質から解離させる工程と、
    　解離した前記エクソソームを含む解離液を回収して処理し、単離エクソソームを得る工程と、
    　を含む、エクソソームの回収方法。
  2. 　前記第１の結合物質は前記エクソソームが有する第１の結合決定基に結合するものであり、前記第２の結合物質は前記エクソソームが有する第２の結合決定基に結合するものであり、前記第１の結合決定基と前記第２の結合決定基とは異なる、請求項１に記載のエクソソームの回収方法。
  3. 　前記解離液が塩溶液であり、前記単離エクソソームを得る工程において、回収した前記解離液を希釈液で希釈する、請求項１または２に記載のエクソソームの回収方法。
  4. 　前記解離液が酸性溶液であり、前記単離エクソソームを得る工程において、回収した前記解離液を塩基性溶液で中和する、請求項１または２に記載のエクソソームの回収方法。
  5. 　前記励起光の照射エネルギーは、７．５μＷ／ｍｍ２以上１０ｍＷ／ｍｍ２以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載のエクソソームの回収方法。
  6. 　前記検体が、血清、血漿、全血、これらの希釈物、または体液から調製したエクソソーム抽出物である、請求項１～５のいずれか一項に記載のエクソソームの回収方法。
  7. 　前記金属膜は、プリズムの上に配置されており、
    　前記励起光は、プリズムを介して前記金属膜に照射される、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載のエクソソームの回収方法。
  8. 　前記金属膜は、回折格子を含み、
    　前記第１の結合物質は、前記回折格子の上に固定化されており、
    　前記励起光は、前記回折格子に照射される、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載のエクソソームの回収方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のエクソソームの回収方法によって単離エクソソームを得る工程と、
    　前記単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程と、を含む、エクソソームの分析方法。
  10. 　前記分析する工程において、細胞特異的マーカーまたは疾患マーカーに結合する第３の結合物質を使用して、ＳＰＦＳ法で前記単離エクソソームの膜タンパク質を分析する、請求項９に記載のエクソソームの分析方法。
  11. 　前記内包物が核酸である、請求項９に記載のエクソソームの分析方法。
  12. 　前記核酸がｍｉＲＮＡである、請求項１１に記載のエクソソームの分析方法。
  13. 　前記分析する工程において、ＰＣＲ法または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する、請求項１１または１２に記載のエクソソームの分析方法。
  14. 　エクソソームを含み得る検体から２以上の同一の測定サンプルを調製し、少なくとも測定サンプル１および測定サンプル２を得る工程と、
    　金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを少なくとも２つ準備する工程と、
    　前記測定サンプル１を用いて、前記検体中のエクソソームの存在を確認する工程と、
    　前記測定サンプル２から前記検体中のエクソソームを回収して、単離エクソソームを得る工程と、
    　前記単離エクソソームの膜タンパク質および／または内包物を分析する工程と、を含む、検体の分析方法であって、
    　前記検体中のエクソソームの存在を確認する工程が、
    　　　１つの前記測定チップの金属膜の上に前記測定サンプル１を提供して、前記測定サンプル１に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、
    　　　前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、
    　　　前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、を含み、
    　前記検体中のエクソソームを回収して、単離エクソソームを得る工程が、
    　　　他の１つの前記測定チップの前記金属膜の上に前記測定サンプル２を提供して、前記測定サンプル２に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、
    　　　解離液を用いて、前記エクソソームを前記第１の結合物質から解離させる工程と、
    　　　解離した前記エクソソームを含む解離液を回収して処理し、単離エクソソームを得る工程とを含む、検体の分析方法。
  15. 　前記分析する工程で得られたデータと共に、前記エクソソームの存在を確認する工程で得られたデータを使用して、前記検体を分析する、請求項１４に記載の検体の分析方法。
     
     
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