JP2014228322A - センサ、検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】厳密な精度設計の不要な光学系の下で、洗浄工程を行うことなく被検体の検査を行うことのでき、且つ利用可能な色素の選択性の高い検査方法、及びこのような検査方法の下で被検体の検査を行うのに適したセンサを提供する。【解決手段】 本発明のセンサは、被検体の検査に利用されるセンサであって、被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体がセンサチップ上に固定されており、センサチップは、基板と、基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を構成しており、検査用特定体は、保護層の表面上に固定されている。【選択図】 図１

Description

本発明はセンサに関する。より詳細には、被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体がセンサチップ上に固定されているセンサであって、被検体と検査用特定体を結合させた状態のセンサに光を照射することで被検体の検査を行う用途に利用されるセンサに関する。また、本発明は、このようなセンサに光を照射することで被検体の検査を行う検査方法に関する。

従来、バイオ測定などにおいて分光測定方法が利用されている。この方法について、図１８を参照して説明する（例えば特許文献１参照）。図１８は、従来の分光測定方法を説明するための概念図である。なお、図１８では、検査対象となる被検体が抗原である場合について説明している。

まず、図１８（ａ）に示すように、試験管９０の内壁に固相抗体９１を固定化する。この固相抗体９１は、被検体である抗原９３と特異的に結合する抗体が選択的に利用される。

そして、図１８（ｂ）に示すように、内壁に固相抗体９１が固定化された試験管９０に、蛍光色素９２で標識した抗体９４と被検体である抗原９３を注入して混合する。ここで、抗体９４も固相抗体９１と同様、抗原９３と特異的に結合する抗体が選択的に利用される。

すると、抗原９３は固相抗体９１及び標識抗体９４と結合して、試験管９０の内壁に固定化される。なお、標識抗体９４のうち、抗原９３と結合されなかったものは、依然として試験管９０内で浮遊状態にある。その後、図１８（ｃ）に示すように、試験管９０内の流体を試験管９０外に排出して管内を洗浄する。これにより、抗原９３と結合されなかった標識抗体９４は試験管の外に放出される（Ｂ／Ｆ分離（Ｂｏｎｄ／Ｆｒｅｅ分離））。この結果、試験管９０内には、内壁に固定化された固相抗体９１、この固相抗体９１に結合した抗原９３、及び固相抗体９１に結合して固定化されている抗原９３に結合した標識抗体９４が残存する。

この状態で図１８（ｄ）に示すように、光源部９６から試験管９０の内壁に向けて光を照射する。このとき、試験管９０の内壁に固定化された標識抗体９４に標識された蛍光色素９２が発光する。この発光を受光部９７で受光して発光の有無又は発光強度を観測することで、被検体である抗原９３の濃度を測定することができる。

また、標識色素からの蛍光強度を増強し、効率的に観察する手法として、表面プラズモン効果を利用した測定方法が開発されている（例えば特許文献２及び３参照）。

特許第４０４４１３０号明細書 特開２００８−１４５３０９号公報 特開２０１２−３２２８２号公報

標識された抗体からの発光を受光して被検体である抗原の存在や濃度を分析する上では、抗体からの発光光量が分析に必要な光量を満たすことが前提となる。このため、特許文献３の方法によれば、抗体に標識される色素としては、高い発光量子収率（Φ＞０．１程度）を満たす色素の利用が要求される。しかし、このように高い発光量子収率を満たしつつ、抗体や抗原に標識可能な色素というのは種類が極めて少ない。また、抗体や抗原によっても標識可能な色素とそうでない色素が存在する。この結果、色素の選択性が狭く、またそもそも本手法が利用できる抗原／抗体の組み合わせに制限があるという課題がある。

また、高い発光量子収率を満たす色素で標識した場合、被検体と結合して固定化された抗体や抗原とは別に、溶液中に浮遊している抗原や抗体に標識された色素からの発光を受光部が受光してしまうという別の問題がある。例えば、図１８（ｂ）の状態であれば、溶液中を浮遊している抗体標識蛍光色素９２からの発光を受光部９７が受光してしまう。この場合、この受光光量に基づいて分析をすると、抗原９３の濃度を正しく測定できない。このため、従来は、浮遊する抗体標識蛍光色素９２からの発光を受光部９７が受光することのないよう、図１８（ｃ）のようにＢ／Ｆ分離工程を行なっている。

しかし、このＢ／Ｆ分離工程においては、作業者の洗い方などによっては、試験管９０の内壁に固定化されていた固相抗体９１、及びこれに結合した抗原９３や抗体９４が流されてしまうおそれがある。つまり、Ｂ／Ｆ分離工程によって固相抗体９１及び抗原９３の残量にばらつきが出やすく、濃度計測のばらつき要因の一つとなる。また、固相抗体９１と抗原９３、又は抗原９３と抗体９４の親和力が弱い場合においては、洗浄によって抗原９３や抗体９４が容器外に流されてしまうことがあるため、そもそもＢ／Ｆ分離が適切に実行できないという課題がある。

特許文献２及び３においては、金属薄膜の伝搬型表面プラズモン共鳴を用いる方法が開示されている。しかし、この方法によれば、エバネッセント波由来の表面プラズモン共鳴を利用するため、検出されるスペクトルの強度が入射角度に依存する。つまり、この表面プラズモン共鳴を実現するためには、センサに対する入射角を精度よく共鳴角に調整することが必要であり、光源部とセンサの光学的位置関係に関して高精度に設計し、製造することが要求される。また、利用時においても、光源部とセンサの位置関係を厳格に調整する必要があり、作業者によって表面プラズモン共鳴による光増強度が変動するおそれがある。

更に、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴による方法では、プラズモン共鳴による光増強度が十分ではないので、低発光量子収率である色素を標識色素として使用できない。

特許文献２では、二光子吸収分光法を利用し、溶液中に浮遊する標識色素からの発光の影響を除去する構成が記載されている。しかし、二光子吸収分光法を利用する場合には、レーザ光焦点を調整する必要があるため、高性能で高額なレーザ装置を上述した厳密な精度設計のなされた光学系に対して調整する必要が生じる。また、レーザが集光するコヒーレント長さは小さく見積もっても数百ナノメートルあるため、抗体標識蛍光色素９２以外の箇所も少なからず励起し、この励起光によって被検体由来の正確な受光量が測定できない可能性がある。更に、この二光子吸収分光法に適した光退色のない堅牢な色素は限られており、標識物質として利用できる色素に大きな制約が生じる。

なお、特許文献３においても、図１８（ｂ）の状態であれば被検体以外の箇所にある抗体標識蛍光色素９２も少なからず励起するため、洗浄工程を行うことが想定されている。

本発明は、上記の課題に鑑み、厳密な精度設計の不要な光学系の下で、洗浄工程を行うことなく被検体の検査を行うことのでき、且つ利用可能な色素の範囲が広い検査方法を提供することを目的とする。また、本発明は、このような検査方法の下で被検体の検査を行うのに適したセンサを提供することを目的とする。

本発明のセンサは、被検体の検査に利用されるセンサであって、被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体がセンサチップ上に固定されており、
前記センサチップは、基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を構成しており、
前記検査用特定体は、前記保護層の表面上に固定されていることを特徴とする。

上記構成によれば、センサチップが基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層を備える構成を有するため、局在表面プラズモン効果を利用することができる。このため、エバネッセント波を利用した表面プラズモン効果とは異なり、基板に対する光の入射角度に関する厳しい制限がなく、自由度が担保される。そして、センサに入射された光が、増強電磁場形成層による光増強効果によってその光強度が高められる。

このセンサを用いて被検体の検査を行う方法の一例としては、色素で標識化された被検体を含む流体を当該センサに流し込むなどの方法によって、センサに固定された検査用特定体と被検体を含む流体を接触させる。なお、この方法は、例えば被検体が検査用特定体と特異的に結合するかどうかを確認し、又はその結合程度を評価するための検査にも利用できるものである。

検査用特定体が被検体と特異的に結合する性質を有している場合、流体内に含まれる被検体が検査用特定体と結合し、センサに固定化される。なお、被検体と検査用特定体の関係（例えば濃度の関係など）によっては、流体内に含まれる全ての被検体が検査用特定体と結合するとは限らず、一部の被検体は依然として流体内を漂うことになる。無論、検査用特定体が、今回の検査対象である被検体と特異的に結合する性質を有していない場合においても、被検体は依然として流体内を漂う。

ここで、局在表面プラズモン効果を利用する場合、従来の素子においては、増強電磁場形成層を構成する多数の金属微粒子の近傍箇所にのみ、その光の増強効果が作用する。一方、本発明では増強電磁場形成層の上層に形成された保護層を介してその表面まで強い増強効果が及ぶため、金属微粒子から遠く離れた保護層表面に固定された検査用特定体並びにこの検査用特定体に結合した被検体の発光が著しく増強される。一方、流体内を漂う被検体に対しては増強電磁場形成層による発光増強効果が及ばない。

この著しく強い発光増強効果の結果、被検体を標識する色素として、通常状態で光らない非発光性（発光量子収率が０．０１程度以下）の色素を利用することが可能となる。つまり、センサに光を入射すると、検査用特定体に結合した被検体に関しては、保護層を介して増強電磁場形成層による光の増強効果が及ぶため、被検体に標識された非発光性色素が発光する。一方、流体内を漂い、検査用特定体に結合しなかった被検体については、増強電磁場形成層による発光増強効果が及ばないため、この被検体に標識された非発光性色素は発光しない。この結果、Ｂ／Ｆ分離である洗浄工程を行わずとも、検査用特定体に結合した被検体からの光のみを受光部により受光することが可能となる。

本発明のセンサによれば、このように検査の際に洗浄工程が不要となる結果、検査用特定体と結合した被検体が洗浄工程で流されてしまうという問題点が解消するため、被検体の結合力が比較的弱い組み合わせの検査用特定体を被検体の検査に利用することも可能となる。このことは、本発明のセンサによって抗原抗体反応を用いた抗原又は抗体の検査を行う場合に、結合力が弱く親和性の低い抗原と抗体の組み合わせであっても、被検体と検査用特定体の組み合わせとして検査に採用することができることを意味しており、検査可能な抗原／抗体の種類を飛躍的に増加できる。

更に、上述したように、本発明のセンサによれば、通常状態で光らない非発光性の色素を標識色素として利用することが可能となるため、色素の選択性が極めて広がる。

本発明のセンサは、増強電磁場形成層と保護層を備えている。後述する実施形態により明らかになるが、発光増強効果は保護層表面にも及ぶため、光が入射されると、保護層に固定された検査用特定体に結合した被検体の標識色素を発光させることができる。

上述したように、本発明のセンサの利用方法としては、検査時に光をセンサに入射させることで、本発明のセンサに固定された検査用特定体に結合していない被検体や別の検査用特定体は発光させずに、センサに固定された検査用特定体と結合した被検体（又はこの被検体と結合した別の検査用特定体）のみを発光させる。そして、この発光した光を受光部において受光することによって分析などに利用される。つまり、検査用特定体と結合していない被検体などからは発光しないため、受光部では単純に発光光量を受光して分析するのみでよく、その検出精度は極めて向上する。このことは、更に以下のような効果をもたらす。

（１）例えば、少数個の反応分子の変化についても検出が可能となるため、溶液中に含まれる被検体の濃度が低い状態の下での被検体の検出感度の上昇が見込める。
（２）検出感度の低い従来の方法の場合、例えば一個の検査用特定体あたり多数個の色素を標識する方法が採用されていた。本発明のセンサであれば少数個の色素標識で検査可能であるため、検査用特定体を複数個の色素で標識することによる検出結果への悪影響が排除できる。
（３）検出感度の低い従来の方法の場合、入射する励起光の強度を高める必要があったが、本発明のセンサであれば検出感度が高いため、励起光の強度を低下させることができる。これにより、高い出力の光が照射されることで試料（被検体、検査用特定体）に対して光分解／熱分解といった悪影響が生じることを排除できる。
（４）少量の色素で検査が可能となり、高価なレーザを励起光とする二光子吸収分光法を用いる必要もないため、検査に必要なコストは大きく低廉化される。

生体物質や抗原／抗体を被検体とし、このような被検体の検査を行う場合には、当該被検体を含む流体として、生理食塩水などのハロゲン化物イオンを含む溶液が用いられることが多い。このとき、仮に、保護層をつけていない増強電磁場形成層の上面に直接、検査用特定体を固定してセンサを形成すると、被検体を含む流体をセンサに流し込むことで、増強電磁場形成層を形成する金属微粒子が当該流体に含まれるハロゲン化物イオンに直接晒されることになる。発光増強効果を高める観点からは、金属微粒子としてＡｇ（銀）を用いるのが好適であるが、この場合、金属微粒子を構成するＡｇがハロゲン化物イオンと反応し、金属微粒子が溶解しセンサ基板表面から脱離してしまう。このような場合、発光増強効果が得られなくなってしまうという問題が生じる。

しかし、本発明の構成によれば、金属微粒子を含む増強電磁場形成層の上層に保護層が形成されており、この保護層表面に検査用特定体が固定されている構成である。このため、被検体を含む流体をセンサに流し込んでも、この流体は保護層に直接接触するのみであり、金属微粒子が直接流体に長時間晒され続けるということがない。このため、金属微粒子として発光増強効果の高いＡｇを用いることが可能となる。なお、本発明の構成においては、金属微粒子としてＡｇを用いるのが好適であるが、他の金属材料（例えばＡｕ）を用いても構わない。

本発明のセンサは、金属微粒子を含む増強電磁場形成層の上層に保護層が形成されているため、金属微粒子が露出しない構成である。金属微粒子が露出し、保護層を有しない構成の場合、取り扱いによっては金属微粒子が容易に基板から脱離するおそれがあるが、本発明のセンサによれば、金属微粒子の脱離が防止される。

このセンサを用いて被検体の検査を行う別の方法の例としては、被検体、及び色素で標識化された別の検査用特定体（「第２検査用特定体」に対応する。）を含む流体を当該センサに流し込むなどの方法によって、センサに固定された検査用特定体（「第１検査用特定体」に対応する。）とこの流体を接触させる。この方法は、上述したような、被検体が検査用特定体（第１検査用特定体、第２検査用特定体）と特異的に結合するかどうかを確認する場合の他、もともと流体内にあった被検体の濃度を測定する検査にも利用できる。

なお、流体内の被検体の濃度を測定する検査に利用する場合には、第１検査用特定体及び第２検査用特定体は、いずれも被検体と特異的に結合する性質を有するものが選択的に用いられる。また、被検体が検査用特定体と特異的に結合するかどうかを確認する場合には、第１検査用特定体及び第２検査用特定体は、被検体と特異的に結合する性質を有する候補として選択されたものが利用される。

この場合においても、第１検査用特定体及び第２検査用特定体がいずれも被検体と特異的に結合する性質を有している場合、流体内に含まれる被検体が流体内において第２検査用特定体と結合すると共に、更に、第１検査用特定体と結合してセンサに固定化される。そして、被検体と結合しなかった第２検査用特定体は依然として流体内を漂う。この状況下でセンサに光を入射させると、上述の例と同様の理由により、被検体を介してセンサに固定化された第２検査用特定体に標識された色素のみが発光し、流体内を漂う第２検査用特定体に標識された色素は発光しない。よって、受光部によってこの発光を受光して発光強度を検出することにより、例えばもともと流体内にあった被検体の濃度を測定することが可能となる。

なお、上述の利用例では、被検体や第２検査用特定体を非発光性の色素で標識する場合について説明したが、自家発光性の物質（例えば自家発光性タンパク質）で標識するものとしても構わない。更には、被検体や第２検査用特定体自体が自家発光性を有する場合においては、標識自体が不要となる。

非発光性の色素で標識する場合には、例えばカロテノイド系、フラボノイド系、又はキノイド系の色素が利用できる。また、自家発光性の物質としては、例えばコラーゲン、リボフラビン、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＦＤＨ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、有色タンパク質などが利用できる。

本発明のセンサに固定化されている検査用特定体は、抗体又は抗原の少なくとも一方を含むものとすることができる。

また、本発明のセンサが備える前記保護層は、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向した有機物の重合体で構成されているものとしても構わない。

この構成により、増強電磁場形成層における局在表面プラズモン効果に起因した増強電磁場を、高効率で保護層の表面に伝達させることが可能となり、検査用特定体に結合した被検体、又はその被検体に結合した別の検査用特定体を高効率で発光させることができる。

また、本発明のセンサが備える前記保護層は、ハロゲン元素を含有するものとしても構わない。

この構成により、増強電磁場形成層における局在表面プラズモン効果に起因した増強電磁場を、更に高効率で保護層の表面に伝達させることが可能となる。なお、この構成は、保護層を有しない構成において露出した金属微粒子に生理食塩水などのハロゲン化物イオンを直接接触させる場合とは異なり、保護層としてハロゲン元素を含有した材料を用いるというものであるので、上記の構成と同様に、ハロゲン化物イオンによる金属微粒子へのダメージを防御する機能は担保される。

本発明の検査方法は、
基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体を前記保護層の表面に固定してセンサを形成する工程（ｂ）、
非発光性色素若しくは自家発光性物質で構成された標識物質で標識された前記被検体、又は自家発光性を有する前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程（ｃ）、
光源部から前記センサに光を照射して、前記検査用特定体に結合された前記被検体に標識された前記標識物質又は自家発光性を有する前記被検体を発光させる工程（ｄ）、
及び、受光部が、前記工程（ｄ）における発光を受光する工程（ｅ）を有することを特徴とする。

この検査方法は、例えば被検体が検査用特定体と特異的に結合するかどうかを確認し、又はその結合程度を評価するための検査に利用できる。

ここで、前記工程（ｂ）を、前記検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程とし、
前記工程（ｃ）を、抗体又は抗原で構成される前記被検体に非発光性色素又は自家発光性物質で標識したものを含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程とすることができる。

また、前記工程（ｂ）を、前記検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程とし、
前記工程（ｃ）を、抗体又は抗原で構成され自家発光性を有する前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程とすることができる。

また、本発明の検査方法は、
基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である第１検査用特定体を前記保護層の表面に固定してセンサを形成する工程（ｂ）、
前記被検体、並びに、非発光性色素若しくは自家発光性物質で構成された標識物質で標識され又は自家発光性を有すると共に、被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である第２検査用特定体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程（ｃ）、
光源部から前記センサに光を照射して、前記第１検査用特定体に結合した前記被検体と結合した前記第２検査用特定体に標識された前記標識物質又は自家発光性を有する前記第２検査用特定体を発光させる工程（ｄ）、
及び、受光部が、前記工程（ｄ）における発光を受光する工程（ｅ）を有することを別の特徴とする。

この検査方法は、被検体が検査用特定体（第１検査用特定体、第２検査用特定体）と特異的に結合するかどうかを確認する場合の他、流体内の被検体の濃度を測定する検査にも利用できる。

ここで、前記工程（ｂ）を、前記第１検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程とし、
前記工程（ｃ）を、抗体又は抗原の少なくとも一方で構成される前記第２検査用特定体に非発光性標識色素又は自家発光性物質で標識したもの、及び前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程とすることができる。

また、前記工程（ｂ）を、前記第１検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程とし、
前記工程（ｃ）を、抗体又は抗原の少なくとも一方で構成され、自家発光性を有する前記第２検査用特定体、及び前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程とすることができる。

なお、上記のいずれの検査方法においても、前記保護層を、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向した有機物の重合体で構成することができる。また、前記保護層にハロゲン元素を含有することもできる。

本発明によれば、厳密な精度設計の不要な光学系の下で、洗浄工程を行うことなく被検体の検査を行うことが可能で、且つ利用可能な色素の選択性が高い検査方法が実現できる。また、本発明のセンサによれば、上記のような検査方法を用いた検査に適したセンサが実現できる。

本発明のセンサの構造を模式的に示す図面である。 本発明の検査方法を説明するための概念図である。 本発明のセンサの性能を検証するための測定装置の概念図である。 センサチップに対して高い発光量子収率（Φ〜１）を有するローダミン６Ｇ色素を担持させたときの、保護層の厚みと光増強度の関係をプロットした結果を示すグラフである。 センサチップに対して非発光性（Φ＜＜０．０１）であるフクシン色素を担持させたときの、保護層の厚みと光増強度の関係をプロットした結果を示すグラフである。 実施例２と比較例１の受光部で受光された光のスペクトル分布を比較したグラフである。 本発明の第２実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。 本発明の第２実施形態の検査方法を説明するための概念図である。 本発明の第３実施形態の検査方法を説明するための概念図である。 本発明の第４実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。 本発明の第４実施形態の検査方法を説明するための概念図である。 本発明の第５実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。 本発明の第５実施形態の検査方法を説明するための概念図である。 実施例３と比較例２の各センサチップに励起光を照射した際に受光部で受光された発光のスペクトル分布を比較したグラフである。 実施例４と比較例３の各センサチップに励起光を照射した際に受光部で受光された発光のスペクトル分布を比較したグラフである。 実施例５と実施例１の各センサチップに励起光を照射した際に受光部で受光されたラマンスペクトルを示すグラフである。 実施例６と実施例７の各センサチップに励起光を照射した際に受光部で受光されたラマンスペクトルを示すグラフである。 従来の分光測定方法を説明するための概念図である。

［第１実施形態］
本発明の第１実施形態につき、図面を参照して説明する。なお、各図において図面の寸法比と実際の寸法比は必ずしも一致しない。

〈センサ構造〉
図１は、本発明のセンサの構造を模式的に示す図面である。センサ１は、センサチップ３上に被検体の検査のため検査用特定体５が固定されている。センサチップ３は、基板７、増強電磁場形成層９及び保護層１１を備えて光増強素子を構成している。検査用特定体５は、保護層１１の上面に固定化されている。なお、図１では、センサ１の正面図を模式的に示したものであり、図面上では検査用特定体５が保護層１１上に５つ描画されているが、実際には奥行き方向に多数の検査用特定体５が保護層１１上に形成されているものとして構わない。

基板７の材質は特に限定されるものではなく、例えば、ガラス、セラミックス、樹脂などを用いることができる。なお、後述するように、センサチップ３の作製工程において加熱処理（例えば１００℃以上の加熱）が行われる場合には、例えばガラス、ポリイミド樹脂などの耐熱性を有するものであることが好ましい。

増強電磁場形成層９は、基板７の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子１０が分散配置されて構成されている。基板７の表面上における金属微粒子１０の配列方法については、二次元的にランダムに配列された構成であっても、規則的に配列された構成であっても構わない。

増強電磁場形成層９を構成する金属微粒子１０としては、例えばＡｇを好適に用いることができるが、励起光の照射により励起されて局在表面プラズモン効果を実現し得るものであれば、Ａｕ、Ａｌ、Ｃｕなどの他の材料を利用することもできる。また、この金属微粒子１０の形状としては、例えば扁平な半球形状、平板状の形状など、形状異方性を有するものを好適に用いることができる。なお、多数の金属微粒子１０は、いずれも均一の大きさ及び形状を備えていることが望ましいが、大きさや形状に多少のばらつきがあっても構わない。

また、金属微粒子１０の粒径としては、励起光の波長以下の大きさであることが好ましい。ここで、本明細書において「粒径」とは、顕微鏡法による投影面積円相当径をいう。具体的には、次のようにして求められる。センサチップ３の表面における任意に選ばれる領域について、長さ２μｍの線分が長さ６ｃｍに拡大（倍率３００００倍）されるよう観察される走査型電子顕微鏡の視野領域（例えば１．５μｍ×２μｍ）を撮像領域として、センサチップ３における当該領域の二次電子像を得る。このとき、明るさの指標（２５６段階）が１００程度以上の金属微粒子の各々について、金属微粒子１０の面積と同一面積の真円の直径が当該金属微粒子１０の粒径として得られる。

なお、金属微粒子１０の粒径は、例えば５〜３００ｎｍの範囲内であり、厚みは例えば５〜７０ｎｍの範囲内である。また、増強電磁場形成層９を構成する金属微粒子１０の密度は、例えば１０^８〜１０^１１個／ｃｍ^２程度とすることができる。

このような増強電磁場形成層９の形成方法の一例としては、基板７の表面に金属微粒子１０の前駆体が適宜の溶媒に分散された分散液をスピンコート法により塗布して加熱する方法を用いることができる。また、別の方法としては、基板７の表面に金属微粒子１０の前駆体をディッピングして加熱する方法、基板７の表面に金属微粒子１０を真空蒸着する方法、基板７の表面に金属微粒子１０をスパッタ蒸着する方法などを用いることができる。

そして、センサチップ３において、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面を含む増強電磁場形成層９の上層には保護層１１が形成されている。保護層１１を構成する材料としては、例えば酸化ケイ素、酸化チタン、酸化セリウム、酸化ボロン、酸化リン、酸化マグネシウム、酸化カルシウム、酸化アルミニウム、酸化ガリウム、酸化ゲルマニウム、酸化亜鉛などを用いることができる。

保護層１１の平均厚さは、例えば５０〜２５０ｎｍであることが好ましい。特に、保護層１１の厚さが８５ｎｍ以上であることにより、検査対象である被検体が生理食塩水のようなハロゲン化物イオン（例えばＣｌ⁻）を多量に含有する溶液に含まれている場合であっても、金属微粒子１０に対する十分な耐性（保護機能）が得られる。

このようなセンサチップ３は、例えば以下の方法により作製される。まず、基板７の表面上に金属ナノ粒子膜を形成し、これを加熱処理することにより粒状性を変化させ、これにより、粒径が所定範囲内にある金属微粒子１０による増強電磁場形成層９を形成する。このとき、形成すべき金属微粒子１０の粒径は、加熱処理条件を適宜変更することにより調整できる。

次に、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に、蒸着法により、金属微粒子１０を起点として保護層を厚さ方向に成長させることにより柱状組織構造を有する保護層１１を形成する。保護層１１の厚さは、成長条件、時間を適宜変更することにより調整できる。また、保護層１１の形成方法としては、高周波（ＲＦ）スパッタ蒸着法、電子線蒸着法、又は電子サイクロトロン共鳴（ＥＣＲ）スパッタ蒸着法などの方法を適宜選択して利用できる。

このようにして形成されたセンサチップ３の保護層１１の表面に、検査用特定体５を固定化させてセンサ１を作製する。本実施形態では、検査用特定体５として抗原５Ａを想定する。なお、保護層１１の表面に抗原５Ａを固定化する方法としては、例えば保護層１１の表面上に抗原５Ａを含む溶液をある一定時間だけ静置する方法が利用できる。更に、検査用特定体５の意図しない吸着を抑制するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミンタンパク）を含む溶液を抗原５Ａが固定化された保護層１１の表面上にある一定時間だけ静置して、ＢＳＡを保護層１１表面上の抗原５Ａが固定化されていない部分に固定化する方法が利用できる。

〈センサ１の使用方法〉
次に、本実施形態のセンサ１を用いて被検体の検査を行う方法について説明する。図２は、検査方法を説明するための概念図である。なお、図２では、図１と同様にセンサ１の断面図を模式的に示しているが、以下では、この紙面上の奥行き方向にも保護層１１の表面に検査用特定体５としての抗原５Ａが形成されており、十分な数の検査用特定体５が保護層１１の表面に存在しているものとして説明する。

上述したように、検査用特定体５として抗原５Ａがセンサチップ３上に固定化されたセンサ１に対し、被検体１５を含む溶液２０（流体）を接触させる。この接触させるための方法としては、種々の方法が採用され得る。一例としては、まず、センサ１よりも高さの高い容器３０をセンサ１の外側面を覆うようにセットすることで、センサ１の上方に容器３０の内側面で覆われた筒状空間を構成しておき、この空間内に溶液２０を注ぎ込むことで、溶液２０とセンサ１を接触させることができる。

本実施形態では、被検体１５として抗体１５Ａを想定する。そして、予めこの抗体１５Ａに対して所定の標識物質１９で標識をしておく。ここで、標識物質１９としては、通常状態で発光しない色素や発光量子収率の低い色素（非発光性色素）を用いることができ、例えばカロテノイド系、フラボノイド系、又はキノイド系の色素が利用できる。これは、後述するように、本発明のセンサ１によれば、センサ１に対して入射された光を励起光とし、金属微粒子１０を含む増強電磁場形成層９に起因した局在表面プラズモン効果によって、センサ１の表面近傍に存在する非発光性色素を発光させることができるためである。なお、センサ１の表面から離れた箇所には、この局在表面プラズモンによる発光増強効果が及ばないため、この標識色素１９は依然として非発光状態のままとなる。

なお、発光量子収率Φとは、分子に吸収された光子数と蛍光により放出された光子数の比で定義される（数１参照）。ここでｋ_ｆが電子励起状態にある分子の蛍光遷移速度定数であり、ｋ_ｎｒが無輻射遷移速度定数（単位時間当たりに消光を起こす速さ）である。
（数１）
Φ＝ｋ_ｆ／（ｋ_ｆ＋ｋ_ｎｒ）

励起された分子のすべてが蛍光によって基底状態に戻れば、発光量子収率は１となり、この値に近い発光量子収率を持つ物質を「発光量子収率の高い物質」と呼ぶ。しかし、実際には、無輻射遷移によって１とはならない。無輻射遷移とは、蛍光を発しないで基底状態に戻る遷移である。発光量子収率が低い色素とはｋ_ｆ＜ｋ_ｎｒである色素のことである。なお、ｋ_ｆ＜＜ｋ_ｎｒの条件ではほとんど発光せず、このような条件を満たす色素を非発光性色素と呼ぶ。

本発明のセンサ１に色素などの標識物質１９が接触することで、分子発光双極子と双極子型表面プラズモン（局在表面プラズモン）の相互作用により、結果的に色素の輻射遷移速度ｋ_ｆが大きくなる。これにより、ｋ_ｆ＞＞ｋ_ｎｒとなるため、上式の発光量子収率が大きくなり、もともとは発光量子収率が０．０１以下の非発光性物質（ｋ_ｆ＜＜ｋ_ｎｒ）である色素でも光を強く発するようになる。

なお、標識物質１９としては、非発光性色素に代えて自家発光性（自家蛍光性）の物質を用いることもできる。発光量子収率が低い自家発光性物質としては、例えばコラーゲン、リボフラビン、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＦＤＨ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、有色タンパク質などが利用できる。

ここで、センサ１に固定化されている抗原５Ａは、抗体１５Ａと特異的に結合するもの、又は特異的に結合する候補として想定されているものが選択的に用いられる。つまり、前者であれば、抗体１５Ａと抗原５Ａとの結合程度の評価検査として、後者であれば、抗体１５Ａが抗原５Ａと特異的に結合するかどうかの確認検査として、本手法を利用できる。

標識物質１９によって標識された抗体１５Ａを含む溶液２０がセンサ１に注ぎ込まれ、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させると、抗原５Ａが抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有している場合、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａがセンサ１に固定化されている抗原５Ａと結合し、センサ１に固定化される。その際に、抗原５Ａと結合しない余分な抗体１５Ａは、溶液２０内で漂うことになる。一方、検査用特定体５としての抗原５Ａが被検体１５としての抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有していない場合には、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａはセンサ１に固定化されている抗原５Ａと結合せず、依然として溶液２０内で漂うことになる。

溶液２０をセンサ１に注ぎ込んで、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後、光源部４１からセンサ１に向けて光を入射させる。入射された光により増強電磁場形成層９において生成したプラズモン電場が、保護層１１の上面に固定化された抗原５Ａに伝搬する。ここで、抗原抗体反応により検査用特定体５に結合された結果、保護層１１に固定化された抗体１５Ａに対しても、この増強電磁場が伝搬する。これにより、抗体１５Ａの標識物質１９が発光する。受光部４３において、この標識物質１９の発光を受光し、受光光量を検出することで、抗原５Ａと結合した抗体１５Ａの数や濃度を分析することができる。

標識物質１９として非発光性の色素を利用すると、抗原５Ａと結合せず溶液２０内に漂っている抗体１５Ａに標識された標識物質１９からの光を受光部４３が受光することはない。このため、本手法によれば、抗原５Ａと結合した抗体１５Ａのみを残存させるための洗浄工程を行うことなく、抗原５Ａと結合した抗体１５Ａからの光のみを受光部４３が検出できる。また、標識物質１９として非発光性の色素を利用しても、抗原５Ａと結合した抗体１５Ａの標識物質１９に対しては、増強電磁場形成層９の光増強効果によって発光を生じさせることができる。このため、標識物質１９として利用可能な色素の選択性が広がる。

また、本実施形態のように被検体１５を抗体１５Ａとする場合、通常、溶液２０としては生理食塩水などのハロゲン化物イオンを含む溶液が用いられる。ところで、上述したように、本手法によれば、保護層１１の上面に固定化された抗原５Ａに対して、抗体１５Ａを含む溶液２０を接触させる。そして、局在表面プラズモン効果を実現させるために設けられた多数の金属微粒子１０は、その上層に形成された保護層１１によって覆われており、上面には露出していない。すなわち、溶液２０が直接に金属微粒子１０と接触することがない。この結果、金属微粒子１０をＡｇで構成していても、溶液２０に含まれるハロゲン化物イオンと反応してセンサチップ３から脱離するという事態を防ぐことができる。

〈センサ１の性能についての説明〉
以下、本発明のセンサ１が備える増強電磁場形成層９によって、光増強効果が実現できる点につき、実施例を参照しながら説明する。

なお、以下においては、あくまで増強電磁場形成層９が光増強効果を有することを説明する目的であるため、センサチップ３を用いて検証を行った。

（実施例１）
まず、実施例１のセンサチップ３の作製方法につき説明する。基板７として数ｃｍ角の大きさのスライドガラスを用い、このスライドガラスの表面上に、Ａｇを１０ｎｍ程度の厚みで蒸着させて金属微粒子１０を形成するためのＡｇ膜を形成した。その後、約１００℃のホットプレート上で、Ａｇ膜が形成された基板７を数分間加熱処理することにより、Ａｇ膜の粒状性を変化させて増強電磁場形成層９としての多数の金属（Ａｇ）微粒子１０によるＡｇ微粒子単層膜を形成した。得られたＡｇ微粒子単層膜における金属微粒子１０の粒径は、５０〜１５０ｎｍの範囲内にあり、厚さは平均で約２０ｎｍであり、金属微粒子１０の密度はおおよそ５×１０^９個／ｃｍ^２であった。

その後、ＲＦスパッタ装置「ＲＦＳ−２００型」（Ｕｌｖａｃ社製）を用いて、酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）をターゲットとして下記条件でスパッタを行うことにより、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に保護層１１を形成することでセンサチップ３を作製した。なお、保護層１１の厚さは、スパッタ時間を適宜に変更することにより調整した。

スパッタ条件は以下のとおりである。
・ターゲットから増強電磁場形成層９の表面までの離間距離：４５ｍｍ
・雰囲気：Ａｒ ３．０Ｐａ（放電時）
・放電出力：１００Ｗ
・ＲＦ周波数：１３．６ＭＨｚ
・保護層１１の成長速度：８．５ｎｍ／分

次に、実施例１として作製されたセンサチップ３に対する性能検証方法について説明する。センサチップ３に対し、保護層１１の表面上にローダミン６Ｇ色素（Ｒｈ６Ｇ：発光量子収率およそ１）の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に担持させた。センサチップ３の表面に担持される色素分子の密度とスピンコートに用いた溶液の色素濃度との関係は、ローダミン６Ｇ色素の濃度が１μＭである場合に、色素分子の担持量が３×１０^１１個／ｃｍ^２である。

そして、センサチップ３に対して励起光を照射して試料（色素分子）から発せられる光の強度を図３に示す測定装置により測定した。図３は、本発明のセンサの性能を検証するための測定装置の概念図である。ダイオードレーザ５０及びフィルタ５１によって光源部４１を構成し、光源部４１からセンサチップ３に対して光を入射させ、保護層１１の表面上に担持させた色素分子からの光を受光部４３によって受光する。受光部４３は、集光レンズ５２、フィルタ５３、受光ヘッド５４及び電子冷却型ダイオードアレイ検出器５５によって構成した。

より詳細には、ダイオードレーザ５０としては、出力１ｍＷ未満の緑色ダイオードレーザ（波長５３２ｎｍ）を用い、このダイオードレーザ５０からの射出光を、フィルタ５１を介して非集光（エネルギー密度約３０ｍＷ／ｃｍ^２）又は反集光（エネルギー密度約１０ｍＷ／ｃｍ^２以下）励起光としてセンサチップ３に対して、約４５°の角度で入射させる。そして、センサチップ３に担持された色素分子による９０°の角度方向に散乱される光を、集光レンズ５２によって、電子冷却型ダイオードアレイ検出器５５の受光ヘッド５４にフィルタ５３を介して集光した。

図３に示す測定装置による測定結果を図４に示す。図４において、縦軸は発光の増強度（単位：倍）を示しており、増強効果がないガラス基板上に担持された同じ量の色素について同じ方法で測定された発光強度に対する相対比率に対応する。

また、試料としてローダミン６Ｇ色素に代えて非発光性のフクシン色素（発光量子収率＜＜０．０１）を用い、保護層１１の表面上に３×１０^１２個／ｃｍ^２の密度で担持させ、上記と同様の方法により発光強度を測定した。この測定結果を図５に示す。

図４及び図５によれば、色素自体の発光量子収率とは関係なく、保護層１１の膜厚を２００ｎｍ以上としても高い発光増強率が維持されていることが分かる。特に、発光量子収率が０．０１未満、すなわち非発光性の色素に対しては、数千倍以上の光増強率が確保されていることが分かる。これにより、金属微粒子１０の上層に、所定の膜厚の保護層１１を形成しても、その上面にまで発光増強効果を伝搬できることが分かる。

なお、別の検証として、ダイオードレーザ５０に代えて出力１ｍＷ未満のＨｅ−Ｎｅレーザ（波長６３２．８ｎｍ）を励起光源として用いた他は、図３と同じ配置でローダミン６Ｇ色素のラマン散乱強度を保護層１１の厚さの関数として測定した。この結果、保護層１１の膜厚が２００ｎｍを超えても、色素分子が直接に金属微粒子１０に表面に吸着した場合に得られた信号と変わらない大きさの増強ラマン信号（増強度は約１０^５倍）が得られた。

このように増強効果が保護層１１の膜厚程度分伝搬する理由の一つとして、蒸着により配向性を持った誘電体で形成された柱状の保護層１１中では、プラズモン電界が乱されず、損失を受けずに保護層１１の表面にまで達する。従って、保護層１１の厚さをある程度大きくした場合であっても、金属微粒子１０に生ずる電磁場（局在表面プラズモン）が保護層１１の表面に伝達される。

（実施例２）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサチップ３に対し、フクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。より詳細には、センサチップ３の保護層１１の上面にフクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。

（比較例１）
基板７に対し、実施例２と同様にフクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。

そして、実施例２及び比較例１のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた光のスペクトル分布を調べた結果を図６に示す。なお、図６において、横軸は光の波長、縦軸は発光強度を表している。

図６を参照すると、実施例２の構成によれば、非発光性の標識物質１９であるフクシン色素は、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴ってフクシン色素が発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例１の構成によれば、発光の増強効果はなく、標識色素１９からの発光を受光することによる分析が困難であることが示唆される。

［第２実施形態］
本発明の第２実施形態につき、図面を参照して説明する。

図７は、本発明の第２実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。図７に示すセンサ１は、保護層１１の上面に固定化されている検査用特定体５が抗体５Ｂである点を除いて、第１実施形態と同じ構成であるため、説明を割愛する。なお、図７においても、図１と同様に、センサ１の正面図を模式的に示したものであり、図面上では検査用特定体５が保護層１１上に５つ描画されているが、実際には奥行き方向に多数の検査用特定体５が保護層１１上に形成されているものとして構わない。以下の実施形態においても同様とする。

図８は、第２実施形態のセンサを用いた検査方法を説明するための概念図である。ここでは、被検体１５として抗原１５Ｂを想定し、予め標識物質１９によって標識された抗原１５Ｂを含む溶液２０を、検査用特定体５として抗体５Ｂがセンサチップ３上に固定化されたセンサ１に対して接触させる。

この構成においても、第１実施形態と同様に、抗体５Ｂが抗原１５Ｂと特異的に結合する性質を有している場合、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後には、溶液２０内に含まれる抗原１５Ｂがセンサ１に固定化されている抗体５Ｂと結合し、センサ１に固定化される。その際に、抗体５Ｂと結合しない余分な抗原１５Ｂは、溶液２０内で漂うことになる。一方、抗体５Ｂが抗原１５Ｂと特異的に結合する性質を有していない場合には、溶液２０内に含まれる抗原１５Ｂは依然として溶液２０内で漂うことになる。

よって、溶液２０をセンサ１に注ぎ込んで、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後、光源部４１からセンサ１に向けて光を入射させ、受光部４３において標識物質１９の発光を受光して受光光量を検出することで、検査用特定体５と結合した被検体１５の数や濃度を分析することができる。

この方法においても、抗原１５Ｂと抗体５Ｂとの結合程度の評価検査や、抗原１５Ｂが抗体５Ｂと特異的に結合するかどうかの確認検査として利用できる。

［第３実施形態］
本発明の第３実施形態につき、図面を参照して説明する。なお、本実施形態のセンサ、第２実施形態のセンサ１と同一の構成であるため、センサの構成に関する説明を割愛する。

図９は、第３実施形態のセンサを用いた検査方法を説明するための概念図である。ここでは、溶液２０に、被検体１５と共に、この被検体１５と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補として想定されている第２検査用特定体６を含ませる。そして、この第２検査用特定体６に対して予め標識物質１９による標識を行なっておく。なお、本実施形態では、第２検査用特定体６と区別するために、センサチップ３に固定されている検査用特定体５を「第１検査用特定体５」と称する。

本実施形態では、第２実施形態と同様に、第１検査用特定体５として抗体５Ｂを想定し、被検体１５として抗原１５Ｂを想定する。また、第２検査用特定体６として抗体６Ａを想定する。

つまり、予め標識された第２検査用特定体６としての抗体６Ａと、被検体１５としての抗原１５Ｂを含む溶液２０を、第１検査用特定体５としての抗体５Ｂが固定されたセンサ１に注ぎ込む。そして、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後、光源部４１からセンサ１に向けて光を入射させ、受光部４３において標識物質１９の発光を受光して受光光量を検出する

これにより、抗原１５Ｂが抗体５Ｂ及び抗体６Ａと特異的に結合する性質を有していれば、抗原１５Ｂがセンサ１に固定された抗体５Ｂと結合してセンサ１に固定化されると共に、更に抗体６Ａとも結合する。この結果、標識物質１９で標識された抗体６Ａがセンサ１に固定化されるため、増強電磁場形成層９による増強電磁場が伝搬し、発光増強効果がこの抗体６Ａの標識物質１９に及ぶ。一方、抗原１５Ｂと結合せずに溶液２０中に残存する抗体６Ａは、溶液２０中に漂うことになり、この抗体６Ａの標識物質１９には増強電磁場形成層９による増強電磁場が伝搬しない。よって、受光部４３において受光光量を検出することで、溶液２０内における被検体１５としての抗原１５Ｂの濃度を測定することができる。

［第４実施形態］
本発明の第４実施形態につき、図面を参照して説明する。

図１０は、本発明の第４実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。図１０に示すセンサ１は、保護層１１の上面に固定化されている検査用特定体５が、抗原５Ａ及び抗体５Ｂを含む構成である点を除いて、第１実施形態と同じ構成であるため、説明を割愛する。なお、検査用特定体５としての抗原５Ａ及び抗体５Ｂは、相互に特異的に結合する性質を有するものとする。

図１１は、第４実施形態のセンサを用いた検査方法を説明するための概念図である。第１実施形態と同様に、被検体１５として抗体１５Ａを想定し、予め標識物質１９によって標識された抗体１５Ａを含む溶液２０を、検査用特定体５としての抗原５Ａ及び抗体５Ｂがセンサチップ３上に固定化されたセンサ１に対して接触させる。

この構成においても、第１実施形態と同様、抗原５Ａが抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有している場合、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後には、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａがセンサ１に固定化されている抗原５Ａと結合し、センサ１に固定化される。その際に、抗原５Ａと結合しない余分な抗体１５Ａは、溶液２０内で漂うことになる。一方、抗原５Ａが抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有していない場合には、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａは依然として溶液２０内で漂うことになる。

よって、溶液２０をセンサ１に注ぎ込んで、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後、光源部４１からセンサ１に向けて光を入射させ、受光部４３において標識物質１９の発光を受光して受光光量を検出することで、検査用特定体５と結合した被検体１５の数や濃度を分析することができる。

なお、この方法は、いわゆるサンドイッチ法を利用して被検体１５の数や濃度を分析する方法に対応する。従って、被検体１５として抗原１５Ｂを想定する場合においても、同様の方法による検査が可能である。また、第２実施形態のように、被検体１５としての抗体１５Ａに加えて、標識物質１９を標識した第２検査用特定体６としての抗原６Ａを含む溶液２０をセンサ１に注ぎ込む方法を採用することも可能である。

［第５実施形態］
本発明の第５実施形態につき、図面を参照して説明する。

図１２は、本発明の第５実施形態のセンサの構造を模式的に示す図面である。図１２に示すセンサ１は、保護層１１の上面に固定化されている検査用特定体５が、抗原５Ａ、抗体５Ｂ、及び抗体５Ｃを含む構成である点を除いて、第１実施形態と同じ構成であるため、説明を割愛する。なお、検査用特定体５としての抗体５Ｂ及び抗体５Ｃは、抗原５Ａと特異的に結合する性質を有するものとする。

図１３は、第５実施形態のセンサを用いた検査方法を説明するための概念図である。第１実施形態と同様に、被検体１５として抗体１５Ａを想定し、予め標識物質１９によって標識された抗体１５Ａを含む溶液２０を、検査用特定体５としての抗原５Ａ、抗体５Ｂ、及び抗体５Ｃがセンサチップ３上に固定化されたセンサ１に対して接触させる。

本手法では、抗体５Ｃとして、抗体１５Ａと特異的に結合するもの、又は結合する候補と想定されているものが採用される。この結果、抗体５Ｃが抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有していれば、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後には、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａがセンサ１に固定化されている抗体５Ｃと結合し、センサ１に固定化される。その際に、結合しない余分な抗体１５Ａは、溶液２０内で漂うことになる。一方、抗体５Ｃが抗体１５Ａと特異的に結合する性質を有していない場合には、溶液２０内に含まれる抗体１５Ａは依然として溶液２０内で漂うことになる。

よって、溶液２０をセンサ１に注ぎ込んで、抗原抗体反応に必要な所定の時間を待機させた後、光源部４１からセンサ１に向けて光を入射させ、受光部４３において標識物質１９の発光を受光して受光光量を検出することで、検査用特定体５と結合した被検体１５の数や濃度を分析することができる。

なお、この方法は、被検体１５としての抗体１５Ａを、二次抗体として機能する抗体５Ｃを介して抗原５Ａに結合させる態様である。第２実施形態のように、被検体１５としての抗体１５Ａに加えて、標識物質１９を標識した第２検査用特定体６としての抗原６Ａを含む溶液２０をセンサ１に注ぎ込む方法を採用することも可能である。

［第６実施形態］
本発明の第６実施形態につき、図面を参照して説明する。

上述の各実施形態では、被検体１５又は第２検査用特定体６に標識物質１９を標識し、センサ１（センサチップ３）に固定化された（第１）検査用特定体５と結合した被検体１５又は第２検査用特定体６の標識物質１９からの発光を受光部４３において受光して受光光量を検出することで、被検体１５の検査を行うものであった。これに対し、被検体１５自体に自家発光性が存在する場合には、上記のような標識物質１９の標識を必ずしも行わなくてもよい。

（実施例３）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサチップ３の保護層１１の上面に、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンの水溶液をスピンコートした。

（比較例２）
基板７に対し、実施例３と同様に、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンの水溶液をスピンコートした。

（実施例４）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサチップ３の保護層１１の上面に、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンの水溶液をスピンコートした。

（比較例３）
基板７に対し、実施例４と同様に、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンの水溶液をスピンコートした。

実施例３及び比較例２のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた発光のスペクトル分布を調べた結果を図１４に示す。同様に、実施例４及び比較例３のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた発光のスペクトル分布を調べた結果を図１５に示す。なお、図１４及び図１５において、横軸は光の波長、縦軸は発光強度を表している。

図１４を参照すると、実施例３の構成によれば、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンは、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴って生体高分子コラーゲンが発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例２の構成によれば、発光の増強効果はなく、自家発光性の生体高分子コラーゲンからの発光を受光することによる分析が困難であることが示唆される。

同様に、図１５を参照すると、実施例４の構成によれば、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンは、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴ってリボフラビンが発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例３の構成によれば、発光の増強効果はなく、自家発光性のリボフラビンからの発光を受光することによる分析が困難であることが示唆される。

このような自家発光性の物質を被検体１５とする場合においても、センサ１には、保護層１１の上面にこのような被検体１５と特異的に結合する性質を有する検査用特定体５を固定化しておき、生体高分子コラーゲンやリボフラビンなどの自家発光性を有する被検体１５を含む溶液２０をセンサ１に注ぎ込むことで、検査が可能である。比較例２及び比較例３に示すように、増強電磁場形成層９による発光増強作用を受けることができない場合には、被検体１５からの発光を検知できないことから、検査用特定体５と結合されずに溶液２０中に漂っている自家発光性を有する被検体１５からの光についても、やはり受光部４３において検知できないことが分かる。この結果、上述した抗原抗体反応と同様の原理により、本発明の手法によって生体高分子コラーゲンやリボフラビンなどの自家発光性を有する被検体１５の数や濃度を検査することができる。

［第７実施形態］
本発明の第７実施形態につき、図面を参照して説明する。

本実施形態におけるセンサは、上述した各実施形態のセンサ１が備える保護層１１に対して、予めハロゲン元素を含有させた点のみが異なり、他は共通である。保護層１１に対してハロゲン元素を含有させる方法としては、保護層１１が形成されたセンサチップ３に対してハロゲン化物塩の水溶液に浸漬する方法を用いることができる。例えば、ハロゲン化物塩水溶液の濃度が０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌの場合には、５〜３０分間程度の室温浸漬により最大の効果を得ることができるが、水溶液の濃度がそれより高い場合、あるいは逆に低い場合には、その濃度に応じて浸漬時間を調整することにより同等の効果を得ることができる。なお、保護層１１におけるハロゲン元素の含有割合は、０．００２質量％〜０．０５質量％であることが好ましい。

なお、上記ハロゲン化物塩の具体例としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）などのアルカリ金属塩や、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。

このように予めハロゲン化物塩水溶液にセンサチップ３を浸漬させた場合においても、多数の金属微粒子１０はその周囲及び上方を保護層１１で覆われているため、ハロゲン化物イオンが直接金属微粒子１０に接触して、金属微粒子１０がハロゲン化物イオンと反応して基板７から脱離してしまうということがない。そして、このように保護層１１に予めハロゲン元素を含有させることで、後述の実施例に示すように、光増強効果を更に高めることができる。

（実施例５）
実施例１と同様の方法を用い、ＲＦスパッタ装置による処理時間を調整して、厚さが１００ｎｍの保護層１１を有するセンサチップ３を作製した。その後、塩化物イオンの濃度が０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウム水溶液中に、増強電磁場形成層９及び保護層１１が形成された基板７を約３０分間浸漬させ、その後、純水で洗浄して乾燥することにより、保護層１１中にハロゲン化物イオンを含有させて、本実施例のセンサチップ３とした。この方法で得られた光増強素子における保護層に含有されたハロゲン元素の含有割合は正確には決定することが難しいが、およそ０．０１質量％のオーダーと推定される。そして、このセンサチップ３の保護層１１の上面に、ローダミン６Ｇ色素の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に３×１０^１１個／ｃｍ^２の密度で担持させた。

なお、比較のために、塩化ナトリウム水溶液に浸漬させなかった以外は同様の方法でセンサチップ３についても作製した。なお、このセンサチップ３は、第１実施形態の項で上述した実施例１の素子に対応する。

そして、実施例５及び実施例１のセンサチップ３に対し、励起光を照射して試料（色素分子）から発せられるラマン散乱光の強度を、ダイオードレーザ５０に代えて出力１ｍＷ未満のＨｅ−Ｎｅレーザ（波長６３２．８ｎｍ）を励起光源として用いた他は、図３と同じ測定装置により測定した。この結果を図１６に示す。なお、図１６のグラフ、縦軸はラマン散乱強度（ｃｐｓ）を示し、横軸はラマンシフト（ｃｍ^−１）を示す。

図１６では、実施例５と実施例１のそれぞれのセンサチップ３に対して、ラマン散乱光の強度を比較した。これは、ラマン散乱光自体の強度が蛍光の強度よりも小さいため、両者の光増強効果を比較する上での比較のしやすさを考慮して行われたものである。ハロゲン化物イオンを浸漬した実施例５の方が、ハロゲン化物イオンを浸漬しなかった実施例１よりも顕著なラマン信号が観測されており、光の増強効果が更に高いことが示唆される。

図１６における、ハロゲン化物イオンを浸漬しなかった実施例１のセンサチップ３においても、第１実施形態で上述したように、蛍光の強度を極めて高くする効果は得られている。またハロゲン化物イオンを浸漬した実施例５では、実施例１よりも更に発光増強効果が高くなっていることが示唆される。

なお、実施例５では、塩化物イオンの濃度が０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウム水溶液を浸漬させたが、これに代えて、塩化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである塩化カリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、臭化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである臭化ナトリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、ヨウ化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌであるヨウ化カリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、塩化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである塩化カルシウム水溶液を浸漬させて形成した素子についても、同様の測定を行った結果、実施例５と同様に高いラマン散乱光を受光できた。一方、塩化ナトリウム水溶液の代わりに硫酸イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである硫酸ナトリウム水溶液を浸漬させて形成した素子について同様の測定を行ったところ、受光したラマン散乱光の強度は低いものであった。このことから、保護層１１にハロゲン元素を添加した場合に、光増強効果を更に高められることが分かる。

［第８実施形態］
本発明の第８実施形態につき、図面を参照して説明する。

本実施形態におけるセンサは、上述した各実施形態のセンサ１が備える保護層１１を、結晶性（配向性）を有する有機物の重合体で構成した点のみが異なり、他は共通である。

なお、この有機物の重合体としては、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル系重合体、ポリビニルアルコールなどを利用することができる。この場合、保護層１１の形成方法としては、保護層形成液をスピンコート法、デイップコート法、スプレーコート法、スリットコート法、バーコート法などを用いて基板７に滴下又は塗布することで実現できるが、スピンコート法は厚さが最も均一な保護層１１を形成する方法として好適に用いることができる。

なお、この保護層１１にハロゲン元素を含有させる場合、保護層形成液としては、溶媒中に所定の重合体およびハロゲンの金属塩を溶解させることにより、或いは溶媒中に所定の重合体が溶解されてなる重合体溶液と、溶媒中にハロゲンの金属塩が溶解されてなる金属塩溶液とを混合することにより、調製することができる。

保護層形成液を調製するための溶媒としては、用いられる重合体および金属塩に応じて適宜選択される。具体的には、用いられる重合体および金属塩を溶解し得るものであればよい。例えば、重合体としてポリビニルアルコール等の水溶性のものを用いる場合には、溶媒として水を用いることができる。また、重合体として水に不溶な重合体例えばポリメチルメタクリレートを用いる場合には、重合体溶液を調製するための溶媒として例えばシクロヘキサノンを用いると共に、金属塩溶液を調製するための溶媒として水とアセトンとの混合溶媒を用い、重合体溶液と金属塩溶液とを混合することによって、保護層形成液を調製することができる。

保護層形成液中における重合体の含有割合は、上記塗布方法と目的とする保護膜の厚さとの組合せによって決定される。例えばスピンコート法（３０００ｒｐｍ）を用いてポリビニルアルコール膜をその水溶液から形成する場合において、膜厚を１００ｎｍに調整するために必要な重合体の含有割合は約４．５質量％である。保護層形成液中における金属塩の割合は、目的とする保護層４０中のハロゲン元素の含有割合や、保護層形成液中の重合体の含有割合に応じて設定される。

（実施例６）
実施例１と同様の方法で、基板７上に増強電磁場形成層９としての多数の金属（Ａｇ）微粒子１０によるＡｇ微粒子単層膜を形成した。

また、純水中に、５質量％のポリビニルアルコール（和光純薬工業（株）製，重合度約５００）、及び０．２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムが溶解されてなる保護層形成液を調製した。その後、スピンコート法によって、基板７の表面に、調製した保護層形成液を塗布して約６０℃で乾燥すると共に結晶化を促すことにより、基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に保護層１１を形成することでセンサチップ３を作製した。なお、保護層１１は、結晶度が５０％以上で厚さが１１０ｎｍであった。

そして、このセンサチップ３の保護層１１の上面に、ローダミン６Ｇ色素の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に３×１０^１１個／ｃｍ^２の密度で担持させた。

（実施例７）
保護層形成液を、以下のようにして調製されたものに変更したこと以外は、実施例６と同様にして光増強素子を製造した。すなわち、シクロヘキサノン（和光純薬工業（株）製）中に３質量％のポリメチルメタクリレート（和光純薬工業（株）製）が溶解されてなる重合体溶液を調製した。一方、純水とアセトンとが質量比で１：１の割合で混合されてなる混合溶媒中に、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムが溶解されてなる金属塩溶液を調製した。そして、重合体溶液と金属塩溶液とを容量比９：１で混合することにより、保護層形成液を調製した。

そして、第７実施形態の図１６と同様の方法により、実施例６及び実施例７のセンサチップ３に対し、励起光を照射して試料（色素分子）から発せられるラマン散乱光の強度を測定した。この結果を図１７に示す。図１６と同様に、図１７のグラフにおいても、縦軸はラマン散乱強度（ｃｐｓ）を示し、横軸はラマンシフト（ｃｍ^−１）を示す。図１７のグラフより、保護層１１を有機物の重合体で構成した場合であっても、強いラマン散乱信号が確認できており、保護層１１の上面に光増強効果が伝搬できていることが分かる。

なお、実施例６及び実施例７では、いずれも保護層１１にハロゲン元素を含有した構成としたが、保護層１１として、ハロゲン元素を含有せずに有機物の重合体で構成しても構わない。

［別実施形態］
上記の各実施形態において、センサ１を、高反射層および誘電体層を更に具えた多層構造を有する構成としてもよい。このような構造のものにおいては、基板７の表面上に高反射層および誘電体層がこの順で形成され、誘電体層の表面上に増強電磁場形成層９が形成される。

１ ： センサ
３ ： センサチップ
５ ： （第１）検査用特定体
５Ａ ： （第１）検査用特定体としての抗原
５Ｂ ： （第１）検査用特定体としての抗体
５Ｃ ： （第１）検査用特定体としての抗体
６ ： 第２検査用特定体
６Ａ ： 第２検査用特定体としての抗体
７ ： 基板
９ ： 増強電磁場形成層
１０ ： 金属微粒子
１１ ： 保護層
１５ ： 被検体
１５Ａ ： 被検体としての抗体
１５Ｂ ： 被検体としての抗原
１９ ： 標識物質
２０ ： 被検体を含む溶液
３０ ： 容器
４１ ： 光源部
４３ ： 受光部
５０ ： ダイオードレーザ
５１ ： フィルタ
５２ ： 集光レンズ
５３ ： フィルタ
５４ ： 受光ヘッド
５５ ： 電子冷却型ダイオードアレイ検出器
９０ ： 試験管
９１ ： 固相抗体
９２ ： 蛍光色素
９３ ： 抗原
９４ ： 抗体（標識抗体）
９６ ： 光源部
９７ ： 受光部

Claims (12)

1. 被検体の検査に利用されるセンサであって、
   前記被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体がセンサチップ上に固定されており、
   前記センサチップは、基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を構成しており、
   前記検査用特定体は、前記保護層の表面上に固定されていることを特徴とするセンサ。
2. 前記検査用特定体が抗体又は抗原の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
3. 前記保護層は、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向性を有する有機物の重合体で構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンサ。
4. 前記保護層は、ハロゲン元素を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサ。
5. 検査方法であって、
   基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
   被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である検査用特定体を前記保護層の表面に固定してセンサを形成する工程（ｂ）、
   非発光性色素若しくは自家発光性物質で構成された標識物質で標識された前記被検体、又は自家発光性を有する前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程（ｃ）、
   光源部から前記センサに光を照射して、前記検査用特定体に結合された前記被検体に標識された前記標識物質又は自家発光性を有する前記被検体を発光させる工程（ｄ）、
   及び、受光部が、前記工程（ｄ）における発光を受光する工程（ｅ）を有することを特徴とする検査方法。
6. 検査方法であって、
   基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
   被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である第１検査用特定体を前記保護層の表面に固定してセンサを形成する工程（ｂ）、
   前記被検体、並びに、非発光性色素若しくは自家発光性物質で構成された標識物質で標識され又は自家発光性を有すると共に、被検体と特異的に結合する、又は特異的に結合する候補である第２検査用特定体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程（ｃ）、
   光源部から前記センサに光を照射して、前記第１検査用特定体に結合した前記被検体と結合した前記第２検査用特定体に標識された前記標識物質又は自家発光性を有する前記第２検査用特定体を発光させる工程（ｄ）、
   及び、受光部が、前記工程（ｄ）における発光を受光する工程（ｅ）を有することを特徴とする検査方法。
7. 前記工程（ｂ）が、前記検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程であり、
   前記工程（ｃ）が、抗体又は抗原で構成される前記被検体に非発光性色素又は自家発光性物質で標識したものを含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程であることを特徴とする請求項５に記載の検査方法。
8. 前記工程（ｂ）が、前記検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程であり、
   前記工程（ｃ）が、抗体又は抗原で構成され自家発光性を有する前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程であることを特徴とする請求項５に記載の検査方法。
9. 前記工程（ｂ）が、前記第１検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程であり、
   前記工程（ｃ）が、抗体又は抗原の少なくとも一方で構成される前記第２検査用特定体に非発光性色素又は自家発光性物質で標識したもの、及び前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程であることを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
10. 前記工程（ｂ）が、前記第１検査用特定体として抗体又は抗原の少なくとも一方を前記保護層の表面に固定する工程であり、
    前記工程（ｃ）が、抗体又は抗原の少なくとも一方で構成され、自家発光性を有する前記第２検査用特定体、及び前記被検体を含む流体を、前記光増強素子に接触させる工程であることを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
11. 前記保護層は、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向性を有する有機物の重合体で構成されていることを特徴とする請求項５〜１０のいずれか１項に記載の検査方法。
12. 前記保護層は、ハロゲン元素を含有することを特徴とする請求項５〜１１のいずれか１項に記載の検査方法。

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