WO2020179611A1 - 検出方法 - Google Patents

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WO2020179611A1
WO2020179611A1 PCT/JP2020/008010 JP2020008010W WO2020179611A1 WO 2020179611 A1 WO2020179611 A1 WO 2020179611A1 JP 2020008010 W JP2020008010 W JP 2020008010W WO 2020179611 A1 WO2020179611 A1 WO 2020179611A1
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WO
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substance
fluorescence
metal film
image
light
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/008010
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English (en)
French (fr)
Inventor
哲 石坂
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a detection method using surface plasmon resonance.
  • SPFS Surface plasmon resonance fluorescence analysis
  • Patent Document 1 discloses, as a measurement method using such surface plasmon resonance fluorescence analysis, a substance to be detected labeled with a fluorescent substance is immobilized on a sensor portion of a sensor chip, and fluorescence generated from the fluorescent substance by excitation light is detected. Disclosed is a measuring method of acquiring an image and measuring the number of fluorescent labels from the image.
  • the measuring method for measuring the number of fluorescent labels from the above image is not affected by electrical noise such as shot noise because light is not detected by the photoelectric conversion element. Therefore, it is considered that the S/N ratio does not decrease and accurate measurement can be performed. However, as a result of examination by the present inventors, they found that the measurement method described in Patent Document 1 may not be able to perform accurate measurement.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and a detection method for detecting the presence or amount of a substance to be detected by measuring the number of bright spots from an image acquired by using surface plasmon resonance fluorescence analysis. It is an object of the present invention to provide a detection method capable of more accurate quantification.
  • a detection method is a fluorescent substance that labels a substance to be detected captured by a capture substance immobilized on a metal film, and emits fluorescence when excited by an electric field based on surface plasmon resonance.
  • a detection method for detecting the presence or amount of the substance to be detected wherein when the fluorescence emitted by the fluorescent substance is detected, the number of bright spots due to the fluorescence is 400 or more.
  • the substance to be detected is more quantitative. Can be detected.
  • FIG. 1 is a diagram showing a surface plasmon resonance fluorescence analyzer that can be used in a detection method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the detection method according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows an optical system of the surface plasmon resonance fluorescence analyzer shown in FIG.
  • FIG. 4 shows how raindrops fall on a tile, which is an example according to the Poisson distribution.
  • FIG. 1 is a diagram showing a surface plasmon resonance fluorescence analyzer (SPFS device) 100 that can be used in a detection method according to an embodiment of the present invention.
  • the SPFS apparatus 100 includes a light source 120 for irradiating the analysis chip 10 with the excitation light ⁇ , an imaging unit 140 for detecting light emitted from the analysis chip 10 (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ), and these components. And a control unit 160 for controlling.
  • the SPFS device 100 is used together with the analysis chip 10. Therefore, the analysis chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the analysis chip 10 includes a dielectric 20 having an incident surface 21, a film formation surface 22 and an emission surface 23, a metal film 30 formed on the film formation surface 22, a film formation surface 22 or The channel cover 40 is disposed on the metal film 30.
  • the analysis chip 10 is replaced after each analysis.
  • the dielectric 20 is made of a member (prism) transparent to the excitation light ⁇ .
  • the dielectric 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22 and an emitting surface 23.
  • the incident surface 21 causes the excitation light ⁇ from the light source 120 to enter the inside of the dielectric body 20.
  • the metal film 30 is formed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ that has entered the inside of the dielectric 20 is reflected by the metal film 30. More specifically, the light is reflected at the interface (deposition surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30.
  • the emission surface 23 emits the excitation light ⁇ reflected by the metal film 30 to the outside of the dielectric 20.
  • the shape of the dielectric 20 is not particularly limited.
  • the shape of the dielectric body 20 is a column body having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film forming surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emitting surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid.
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ is not incident perpendicularly to the incident surface 21 in the scanning range centered on the ideal enhancement angle.
  • the angle between the incident surface 21 and the film forming surface 22 and the angle between the film forming surface 22 and the emitting surface 23 are both about 80 °.
  • the material of the dielectric 20 include resin and glass.
  • the material of the dielectric 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is formed on the film formation surface 22 of the dielectric 20.
  • an interaction surface plasmon resonance; SPR
  • SPR surface plasmon resonance
  • An enhanced electric field localized field light
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that causes surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum and alloys thereof.
  • the metal constituting the metal film 30 is preferably gold from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption of substances in the sample.
  • the metal forming the metal film 30 is gold.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of methods for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a trapping substance for trapping the substance to be detected is immobilized on the surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20. By immobilizing the capture substance, it becomes possible to selectively detect the substance to be detected.
  • the area of the region where the capture substance is immobilized on the metal film 30 may be an area where an imaging range in which the number of bright spots due to fluorescence is 400 or more can be obtained.
  • the trapping substance is uniformly immobilized in a predetermined region on the metal film 30.
  • the type of trapping substance is not particularly limited as long as it can trap the substance to be detected.
  • the capture substance is an antibody or a fragment thereof specific to the substance to be detected.
  • the trapping substance may be immobilized on the metal film 30 via the self-assembled monolayer formed on the metal film 30 and the hydrophilic polymer layer formed thereon. That is, the trapping substance may be immobilized on the metal film 30 via a self-assembled monolayer and a hydrophilic polymer. In this case, a capture substance layer mainly containing a capture substance is formed on the hydrophilic polymer layer.
  • carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms is usually used, and 10-carboxy-1-decanethiol is particularly preferably used.
  • the hydrophilic polymer is preferably one that can mediate the bond between the self-assembled monomolecule and the capture substance.
  • dextran such as carboxymethyl dextran (CMD) is preferable as the polysaccharide
  • polyacrylic acid is preferable as the resin.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • These polymers have a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH), and the inclusion of water molecules by hydrogen bonds can prevent the adsorption of non-specific proteins.
  • the thickness (spacing) between the trapping substance layer and the metal film is not particularly limited, but is preferably 40 nm or more and 100 nm or less. When the thickness is 40 nm or more, weakening of fluorescence due to metal quenching can be prevented. When the thickness is 100 nm or less, it is possible to prevent the fluorescent substance from falling out of the range of the enhanced electric field due to surface plasmon resonance.
  • the thickness of the trapping substance layer is not particularly limited, but is preferably 100 nm or less. Since the thickness is 100 nm or less, for example, even if the fluorescent labeling substance has a size of several tens of nm or more (for example, PID (Phosphor Integrated Dot)), it enters the capture substance layer and is captured by the capture substance. It becomes easy to label the detected substance (for example, an antigen) thus detected.
  • PID Phosphor Integrated Dot
  • the flow path lid 40 is arranged with the flow path 41 interposed therebetween on a surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20.
  • the flow path lid 40 may be disposed on the film formation surface 22 with the flow path 41 interposed therebetween.
  • the area of the bottom surface of the flow channel 41 may be an area that can obtain an imaging range in which the number of bright spots due to fluorescence is 400 or more.
  • the flow path lid 40 forms, together with the metal film 30 (and the dielectric 20), a flow path 41 through which a liquid such as a sample, a fluorescent labeling liquid, and a cleaning liquid flows.
  • the trapping substance is exposed in the flow channel 41. Both ends of the channel 41 are connected to an inlet and an outlet (both not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40. When liquids are injected into the flow path 41, these liquids come into contact with the trapping material in the flow path 41.
  • the channel cover 40 is made of a material that is transparent to the light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20 and its vicinity.
  • the material of the flow path lid 40 include resin.
  • a part of the flow path lid 40 may be made of an opaque material as long as these lights can be guided to the imaging unit 140.
  • the flow path lid 40 is bonded to the metal film 30 or the dielectric 20 by, for example, adhesion with a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, pressure bonding using a clamp member, or the like.
  • the excitation light ⁇ guided to the dielectric 20 is incident on the dielectric 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ that has entered the dielectric 20 enters the interface (deposition surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30 at a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs).
  • the reflected light from the interface is emitted from the emitting surface 23 to the outside of the dielectric body 20.
  • the excitation light ⁇ is incident on the interface at an angle at which the surface plasmon resonance occurs, the plasmon scattered light ⁇ and/or the fluorescence ⁇ is emitted from the metal film 30 and the vicinity thereof toward the imaging unit 140.
  • the SPFS device 100 includes a light source 120, a lens 141, an excitation light cut filter 143, an imaging unit 140, and a control unit 160.
  • the light source 120 emits the excitation light ⁇ .
  • the position and orientation of the light source 120 are adjusted by the controller 160.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the interface (deposition surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30 is adjusted.
  • the metal film 30 is irradiated with the excitation light ⁇ , the plasmon scattered light ⁇ having the same wavelength as the excitation light ⁇ and the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance are emitted from the surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20 and its vicinity. Etc. are released upward. Further, the excitation light ⁇ is reflected at the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 and is emitted from the exit surface 23 to the outside of the dielectric 20.
  • the light source 120 is a laser diode (hereinafter abbreviated as “LD”) and emits the excitation light ⁇ (single-mode laser light) toward the incident surface 21 of the analysis chip 10. More specifically, the light source 120 uses only P waves with respect to the interface so that the excitation light ⁇ has a total reflection angle with respect to the interface (deposition surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30 of the analysis chip 10. Is emitted toward the incident surface 21.
  • LD laser diode
  • the type of the light source 120 is not particularly limited, and may be LD.
  • Examples of the light source 120 include a light emitting diode, a mercury lamp, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source 120 is preferably converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source 120 is not monochromatic light, the light emitted from the light source 120 is preferably converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source 120 is not linearly polarized light, it is preferable that the light emitted from the light source 120 be converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the lens 141 forms an image of the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 on the light receiving surface of the imaging unit 140.
  • the optical system formed by the lens 141 will be described with reference to FIG.
  • FIG. 3 shows an optical system of the surface plasmon resonance fluorescence analyzer 100 shown in FIG.
  • the light receiving surface of the image pickup unit 140 is a square, and the number of pixels on the image pickup surface is 10,000,000 and the length of one side of the pixel is 0.005 mm as a representative value of available image pickup elements.
  • the area of the metal film 30 to be imaged becomes too large, it becomes difficult to maintain the uniformity of the excitation light and the solid phase film, so it is assumed to be 1 mm 2 (the length of one side of the imaging region is 1 mm).
  • the magnification rate (lateral magnification) required by the lens 141 at this time is 16 times. In practice, it is preferable to set the enlargement ratio by the lens 141 to 4 to 64 times, taking into consideration about 1/4 to 4 times the arbitrariness of the pixel size of the image sensor and the combination of the number of pixels.
  • the object-image distance L is approximately represented by the following formula (1) using the focal length f of the lens 141.
  • the focal length f of the lens 141 should be short in order to avoid an increase in size of the apparatus, and it is desirable to suppress it to 10 times or less with respect to the maximum image height Y of the imaging unit 140.
  • the focal length f of the lens 141 is preferably 113 mm or less.
  • the focal length f of the lens 141 is equal to or greater than the maximum image height Y of the imaging unit 140.
  • the focal length f of the lens 141 is preferably the maximum image height Y or more and 10 times or less of the imaging unit 140.
  • the excitation light cut filter 143 is arranged between the lens 141 and the imaging unit 140.
  • the excitation light cut filter 143 transmits the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 and blocks light having the same wavelength as the excitation light ⁇ (for example, plasmon scattered light ⁇ and stray light of the excitation light ⁇ ).
  • the excitation light cut filter 143 blocks the plasmon scattered light ⁇ and the like while allowing the fluorescence ⁇ to pass therethrough, thereby preventing the light other than the wavelength of the fluorescence ⁇ from reaching the imaging unit 140.
  • the excitation light cut filter 143 removes a noise component from the light emitted from the metal film 30 and enables the imaging unit 140 to detect the fluorescence ⁇ with a high S/N ratio. It contributes to improvement of detection accuracy and sensitivity.
  • the type of the excitation light cut filter 143 is not particularly limited as long as it can pass the fluorescence ⁇ and block the light having the same wavelength as the excitation light ⁇ (for example, plasmon scattered light ⁇ ).
  • the excitation light cut filter 143 may be an absorption filter that transmits the fluorescence ⁇ and absorbs the light of the wavelength of the excitation light ⁇ , or may transmit the fluorescence ⁇ and reflect the light of the wavelength of the excitation light ⁇ . It may be a reflection filter. From the viewpoint of improving the S/N ratio, the excitation light cut filter 143 is preferably an absorption filter.
  • a reflection filter such as a dielectric multilayer film may transmit light having the same wavelength as the excitation light ⁇ depending on the incident angle, but an absorption filter such as colored glass has the same wavelength as the excitation light ⁇ regardless of the incident angle. It is possible to block light of a wavelength. Further, since the reflection filter reflects light having the same wavelength as the excitation light ⁇ , it may cause stray light.However, the absorption filter absorbs light having the same wavelength as the excitation light ⁇ , which causes stray light. There is nothing to do.
  • the excitation light cut filter 143 is an absorption filter. Alternatively, the absorption filter may be mainly used together with the reflection filter.
  • the transmittance of light having the same wavelength as the excitation light ⁇ in the excitation light cut filter (absorption filter) 143 is not particularly limited, but is preferably 1% or less from the viewpoint of improving the S/N ratio.
  • the absorption filter 143 for example, when the wavelength of the excitation light ⁇ is 635 to 640 nm which is often used as a laser diode, W-R665 manufactured by HOYA or the like can be used.
  • the imaging unit 140 is arranged so as to face a surface of the metal film 30 of the analysis chip 10 that does not face the dielectric 20.
  • the imaging unit 140 images the light (plasmon scattered light ⁇ or fluorescence ⁇ ) emitted from the metal film 30.
  • the light receiving unit of the image pickup unit 140 is composed of an image pickup device.
  • the lens 141, the absorption filter 143, and the imaging unit 140 are arranged in this order from the metal film 30 side so as to face the surface of the metal film 30.
  • the control unit 160 centrally controls the light source 120, the excitation light cut filter 143, and the imaging unit 140. Specifically, the control unit 160 controls the position and orientation of the light source 120, and sets the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 to a predetermined angle. When determining the enhancement angle, the control unit 160 removes the excitation light cut filter 143 from the optical path so that the plasmon scattered light ⁇ reaches the imaging unit 140. Further, the control unit 160 arranges the excitation light cut filter 143 on the optical path when capturing an image of the bright spot due to the fluorescence ⁇ , and the light having the same wavelength as the excitation light ⁇ (the plasmon scattered light ⁇ or the stray light of the excitation light ⁇ ). Does not reach the imaging unit 140. Further, the control unit 160 controls the image capturing unit 140 to set an image capturing range to a predetermined range and acquire an image.
  • the control unit 160 is, for example, a computer that executes software.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a detection method using the SPFS device 100 according to the embodiment of the present invention.
  • step S10 prepare for measurement (step S10).
  • the analysis chip 10 is installed at a predetermined position of the SPFS device 100.
  • the flow channel 41 is washed to remove the moisturizer so that the trapping substance can properly capture the substance to be detected.
  • the substance to be detected in the sample is allowed to react with the capture substance (primary reaction, step S20). Specifically, the sample is injected into the flow channel 41 to bring the sample into contact with the capture substance. When the substance to be detected is present in the sample, at least part of the substance to be detected is captured by the capture substance. After that, the inside of the flow channel 41 is washed with a buffer solution or the like to remove the substance that is not captured by the capture substance.
  • the type of sample is not particularly limited. Examples of specimens include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nostril fluid, saliva, semen and dilutions thereof. When diluting the sample, it is preferable to adjust the dilution rate of the sample so that the number of bright spots in the imaging range is 400 or more in step S60 described later.
  • the enhancement angle is measured (step S30). Specifically, while irradiating the predetermined position of the metal film 30 (deposition surface 22) with the excitation light ⁇ , the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is scanned to obtain an optimum value. Determine the angle of incidence. This is because the control unit 160 controls the light source 120 to irradiate a predetermined position on the metal film 30 (deposition surface 22) with the excitation light ⁇ , and the excitation light ⁇ on the metal film 30 (deposition surface 22). It is performed by scanning the incident angle of.
  • control unit 160 controls the absorption filter 143 so that it does not exist on the optical path, and the imaging unit 140 detects the plasmon scattered light ⁇ from the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and the vicinity thereof).
  • the imaging unit 140 is controlled.
  • the plasmon scattered light ⁇ from the top of the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity) reaches the imaging unit 140 via the lens 141.
  • the control unit 160 obtains data including the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the plasmon scattered light ⁇ .
  • the control unit 160 analyzes the data to determine the incident angle (enhanced angle) at which the intensity of the plasmon scattered light ⁇ is maximized.
  • the enhancement angle is basically determined by the material and shape of the dielectric 20, the thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow channel 41, and the like, but the type and amount of the substance in the flow channel 41, It slightly fluctuates due to various factors such as the shape error of the dielectric 20. Therefore, it is preferable to determine the enhancement angle each time the analysis is performed.
  • the enhancement angle is determined on the order of 0.1°.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is set to the enhancement angle determined in the previous step (step S40). Specifically, the control unit 160 controls the light source 120 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the metal film 30 (deposition surface 22) to the enhancement angle. In the subsequent steps, the angle of incidence of the excitation light ⁇ on the metal film 30 (deposition surface 22) remains the enhanced angle.
  • the substance to be detected captured by the capture substance is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S50).
  • the fluorescent labeling liquid is injected into the flow channel 41.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing an antibody (secondary antibody) labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent labeling solution comes into contact with the substance to be detected, and the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance.
  • the inside of the flow channel 41 is washed with a buffer solution or the like to remove free fluorescent substances and the like.
  • the excitation light ⁇ is applied to the metal film 30 (deposition surface 22) to detect the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance on the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity), and the fluorescence ⁇ is emitted.
  • the imaging range is set so that the number of points is 400 or more (step S60).
  • the control unit 160 controls the light source 120 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control unit 160 controls the imaging unit 140 so that the imaging unit 140 detects the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 (the metal film 30 and the vicinity thereof).
  • the control unit 160 measures the number of bright spots due to the fluorescence ⁇ , and if the number of bright spots is less than 400, the imaging range is expanded. Thereby, the imaging range is set such that the number of bright spots due to fluorescence is 400 or more.
  • control unit 160 moves the absorption filter 143 so that the absorption filter 143 exists on the optical path.
  • the absorption filter 143 does not transmit the plasmon scattered light ⁇ , so that only the fluorescence ⁇ is detected by the imaging unit 140.
  • the excitation light ⁇ is applied to the metal film 30 (deposition surface 22), and an image of the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance on the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and the vicinity thereof) in the set image range. Is acquired (step S70). Specifically, the control unit 160 acquires the image obtained by the imaging unit 140 as processable data.
  • the control unit 160 extracts the bright spots due to the fluorescence ⁇ from the image data and counts the number of bright spots. From the number of bright spots, the amount (or concentration) of the substance to be detected in the sample can be determined.
  • the method for extracting the bright spots is not particularly limited and can be appropriately selected from known image processing methods. For example, when the standard deviation ⁇ of the brightness of the pixels around the specific pixel and the difference x between the brightness of the specific pixel and the average value of the brightness of the surrounding pixels satisfy the relation of x>10 ⁇ , It may be determined that there is a bright spot at the pixel position.
  • the low frequency component in the background may be removed by a known trend removing method. As a result, noise components can be removed, and more accurate quantification can be performed.
  • the number of bright spots due to fluorescence existing in the area that can be observed in one measurement will vary before and after the average value, and this variation is described as a Poisson distribution.
  • a similar example is that the number of raindrops falling on a plurality of tiles having the same area on the sidewalk at the start of rain varies depending on the tiles. An example of how raindrops fall on this tile is shown in FIG. Although there are 25 tiles in FIG. 4, the number of raindrops in each tile varies.
  • the lower limit of quantification for concentration measurement is CV (coefficient of variation) of 10%, but this is a variation including all processes in measurement such as liquid feeding, dilution, and environmental change, and achieves CV of 10%. Therefore, it is necessary to secure at least CV 5% or less (S/N of 20 or more), preferably CV 3% or less (S/N of 33 or more) as the detection system alone (surface plasmon enhanced fluorescence measurement system alone).
  • CV is 5.0% or less, and more accurate quantification is possible. It is thought that you can do it.
  • the upper limit of the number of bright spots in one image is not particularly limited, but the upper limit can be set in consideration of the fact that the overlapping of bright spots does not occur in the image.
  • the number of pixels of the imaging unit 140 is N and the number of bright spots is m. Observing m bright points with N image sensors can be said to be an operation of throwing m bright points into N image sensors. Here, in order to cause almost no overlap of bright spots, the number m of bright spots needs to be extremely sparse with respect to N image elements.
  • the upper limit of the number of bright spots may be, for example, 3000 or less, or 150,000 or less.
  • the upper limit of the number of pixels is set from the viewpoint of the availability and price of the image pickup device, and the lower limit is set from the viewpoint that the range of the number of bright spots does not become too narrow.
  • the pixel size of the image sensor is a (mm) and the absolute value of the magnification of the optical system is M as described above
  • the corresponding pixel size on the metal film is a / M (mm), which can be expressed on the metal film.
  • the actual resolution is a/0.35M ⁇ 3a/M (mm) as the reciprocal of this.
  • it is desirable to select a and M such that 3a/M ⁇ 0.005 so that adjacent bright spots having a pitch of 0.005 mm 5 ⁇ m or less can be decomposed.
  • Effective area of metal film surface 1 mm 2 (1 x 1 mm)
  • Excitation light cut filter absorption filter (HOYA W-R665, internal transmittance of 640 nm 0.1%)
  • Most commercially available image sensors have a rectangular shape with an aspect ratio of about 2:3 instead of a square image surface. In that case, a square area is selected in the rectangular shape and used. The upper observation area may be selected as a rectangle.
  • the detection method according to the present invention is useful for, for example, clinical examination because it can perform more accurate quantification.
  • Analytical chip 10
  • Dielectric 21 Incident surface 22
  • Film formation surface 23 Exit surface 30
  • Metal film 40 Flow path lid 41
  • Flow path 100 Surface plasmon resonance fluorescence analyzer (SPFS device) 120 light source 140 imaging unit 141 lens 143 excitation light cut filter (absorption filter) 160 Control unit

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Abstract

本発明は、表面プラズモン共鳴蛍光分析を利用して取得した画像から輝点の数を計測することで被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法であって、より正確な定量ができる検出方法を提供することに関する。本発明の検出方法は、金属膜上に固定された捕捉物質によって捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する。本発明の検出方法は、前記蛍光物質が発する前記蛍光を観察したときに、前記蛍光による輝点の数が４００個以上となるように撮像範囲を設定する工程と、前記撮像範囲における前記蛍光の画像を得る工程と、前記画像中の前記蛍光による輝点の数を計測する工程と、を有する。

Description

検出方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴を利用した検出方法に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。
　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。
　特許文献１は、このような表面プラズモン共鳴蛍光分析を利用する測定方法として、センサチップのセンサ部上に、蛍光物質で標識した被検出物質を固定させ、励起光によって蛍光物質から発生した蛍光の画像を取得し、この画像から蛍光標識の数を計測する測定方法を開示している。
特開２０１２－２０２７４２号公報
　上記のような画像から蛍光標識の数を計測する測定方法は、光電変換素子で光を検出していないためショットノイズ等の電気ノイズの影響は受けない。そのため、Ｓ／Ｎ比が低くなることはなく、正確な測定ができるとも考えられる。しかしながら、本発明者らが検討したところ、特許文献１に記載の測定方法では正確な測定ができない場合があることを見いだした。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、表面プラズモン共鳴蛍光分析を利用して取得した画像から輝点の数を計測することで被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法であって、より正確な定量ができる検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の一実施の形態に係る検出方法は、金属膜上に固定化された捕捉物質によって捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法であって、前記蛍光物質が発する前記蛍光を検出したときに、前記蛍光による輝点の数が４００個以上となるように撮像範囲を設定する工程と、前記撮像範囲における前記蛍光の画像を得る工程と、前記画像中の前記蛍光による輝点の数を計測する工程と、を有する。
　本発明によれば、表面プラズモン共鳴蛍光分析を利用して取得した画像から輝点の数を計測することで被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法において、より定量的に被検出物質を検出することができる。
図１は、本発明の一実施の形態に係る検出方法に用いることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置を示す図である。 図２は、本発明の一実施の形態に係る検出方法を示すフローチャートである。 図３は、図１に示されている表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の光学系を示す。 図４は、ポアソン分布に従う例である、タイルに落ちる雨粒の様子を示す。
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　（ＳＰＦＳ装置の構成）
　図１は、本発明の一実施の形態に係る検出方法に用いることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００を示す図である。
　ＳＰＦＳ装置１００は、分析チップ１０に励起光αを照射するための光源１２０と、分析チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）を検出するための撮像部１４０と、これらを制御する制御部１６０とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、分析チップ１０とともに使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　図１に示されるように、分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する誘電体２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。
　誘電体２０は、励起光αに対して透明な部材（プリズム）からなる。誘電体２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、光源１２０からの励起光αを誘電体２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が形成される。誘電体２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αを誘電体２０の外部に出射させる。誘電体２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、誘電体２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分が誘電体２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが光源１２０に戻らないように形成される。励起光αが、たとえば、レーザーダイオードである光源１２０に戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。誘電体２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。誘電体２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、誘電体２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴；ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に増強電場（局在場光）を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。これらの中では、金属膜３０を構成する金属は、検体中の物質の非特異的吸着を抑制する観点からは、金であることが好ましい。本実施の形態では、金属膜３０を構成する金属は金である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、特に図示しないが、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉物質が固定化されている。捕捉物質を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。金属膜３０において捕捉物質が固定化されている領域の面積は、蛍光による輝点の数が４００個以上となるような撮像範囲を得ることができる面積であればよい。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域に、捕捉物質が均一に固定化されている。捕捉物質の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉物質は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
　捕捉物質は、金属膜３０の上に形成された自己組織化単分子膜およびその上に形成された親水性高分子層を介して金属膜３０上に固定化されていてもよい。すなわち、捕捉物質は、自己組織化単分子および親水性高分子を介して、金属膜３０上に固定化されていてもよい。この場合、主として捕捉物質を含む捕捉物質層が親水性高分子層の上に形成される。
　自己組織化単分子は、通常、炭素原子数４～２０程度のカルボキシアルカンチオールが使用され、特に好ましくは１０－カルボキシ－１－デカンチオールが使用される。
　親水性高分子は、自己組織化単分子と捕捉物質との結合を介在しうるものが好ましい。親水性高分子は、多糖類としてはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが好ましく、樹脂としてはポリアクリル酸が好ましい。これらの高分子は、水酸基（－ＯＨ）およびカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有しており、水素結合による水分子の内包により非特異的タンパク質の吸着を防ぐことができる。
　捕捉物質層と、金属膜との間の厚み（間隔）は、特に限定されないが、４０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましい。当該厚みが４０ｎｍ以上であることで、金属消光により蛍光が弱まることを防ぐことができる。当該厚みが１００ｎｍ以下であることで、蛍光物質が表面プラズモン共鳴による増強電場の範囲から外れることを防ぐことができる。
　捕捉物質層の厚みは、特に限定されないが、１００ｎｍ以下であることが好ましい。当該厚みが１００ｎｍ以下であることで、例えば、数十ｎｍ以上の大きさを持つ蛍光標識物質（例えば、ＰＩＤ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｄｏｔ））であっても、捕捉物質層に入り込んで、捕捉物質に捕捉された被検出物質（たとえば、抗原）を標識することが容易になる。
　流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。金属膜３０が誘電体２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路４１の底面の面積は、蛍光による輝点の数が４００個以上となるような撮像範囲を得ることができる面積であればよい。流路蓋４０は、金属膜３０（および誘電体２０）と共に、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。捕捉物質は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口および排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は捕捉物質に接触する。
　流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面およびその近傍から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を撮像部１４０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０または誘電体２０に接合されている。
　図１に示されるように、誘電体２０へ導かれた励起光αは、入射面２１から誘電体２０内に入射する。誘電体２０内に入射した励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。界面からの反射光は、出射面２３から誘電体２０外に出射される。一方、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが界面に入射することで、金属膜３０およびその近傍からは、プラズモン散乱光βおよび／または蛍光γが、撮像部１４０の方向へ出射される。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１２０、レンズ１４１、励起光カットフィルター１４３、撮像部１４０および制御部１６０を有する。
　光源１２０は励起光αを出射する。光源１２０は、制御部１６０によって位置および向きが調整される。これにより、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角が調整される。励起光αが金属膜３０に照射されると、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面およびその近傍からは、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光βや蛍光物質から放出された蛍光γなどが上方に放出される。また、励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面で反射して、出射面２３から誘電体２０の外部に出射される。
　本実施の形態では、光源１２０は、レーザーダイオード（以下「ＬＤ」と略記する）であり、分析チップ１０の入射面２１に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。より具体的には、光源１２０は、分析チップ１０の誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対して励起光αが全反射角度となるように、界面に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。
　なお、光源１２０の種類は、特に限定されず、ＬＤでなくてもよい。光源１２０の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源１２０から出射される光がビームでない場合は、光源１２０から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換されることが好ましい。また、光源１２０から出射される光が単色光でない場合は、光源１２０から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換されることが好ましい。さらに、光源１２０から出射される光が直線偏光でない場合は、光源１２０から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換されることが好ましい。
　レンズ１４１は、金属膜３０上から出射される蛍光γを撮像部１４０の受光面上に結像させる。レンズ１４１によって形成される光学系を、図３を用いて説明する。
　図３は、図１に示されている表面プラズモン共鳴蛍光分析装置１００の光学系を示す。ここで、撮像部１４０の受光面が正方形であり、入手可能な撮像素子の代表値として撮像面の画素数を１０，０００，０００、画素の１辺の長さを０．００５ｍｍと仮定すると、受光面の１辺には約３，２００画素があることになり、受光面の一辺の長さは１６ｍｍとなる。
　一方、撮像される金属膜３０の面積は、大きくなりすぎると、励起光や固相膜の均一性が保ちにくくなるので１ｍｍ２（撮像領域の一辺の長さが１ｍｍ）と仮定する。このとき必要となる、レンズ１４１による拡大率（横倍率）は１６倍となる。実際には撮像素子の画素サイズや画素数の組み合わせの任意性を１／４～４倍程度考慮して、レンズ１４１による拡大率を４～６４倍とするのが好ましい。
　このような拡大率Ｍ（Ｍは絶対値としてＭ＞０）を採用した場合、物像間距離Ｌはレンズ１４１の焦点距離ｆを用いて近似的に下記の式（１）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　すなわちＬは拡大率が一定の場合、焦点距離ｆに比例して増大する。よって、レンズ１４１の焦点距離ｆは、装置の大型化を避けるためには短い方が良く、撮像部１４０の最大像高Ｙに対して１０倍以下に抑えることが望ましい。たとえば、受光面の１辺の長さが１６ｍｍの場合、最大像高Ｙは対角線の１／２とすると１１．３ｍｍとなる。よって、レンズ１４１の焦点距離ｆは１１３ｍｍ以下が望ましい。
　一方、焦点距離ｆが短くなると、画角が広くなりレンズサイズが増大したりコストが上昇したりするため、焦点距離ｆは短ければ短いほど良いというものではない。よって、レンズ１４１の焦点距離ｆは、撮像部１４０の最大像高Ｙ以上であることが望ましい。
　よって総合的に、レンズ１４１の焦点距離ｆは、撮像部１４０の最大像高Ｙ以上１０倍以下が好ましい。
　本実施の形態において、励起光カットフィルター１４３は、レンズ１４１と撮像部１４０との間に配置されている。励起光カットフィルター１４３は、金属膜３０上から出射された蛍光γを透過させ、励起光αと同一波長の光（例えばプラズモン散乱光βおよび励起光αの迷光）を遮断する。励起光カットフィルター１４３は、プラズモン散乱光β等を遮断する一方で蛍光γを透過させることで、撮像部１４０に蛍光γの波長以外の光が撮像部１４０に到達することを防ぐ。すなわち、励起光カットフィルター１４３は、金属膜３０上から出射された光からノイズ成分を除去し、撮像部１４０が高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出できるようにするため、微弱な蛍光γの検出精度および感度の向上に寄与する。
　励起光カットフィルター１４３の種類は、蛍光γを透過させ、励起光αと同一波長の光（例えばプラズモン散乱光β）を遮断することができれば特に限定されない。たとえば、励起光カットフィルター１４３は、蛍光γを透過させ、励起光αの波長の光を吸収する吸収フィルターであってもよいし、蛍光γを透過させ、励起光αの波長の光を反射する反射フィルターであってもよい。Ｓ／Ｎ比を向上させる観点からは、励起光カットフィルター１４３は、吸収フィルターであることが好ましい。誘電体多層膜等の反射フィルターは、入射角によっては励起光αと同一波長の光を透過させてしまうことがあるが、色ガラス等の吸収フィルターは、入射角に関係なく励起光αと同一波長の光を遮断することができる。また、反射フィルターは、励起光αと同一波長の光を反射させるため、迷光を生じさせてしまうことがあるが、吸収フィルターは、励起光αと同一波長の光を吸収するため、迷光を生じさせることがない。本実施の形態では、励起光カットフィルター１４３は、吸収フィルターである。あるいは、吸収フィルターを主として、反射フィルターを併用しても構わない。
　励起光カットフィルター（吸収フィルター）１４３における励起光αと同一波長の光の透過率は、特に限定されないが、Ｓ／Ｎ比を向上させる観点からは１％以下であることが好ましい。吸収フィルター１４３は、例えば励起光αの波長がレーザーダイオードとしてよく用いられる６３５～６４０ｎｍの場合、ＨＯＹＡ社製のＷ－Ｒ６６５などを用いることができる。
　撮像部１４０は、分析チップ１０の金属膜３０の誘電体２０と対向しない面に対向するように配置されている。撮像部１４０は、金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）を撮像する。撮像部１４０の受光部は撮像素子により構成される。レンズ１４１、吸収フィルター１４３、および撮像部１４０は、金属膜３０の表面と対向するように、金属膜３０側からこの順番で配置されている。
　制御部１６０は、光源１２０、励起光カットフィルター１４３、撮像部１４０の制御を一元的に行う。具体的には、制御部１６０は、光源１２０の位置および向きを制御し、金属膜３０に対する励起光αの入射角を所定の角度に設定する。また、制御部１６０は、増強角を決定するときには、励起光カットフィルター１４３を光路上から除去し、プラズモン散乱光βが撮像部１４０に到達するようにする。また、制御部１６０は、蛍光γによる輝点を撮像するときには、励起光カットフィルター１４３を光路上に配置し、励起光αと同一波長の光（プラズモン散乱光βや励起光αの迷光等）が撮像部１４０に到達しないようにする。また、制御部１６０は、撮像部１４０が撮像範囲を所定の範囲に設定し、画像を取得することを制御する。制御部１６０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
　（ＳＰＦＳ装置の動作）
　図２は、ＳＰＦＳ装置１００を用いた、本発明の一実施の形態に係る検出方法を示すフローチャートである。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置に分析チップ１０を設置する。また、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉物質が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、検体中の被検出物質と捕捉物質とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉物質とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉物質により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉物質に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。検体を希釈する場合は、この後説明する工程Ｓ６０において、撮像範囲における輝点の数が４００個以上となるように、検体の希釈率を調整することが好ましい。
　次いで、増強角の測定を行う（工程Ｓ３０）。具体的には、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する。これは、制御部１６０が、光源１２０を制御して、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査することで行われる。また、制御部１６０は、吸収フィルター１４３を光路上に存在しないように制御し、撮像部１４０が金属膜３０上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出するように、撮像部１４０を制御する。金属膜３０上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βは、レンズ１４１を介して撮像部１４０に到達する。これにより、制御部１６０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１６０は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、基本的には、誘電体２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の物質の種類および量、誘電体２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、分析を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°度程度のオーダーで決定される。
　次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１６０は、光源１２０を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
　次いで、捕捉物質に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ５０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を注入する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に注入されると、蛍光標識液が被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上の蛍光物質から放出される蛍光γを検出し、蛍光γによる輝点の数が４００個以上となるように撮像範囲を設定する（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１６０は、光源１２０を制御して、励起光αを出射させる。同時に、制御部１６０は、撮像部１４０が金属膜３０（金属膜３０およびその近傍）上から放出される蛍光γを検出するように、撮像部１４０を制御する。制御部１６０は、蛍光γによる輝点の数を計測し、輝点の数が４００個未満であれば撮像範囲を広げる。これにより、蛍光による輝点の数が４００個以上となるように撮像範囲を設定する。
　また、このとき、制御部１６０は吸収フィルター１４３が光路上に存在するように吸収フィルター１４３を移動させる。これにより、吸収フィルター１４３はプラズモン散乱光βを透過させないため、蛍光γのみが撮像部１４０に検出される。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、設定した画像範囲において、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上の蛍光物質から放出される蛍光γの画像を取得する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御部１６０が撮像部１４０で得られた画像を処理可能なデータとして取得する。
　次いで、画像中の輝点の数を計測する（工程Ｓ８０）。具体的には、制御部１６０が、画像のデータから蛍光γによる輝点を抽出し、輝点の数を計測する。この輝点の数から、検体中の被検出物質の量（または濃度）が決定されうる。輝点の抽出方法は、特に限定されず、公知の画像処理方法から適宜選択されうる。たとえば、特定の画素の周囲の画素の輝度の標準偏差σと、特定の画素の輝度と周囲の画素の輝度の平均値との差ｘとが、ｘ＞１０σの関係を満たす場合に、特定の画素の位置に輝点があると判定してもよい。
　なお、画像から輝点を抽出する前に、公知のトレンド除去法によりバックグラウンドの低周波成分を除去してもよい。これによりノイズとなる成分を除去することができ、より正確な定量ができる。
　（効果）
　本実施の形態に係る検出方法では、１つの画像中に４００個以上の輝点が存在する条件で画像中の輝点の数を測定するため、より正確に被検出物質を定量的に検出することができる。その理由は以下の様に考えられる。
　１回の測定で観察できる領域に存在する蛍光による輝点の数は、平均値の前後で測定ごとにばらつくことになり、このバラツキ具合はポアソン分布として記述される。これに類似の例としては、雨の降りだしに歩道の同面積の複数のタイルに落ちる雨粒の数が、タイルによってばらつくこととが挙げられる。このタイルに落ちる雨粒の様子の例を図４に示す。図４には２５個のタイルがあるが、それぞれのタイルにある雨粒の数はばらついている。
　本実施の形態に係る検出方法で、より正確な定量ができる理由と、図４との関係は次のように考えればよい。図４には２５個のタイルが示されているが、１個のタイルが１回の測定における撮像範囲にある輝点の数を表していると考えると、測定を２５回繰り返したときに２５個のタイルが得られる。ポアソン分布の理論式より、１個のタイル中の輝点の平均数をλとしたとき、バラツキの標準偏差はλの平方根で与えられる。よってＳ／Ｎは、Ｓを輝点の平均数、Ｎを標準偏差とすると、簡単な下記の式（２）で与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで一般に濃度測定の定量下限は、ＣＶ（変動係数）１０％が採用されているが、これは送液、希釈、環境変動など、測定における全プロセスを含むバラツキであり、ＣＶ１０％を達成するには、検出系単体（表面プラズモン増強蛍光測定系単体）としては少なくともＣＶ５％以下（Ｓ／Ｎで２０以上）、望ましくはＣＶ３％以下（Ｓ／Ｎで３３以上）を確保する必要がある。
　上記の式（２）に従い、輝点の数ＳとＣＶ（％）の関係を計算してみると下記の表１のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記の表１から明らかなように、ＣＶ５％以下とするには輝点の数Ｓを４００個以上とする必要がある。
　本実施の形態によれば、１つの画像中に４００個以上の輝点が存在する条件で画像中の輝点を計測することになるので、ＣＶが５．０％以下となり、より正確な定量ができると考えられる。
　なお、１つの画像中における輝点の数の上限は特に制限されないが、輝点の重なりが画像中において生じないことを考慮してその上限を定めることができる。
　撮像部１４０の画素数をＮとし、輝点の数をｍと仮定する。Ｎ個の撮像素子でｍ個の輝点を観察するということは、Ｎ個の撮像素子にｍ個の輝点を投げ入れる操作といえる。ここで、輝点の重なりがほとんど起こらないためには、輝点の数ｍがＮ個の画像素子に対して極めて疎である必要がある。
　具体的には、１回の粒子投入にあたり、画素数Ｎにおいて、ある１画素に粒子が入る確率は１／Ｎである。これをｍ回繰り返したとき、その画素に粒子が入る確率はｍ／Ｎである。これが非常に小さな値となることを条件とすればよい。ここでは滅多に起こらない数字として、たとえば、正規分布の±３σ外となる確率０．３％を適用すると、ｍ／Ｎ≦０．００３となる。たとえば、Ｎ＝１０００万画素のとき、ｍ≦３万個となる。
　ここで撮像部１４０の画素数は、たとえば、１００万以上５０００万以下であるので、輝点の数の上限は、たとえば、３０００個以下、または１５万個以下であればよい。なお画素数の上限は撮像素子の入手性や価格から、下限は輝点の数の取りうる範囲が狭くなりすぎないとの観点で設定される。
　さらに本発明の実施の形態において、金属膜上でどの程度まで近接した輝点が解像できるか、考察してみる。撮像素子の画素サイズをａ（ｍｍ）、光学系の拡大率の絶対値を前述のとおりＭとすると、金属膜上の対応する画素サイズはａ／Ｍ（ｍｍ）となり、金属膜上で表現できる理論上の最大空間周波数は、ナイキスト周波数をｆＮとしてｆＮ＝Ｍ／（２ａ）（１／ｍｍ）となる。実際には理論上のナイキスト周波数に対し７割程度の周波数が解像の上限周波数となることから、実際の最大空間周波数は、０．７ｆＮ＝０．３５Ｍ／ａ（１／ｍｍ）となる。実際の解像度はこの逆数としてａ／０．３５Ｍ≒３ａ／Ｍ（ｍｍ）となる。本発明の実施の形態ではピッチ０．００５ｍｍ＝５μｍ以下で隣接し存在する輝点も分解できるよう、３ａ／Ｍ≦０．００５となるようａとＭを選ぶことが望ましい。
　例えば下記のように諸値を設定することにより、十分なＳ／Ｎを確保したプラズモン共鳴による高感度検出が可能となる。
　金属膜面の有効面積：１ｍｍ２（１×１ｍｍ）
　励起光（ＬＤ）波長：６４０ｎｍ
　励起光カットフィルター：吸収フィルター（ＨＯＹＡ社製Ｗ－Ｒ６６５、６４０ｎｍの内部透過率０．１％）
　撮像レンズの焦点距離：Ｆ＝２０ｍｍ
　拡大倍率（絶対値）：Ｍ＝８
　撮像素子の画素サイズ（正方を仮定）：ａ＝０．０１ｍｍ
　撮像素子の画素数（正方を仮定）：４００万画素（このとき輝点の上限１２，０００個）
　撮像素子の半対角長：Ｙ＝１４．１ｍｍ（Ｙ＜ｆ＜１０Ｙ）
　３ａ／Ｍ＝０．００３８ｍｍ
　なお市販の撮像素子は、撮像面の形状が正方ではなく縦横比２：３前後の長方形状のものが多いが、その際は長方形状の中で正方領域を選択して用いたり、金属膜面上の観察領域を長方形に選ぶなどすればよい。
　本出願は、２０１９年３月１日出願の特願２０１９－０３７７６１に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る検出方法は、より正確な定量ができることから、例えば臨床検査などに有用である。
　１０　分析チップ
　２０　誘電体
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　１００　表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）
　１２０　光源
　１４０　撮像部
　１４１　レンズ
　１４３　励起光カットフィルター（吸収フィルター）
　１６０　制御部

Claims (6)

  1. 　金属膜上に固定化された捕捉物質によって捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法であって、
    　前記蛍光物質が発する前記蛍光を検出したときに、前記蛍光による輝点の数が４００個以上となるように撮像範囲を設定する工程と、
    　前記撮像範囲における前記蛍光の画像を得る工程と、
    　前記画像中の前記蛍光による輝点の数を計測する工程と、
    　を有する、検出方法。
  2. 　前記蛍光の画像を得る工程では、励起光の波長の光を吸収する吸収フィルターを透過した蛍光の画像を得る、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記吸収フィルターにおける励起光の波長の光の透過率は１％以下である、請求項１または請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記金属膜を構成する金属は金である、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記捕捉物質は、自己組織化単分子および親水性高分子を介して、前記金属膜上に固定化されており、
    　前記捕捉物質を含む捕捉物質層と、前記金属膜との間の厚みは、４０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　前記捕捉物質層の厚みは１００ｎｍ以下である、請求項５に記載の検出方法。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005095927A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Omron Corporation 局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置
JP2008102117A (ja) * 2006-09-21 2008-05-01 Fujifilm Corp 表面プラズモン増強蛍光センサおよび蛍光検出方法
WO2012042804A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 コニカミノルタホールディングス株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
JP2012168165A (ja) * 2011-01-27 2012-09-06 Konica Minolta Holdings Inc 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法、およびアッセイ用キット
JP2012202742A (ja) * 2011-03-24 2012-10-22 Fujifilm Corp 検出方法および検出装置
JP2013113769A (ja) * 2011-11-30 2013-06-10 Konica Minolta Inc 計測方法及び計測装置
JP2018155608A (ja) * 2017-03-17 2018-10-04 コニカミノルタ株式会社 蛍光体集積粒子複合体を用いた多段階蛍光染色方法および蛍光体集積粒子複合体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005095927A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Omron Corporation 局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置
JP2008102117A (ja) * 2006-09-21 2008-05-01 Fujifilm Corp 表面プラズモン増強蛍光センサおよび蛍光検出方法
WO2012042804A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 コニカミノルタホールディングス株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
JP2012168165A (ja) * 2011-01-27 2012-09-06 Konica Minolta Holdings Inc 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法、およびアッセイ用キット
JP2012202742A (ja) * 2011-03-24 2012-10-22 Fujifilm Corp 検出方法および検出装置
JP2013113769A (ja) * 2011-11-30 2013-06-10 Konica Minolta Inc 計測方法及び計測装置
JP2018155608A (ja) * 2017-03-17 2018-10-04 コニカミノルタ株式会社 蛍光体集積粒子複合体を用いた多段階蛍光染色方法および蛍光体集積粒子複合体

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