JP2013113769A - 計測方法及び計測装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】センサーチップは、プリズム、金膜、抗原捕捉膜及び流路形成物を備える。2種類以上の抗原捕捉膜及び2種類以上の測定液において抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせが決定される。測定液は、共鳴角が検出される場合及び表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合に流路に満たされる。2種類以上の抗原捕捉膜から特定の種類の抗原捕捉膜が選択された場合は、特定の種類の抗原捕捉膜と組み合わされた特定の種類の測定液が選択される。抗原捕捉膜の種類と測定液の種類とは、抗原捕捉膜の種類の違いによる共鳴角の違いが解消するように組み合わされる。
【選択図】図6
Description
この望ましい実施形態は、表面プラズモン励起蛍光分光法(SPFS)により計測を行う計測方法及び計測装置に関する。
図1の模式図は、計測装置を示す。
図2から図4までの模式図は、センサーチップを示す。図2から図4までは、それぞれ、斜視図、横断面図及び縦断面図である。
図5の模式図は、試薬チップを示す。
図6は、抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせの例を示す。
図7のグラフは、励起光の入射角と表面プラズモン励起蛍光の光量との関係を示す。図7のグラフは、抗原捕捉膜に固定された抗体の種類のみが異なる2種類のセンサーチップの各々について励起光の入射角と表面プラズモン励起蛍光の光量との関係を示す。図7のグラフに示す励起光の入射角と表面プラズモン励起蛍光の光量との関係の測定においては、検体から抽出されたAFP(α−フェトプロテイン)抗原濃度が1.0ng/mlの試料液が用いられ、抗原捕捉膜の種類以外は同一の条件で測定が行われている。
計測が行われる場合は、図9に示すように、送液機構1044により試料液1212が流路1160に満たされ、抗原1242が抗原捕捉膜1104に捕捉される。抗原1242の捕捉は、抗原捕捉膜1104に固定された抗体1240と試料液1212に含まれる抗原1242とを結合させる1次免疫反応(抗原−抗体反応)により行われる。
抗原1242が捕捉された後に、図10に示すように、送液機構1044により測定液1218が流路1160に満たされ、測定液1218が流路1160に満たされた状態において測定機構1042により共鳴角θrが検出される。抗原捕捉膜1104の種類の違いによる共鳴角θrの違いが解消するように抗原捕捉膜1104の種類に応じて測定液1218の種類が選択された場合は、抗原捕捉膜1104の種類によらず共鳴角θrはほぼ一定である。このため、共鳴角θrの検出の範囲は概ね0〜1°と狭く、共鳴角θrの検出は容易である。このことは、共鳴角θrの検出に必要な時間を短くすること、共鳴角θrの検出に必要な機構を小型化すること等に寄与する。抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類とは、典型的には共鳴角θrが約70°になるように組み合わされる。ただし、共鳴角θrの目標は、プリズム1100の材質、形状等のセンサーチップ1022の材質、構造に応じて設定される。
共鳴角θrが検出された後に、図11に示すように、送液機構1044により蛍光標識液1216が流路1160に満たされ、抗原捕捉膜1104に捕捉された抗原1242に蛍光標識抗体1244が付加される。蛍光標識抗体1244の付加は、抗原捕捉膜1104に捕捉された抗原1242と蛍光標識液1216に含まれる蛍光標識抗体1244とを結合させる2次免疫反応(抗原−抗体反応)により行われる。
蛍光標識抗体1244が付加された後に、図12に示すように、送液機構1044により測定液1218が流路1160に満たされ、測定液1218が流路1160に満たされた状態において測定機構1042により表面プラズモン励起蛍光FLの光量が測定される。
図2から図4までに示すように、反射面1142は金膜1102の一方の主面1260に密着させられ、抗原捕捉膜1104は金膜1102の他方の主面1262に定着させられる。流路形成物1106は、金膜1102及び抗原捕捉膜1104が形成されたプリズム1100に接合される。
図2から図4までに示すように、プリズム1100は、台形柱体である。プリズム1100は、望ましくは等脚台形柱体である。プリズム1100の一方の傾斜側面は入射面1140になる。プリズム1100の幅広の平行側面は反射面1142になる。プリズム1100の他方の傾斜側面は出射面1144になる。
金膜1102は、薄膜である。金膜1102の膜厚は、望ましくは100nm以下であり、さらに望ましくは40〜50nmである。ただし、金膜1102の膜厚がこの範囲外であってもよい。
図3及び図4に示すように、抗原捕捉膜1104は、流路1160の内部に露出する。このため、液体が流路1160に満たされた場合は、流路1160に満たされた液体が抗原捕捉膜1104に接触する。計測の対象の抗原1242を含む試料液1212が抗原捕捉膜1104に接触した場合は、抗原捕捉膜1104に固定された抗体1240と試料液1212に含まれる抗原1242とが結合する。計測の対象の抗原1242が抗原捕捉膜1104に捕捉された状態において蛍光標識抗体1244を含む蛍光標識液1216が抗原捕捉膜1104に接触した場合は、抗原捕捉膜1104に捕捉された抗原1242と蛍光標識液1216に含まれる蛍光標識抗体1244とが結合する。
図4に示すように、流路1160は、一方の開口1300から流路形成物1106の内部を経由して他方の開口1302へ至る。流路1160の一部は接合面に露出する。
図13の模式図は、バーコードラベルの平面図である。
バーコードリーダー1048は、イメージセンサーによりバーコード1360を読み取り、抗原捕捉膜1104の種類を識別する。バーコード1360が他の種類の識別子に置き換えられる場合は、当該他の種類の識別子の識別に適した識別機構が設けられる。例えば、識別子として切り欠き等の構造が形成される場合は、当該構造を検出するリミットスイッチ、光センサー等が設けられる。
図1に示すように、支持機構1046は、センサーチップ1022を支持し、センサーチップ1022を一定の位置に位置づける。センサーチップ1022は、支持機構1046に着脱可能であり、計測ごとに交換される。支持機構1046に支持されるセンサーチップ1022が備える抗原捕捉膜1104の種類は、計測ごとに異なる可能性がある。しかし、計測装置1000においては、抗原捕捉膜1104の種類に応じて測定液1218の種類が選択され、抗原捕捉膜1104の種類が異なっても共鳴角θrがほぼ一定になる。
図1に示すように、送液機構1044は、液体を試薬チップ1024からセンサーチップ1022へ供給し、液体をセンサーチップ1022から回収する。液体がセンサーチップ1022へ供給される場合は、一方の開口1300へ液体が供給され、流路1160が液体で満たされ、液体が抗原捕捉膜1104に接触する。液体がセンサーチップ1022から回収される場合は、一方の開口1300から液体が回収され、流路1160が空又は空に近い状態になる。
図1に示すように、レーザーダイオード1060は励起光ELを放射する。
図1に示すように、直線偏光板1062は、励起光ELの光路上に配置され、レーザーダイオード1060から放射された励起光ELを直線偏光へ変換する。励起光ELの偏光方向は、励起光ELがプリズム1100の反射面1142に対してp偏光になるように選択される。これにより、エバネッセント波のもれだしが増加し、表面プラズモン励起蛍光FLの光量が増加し、計測の精度及び感度が向上する。
図1に示すように、ミラー1064は、励起光ELの光路上に配置され、直線偏光板1062を通過した励起光ELを反射する。ミラー1064により反射された励起光ELは、プリズム1100に照射される。プリズム1100に照射された光は、図3に示すように、入射面1140へ入射し、反射面1142に反射され、出射面1144から出射する。反射面1142への励起光ELの入射角θは、臨界角θcより大きい。
図1に示すように、光電子増倍管1080は、センサーチップ1022から出射する表面プラズモン励起蛍光FLの光路上に配置され、表面プラズモン励起蛍光FLの光量を測定する。光電子増倍管1080が他の形式の光量センサーに置きかえられてもよい。例えば、光電子増倍管1080が電荷結合素子(CCD)センサー等に置きかえられてもよい。
図1に示すように、バンドパスフィルター1082は表面プラズモン励起蛍光FLの光路上に配置される。バンドパスフィルター1082は、通過域に含まれる波長の光を透過し、阻止域に含まれる波長の光を減衰させる。通過域が表面プラズモン励起蛍光FLの波長を含み阻止域が励起光ELの波長を含むようにバンドパスフィルター1082の仕様は選択される。
図1に示すように、バンドパスフィルター駆動機構1084は、バンドパスフィルター1082が表面プラズモン励起蛍光FLの光路上に配置された状態とバンドパスフィルター1082が表面プラズモン励起蛍光FLの光路上に配置されない状態とを切り替える。
図1に示すように、フォトダイオード1086は、プリズム1100と金膜1102との界面において反射された励起光EL(以下では「反射光」という)の光路上に配置され反射光の光量を測定する。フォトダイオード1086が他の形式の光量センサーに置きかえられてもよい。例えば、フォトダイオード1086がフォトトランジスター、フォトレジスター等に置きかえられてもよい。反射光の光量によらずに共鳴角θrが検出される場合はフォトダイオード1086が省略されてもよい。
試薬チップ1024は、希釈液1214、蛍光標識液1216、2種類の測定液1218及び洗浄液1220が収容された状態で作業者に提供される。希釈液1214、蛍光標識液1216、2種類の測定液1218及び洗浄液1220の全部又は一部が作業者により試薬チップ1024に収容されてもよい。検体1210は、作業者により試薬チップ1024に収容される。試料液1212は、計測装置1000の内部において検体1210及び希釈液1214から調製される。2種類の測定液1218が作業者により又は計測装置1000の内部において調製されてもよい。
検体1210は、典型的には、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、体腔液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。体腔液には、髄液、腹水、胸水等がある。
測定液1218は、抗体1240、抗原1242及び蛍光標識抗体1244を失活させないpHを維持する緩衝能を持つバッファー液である。抗体1240、抗原1242及び蛍光標識抗体1244を失活させず表面プラズモン励起蛍光FLの光量の測定を阻害しない限り、バッファー液に代えて緩衝能を持たない液が用いられてもよい。望ましくは、測定液の1218の温度は一定に維持される。
蛍光標識液1216には、計測の対象の抗原1242と特異的に結合する蛍光標識抗体1244が含まれる。蛍光標識抗体1244には、エバネッセント波の電場により励起される蛍光標識が付加される。
洗浄液1220には、望ましくは、界面活性剤が添加される。
計測の対象の抗原1242は、核酸、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質等であってもよく、これらを修飾することにより得られる修飾分子であってもよく、これらのうちの2種類以上の複合体であってもよい。核酸は、一本鎖及び二本鎖のいずれであってもよい。核酸は、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等であってもよく、ヌクレオシド、ヌクレオチド等であってもよく、ヌクレオシド、ヌクレオチド等を修飾することにより得られる修飾分子であってもよく、ヌクレオシド、ヌクレオチド等のうちの2種類以上の複合体であってもよい。タンパク質には、ポリペプチド、オリゴペプチド等がある。アミノ酸には、修飾アミノ酸も含まれる。計測の対象の抗原1242は、具体的には、AFP等のがん胎児性抗原又は腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等であるが、これら以外であってもよい。
コントローラー1052は、制御プログラムを実行する組み込みコンピューターである。1個の組み込みコンピューターがコントローラー1052の機能を担ってもよいし、2個以上の組み込みコンピューターが分担してコントローラー1052の機能を担ってもよい。組み込みコンピューターにはCPU及びメモリーが設けられる。ソフトウエアを伴わないハードウエアがコントローラー1052の全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、例えば、オペアンプ、コンパレーター等の電子回路であるが、リンク機構等の機械的な機構がハードウエアに含まれてもよい。コントローラー1052による処理の全部又は一部が、手作業により実行されてもよく、計測装置1000の外部において実行されてもよい。コントローラー1052は、測定機構1042、送液機構1044、バーコードリーダー1048等の計測装置1000の構成物を制御する。
図15及び図16のフローチャートは、計測の流れを示す。
図15及び図16に示すように、本計測に先立って、抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせが決定される(ステップS100)。決定された抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせは、本体1000に入力され、組み合わせ記憶部1382に記憶される。抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせは、事前測定により実験的に決定されてもよいし、理論的に決定されてもよい。抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせの決定は、計測ごとに行われる必要はない。決定された抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせは、2回以上の計測において繰り返し参照される。
特定の種類の抗原捕捉膜1104が選択された後に、本体1020、センサーチップ1022及び試薬チップ1024が準備される(ステップS102)。本体1020は、抗原捕捉膜1104の種類と測定液1218の種類との組み合わせが組み合わせ記憶部1382に記憶された状態で提供される。センサーチップ1022は、選択された特定の種類の抗原捕捉膜1104を備えるものが選択される。
本体1020、センサーチップ1022及び試薬チップ1024が準備された後に、センサーチップ1022及び試薬チップ1024が本体1020に取り付けられる(ステップS103)。
センサーチップ1022及び試薬チップ1024が取り付けられた後に、試料液1212が調製される(ステップS104)。試料液1212が調製される場合は、試料液準備部1380が送液機構1044を制御し、送液機構1044により検体1210及び希釈液1214が混合される。検体1210がそのまま試料液1212とされてもよい。試料液1212が手作業で調製されてもよい。試料液1212が手作業で調製される場合は、当該手作業は計測装置1000の内部で行われてもよいし外部で行われてもよい。調製された試料液1212は希釈容器1182に収容される。試料液1212が調製される場合に希釈以外の前処理が行われてもよい。例えば、血球分離、試薬の混合等の前処理が行われてもよい。
センサーチップ1022及び試薬チップ1024が取り付けられた後に、バーコードリーダー1048によりバーコード1360が読み取られ、抗原捕捉膜1104の種類が識別される(ステップS105)。操作ボタン1050により抗原捕捉膜1104の種類の入力が受け付けられ、入力の結果から抗原捕捉膜1104の種類が識別されてもよい。操作ボタン1050が他の種類の入力デバイスに置き換えられてもよい。例えば、操作ボタン1050がキーボード、タッチパネル等に置き換えられてもよい。測定液1218が作業者の手動操作により選択される場合は、バーコードリーダー1048による抗原捕捉膜1104の種類の識別が省略されてもよい。
抗原捕捉膜1104の種類が識別された後に、測定液選択部1386が、組み合わせ記憶部1382に記憶された組み合わせを参照し、バーコードリーダー1048により識別された特定の種類の抗原捕捉膜1104と組み合わされた特定の種類の測定液1218を選択する(ステップS106)。2種類の測定液1218があらかじめ準備される必要はなく、特定の種類の抗原捕捉膜1104と組み合わされた特定の種類の測定液1218が計測ごとに調製されてもよい。
試料液1212が準備された後に、1次免疫反応進行部1388が送液機構1044を制御し、送液機構1044により試料液1212がセンサーチップ1022へ供給されセンサーチップ1022から回収され、1次免疫反応が進行させられる(ステップS107)。試料液1212がセンサーチップ1022へ供給されてからセンサーチップ1022から回収されるまでの間、試料液1212が流路1160に満たされる。これにより、試料液1212が抗原捕捉膜1104に接触し、試料液1212に含まれる抗原1242が抗原捕捉膜1104に捕捉される。試料液1212は、試料液1212が抗原捕捉膜1104に十分に接触する程度に流路1160に満たされればよい。すなわち、主に反応室1322が試料液1212で満たされればよく、流路1160の全体が試料液1212で満たされることは必ずしも必要がない。
1次免疫反応の後に、洗浄部1390が送液機構1044を制御し、送液機構1044により洗浄液1220がセンサーチップ1022へ供給されセンサーチップ1022から回収され、流路1160が洗浄される(ステップS108)。これにより、未反応の抗原1242、不要物等が流路1160から除去される。未反応の抗原1242、不要物の残存が無視できるほど少ない場合は、流路1160の洗浄が省略されてもよい。
流路1160が洗浄された後に、共鳴角検出部1392が測定機構1042及び送液機構1044を制御し、共鳴角が検出される(ステップS109)。
共鳴角θrが検出された後に、2次免疫反応進行部1394が送液機構1044を制御し、送液機構1044により蛍光標識液1216がセンサーチップ1022へ供給されセンサーチップ1022から回収され、2次免疫反応が進行させられる(ステップS110)。蛍光標識液1216がセンサーチップ1022へ供給されてから回収されるまでの間、蛍光標識液1216が流路1160に満たされる。これにより、蛍光標識液1216が抗原捕捉膜1104に接触し、抗原捕捉膜1104に捕捉された抗原1242に蛍光標識抗体1244が付加される。
2次免疫反応の後に、洗浄部1390が送液機構1044を制御し、送液機構1044により洗浄液1220がセンサーチップ1022へ供給されセンサーチップ1022から回収され、流路1160が洗浄される(ステップS111)。これにより、未反応の蛍光標識抗体1244、不要物等が流路1160から除去される。未反応の蛍光標識抗体1244、不要物の残存が無視できるほど少ない場合は、流路1160の洗浄が省略されてもよい。
流路1160が洗浄された後に、測定部1396が測定機構1042及び送液機構1044を制御し、表面プラズモン励起蛍光FLの光量が測定される(ステップS112)。
図5に示す試薬チップ1024には2種類の測定液1218が収容され、計測装置1000においては支持機構1046に保持されたセンサーチップ1022が備える抗原捕捉膜1104の種類に応じて2種類の測定液1218から特定の種類の測定液1218が選択される。
1042 測定機構
1044 送液機構
1048 バーコードリーダー
1104 抗原捕捉膜
1160 流路
1212 試料液
1216 蛍光標識液
1218 測定液
Claims (5)
- 表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う計測方法であって、
(a) 計測の対象の抗原と結合する抗体が固定された2種類以上の抗原捕捉膜及び2種類以上の測定液において抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせを決定する工程と、
(b) 前記2種類以上の抗原捕捉膜から特定の種類の抗原捕捉膜を選択する工程と、
(c) 誘電体媒体、導電体膜、特定の種類の抗原捕捉膜及び流路形成物を備え、前記誘電体媒体が入射面、反射面及び出射面を備え、励起光が前記入射面に入射し前記反射面に反射され前記出射面から出射するように前記入射面、前記反射面及び前記出射面が配置され、前記流路形成物に流路が形成され、前記特定の種類の抗原捕捉膜が前記流路の内部に露出し、前記導電体膜が第1の主面及び第2の主面を備え、前記反射面が前記第1の主面に密着し、前記特定の種類の抗原捕捉膜が前記第2の主面に定着するセンサーチップを準備する工程と、
(d) 前記組み合わせにおいて前記特定の種類の抗原捕捉膜と組み合わされた特定の種類の測定液を選択する工程と、
(e) 試料液を前記流路に満たす工程と、
(f) 前記工程(e)の前又は後に前記特定の種類の測定液を前記流路に満たし、前記特定の種類の測定液が前記流路に満たされた状態において共鳴角を検出する工程と、
(g) 前記工程(e)及び前記工程(f)の後に前記抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識液を前記流路に満たす工程と、
(h) 前記工程(g)の後に前記特定の種類の測定液を前記流路に満たし、前記特定の種類の測定液が前記流路に満たされた状態において表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
を備え、
前記工程(a)は、
前記抗原捕捉膜の種類の違いによる前記共鳴角の違いが解消するように抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせを決定する
計測方法。 - 請求項1の計測方法において、
前記工程(a)は、
前記2種類以上の測定液において屈折率を異ならせることにより前記抗原捕捉膜の種類の違いによる前記共鳴角の違いを解消する
計測方法。 - 請求項2の計測方法において、
前記工程(a)は、
前記2種類以上の測定液において添加物の有無、添加物の種類及び添加物の濃度の全部又は一部を異ならせることにより前記屈折率を異ならせる
計測方法。 - 請求項1から請求項3までのいずれかの計測方法において、
前記工程(c)は、
抗原捕捉膜の種類を識別する識別子が付与された前記センサーチップを準備し、
(i) 前記識別子を読み取り、抗原捕捉膜の種類を識別する工程、
をさらに備え、
前記工程(d)は、
前記工程(i)において識別された前記特定の種類の抗原捕捉膜と組み合わされた特定の種類の測定液を選択する
計測方法。 - 表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う計測装置であって、
計測の対象の抗原と結合する抗体が固定された2種類以上の抗原捕捉膜及び2種類以上の測定液における抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせを記憶する組み合わせ記憶部と、
誘電体媒体、導電体膜、特定の種類の抗原捕捉膜及び流路形成物を備え、前記誘電体媒体が入射面、反射面及び出射面を備え、励起光が前記入射面に入射し前記反射面に反射され前記出射面から出射するように前記入射面、前記反射面及び前記出射面が配置され、前記特定の種類の抗原捕捉膜が前記2種類以上の抗原捕捉膜から選択され、前記流路形成物に流路が形成され、前記特定の種類の抗原捕捉膜が前記流路の内部に露出し、前記導電体膜が第1の主面及び第2の主面を備え、前記反射面が前記第1の主面に密着し、前記特定の種類の抗原捕捉膜が前記第2の主面に定着するセンサーチップと、
共鳴角を検出するとともに表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する測定機構と、
抗原捕捉膜の種類を識別する識別機構と、
前記組み合わせを参照し、前記識別機構により識別された前記特定の種類の抗原捕捉膜と組み合わされた特定の種類の測定液を選択する測定液選択部と、
試料液、前記抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識液及び前記特定の種類の測定液で前記流路を満たす送液機構と、
前記送液機構を制御し、前記試料液を前記流路に満たさせる1次免疫反応進行部と、
前記試料液が前記流路に満たされる前又は満たされた後に、前記送液機構を制御し、前記特定の種類の測定液を前記流路に満たさせ、前記測定機構を制御し、前記特定の種類の測定液が前記流路に満たされた状態において前記共鳴角を検出させる共鳴角検出部と、
前記試料液が前記流路に満たされた後であって前記特定の種類の測定液が前記流路に満たされ前記共鳴角が検出された後に、前記送液機構を制御し、前記蛍光標識液を前記流路に満たさせる2次免疫反応進行部と、
前記蛍光標識液が前記流路に満たされた後に、前記送液機構を制御し、前記特定の種類の測定液を前記流路に満たさせ、前記測定機構を制御し、前記表面プラズモン励起蛍光の光量を測定させる測定部と、
を備え、
前記組み合わせ記憶部は、
前記抗原捕捉膜の種類の違いによる前記共鳴角の違いが解消する抗原捕捉膜の種類と測定液の種類との組み合わせを記憶する
計測装置。
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