CN101133318A - 荧光检测设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光检测设备,此设备包括承载样品(111)的载体装置(101)、使样品(111)发射荧光的样品激发装置和用来检测所述荧光的检测装置,所述的载体装置(101)包含具有粗糙表面(115)的可以使所述荧光偏向多个方向的层,所述的检测装置覆盖在观测锥体上,在多个方向收集被偏转的荧光。
Description
技术领域
本发明涉及光谱学领域,特别涉及到荧光成像技术。
背景技术
许多研究和应用,尤其在生物学里都利用荧光信号。荧光信号的微弱性是一个主要的绊脚石。在大多数的应用和研究中,荧光标记或者说是荧光团的数量经常是有限的。例如对于生物芯片的情况,或者当监控细胞中少量的分子时,提高灵敏度是非常重要的。增强的荧光信号也用于寻找有低荧光量子效率的分子。
现今,一些特定的观察方法,特别是运用全反射的倏逝波的照明技术,已经基本使需求得到了满足。此外,荧光信号的微弱性使之有必要使用附加的放大技术,通常价格不菲,需要大量的时间并引入必须进行控制的放大偏置。一个典型的案例就是DNA芯片,对于DNA芯片聚合酶链反应(PCR)中放大步骤经常是必要的。许多类型的载体的发展都是为了增强荧光信号并使放大步骤的需求最小化。
一些如美国专利US-5.866.433所述的载体采用在一个透明的惰性分离层下引入纳米金属粉的方法来增强荧光。
还存在一些具有透明间隔层的反射镜型载体。美国专利US-4.649.280中提出的载体就是由透明间隔层覆盖的完美反射镜。美国专利US-5.006.716中提出了具有周期性波动起伏传导层的反射镜,以便引导荧光至优先方向,因而需要沿一个明确定义的方向激发和检测。因此,在使用此类载体时需要特定的激发和观测配置。
然而,所有这些使荧光信号在一定程度上增强的载体都有一些缺点,特别体现于检测装置的特定属性或者特殊的使用配置上。因此,使用这些载体仍然复杂和/或昂贵。
因此,本发明的目标在于提供一种简化的荧光检测设备。此设备起码可以克服至少一种上文提到的弊端。
发明内容
本发明由下文在权利要求书中定义的荧光检测设备组成。
更准确的说,提供了一种荧光检测设备,其包括承载样品的载体装置、使样品发射荧光的样品激发装置和用来检测所述荧光的检测装置,其特征在于所述的载体装置包含具有粗糙表面的可以使所述荧光偏向多个方向的层,所述的检测装置覆盖观测锥体,以便从多个方向收集被偏转的荧光。
因此,这样的设备可以使源于样品中被激发的荧光团的荧光信号增强,所述的荧光信号在宽的传输管道(1obe)里而非一个特定的方向上发射。因此宽孔径中的检测使收集大部分的荧光信号成为可能。收集到的荧光信号可以在不需要任何前端放大和/或使用特殊的检测系统或特殊的配置情况下被增强。
载体装置的粗糙表面层的粗糙度由至少三个参数定义,第一个参数代表粗糙度的标准差;第二个参数代表粗糙度的平均空间周期;第三个参数代表粗糙度空间周期的范围。第二个和第三个参数由粗糙界面形貌图的功率谱辐射状剖面导出。其中,第一个参数为非零且小于100纳米(nm),第二个参数为非零且小于1000纳米,第三个参数为非零且小于1500纳米。
按照本发明,优选但非限制的荧光检测设备的样式如下:
-观测锥体具有至少10度的顶角;
-含有粗糙表面的层是连续的或者准连续的;
-含有粗糙表面的层是传导层;
-传导层是由银、金、铜、铝或铂制成的金属层;
-传导层是半导体;
-传导层的厚度大于20纳米;
-载体装置包涵对在荧光过程中激发和辐射波长透明的间隔层;
-间隔层是高分子层或者陶瓷层;
-间隔层的厚度大于20纳米;
-间隔层大约60纳米厚,传导层大约60纳米厚,传导层表面的粗糙度由大约为20纳米的第一参数、大约350纳米的第二参数以及大约600纳米的第三参数定义;
一间隔层根据厚度的梯度安排,并且从载体装置的第一末端到载体装置的第二末端增加;
-激发装置覆盖于发光锥体。
根据本发明,荧光检测设备用来监控样品中的荧光团。它尤其可以用来进行荧光团间的能量交换研究。
本发明中荧光检测设备的另外一个优选但非限制的用途为测量透明样品的厚度。
本发明中,还为荧光监测器提供了样品载体装置,其特征是包含具有粗糙表面的能使所述荧光偏向多个方向的层。
最后,本发明涉及的荧光检测方法包括一些连续的步骤:激发由载体装置承载的样品使所述样品发射荧光以及检测所述样品发射的所述荧光。此荧光检测方法的特征是,所述的载体装置包含有粗糙表面的能使荧光偏向多个方向的层,荧光检测步骤包括在一个锥体内进行观测,以便从多个方向收集被偏转的荧光。
附图说明
本发明的其他特征及优点将在如下描述中变得清晰起来,这些描述只是说明性的而非限定性的,应当结合附图进行参考:
-图1为本发明的荧光检测设备的示意图,
-图2为本发明所定义的粗糙表面的横截面图,
-图3为原子力显微镜下粗糙表面的形貌图,
-图4显示了从图3所示的形貌图得到的功率谱的辐射状剖面,作为空间频率的函数,
-图5显示了作为空间周期的函数的功率谱辐射状剖面,
-图6为荧光检测设备的第一优选实施方案中的载体横截面图,
-图7为荧光检测设备的第二优选实施方案中的载体横截面图,
-图8为荧光检测设备的第三优选实施方案中的载体横截面图。
具体实施方式
图1为本发明荧光检测设备的示意图。此设备包含承载样品11的载体装置1,激发装置2和荧光检测装置3。
样品11的激发装置2被设定为用来激发在样品中的待检荧光团。荧光团以2种谱线为特征:入射光吸收谱(或激发谱)和荧光发射谱。因此,激发装置2包含光源21和能使激发装置2以对应于待检荧光团的吸收谱的波长进行发射的激发滤波器22。而且,激发装置2可能在一个立体角的范围内分布,以按照照明锥体来激发待分析的样品。
荧光检测设备的检测装置3被设置为仅检测与待检荧光团的发射谱线特征对应的荧光辐射。因而,检测装置3包含观测装置31和只允许传输具有待检荧光的辐射特征的发射滤波器32。而且,检测装置3覆盖于观测锥体上,而能够检测从多个方向进行发射的辐射。观测锥体可以被定义为至少10度的顶角。
荧光检测设备还包含分色镜4,分色镜使入射光线朝样品方向反射,并且只允许传输具有由待检荧光团发射的荧光特征的辐射。
例如,几何光学系统中运用的载体1可能是标准的,共焦的,单光子或双光子的荧光显微镜之一或者扫描仪之一。
更进一步的,当将载体1制造为自增强发射荧光时,油浸接物镜(如水、油)就不再需要了。因此,载体1的自增强使简单的空气接物镜成为可能,当油浸接物镜比较复杂或者苛求度高时,优势会更明显的表现出来。
图2,3,4,5阐明了定义表面粗糙度所选的参数。
表现表面S形貌特征的统计型参数由参考面R决定。参考面R的位置对应于不同表面点的平均高度。图2所示为表面地形的一维剖面图。此剖面证明了所用的第一参数,称为粗糙度标准差,描述了剖面高度上的特征。此参数对应于剖面与参考面R的差值h(x,y)的均方根,即
其中Lx和Ly为所分析的粗糙界面的尺寸,h(x,y)为在位置(x,y)处表面在参考面R上方的高度。
此外,粗糙度还将由表明表面粗糙度特征的两个参数λA和Δλ来定义。这对参数由源于所分析的粗糙表面形貌图的功率谱所确定。利用原子力显微镜(AFM)对粗糙表面进行观察所得到的图像如图3所示。从形貌图出发,就可以根据图像的傅立叶变换形式对功率谱进行处理。这种新的表现形式相当于以给定方向的正弦函数为基础的表面分解。因为一个粗糙表面并没有一个优先的方向,它的频谱表现形式也不会有。继而能够只考虑功率谱的辐射状剖面,如图4所示。表面粗糙度本质上由在辐射谱上具有显著值的空间频率组成。还可以把辐射状剖面表示成空间周期λ的函数,如图5所示。在最大辐射状剖面的中间高度处定义谱宽Δγ。此辐射状剖面的谱宽Δγ表示了组成表面的不同波长的波。因此空间周期的平均值λA和谱宽Δγ将足以准确的描述表面粗糙度。
已经定义了不同的表明粗糙度特征的参数,也应当对用来增强荧光信号的载体1做一个更详细的描述。增强荧光的重要特征表现为,必须被间隔层覆盖的传导层的存在和粗糙界面的存在。
对于在荧光过程中引入的波长,也就是对于待测荧光团的激发和辐射波长间隔层必须是透明的,这样才能使电磁辐射到达传导层。间隔层的厚度通常是几十纳米(nm),也可能针对给定的荧光团和激发波长进行调整。间隔层可能是高分子层(PPMA,PEG等),或者陶瓷层(SiO2,Al2O3,TiO2等)。例如当样本的目标是用于观察生物分子时,样品本身也可以组成间隔层;因此样本的油脂层,细胞膜可能构成间隔层。在稍后的例子里,使用包含间隔层的载体则都是不必要的。
传导层的属性并不是特别关键。例如,它可以由金属,如金,银,铜,铝或铂制成。传导层也可以是半导体。这层必须是连续的或者准连续的,但是厚度并不关键。连续的意思是,它必须完全覆盖载体的与荧光相关的活跃表面。准连续的层是指该层有一些非常小的不完整使之不能严格覆盖整个载体的活跃表面。
存在于传导层和间隔层之间的胞质基因激发现象可能导致荧光辐射的能量损失,而造成待检荧光信号的衰减。然而,胞质基因与通过粗糙表面传输的电磁波的耦合可以将能量传递给荧光信号。因此载体1应包含更多的粗糙界面15以促使此类耦合的发生,以便检测装置3将增强的荧光信号检测出来。界面的粗糙度由粗糙度标准差(非零,值约为几十纳米)和λA、Δλ(两个均非零,值约为几百纳米)来定义。粗糙表面的各向同性和随机属性也是很重要的,因为沿各个方向存在的多个空间频率的谱传播,是将入射波束与表面耦合,并且将样品的荧光团所发射的荧光反射到覆盖有检测装置的整个观测锥体上的方法。
图6显示了以粗糙界面作为传导层113的表面115的载体101。这样以粗糙界面作为传导层113的表面115的载体101可以按如下方法制造。
载体101包含其上连续沉积了传导层113、间隔层112和样品111的衬底114。这样的衬底114可以是玻璃片或者硅晶片。
传导层113可以用不同的技术进行制造。例如,载体表面可以利用化学或者机械侵袭的方法使其变为粗糙,然后利用热蒸发,激光消融,电化学,溅射等方法进行传导材料的沉积。如果载体本身已经是可传导的,唯一的步骤就是粗糙化了。
间隔层112,如果它不包含在待观测样品中时,可以用与沉积传导层相似的方法将其沉积于粗糙表面115之上。如果是高分子层的情况,可以运用“浸镀”或“旋涂”法。
特别的,这种载体可以在大约10-8托的高真空条件下制作。首先在一个干净的显微镜片上以高温蒸发(300℃)沉积大约60纳米厚的银层。这个几十纳米厚的第一层沉积创造了粗糙的底层。第二层沉积以低温(环境温度)方法制造一个60纳米厚的银层,以便形成粗糙而连续的传导层。粗糙表面层的粗糙度被定义为粗糙度标准差为20纳米,粗糙度平均空间周期λA为350纳米,粗糙度空间周期范围为Δλ约600纳米(在200和800纳米之间)。然后以每100次激光照射几纳米的沉积速率,通过脉冲激光消融方法沉积60纳米厚的氧化铝(Al2O3)层,由此形成间隔层。
根据另外一种实施方式和图7的载体201,还进一步含有包含粗糙表面216的间隔层212。
如上文所述的荧光检测设备将特别被用来监控样品里的荧光团。特别是,本发明不仅可以用于湿或干生物传感器(例如,生物芯片),还可以用于生物学和医疗图像(细菌,细胞,膜,生物分子,病理切片等)。
此外,本类荧光检测设备还可以用来研究能量转移,例如荧光共振能量转移(FRET),FRET对于研究生物分子间的互相作用是非常有价值的,但以前常常受到信号的微弱的局限。载体/荧光团的交互作用改变了电磁能量的传播从而改变了FRET类型的过程。运用本发明的荧光检测设备件即可增强此类过程的性能。
荧光检测设备还可以用来测量透明样品的厚度。
荧光信号的增强程度取决于间隔层的厚度。为了测量透明样品的厚度,荧光检测设备将包含如图8所示的载体301,其中传导层313的表面315是粗糙的,间隔层312被安排为一个厚度梯度的形式,即厚度从载体的一端向另一端增大。透明样品的厚度将根据在没有透明样品的载体301和加上透明样品311的载体301之间检测到的荧光密度的最大偏移量进行计算。
运用此类设备的好处在于,它可以在不利用特定的椭率计类仪表的基础上实现厚度的精确测量。
读者应了解,在不超越在此描述的新信息和优点的基础上可以进行许多改动。因此,所有此类的改动应当在后附的权利要求书中限定的荧光检测设备及其用途的范围之内。
Claims (24)
1.一种荧光检测设备,包括承载样品(11)的载体装置(1)、使样品(11)发射荧光的样品激发装置(2)和用来检测所述荧光的检测装置(3),其特征在于所述的载体装置(1)包含具有粗糙表面(15)的、用于使所述荧光偏向多个方向的层,所述的检测装置(3)覆盖在观测锥体上,以便在各个方向收集被偏转的荧光。
2.根据权利要求1所述的荧光检测设备,其特征在于观测锥体的顶角至少为10度。
3.根据权利要求1或2所述的荧光检测设备,其特征在于粗糙表面(15)具有由非零且小于100纳米的粗糙度标准差()定义的粗糙度。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于粗糙表面(15)具有由粗糙度的平均空间周期(λA)定义的粗糙度,所述粗糙度的平均空间周期(λA)得自于粗糙表面(15)形貌图的功率谱辐射状剖面,为非零且小于1000内米。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于粗糙表面(15)具有由粗糙度的空间周期范围(Δλ)定义的粗糙度,所述粗糙度的空间周期范围(Δλ)得自于粗糙表面(15)形貌图的功率谱辐射状剖面,为非零且小于1500纳米。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于含有粗糙表面(15)的层为连续或者准连续的。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于含有粗糙表面(115)的层为传导层(113)。
8.根据权利要求7所述的荧光检测设备,其特征在于传导层(113)为金属层。
9.根据权利要求8所述的荧光检测设备,其特征在于金属层由银、金、铜、铝或铂制成。
10.根据权利要求7所述的荧光检测设备,其特征在于传导层(113)为半导体。
11.根据权利要求7至10中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于传导层(113)厚度大于20纳米。
12.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于是载体装置(101)包含有间隔层(112),该间隔层对与荧光过程有关的激发和辐射波长透明。
13.根据权利要求12所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(112)为高分子层。
14.根据权利要求12所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(112)为陶瓷层。
15.根据权利要求12至14中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(112)厚度大于20纳米。
16.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(112)的厚度约为60纳米,传导层(113)的厚度约为60内米,传导层(113)的表面粗糙度由约为20纳米的粗糙度标准差()、约为350纳米的粗糙度平均空间周期(λA)以及约为600内米粗糙度空间周期范围(Δλ)定义。
17.根据权利要求12至14中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(312)被设置为具有厚度梯度。
18.根据权利要求17所述的荧光检测设备,其特征在于间隔层(312)的厚度由载体装置的第一末端向载体装置的第二末端增加。
19.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备,其特征在于激发装置(2)覆盖于照明锥体之上。
20.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备,其用途是监控样品中的荧光团。
21.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备,其用途是研究荧光团间的能量转换。
22.根据权利要求1至19中任意一项所述的荧光检测设备,其用途是测量样品厚度。
23.根据以上权利要求中任意一项所述的荧光检测设备的样品载体装置,其特征在于包含具有粗糙表面的、能使所述荧光偏向多个方向的层。
24.一种荧光检测方法,包括下列步骤:
-对承载于载体装置上的样品的激发,使得所述样品发射荧光;
-对由所述激发样品所发射荧光的检测;
其特征在于所述的载体装置包含具有粗糙表面的能使所述荧光偏向多个方向的层,所述荧光检测步骤包含在锥体中的观测,此锥体在多个方向收集被偏转的荧光。
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