CN102621111A - 用于扫描显微成像样本的方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种用于扫描显微成像样本(28)的方法和装置。采取下述措施，在相继的扫描时间间隔中通过扫描光束(14)扫描多个样本点，在相关扫描时间间隔内，反复感测相应扫描样本点发射的辐射强度，依据相应扫描样本点上感测的强度，确定出强度平均值，作为平均值图像点信号，并将该平均值图像点信号组合成平均值光栅图像信号。进一步采取措施，以依据相应扫描样本点上感测的强度，另外确定出强度方差值，作为方差图像点信号，并将该方差图像点信号组合成方差光栅图像信号。

Description

用于扫描显微成像样本的方法和装置

技术领域

本发明涉及用于扫描显微成像样本的方法和装置，分别根据权利要求1和权利要求9的前序部分。 

背景技术

在扫描显微术中，特别是在共焦显微术中，并不能照射全部待成像样本，只能以通过扫描光束的光栅移动来逐点扫描待成像样本，扫描光束通常由激光光源发射。为了扫描单个样本点，提供一扫描时间间隔，在该间隔期间扫描光束照射相应样本点。由该样本点发射的辐射，例如被扫描光束触发的荧光，随后被探测器感测并被转换成图像点信号。最后，由为单个样本点生成的图像点信号组合成光栅图像信号，并基于该信号呈现描绘全部样本的光栅图像。 

该单个图像点信号再现在相关扫描时间间隔期间由单个样本点发射的辐射的亮度或强度。为了尽可能精确地感测辐射强度，可以想到，在相应扫描时间间隔期间，当前被扫描的样本点发射的辐射强度被反复地感测，随后由这些被感测的强度确定出强度平均值。 

在这种情况下，各自代表了相应扫描时间间隔期间上的平均强度或亮度的单个平均值图像点信号组合成作为结果的光栅图像信号，该光栅图像信号再现了全部成像样本。 

以上述方式获得的光栅图像唯一地包含作为图像信息的样本亮度。为了允许例如待分析的漫射的动态过程，可取的是，生成的该光栅图像能够提供多于亮度的图像信息。 

可获得另外的这种类型的图像信息，例如以荧光相关光谱法的方式。然而，采用这种方法，通常仅感测单一图像点的图像信息，即不能由此生成可评价(evaluatable)的光栅图像。采用与图像信息的自相关协作的所谓光栅图像相关光谱法，却是可能的。但采用这种方法，光栅移动的速度必须以与待分析的动态过程，例如漫射，发生的速度在相同范围内。此外，如果光栅的移动是非线性的，则采用这种方法的评价会特别复杂。在相关 光谱领域中，还应提及在文献中称作“数量和亮度”(简称“N&B”)的分析方法。这种方法需要多个图像以允许基于特定图像位置处的波动对动态过程作出结论。 

发明内容

本发明的一个目的在于进一步发展最初提出的用于扫描显微成像样本的方法和装置，从而能够基于光栅图像简单快速地分析动态过程。 

借由权利要求1特征的方法和借由权利要求9特征的装置，本发明可达到上述目的。 

根据本发明的方法，依据在各自的扫描样本点感测的强度，除了作为平均值图像点信号使用的强度平均值之外，还确定作为方差图像点信号的强度方差值，并将为单个样本点生成的方差图像点信号组成方差光栅图像信号。当然，此处的“样本点”并不能被理解为严格数学意义上的点，而是空间地精细划定的、被聚焦的扫描光束照射的样本分区。 

因此，本发明提供了对扫描光束入射其上的每一单个样本点，由该样本点发射的辐射的强度在相关扫描时间间隔内被反复地感测，以及随后依据这些多个强度值确定强度平均值和强度方差值。对每一样本点，除了由强度平均值给出的平均亮度，强度方差值形式的另一图像信息项由此可另外获得。在每一情况中，强度平均值和强度方差值均用作图像点信号。随后，分别将为所有样本点生成的图像点信号组成平均值光栅图像信号和方差光栅图像信号。以这种方式生成两个光栅图像，即其每个图像点或像素代表强度平均值及因而是平均亮度的一个图像，和其每个图像点或像素使得强度方差形式的另一图像信息项可用的另一图像。 

该另一图像信息可用来分析动态过程。例如，其可用在荧光光谱法中以分析荧光染料的漫射。根据该应用，基于该另一图像信息还可以获得黏度波动、膜通透性、颗粒尺寸等的有关证据。 

因此，根据本发明的方法使得能够在照射期间获得一个样本点的两个不同的图像信息项(即平均值和方差)，并因此生成与该样本点关联的两个图像点。因此，对入射在样本上的同一扫描光束，组合这些图像点的结果所生成不只一个光栅图像而是二个，一个再现平均亮度，另一再现亮度方差。因而这种方法比现有技术已知的和前述引用的方法更有效。 

基于各自的平均值图像点信号和关联的方差图像点信号，优选地生成 评价图像点信号。以这种方式生成的评价图像点信号随后被组合成评价光栅图像信号。在该有利的改进中，另外生成的评价光栅图像作为除了平均值光栅图像和方差光栅图像之外的第三图像。这三个光栅图像随后以各种方式呈现在显示设备上，例如一个接着另一个，一个重叠在另一个上，同时地，或依照预定的图像序列，从而有助于分析动态程序。 

在每一扫描时间间隔内发射的辐射强度优选地在连续的子间隔中被n次数字化以感测出n个强度值，n为大于1的整数，且每一子间隔等于扫描时间间隔的1/n。举个例子，如果扫描时间间隔(常也作为“像素时间”提及)为10μs，在每一扫描时间间隔内感测强度值的测量频率为40MHz，则对每一图像点或像素获得了n＝400个测量值。随后，基于这400个测量值确定强度平均值和强度方差。 

在一有利的实施例中，通过如下方式感测该n个强度值：在相应扫描时间间隔内，模数转换器n次将相应于发射的辐射的模拟信号转换成表示相应强度值的数字信号，每种情况下都以一等于子间隔的预定转换时间进行转换。这种情况下，因而要将模数转换器的转换时间设定为足够的短，从而能在扫描时间间隔内n次操作转换器，以n次数字化逻辑信号并因此感测n个强度值。 

在一可选的实施例中，代替模数转换器，可采用光子计数器，该光子技术器的计数时间设定为足够短以在扫描时间间隔内实施n次计数循环。 

优选地，根据下述公式(1)确定相应强度平均值 

$\stackrel{\‾}{x}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i---\left(1\right)$

根据下述公式(2)确定相应强度方差值V： 

$V=\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2---\left(2\right)$

其中，优选地，根据公式(3)确定变量 

$\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x_i}^2-n{\stackrel{\‾}{x}}^2---\left(3\right)$

或根据下述公式(3’)： 

$\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x_i}^2-\frac{1}{n}{\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i\right)}^2---\left(3^{,}\right)$

其中x_i表示在相应扫描时间间隔内感测的强度，n表示一个大于1的整数，其指示了在相应扫描时间间隔内感测的强度x_i的数量。 

作为依照公式(3)或(3’)的信号处理的结果，强度x_i的和，及其平方的和均可以同一途径来计算。因而，可在图像获取期间，即在扫描光束照射相应样本点期间实时地直接实施计算操作。 

优选地，确定强度方差值V和强度平均值 

的商为评价图像点信号。这种改进可用于例如感测样本中漫射增加的区域。特别地，如果假定一静态样本(即在样本滑道上固定的一样本)依照泊松统计发射光子，则方差与发射的光子数量成正比。这表示平均值光栅图像和方差光栅图像提供相同的图像信息(不考虑统计波动)。如果光子源额外地变化，例如作为荧光染料等漫射的结果，则相对关联的强度平均值，也即图像亮度，方差会相应地增加。因而，基于对每一单个样本点计算的强度方差值和强度平均值 

的商，能探测样本中漫射增加的区域。通过该商计算的评价图像点信号可用于生成评价光栅图像，该图像中这些区域将显而易见。 

在另一有利的实施例中，采取措施以确定在相关扫描时间间隔内相应样本点发射的光子数量N_ph，作为评价图像点信号，其为采用下述公式(4)的强度平均值 

和强度方差值V的函数： 

$N_{\mathrm{ph}}=\frac{{\stackrel{\‾}{x}}^2}{V}---\left(4\right)$

该改进基于这样的认识：当泊松统计可用时，由公式(4)给出发射的光子数量N_ph。可独立于任何增益系数和校准(calibrations)确定光子数量N_ph。这仅需要泊松噪音为测量信号波动、也即感测的强度值波动的主要来源(如果噪音效果可以忽略的话)。因此可将全增益(固有未知)概括为因数θ。这种情况下，光子数量N_ph为下述公式(5)： 

$\frac{N_{\mathrm{ph}}}{\mathrm{\θ}}=\stackrel{\‾}{x}---\left(5\right)$

泊松统计率(Possion statistics yield)： 

$\frac{N_{\mathrm{ph}}}{{\mathrm{\θ}}^2}=v---\left(6\right)$

最终，由公式(5)和(6)获得下式： 

$\frac{{\stackrel{\‾}{x}}^2}{V}=\frac{{\left(\frac{\mathrm{Nph}}{\mathrm{\θ}}\right)}^2}{\frac{\mathrm{Nph}}{{\mathrm{\θ}}^2}}=N_{\mathrm{ph}}---\left(7\right)$

由上述考虑可见，根据公式(4)的评价图像点信号事实上适于确定光子数量N_ph。考虑到扫描时间间隔，因此绝对的探测光子流量(例如每秒的光子)可独立于增益系数和校准来描述。 

依据权利要求9，根据本发明的装置被具体化以实施根据权利要求1的方法。 

在该装置一特别有利的改进中，确定相应强度平均值和相应强度方差值的计算单元包含自由可编程逻辑模块，特别地是现场可编程门阵列(FPGA)，数字信号处理器(DSP)，或特定用途集成电路(ASIC)。这种类型的逻辑模块能够在获取图像期间、即实时地，直接计算本发明待确定的变量，也就是强度平均值和强度方差值。在评价单元中将平均值图像点信号组合成平均值光栅图像信号、将方差图像信号组合成方差光栅图像信号，并随后评价这些图像，因而传输至评价单元的数据的量大大地减少了。例如，仅需将每一单个样本点的强度平均值和强度方差值传输至评价单元。 

下文中，将参考附图，基于示例的实施例阐释本发明。 

附图说明

图1示出根据本发明的共焦扫描显微镜的构造。 

图2示出在根据图1的扫描显微镜中提供的计算单元，及与该计算单元交互的组件。 

具体实施方式

图1图解地示出根据本发明的共焦扫描显微镜10。扫描显微镜10包含将扫描光束14发射至第一孔径16上的激光光源12。固定分光镜17将穿过第一孔径16的扫描光束14反射至扫描单元18上。扫描单元18包括安装了万向架的扫描镜20，扫描镜20将扫描光束14朝向由两个透镜22和24组成的扫描光学系统反射。在穿过扫描光学系统后，扫描光束14抵达至物镜26，物镜26将扫描光束14聚焦在搁置在样本台30上的样本28上。在图1中，由激光光源12发射的、并最后聚焦在样本28上的扫描光束由实线表示。 

待成像的样本28配备有荧光染料，该荧光染料被扫描光束14激发将发射荧光辐射。在图1中该荧光辐射由虚线表示，并被标记为32。荧光辐 射32的波长不同于扫描光束14的波长。与扫描光束14的传播方向相反，荧光辐射32穿过目镜26和由两个透镜22和24组成的扫描光学系统，随后入射至扫描镜20上，扫描镜将其朝向分束器17反射。分束器17具体设置为对荧光辐射32波长是透明的。因而荧光辐射32穿过分束器17，并随后穿过第二孔径34。探测器36接收穿过第二孔径34的荧光辐射，并将其转换成相应的模拟电压信号。 

第一孔径16以本身已知的方式将扫描光束14聚焦至样本28上。这表示，扫描光束14并不照射整个样本28，而是在每个时间点照射其衍射极限的小部分，其在本发明中简称为“样本点”。该样本点通过第二孔径34以相应图像点的形式成像在探测器36上。 

通过驱动系统(图1中未示出)移动用万向架固定的扫描镜20，因而扫描光束14一次扫描样本28的一个样本点。为此提供一扫描时间间隔，在该间隔期间扫描光束14照射相应样本点。 

本发明提供了在扫描光束14照射相应样本点的扫描时间间隔期间，该样本点发射的荧光辐射的强度被反复地感测以获得多个强度值，并以稍后阐释的方式处理这些强度值。在该示例的实施例中，由于探测器36产生的模拟电压信号被发送至模数转换器38，在每个扫描时间间隔内可感测多个强度值。模数转换器38以一定的转换时间将发送至其的模拟电压信号转换成数字信号，该转换时间设置成能够在相应扫描时间间隔内完成多次模拟数字转换。 

如果假定，纯粹举例来说，模数转换器38以40MHz的频率运行，扫描时间间隔为10μs，则在扫描时间间隔内可实施400次模拟数字转换。这表示对单个样本点可确定出400个数字强度值。 

模数转换器生成的数字强度值被输出至计算单元40。在该示例的实施例中，计算单元400是自由可编程逻辑模块，例如为FPGA、DSP或ASIC。根据从模数转换器38发送至计算单元的数字强度值，计算单元40确定出至少两个与相应扫描样本点关联的图像点信号，也就是平均值图像点信号和方差图像点信号。下面参考附图2进一步地阐释这两个图像点信号的确定。 

由计算单元40执行的为确定两个图像点信号所需的计算操作是实时的，即在相应扫描时间间隔之后，两个图像点信号便立即可用。计算单元40将图像点信号输出至评价单元42，例如个人电脑。一旦扫描光束40扫 描完所有的样本点，平均值图像点信号的序列和方差图像点信号的序列(如果适用，还有另外的图像点信号序列)就可用，这些序列分别被组合成平均值光栅图像信号和方差光栅图像信号。在该示例的实施例中，在评价单元42中组合这些光栅图像信号。但借由计算单元40的适当的程序，这也可发生在后者中。随后，评价单元42将光栅图像信号输出至监视器44，监视器44上显示成像样本28相应的光栅图像。 

参考附图2，下面将更详细地阐释计算单元40对图像点信号的确定。为此，附图2图解地描绘出计算单元40示例的构造。 

如前所述，在扫描光束14照射相应样本点的扫描时间间隔内，探测器36生成模拟电压信号，模数转换器38通过转换该模拟电压信号生成数字强度值，计算单元40接收数字强度值。计算单元40包含延时元件46，数字强度值自模数转换器38被发送至该延时元件46。再次将前述实施例作为基础，其中扫描时间间隔具有10μs的长度，模数转换器38具有40MHz的转换频率，则延时元件46接收n＝400个附图1中标记为x₁，x₂，x₃，...，x_n的强度值。延时元件46在强度值x₁，x₂，x₃，...，x_n上执行缓冲操作，基于根据最先保存的强度值同样也最先从存储器中移出的所谓“先进，先出”的原则。 

延时元件46将强度值x₁，x₂，x₃，...，x_n发送至第一功能块48和第二功能块50。第一功能块48生成强度值x₁，x₂，x₃，...，x_n的和，第二功能块50确定出强度值x₁，x₂，x₃，...，x_n的平方的和。第一功能块48将确定的和输出至第三功能块52和第四功能块54。第二功能块50将确定的平方的和发送至第四功能块54。 

第三功能块52根据前文指出的公式(1)确定强度平均值 另一方面，第四功能块54采用上文例举的公式(2)，(3)和(3’)确定强度方差值V。第三功能块将强度平均值 

作为平均值图像点信号输出至评价单元42。第四功能块54相应地将强度方差值V作为方差图像点信号输出至评价单元42。 

对每一扫描的样本点，实施计算单元40上述的计算操作。一旦扫描光束14扫描完所有的样本点，平均值图像点信号序列和方差图像点信号序列就可用，这些序列在评价单元42中被分别组合成平均值光栅图像信号和方差光栅图像信号。基于这些光栅图像信号，平均值光栅图像和方差光栅图像被分别显示在监视器44上。本文中可采用任何类型的图像显示方式。例如，在监视器44上，上述两个光栅图像可一个接着一个显示， 一个重叠在另一个上显示，或以预定的时间序列相继地显示。还可以在监视器44上再生出包含在方差光栅图像中的其它图像信息，作为以假彩或三维绘图的形式在平均值光栅图像上的覆盖图。 

正如先前所讨论的，包含在方差光栅图像中的其它图像信息可特别地用来分析动态过程。例如，基于该图像信息，能够获得黏度波动、膜通透性、颗粒尺寸、扩散参数等的有关证据。 

基于计算单元40中确定的强度方差值V，还可确定出其它变量。此处可提及的一个实施例是强度方差值V和强度平均值 

的商。依照上文指出的公式(7)，还可确定出光子数量N_ph。基于这些变量，对每一样本点生成相应的评价图像点信号，以随后将所有样本点的评价图像点信号组合成评价光栅图像信号，并将相应的光栅图像显示在监视器44上。 

上述实施例应被理解为仅仅是示例。因而当保持了根据本发明的方法，附图1和2示出的示例的实施例当然地可被修改。举例来说，可以将探测器36和模数转换器38替换成光子计数器，光子计数器可通过在相应扫描时间间隔内、以多次计算循环的方式感测相应于相应样本点发射的辐射的光子数量来感测强度值。此外，不言而喻的是，基于强度平均值和强度方差值还可确定除了上述评价变量以外的变量。 

部件目录 

10 共焦扫描显微镜 

12 激光光源 

14 扫描光束 

16 第一孔径 

17 分束器 

18 扫描单元 

20 扫描镜 

22，24 透镜 

26 物镜 

28 样本 

30 样本台 

32 荧光辐射 

34 第二孔径 

36 探测器 

38 模数转换器 

40 计算单元 

42 评价单元 

44 监视器 

46 延时单元 

48 第一功能块 

50 第二功能块 

52 第三功能块 

54 第四功能块。 

Claims (15)

1.一种用于扫描显微成像样本(28)的方法，包括下述步骤：

在相继的扫描时间间隔中通过扫描光束(14)扫描多个样本点，

在相关扫描时间间隔内，反复感测相应扫描样本点发射的辐射强度，

依据相应扫描样本点上感测的强度，确定出强度平均值，作为平均值图像点信号，并且

将该平均值图像点信号组合成平均值光栅图像信号，

其中，依据相应扫描样本点上感测的强度，另外确定出强度方差值，作为方差图像点信号，并且

将该方差图像点信号组合成方差光栅图像信号。

2.根据权利要求1的方法，其中基于相应平均值图像点信号和相关方差图像点信号，生成评价图像点信号，并将生成的评价图像点信号组合成评价光栅图像信号。

3.根据权利要求1或2的方法，其中在相继的子间隔中n次数字化每一扫描时间间隔内发射的辐射强度，以感测出n个强度值，n为大于1的整数，且每一子间隔等于扫描时间间隔的1/n。

4.根据权利要求3的方法，其中通过如下方式感测该n个强度值：在相应扫描时间间隔内，通过模数转换器n次将相应于发射的辐射的模拟信号转换成表示相应强度值的数字信号，每种情况下都以一等于子间隔的预定转换时间进行转换。

5.根据权利要求3的方法，其中通过如下方式感测该n个强度值：在相应扫描时间间隔内，通过光子计数器n次确定出相应于发射的辐射的光子数量，每种情况下都以一等于子间隔的预定转换时间进行确定。

6.根据前述权利要求之一的方法，其中根据下述公式(1)确定相应强度平均值

$\stackrel{\‾}{x}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i---\left(1\right)$

根据下述公式(2)确定相应强度方差值V：

$V=\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2---\left(2\right)$

其中，优选地，根据公式(3)确定变量

$\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x_i}^2-n{\stackrel{\‾}{x}}^2---\left(3\right)$

或根据下述公式(3’)：

$\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x_i}^2-\frac{1}{n}{\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{x}_i\right)}^2---\left(3^{,}\right)$

其中x_i表示在相应扫描时间间隔内感测的强度，n表示大于1的整数，其指示了在相应扫描时间间隔内感测的强度x_i的数量。

7.根据权利要求6的方法，其中确定强度方差值V和强度平均值的商，作为评价图像点信号。

8.根据权利要求6或7的方法，其中确定在相关扫描时间间隔内探测的相应样本点发射的光子数量N_ph，作为评价图像点信号，其为根据下述公式(4)的强度平均值

和强度方差值V的函数：

$N_{\mathrm{ph}}=\frac{{\stackrel{\‾}{x}}^2}{V}---\left(4\right)$

9.一种用于扫描显微成像样本的装置，包括：

扫描单元(12，18)，设置为在相继的扫描时间间隔中通过扫描光束(14)扫描多个样本点，

感测单元(36，38)，设置为在相关扫描时间间隔内，反复感测相应扫描样本点发射的辐射强度，

计算单元(40)，设置为依据相应扫描样本点上感测的强度，确定出强度平均值，作为平均值图像点信号，以及

评价单元(42)，设置为将该平均值图像点信号组合成平均值光栅图像信号，

其中，计算单元(40)进一步地设置为依据相应扫描样本点上感测的强度，另外确定出强度方差值，作为方差图像点信号，并且

评价单元(42)进一步地设置为将该方差图像点信号组合成方差光栅图像信号。

10.根据权利要求9的装置，其中评价单元(42)进一步地设置为基于平均值图像点信号和方差图像点信号，生成评价光栅图像信号，并将生成的评价图像点信号组合成评价光栅图像信号。

11.根据权利要求8或9的装置，其中感测单元(36，38)包含数字化工具(38)，其设置为在相继的子间隔中n次数字化每一扫描时间间隔内探测的辐射强度，以感测出n个强度值，n为大于1的整数，且每一子间隔等于扫描时间间隔的1/n。

12.根据权利要求11的装置，其中该数字化工具包含模数转换器(38)，其设置为通过如下方式感测该n个强度值：在相应扫描时间间隔内，模数转换器n次将相应于发射的辐射的模拟信号转换成表示相应强度值的数字信号，每种情况下都以一等于子间隔的预定转换时间进行转换。

13.根据权利要求11的装置，其中该数字化工具包含光子计数器，其设置为通过如下方式感测该n个强度值：在相应扫描时间间隔内，光子计数器n次确定出对应于发射的辐射的光子数量，每种情况下都以一等于子间隔的预定计数时间进行确定。

14.根据权利要求9至13之一的装置，其中该计算单元(40)包含自由可编程逻辑模块，特别地为FPGA，DSP或ASIC。

15.一种共焦扫描显微镜(10)，具有根据权利要求9至14之一的装置。

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