WO2007013343A1 - 細菌の検出方法 - Google Patents

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WO2007013343A1
WO2007013343A1 PCT/JP2006/314374 JP2006314374W WO2007013343A1 WO 2007013343 A1 WO2007013343 A1 WO 2007013343A1 JP 2006314374 W JP2006314374 W JP 2006314374W WO 2007013343 A1 WO2007013343 A1 WO 2007013343A1
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WO
WIPO (PCT)
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dna
group
substrate
detecting
bacterium
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/314374
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Kinoshita
Fumio Kato
Yojiro Anzai
Kentaro Fujimoto
Toru Yakabe
Kanehisa Yokoyama
Original Assignee
Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. filed Critical Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Priority to JP2007528429A priority Critical patent/JP4922936B2/ja
Publication of WO2007013343A1 publication Critical patent/WO2007013343A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a bacteria detection method for detecting bacteria in a specimen.
  • Detection and identification of Salmonella is performed by enrichment, isolation culture, confirmation culture by biochemical properties, serotyping by o (cell) antigen, K (Vi capsule) antigen, H (flagellar) antigen, A comprehensive judgment of inspection is required.
  • this method is time consuming and labor intensive, and may be different from the original form (property) when identifying bacteria by the form of the fungus, for example, under a microscope. There were cases where exceptional properties made it difficult to judge. Simple kits for assimilation tests are also commercially available and widely used. However, one kit is usually required for each sample and is disposable. There was also a problem that things would be generated.
  • PCR can synthesize millions of DNA copies, it is very sensitive to contaminants, so if you start a very small amount of vertical DNA force reaction, the product of the previous reaction (product carryover) Another problem is contamination of substances that enter the external force of the reaction system. For example, just one copy of a plasmid containing the target sequence may be misinterpreted in the reaction system.
  • an expensive enzyme such as polymerase must be used, and it is difficult to reduce the cost.
  • messenger RNA extracted from cells which was called DNA microarrays or DNA chips, was examined for gene expression on multiple DNA fragments with different sequences fixed to different locations on the substrate.
  • an array is prepared by immobilizing oligonucleotides having a specific base sequence for a specific bacterial species on a single glass slide for multiple types of bacterial species, and identifying the genomic DNA of the bacterial specimen. Amplify the nucleotide sequence site of PCR using the PCR method, and simultaneously with the amplification! /, Hybridize by applying the labeled cDNA after amplification to the array and detecting the label bound on the array Therefore, a method for identifying bacterial species has also been proposed. In this method, an expensive enzyme is indispensable because the PCR method is used, and it is difficult to reduce the cost. In addition, since one array is required for the examination of one specimen, there is a problem that the cost becomes very high in consideration of the array production cost, the reagent cost required for hybridization, the cost related to detection, and the like.
  • Non-Patent Document 1 a primer DNA that amplifies a 23S ribosomal DNA chain derived from bacteria is immobilized on the surface of a glass substrate, and the primer is extended in a PCR-like environment using a 23S ribosomal DNA in a saddle shape.
  • a method of performing detection is described. This method is close to simultaneous amplification of the gene and detection by the DNA microarray. It can be expected to simplify the operation and detect bacteria quickly. It is necessary to supply a sample solution that has been amplified by PCR in advance, which has poor sensitivity, to the surface of the substrate and perform a DNA elongation reaction on the substrate.
  • Non-patent literature 1 Georg Mitterer, et al, "icroarray-Basea identincation in Clinical Sam pies by Solid-Phase PCRAmplification of 23S Ribosomal DNA Sequences of poly ", Journal of Clinical Microbiology, 2004, Vol. 42, No.3 pl048-1057
  • the present inventors used various substrates for detecting bacteria by immobilizing primer DNA corresponding to 16S and 23S ribosome DNA on a substrate represented by Non-Patent Document 1 and extending the DNA.
  • a substrate having a predetermined polymer substance on the surface was used, the primer was extended with good reproducibility and the detection sensitivity of bacteria was high, and the present invention was completed.
  • a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of a phospholipid and an electron-withdrawing substituent force A second unit having a carboxylic acid derivative group bonded to an S-carbonyl group
  • a primer for DNA extension consisting of a part of the base sequence homologous to the base sequence of the 16S or 23S ribosomal DNA of the bacterium to be detected;
  • the groups derived from the phosphate ester contained in the first unit of the substrate are phosphorylcholine group, phosphorylethanolamine group, phosphorylserine group, phosphorylinositol group, A method for detecting bacteria, characterized by being either a phosphorylglycerol group or a phosphatidylphosphorylglycerol group,
  • the DNA elongation primer DNA chain strength The bacterium characterized in that the electron-withdrawing substituent is covalently bonded at the site of the second unit having a carboxylic acid derivative group formed by bonding to a carbo group. Detection method,
  • the substrate includes a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting a hydrophilic portion of a phospholipid, and a third unit having a butyl methacrylate group.
  • a method for detecting bacteria characterized by comprising two polymer substances;
  • a method for detecting bacteria wherein the substrate is made of plastic material
  • step (c) is performed by a treatment in a predetermined heat cycle
  • the number of heat cycles is 1 or more.
  • the labeled nucleotide monomer into which the labeled compound is introduced in the step (b) is bound to the labeled compound, and the compound into which the oxidoreductase is introduced is allowed to act on the oxidized nucleotide.
  • a method for detecting a bacterium comprising a step of causing an oxidation or reduction reaction between an enzyme and a colored substrate to cause the colored substrate to develop a color.
  • the DNA chain elongation enzyme system and the liquid phase system into which the sample containing the nucleotide monomer has been introduced are raised to a temperature at which the DNA chain is thermally denatured (hereinafter referred to as “thermal denaturation treatment temperature”).
  • the temperature is lowered to the annealing temperature (hereinafter referred to as “annealing temperature”), and the DNA elongation temperature is maintained by maintaining the DNA elongation temperature, and the entire treatment is the same.
  • annealing temperature a temperature at which the DNA chain is thermally denatured
  • groups derived from a phosphate ester contained in the first unit of the substrate are phosphorylcholine group, phosphorylethanolamine group, phosphorylserine group, phosphorylinositol group, phosphorylglycerol group, phosphatidyl group.
  • Phosphoryldari The serol group can be misaligned.
  • the DNA chain elongation reaction that occurs on the surface of the substrate can be performed in an environment equivalent to that in the cell, and DNA reaction efficiency is high. Chain extension can be performed more efficiently under milder conditions.
  • a primer DNA strand consisting of a sequence similar to a fungus-specific sequence of 16S or 23S ribosome of a fungus is immobilized on the substrate surface on the substrate, and a fungus is obtained by an extension reaction of the primer DNA strand.
  • bacteria can be detected with high sensitivity by eliminating the need for significant gene amplification by PCR or by fragmenting ribosomal DNA.
  • the bacterial detection method is formed by binding a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of a phospholipid and an electron-withdrawing substituent force S-carbonyl group.
  • A a portion of the base sequence that is similar to the base sequence of the 16S or 23S ribosomal DNA of the bacteria to be detected;
  • B a step of fixing a DNA strand on the substrate surface, and (b) contacting a sample solution containing a ribosomal DNA strand prepared from bacteria, a nucleotide monomer, and a DNA extension enzyme, on the substrate surface.
  • a step of extending the DNA strand of the primer for DNA extension immobilized on the surface of the substrate by making the ribosomal DNA strand in the sample solution into a saddle shape.
  • a polymer substance having a unit is a polymer having both the property of suppressing nonspecific adsorption of DNA strands and the property of fixing DNA strands.
  • the group derived from the phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid contained in the first unit plays a role in suppressing nonspecific adsorption of the cage DNA fragment, and the carboxylic acid contained in the second unit.
  • the derivation group plays a role in anchoring the primer. That is, the primer is covalently bonded at the site of the carboxylic acid derivative group of the coating layer that is a polymer material, and the surface of the substrate Immobilized on the surface.
  • the first unit is, for example, a (meth) ataryloxyalkyl phosphorinorecholine group such as a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine group, a 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine group;
  • (Meth) acryloyloxyalkoxyalkylphosphorylcholine groups such as 2-methacryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine group and 10-methacryloyloxyethoxynor phosphorylcholine group;
  • Alkaryl phosphorylcholine groups such as aryl phosphoryl choline group, butyr phosphoryl choline group, hexenyl phosphoryl choline group, otatur phosphoryl choline group, and desyl phosphoryl choline group;
  • Etc., and phosphorylcholine basicity S is contained in these groups and can be configured as follows.
  • the basic skeleton is a phosphorylcholine group represented by the following formula (a).
  • This phosphorylcholine is represented by the following formula (b) phosphorylethanolamine group, the following formula (c) phosphorylinositol group, It may be replaced with a phosphoric acid group such as a phosphorylserine group of the following formula (d), a phosphorylglycerol group of the following formula (e), or a phosphatidylphosphorylglycerol group shown by the following formula (f). But the same).
  • Carboxylic acid derivatives are those in which the force loxyl group of the carboxylic acid is activated, and C
  • the carboxylic acid derivative is a compound in which a nucleophilic reaction is activated by bonding a group having higher electron withdrawing property than an alkoxyl group to a carbonyl group.
  • Carboxylic acid-derived groups are compounds having reactivity with amino groups, thiol groups, hydroxyl groups and the like.
  • carboxylic acid derivative a carboxyl group such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, maleic acid, and fumaric acid, which are carboxylic acids, is an acid anhydride, an acid halide, an active ester. And compounds converted to active amides.
  • Carboxylic acid-derived groups are activated groups derived from such compounds, for example, p-trifluoro groups, N active ester groups such as hydroxysuccinimide groups; halos such as Cl, mono-F, etc. Gen;
  • the carboxylic acid-derived group may be a group represented by the following formula (1).
  • A is a leaving group excluding a hydroxyl group.
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, which may be linear, branched, or cyclic.
  • R 1 may be a divalent group that forms a ring with C.
  • R 2 is a divalent group that forms a ring with N. It may be a group of [0025]
  • Examples of the group represented by the above formula (p) include groups represented by the following formulas (r), (s), and (w).
  • Examples of the group represented by the above formula (q) include a group represented by the following formula (u).
  • the group represented by the above formula (1) is, for example, a group derived from an acid anhydride represented by the following formula (r), formula (s), etc .;
  • an active ester group is preferably used because it is excellent in reactivity under mild conditions.
  • Mild conditions include, for example, neutral or alkaline conditions, specifically pH 7.0 or higher and 10.0 or lower, more specifically pH 7.6 or higher and 9.0 or lower, and more specifically pH 8. Can be 0.
  • the "active ester group” as defined in the present specification is not strictly defined according to the definition, but as a conventional technical expression, an alcohol of the ester group is used.
  • a group of esters that have a high acidity and an electron-attracting group on the side to activate a nucleophilic reaction that is, an ester group having a high reaction activity, can be used for various chemical syntheses, such as polymers. Those commonly used in the fields of chemistry, peptide synthesis and the like.
  • the active ester method is an amino acid.
  • it is used as one of the methods for activating the C-terminus of the peptide.
  • the ester group has an electron-withdrawing group on the alcohol side of the ester group and is more active than the alkyl ester.
  • the active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group and hydroxyl group. More specifically, phenol esters, thiophenol esters, N hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. have much higher activity than alkyl esters. Known as the active ester group.
  • the activated carboxylic acid derivative group in the polymer substance is an active ester group
  • the active ester group include p-trophenyl group, N-hydroxysuccinimide group, succinimide group, phthalimide group, 5-norbornene 2,3-dicarboximide group, and the like, for example, p-trophenyl group. It is preferably used.
  • the first unit and the second unit are derived from a phosphate ester that forms the hydrophilic part of the phospholipid.
  • the first unit containing a group may have a 2-methacryloyloxychetylphosphorylcholine group, and may be an active ester group-nitrophenol group.
  • the polymer substance used for the coating layer of the substrate of the present embodiment includes other groups in addition to the group derived from the phosphate ester and the carboxylic acid derivative group constituting the hydrophilic part of the phospholipid. But you can.
  • the polymer substance can be a copolymer. Specifically, the polymer substance is preferably a copolymer containing a butyl methacrylate group. By so doing, the polymer substance can be appropriately hydrophobized, and the adsorbability of the polymer substance to the substrate surface can be more suitably ensured.
  • the polymer substance is composed of a first monomer having a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine (MPC) group, and a p-trope-carboxyl polyethylene glycol methacrylate (NPMA) group. And a second monomer having a butyl metallate (BMA) group.
  • a, b, and c are each independently a positive integer.
  • the first to third monomers may be block copolymerized, or these monomers may be randomly copolymerized! /.
  • the copolymer represented by the general formula (2) has an appropriate hydrophobicity of a high molecular weight substance, a property of suppressing non-specific adsorption of a cage DNA fragment, and a property of immobilizing a primer. This is an even better structure. For this reason, by using such a copolymer, the surface of the substrate is more reliably coated with the polymer material, and nonspecific adsorption of the vertical DNA fragment onto the substrate coated with the polymer material is performed. In addition, the primer can be more securely immobilized by covalent bonding and introduced onto the substrate while suppressing the above-described phenomenon.
  • the copolymer represented by the general formula (2) can be obtained by mixing MPC, BMA, and NPMA monomers and using a known polymerization method such as radical polymerization.
  • a known polymerization method such as radical polymerization.
  • solution polymerization is performed in an inert gas atmosphere such as Ar under a temperature condition of 30 ° C to 90 ° C. I can do it.
  • the solvent used for the solution polymerization is appropriately selected.
  • an alcoholic solvent such as methanol, ethanol ⁇ isoprono norole, an etherol such as jetinoreethenore, and an organic solvent such as chlorohonolem alone or in combination.
  • it can be a mixed solvent in which the volume ratio of diethyl ether and black mouth form is 8 to 2.
  • the radical polymerization initiator used in the radical polymerization reaction those usually used can be used.
  • azo-based initiators such as azobisisobutyor-tolyl (AIBN), azobis valero-tolyl;
  • Oil-soluble organic peroxides such as lauroyl peroxide, benzoyl peroxide, t-butylperoxyneodecanoate, t-butylperoxybivalate;
  • polymerization is carried out in Ar at 60 ° C for about 2 to 6 hours using a mixed solvent and AIBN in which the volume ratio of jetyl ether and black mouth form is 8 to 2. Can do.
  • the high molecular substance has a third unit containing a butyl metatalylate group.
  • a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid is described.
  • a polymer substance having a first unit containing and a second unit containing a carboxylic acid derivative group is used as the first polymer substance, and in addition to this, a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid.
  • a second polymeric material having a first unit comprising and a third unit comprising a butyl metatalylate group.
  • the first unit of the first polymer substance and the first unit of the second polymer substance may have the same structure or different structures. Further, when the first polymer substance includes a third unit containing a butyl metatalylate group, the third unit of the first polymer substance and the third unit of the second polymer substance are the same. It may be a structure or a different structure.
  • Such a second polymer substance is used as a polymer that suppresses non-specific adsorption of cage DNA fragments.
  • Such polymers for example phosphorylcholine group 30 molar 0/0, contains a proportion of butyl methacrylate Tali rate group 70 mole 0/0, MPC poly mer is shall (manufactured by NOF Corporation) Can be used.
  • the high molecular substance is composed of the first high molecular substance and the second high molecular substance, these high molecular substances can be mixed together. Since each polymer substance polymer can be dissolved in, for example, an ethanol solution, a mixed polymer can be easily obtained by mixing each polymer solution.
  • the substrate including the coating layer having the above-described polymer substance force on the surface has a predetermined shape. It is obtained by applying a liquid containing a polymer substance to the surface of the substrate processed into a substrate and drying it. Alternatively, the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
  • thermoplastic resin can be used from the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity.
  • thermoplastic resin one having a small amount of fluorescence generation can be used. By using a resin having a small amount of fluorescence, the background in the detection reaction of the DNA strand can be lowered, so that the detection sensitivity can be further improved.
  • thermoplastic resins with low fluorescence generation include linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene;
  • Etc. can be used.
  • saturated cyclic polyolefin is particularly excellent in heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, transparency and moldability, and is therefore suitable for optical analysis and is preferably used as a substrate material.
  • the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of cyclic olefin and a-olefin.
  • the former include hydrogenation of norbornene-based monomers represented by, for example, norbornene, dicyclopentagen, and tetracyclododecene, and polymers obtained by ring-opening polymerization of these alkyl-substituted products. It is a saturated polymer produced.
  • the latter copolymer is cyclic with ⁇ -olefins such as ethylene, propylene, isopropylene, 1-butene, 3-methyl 1-butene, 1-pentene, 3-methyl 1-pentene, 1-hexene and 1-octene. It is a saturated polymer produced by hydrogenating a random copolymer of olefin monomers.
  • a copolymer with ethylene is most preferable.
  • These resins may be used alone, or may be two or more types of copolymers or mixtures.
  • a substrate having a plastic material force including a polymer substance on the surface as described above can be obtained by applying a liquid containing the polymer substance on the surface of the substrate processed into a predetermined shape and drying it.
  • the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
  • the shape is not limited to a plate shape, and may be, for example, a film shape or a sheet shape.
  • the substrate can be a flexible plastic film.
  • the substrate may be composed of a single member or a plurality of member forces.
  • This method includes the following steps (a) to (c).
  • a primer for DNA extension consisting of a part of the base sequence homologous to the base sequence of the 16S or 23S ribosomal DNA of the bacterium to be detected;
  • step (a) a DNA extension primer DNA strand is immobilized on the surface of the substrate.
  • the primer is immobilized by (ii) deactivating the active ester group on the substrate surface other than the primer immobilized, that is, deactivating the remaining active ester groups. Can be fixed to the surface of the substrate.
  • step (i) when fixing the primer DNA strand that anneals with the vertical DNA fragment on the substrate, a method of spotting a liquid in which the primer DNA strand is dissolved or dispersed is applied. Preferred. A part of the active ester group contained in the polymer substance reacts with the primer to form a covalent bond between the primers.
  • the liquid in which the primer DNA strand is dissolved or dispersed can be, for example, neutral or alkaline, for example, pH 7.6 or higher.
  • step (ii) after washing, the inert ester treatment of the active ester on the surface of the plastic substrate other than the primer DNA chain immobilized is treated with an alkaline compound. This is carried out with a compound having a primary amino group.
  • alkaline compounds include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, hydroxide Lithium, potassium phosphate, or the like can be used.
  • the compounds having a primary amino group include glycine, 9 aminoacazine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5 amino 2,3 dihydro-1,4 pentanol, aminoethanethiol hydrochloride Salt, aminoethanethiolsulfate, 2- (2aminoethylamino) ethanol, dihydrogen phosphate 2-aminoethyl, hydrogensulfate aminoethyl, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein , 6-aminohexanoic acid, aminohexylcellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2-aminooctane Acid, 1-amino 2-propanol, 3
  • an amino group is preferably introduced into the primer DNA strand that is immobilized on the substrate in order to increase the reactivity with the active ester group. Since the amino group is excellent in reactivity with the active ester group, the primer can be efficiently and strongly immobilized on the surface of the substrate by using a primer having an amino group introduced therein.
  • the amino group can be introduced at the end of the primer DNA strand. ⁇ may be a side chain! / ⁇ may be introduced at the end of the molecular strand, thus further annealing with a complementary DNA fragment. Can be done more efficiently From this point of view, it is preferable.
  • the primer DNA strand for DNA extension to be used includes a DNA strand comprising a part of the base sequence homologous to the base sequence of the 16S or 23S ribosomal DNA of the bacteria to be detected. .
  • Such DNA strand selection is designed based on the bacterial strain-specific sequence from the 16S or 23S ribosomal DNA sequence of the bacteria to be detected.
  • the length of the primer DNA strand can be arbitrarily determined depending on the detection target.For example, it is 5 to 50 bases, but 20 to 30 bases also has the power of reducing the elongation of the DNA strand. Is preferred.
  • the designed and synthesized DNA strand is modified with an amino group so that it reacts with the active ester group on the substrate surface and is firmly fixed.
  • the "base sequence that is identical to the base sequence of the 16S or 23S ribosomal DNA of the bacterium to be detected” refers to a base sequence that includes the same sequence as the characteristic sequence of the bacterium to be detected.
  • the sequence in ribosomal DNA has a sequence portion common to each bacterial species and a sequence portion that differs depending on the bacterial species, and has different base sequences depending on the bacteria.
  • the primer DNA strand a part of the base sequence of such a base sequence is used, and if the target bacterium is present in the sample sample sample, this primer DNA strand extension reaction occurs.
  • the primer DNA strand is immobilized on the substrate surface, a plurality of spots are provided in a fixed section, and the primer DNA strand is immobilized at each spot to form a DNA array.
  • step (b) the sample solution is brought into contact with the substrate surface on the substrate surface prepared as described above.
  • This sample solution contains a ribosomal DNA chain prepared from bacteria, an enzyme system for DNA elongation, and nucleotide monomers.
  • Ribosomal DNA strands prepared from bacteria are used as vertical DNA fragments that are annealed to immobilized primer DNA strands and can be prepared, for example, as shown below. it can.
  • This fragmentation step is necessary because bacterial ribosomal DNA is circular and long.
  • One of the fragmentation or excision methods is the PCR method.
  • a primer design for amplification by PCR method is performed, and a part of the DNA strand is excised by amplification by PCR method. Obtain a fragmented DNA strand.
  • the primer should be designed so that the length of the DNA strand cut out at this time is about 100 to 1000 bases.
  • PCR Since the purpose of PCR here is to cut out DNA fragments, it is not necessary to amplify DNA, and amplification of about 5 to 15 cycles may be used, but more cycles may be used.
  • fragmentation of DNA strands can be disrupted by ultrasonic waves. However, it is necessary to crush under the crushing conditions so that the DNA strand is not fragmented. It is also possible to fragment DNA strands with restriction enzymes.
  • DNA polymerase or DNA ligase can be used as the DNA chain elongation enzyme system in the reaction system consisting of the introduced sample solution, and nucleotides can be used as buffers. Buffers containing monomers (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, etc.) can be used.
  • DNA polymerase particularly TaqDNA polymerase, TthDNA polymerase, PfuDNA polymerase, and the like, which are DNA polymerases derived from heat-resistant bacteria, can also be used.
  • DN A specific example using A polymerase is not particularly limited as long as it is an enzyme that synthesizes a new DNA strand using a DNA strand as a saddle.
  • DNA polymerases include Poll type I DNA polymerase (such as colonic bacterial DNA polymerase I and Tarenou fragment), ⁇ type DN DN polymerase (Pyrococcus' Friosus-derived DNA polymerase, VENT DNA polymerase, KOD DNA polymerase, DEEP VENT DNA polymerase) and non- ⁇ non-pol I type DNA polymerase (DNA polymerase described in WO 97/24444 pamphlet).
  • DNA strand amplification can be performed because the DNA strand elongation reaction can be performed by using DNA ligase instead of DNA polymerase.
  • nucleotide monomers examples include dATP, dCTP, dGTP, dTTP, and the like, and these nucleotide monomers may be modified as described later.
  • step (c) the upper force of the sample solution supplied on the substrate on which the primer DNA strand has been fixed in step (b) is also covered with a cover glass, if necessary, and stored in a sealed container.
  • heat treatment is performed in the presence of a DNA chain elongation enzyme system and nucleotide monomers, and the ribosomal DNA chain in the introduced sample solution is formed into a saddle shape and immobilized on the substrate surface. Extend the DNA strand from the primer DNA strand.
  • the temperature of the reaction system into which the sample has been introduced in step (b) is increased to a temperature higher than the heat denaturation temperature (Tm) of the DNA strand, for example, 90 ° C. to 95 ° C.
  • Tm heat denaturation temperature
  • the temperature of the reaction system is the temperature at which the primer and the vertical DNA fragment anneal (signal temperature), for example, 4 ° C to 65 ° C, preferably 50 ° C to 65 ° C. Lower.
  • the force described for the case where the heat denaturation treatment, annealing treatment, DNA strand elongation treatment force is 1, and the heat cycle number may be 1 or more.
  • the reaction solution is removed, and the DNA microarray is washed with, for example, 0.1 wt% SDS solution to complete the DNA strand elongation reaction. To do.
  • At least one nucleotide monomer in the sample solution to be introduced into the step (b) may be labeled.
  • Cy3-dUTP fluorescently labeled at position 3 of the dTTP base as a nucleotide monomer
  • Cy3-dUTP is inserted into the extended (primer) side position corresponding to adenine (A) of the vertical DNA fragment.
  • the DNA fragment formed from the primer that has undergone the extension reaction is fluorescently stained with Cy3-dUTP, so that this DNA fragment can be detected.
  • nucleotide monomers is labeled with a fluorescent dye such as Cy3, the spot can be confirmed with a fluorescent scanner.
  • nucleotide monomers may be labeled, or a plurality of types of nucleotide monomers may be labeled.
  • Methods of introduction of the phosphor a method of introducing light absorbing method of radiolabeled (P 32 -ATP, P 32 - dATP), DNA by a method of non-radioactive labels such as enzyme labels The strand can be detected.
  • the labeled compound is further bound to the labeled nucleotide monomer into which the labeled compound has been introduced in the step (d) (b).
  • a step may be provided in which a compound into which oxidoreductase has been introduced is allowed to act to cause oxidation or reduction reaction between the oxidoreductase and a substrate that develops color, thereby causing the substrate to develop color.
  • a labeled nucleotide monomer for example, biotin
  • a labeled compound of digoxigenin DIG: steroidal natural product
  • DIG digoxigenin
  • a labeled compound of digoxigenin for example, Biotin-dUTP, DIG-dUTP
  • a compound in which an oxidoreductase has been introduced such as alkaline phosphatase or avidin in which peroxidase is introduced
  • a strong bond is formed between piotin and avidin, and an oxidoreductase is introduced into this labeled nucleotide monomer portion after extension.
  • the substrate was allowed to develop color by reacting with a coloring reagent such as -troblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) for several hours.
  • a coloring reagent such as -troblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) for several hours.
  • NBT -troblue tetrazolium
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • acid reductase such as alkaline phosphatase or alkaline phosphatase is introduced in this way, and nitro blue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) are introduced.
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • the DNA strand after extension may be labeled by reacting with a substrate, but the nucleotide monomer introduced during the extension reaction may be directly fluorescently labeled.
  • the extended DNA is labeled with alkaline phosphatase.
  • a coloring reagent such as BCIPZNBT
  • a primer DNA strand comprising each bacterial-specific 23S ribosomal DNA sequence is immobilized on the surface of each substrate of a plastic and glass substrate as a substrate corresponding to this embodiment and an aldehyde substrate corresponding to a conventional substrate. Then, perform DNA strand amplification reaction on each substrate to detect primer DNA strand amplification reaction and evaluate bacterial detectability. went.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated product of ring opening polymer of 5-methyl-2-norbornene (MFR (Melt flow rate): 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature)
  • MFR Melt flow rate
  • hydrogenation rate substantially 100%, heat distortion temperature
  • a glass-shaped substrate was obtained by injection molding at 123 ° C.
  • the substrate was made of 2-methacryloyloxystil phosphorylcholine-butyl methacrylate p-nitrophenyl polyethylene glycol methacrylate copolymer.
  • a normal glass substrate was prepared from 2-methacryloyloxyscheylphosphorylcholine-butyl methacrylate, tert-phenyl oxycarbonyl polyethylene glycol methacrylate copolymer (each group in mol% 25: 74: 1) was immersed in a 0.5 wt% ethanol solution to introduce a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group on the surface of the substrate to obtain a glass substrate.
  • Methyl 2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated product (MFR: 21 gZlO content, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature: 123 ° C) by injection molding A slide glass substrate was obtained.
  • the molded product was subjected to a hydrophilic treatment on the surface by a low-temperature oxygen plasma treatment.
  • an aminoalkylsilane prepared by dissolving ⁇ -aminopropyltriethoxysilane at a concentration of 5% in methanol was prepared as an amino group introduction treatment solution, immersed in this solution for 2 hours, and then the substrate.
  • Oligo DNA chain consisting of 23S ribosomal DNA sequence modified with each amino acid modified with amino group at the end was dissolved using 0.25 M carbonate buffer (pH 9.0) to prepare 10 M oligo DNA solution. .
  • This solution was spotted on the surface of a plastic substrate, a glass substrate, and an aldehyde substrate with a 100 m diameter cross-cut pin using a spotter (Marks-1 manufactured by Hitachi Software Engineering).
  • Each substrate on which the oligo DNA was spotted was immersed in a sealed container (10 cm x 15 cm x 3 cm) moistened with 200 ⁇ l (D0. 25 M phosphate buffer (pH 8.5)) for a whole day and night. Primer) was immobilized.
  • the 23S ribosomal DNA detection primer for each species is shown below.
  • Staphylococcus aureus CTAAGGGCGTTGAAGCATGATCGTA (SEQ ID NO: 1) SA— 1
  • the agar medium was used at 37 ° C for a whole day and night (14-18 hours).
  • the medium is an instant medium.
  • Use normal bouillon sakaeken the liquid medium dissolves the indicated amount of normal bouillon sakaeken in demineralized water, and the agar medium adds 1.6% agar to each, after autoclaving. ,used.
  • 23S ribosomal DNA was amplified by PCR reaction using a universal primer of 23S ribosomal DNA.
  • Antisense The same amount of the following was mixed.
  • a thermal cycler was used for 10 cycles of heat denaturation at 95 ° C for 1 minute, annealing at 75 ° C for 2 minutes, and DNA strand extension reaction at 72 ° C for 5 minutes to obtain a PCR product.
  • the fluorescence intensity of the spots was measured with a slide scanner (ScanArray Perkin Elma).

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Abstract

　リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、菌種特異な１６Ｓ又は２３ＳリボゾームＤＮＡの菌種特異配列部分の伸長用のプライマーを固定化させ、菌検体から抽出したＤＮＡおよびヌクレオチドモノマーおよびＤＮＡ伸長用酵素を含む試料を接触させ、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、ＤＮＡ鎖の伸長と増幅反応を行い、細菌の検出を行う。

Description

明 細 書
細菌の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、検体中の細菌の検出を行う細菌の検出方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、サルモネラ菌等の細菌の検出'同定は、細菌を培養することで細菌を増殖さ せ、糖の資化性検査等の生化学検査を行うことにより主として行われている。例えば
、サルモネラ菌の検出'同定には増菌、分離培養、生化学性状による確認培養、 o( 菌体)抗原、 K(Vi莢膜)抗原、 H (鞭毛)抗原による血清型別が行われ、各検査の総 合的判断が必要とされている。しかしながら、この方法は時間と手間が掛カる上に、 例えば顕微鏡下、菌の形態により菌の同定を行なう際、本来の形態 (性状)と異なる こともあり、その際、形態による判定を誤るなど、例外的な性状が判断を困難にする 場合等があった。資化性検査用の簡便なキットも市販され広く用いられてきているが 、通常 1検体につき 1キットが必要であり、かつ使い捨てであるため、大量の検体の検 查を行うと膨大な医療廃棄物が発生してしまうという問題も残されていた。
[0003] また、細菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ'チェイン'リ アクション (PCR法）により、検体試料中の特定の DNA断片の増幅の有無から細菌 種を特定する方法が開発されている。し力しながら、微生物の多様性によりプライマ 一の伸長反応部分に変異が起こると、伸長反応が起こるべき検体試料にぉ 、て伸長 反応が起こらない場合には、偽陰性と判定されることになり、誤判定が生じる危険性 を含んでいた。 PCRは数百万もの DNAコピーを合成できる一方で、混入物に非常に 敏感なためごく微量の铸型 DNA力 反応を開始する場合、前に行った反応の生成物 (生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外力 入ってくる物質のコンタミネー シヨンが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に 1コピー混入しただ けで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、 PCR等の核酸増幅を用いる場合に は、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であ ると 、う問題も持ち合わせて 、た。 [0004] 一方、最近、 DNAマイクロアレイあるいは DNAチップとよばれる、配列の異なる多 数の DNA断片を基板のそれぞれ異なる箇所に固定したものに、遺伝子の発現状態 を調べた 、細胞から取り出したメッセンジャー RNAの逆転写物（蛍光標識あるいはラ ジォアイソトープ標識をしたもの）を投入し、ノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、それ ぞれの配列の DNA断片固定箇所にどの程度逆転写物がハイブリダィズしたかを調 ベ、試料細胞中の遺伝子発現を調べる方法が注目されている。この方法を利用して 、細菌種特有なメッセンジャー RNAを検出することで、細菌検体の細菌種を識別する 方法も開発されてきている。しかし、細菌の場合には、通常アレイの解析に必要な 10 マイクログラム以上の十分な RNAが取れないことから実用的には大いに問題が残さ れている。また、逆転写反応には高価な逆転写酵素が必要であることから低コストィ匕 が困難であると 、う問題もある。
また、特定の細菌種に特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを、複数種類の 細菌種に対して 1枚のスライドガラス上に固定してアレイを作製しておき、細菌検体の ゲノム DNAの特定の塩基配列部位を PCR法を用いて増幅し、増幅と同時にある!/、は 増幅後に常法により標識ィ匕した cDNAをアレイにかけてハイブリダィゼーシヨンさせ 、アレイ上に結合した標識を検出することで、細菌種を同定する方法も提案されてい る。この方法では、 PCR法を用いるため高価な酵素が不可欠であり、低コスト化が難し い。また、 1検体の検査に 1アレイ必要であるため、アレイ作製費用、ハイブリダィゼー シヨンに必要な試薬費用、検出にかかわる費用等を勘案すると非常にコストが高くな つてしまうという問題があった。
[0005] 非特許文献 1には、ガラス基板の表面に細菌由来の 23Sリボゾーム DNA鎖を増幅 するプライマー DNAを固定化し、 23Sリボゾーム DNAを铸型にして PCR様環境化 でプライマーを伸長させ、細菌の検出を行う方法が記載されている。この方法は、遺 伝子の増幅と DNAマイクロアレイによる検出を同時に行うのに近い操作となっており 、操作の簡便化が図れかつ、迅速に菌の検出が出来ることが期待できるが、実際に は感度が悪ぐ予め PCRによりかなり増幅した検体溶液を基板表面に供給し、基板 上での DNA伸長反応を行う必要がある。
非特干文献 1 : Georg Mitterer, et al," icroarray-Basea identincation in Clinical Sam pies by Solid-Phase PCRAmplification of 23S Ribosomal DNA Sequences of poly", Jo urnal of ClinicalMicrobiology, 2004, Vol. 42, No.3 pl048- 1057
発明の開示
[0006] 本発明の目的は、細菌検体に対して信頼性高く且つ高速に細菌の細菌種を識別で きる検出方法を低コストで提供することにある。また、 DNAアレイのように数多くの検 体について、検出を並列的に行なうことにより、非常に高速かつ低コストで細菌種の 同定を行なうことが可能な細菌同定方法を提供することを目的になされたものである
[0007] 本発明者等は、非特許文献 1に代表される基板上に 16Sおよび 23Sリボゾーム DN Aに対応したプライマー DNAを固定し DNAを伸長させ菌を検出方法について、種 々の基板を用いて検討する過程で、表面に所定の高分子物質を配した基板を用い ると、再現性よくプライマーが伸長し菌の検出感度が高いことを見出し、本発明の完 成に至った。
即ち本発明は、
(1)リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位 と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(a)検出の対象となる細菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相同する 塩基配列の一部よりなる DNA伸長用プライマー DNA鎖を基体表面に固定するェ 程、
(b)細菌より調製したリボゾーム DNA鎖、ヌクレオチドモノマー、及び DNA伸長用酵 素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
(c)前記試料溶液中のリボゾーム DNA鎖を铸型にして、基体表面に固定ィ匕されてい る DNA伸長用プライマー DNA鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とする細菌の検出方法、
(2) (1)の細菌の検出方法において、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリ ン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、 ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基の 、ずれかであ ることを特徴とする細菌の検出方法、
(3) (1)の細菌の検出方法において
前記ヌクレオチドモノマーの 、ずれかに標識がなされて 、ることを特徴とする細菌 の検出方法、
(4) (1)の細菌の検出方法において
DNA鎖伸長用酵素力 DNAポリメラーゼ又は DNAリガーゼであることを特徴とす る細菌の検出方法、
(5) (1)の細菌の検出方法において、
前記 DNA伸長用プライマー DNA鎖力 前記電子求引性の置換基がカルボ-ル 基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合しているこ とを特徴とする細菌の検出方法、
(6) (1)の細菌の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有することを特徴とす る細菌の検出方法、
(7) (1)または（6)の細菌の検出方法において
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステ ルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタタリレート基を含む第三単位とを 有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする細菌の検出方法、
(8) (1)の細菌の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料力 なることを特徴とする細菌の検出方法、
(9) (1)の細菌の検出方法において
前記 (c)の工程が、所定のヒートサイクルで処理することにより行われることを特徴と する細菌の検出方法、
(10) (9)の細菌の検出方法において、前記ヒートサイクル力 熱変性温度での保持 、ァニール処理温度での保持、 DNA伸長温度での保持を含むことを特徴とする細 菌の検出方法、
(11) (9)又は（10)の細菌の検出方法において、ヒートサイクル数が 1以上であること を特徴とする細菌の検出方法、
(12) (10)又は（11)の細菌の検出方法において、ァニール処理温度と DNA伸長 温度が同一温度であることを特徴とする細菌の検出方法、
(13) (3)の細菌の検出方法において、標識が蛍光色素であることを特徴とする細菌 の検出方法、
(14) (3)の細菌の検出方法において、
さらに (d)前記 (b)工程にて標識ィ匕合物が導入された標識ヌクレオチドモノマーに 対して、この標識化合物と結合し、酸化還元酵素が導入された化合物を作用させて、 この酸化還元酵素と発色する基質との間で酸化又は還元反応させて、該基質を発色 させる工程、を含むことを特徴とする細菌の検出方法
である。
[0008] 本発明に係る細菌の検出方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより 誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合して なるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体 に、 DNA伸長用のプライマー DNA鎖を固定化させ、所望する 16Sあるいは 23Sリボ ゾーム DNA断片鎖を铸型にして、 DNA鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマ 一を含む試料が導入された液相系を、 DNA鎖を熱変性する温度 (以下、「熱変性処 理温度」という）まで引き上げ、前記反応系の温度をァニール処理する温度（以下、「 ァニール処理温度」という）まで下げ、 DNA伸長温度を保つことにより、基板上に固 定ィ匕された DNA鎖の伸長反応を行 ヽ、かつ全処理を同一の液相系で行うことを特 徴としている。
[0009] また、従来ではァニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まな力つた DN A断片を除くための洗浄処理が必要であつたが、基板上に非特異的に吸着する DN A断片が極少量であることこと、および DNA鎖伸長に力かる酵素反応が有効機能す ると考えられ、伸長反応の前に基板の洗浄処理が不要になる。
[0010] この DNA鎖伸長方法において、基板の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘 導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基 、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルダリ セロール基の 、ずれかにすることができる。
このように、基板の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基板表面で起こる DNA鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行うことが可能になり、酵素反応効率 が高ぐ DNA鎖伸長を、よりマイルドな条件でより高効率に行うことが可能になる。
[0011] 本発明によれば、基板上に菌の 16Sあるいは 23Sリボゾームの菌特異的配列に相 同する配列よりなるプライマー DNA鎖を基板表面に固定ィ匕し、プライマー DNA鎖の 伸長反応により菌を検出する方法において、 PCRにより大幅な遺伝子の増幅をする 必要がなぐあるいはリボゾーム DNAの断片化をするだけで、高感度に細菌の検出 が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係る細菌の検出方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステ ルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合 してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基 体に、（a)検出の対象となる細菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相 同する塩基配列の一部よりなる DNA伸長用プライマー DNA鎖を基体表面に固定 する工程、（b)細菌より調製したリボゾーム DNA鎖、ヌクレオチドモノマー、及び DN A伸長用酵素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、 (c)前記試料溶液中 のリボゾーム DNA鎖を铸型にして、基体表面に固定化されている DNA伸長用プラ イマ一 DNA鎖を伸長させる工程、を含むことを特徴として 、る。
[0013] このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位 と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを有する高分子物質は、 DNA鎖の非特異的吸着を抑制する性質と DNA 鎖を固定ィ匕する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂 質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は铸型 DNA断片の非特異 的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマ 一をィ匕学的に固定ィ匕する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質 力 なるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表 面に固定化される。
[0014] 第一の単位は、たとえば、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基、 6—メ タクリロイルォキシへキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アタリロイルォキシアルキル ホスホリノレコリン基；
2—メタクリロイルォキシエトキシェチルホスホリルコリン基および 10—メタクリロイル ォキシエトキシノ-ルホスホリルコリン基等の（メタ）アタリロイルォキシアルコキシアル キルホスホリルコリン基；
ァリルホスホリルコリン基、ブテュルホスホリルコリン基、へキセニルホスホリルコリン 基、オタテュルホスホリルコリン基、およびデセ-ルホスホリルコリン基等のァルケ-ル ホスホリノレコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基力 Sこれらの基中に含まれて 、る構成とすることがで きる。
[0015] また、これらの基のうち、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンが好ましい。
第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンを有する構成とすることに より、基板表面における铸型 DNA断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制するこ とがでさる。
[0016] なお、ここでは基本骨格として下記式 (a)に示すホスホリルコリン基である例を挙げ た力 このホスホリルコリンを下記式（b)のホスホリルエタノールアミン基、下記式（c) のホスホリルイノシトール基、下記式（d)のホスホリルセリン基、下記式（e)のホスホリ ルグリセロール基、下記式（f)に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基など のリン酸基に置き換えてもよ 、（以下につ!、ても同様)。
[0017] (化 1)
Figure imgf000009_0001
[0018] カルボン酸誘導体は、カルボン酸の力ルポキシル基が活性化されたものであり、 C
=0を介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、 アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活 性ィ匕された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に 対する反応性を有する化合物である。
[0019] カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタタリ ル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロ ゲン化物、活性エステル、活性ィ匕アミドに変換されたィ匕合物が挙げられる。カルボン 酸誘導基は、こうしたィ匕合物に由来する活性ィ匕された基であり、たとえば、 p -トロ フエ-ル基ゃ N ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基; Cl、 一 F等のハロ ゲン；
等の基を有することができる。
[0020] また、カルボン酸誘導基は、下記式（1)に示される基とすることができる。
[0021] (化 2) c o =
A
[0022] (ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く脱離基である。 )
上記式（1)に示される一価の基は、たとえば下記式 (p)または式 (q)から選択される V、ずれかの基とすることができる。
[0023] (化 3) 一 C - 0 — CR1
II (P)
o
一 C一 O — NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 ) [0025] 上記式 (p)に示される基として、たとえば下記式 (r)、（s)、および (w)に示される基 が挙げられる。また、上記式 (q)に示される基として、たとえば下記式 (u)に示される 基が挙げられる。
[0026] 上記式（1)に示される基は、たとえば下記式 (r)、式 (s)等に示される酸無水物由来 の基；
下記式 (t)に示される酸ハロゲンィ匕物由来の基；
下記式 (u)、式 (w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式 (V)に示される活性ィ匕アミド由来の基とすることができる。
[0027] (化 4)
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
[0028] カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優 れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ 性の条件、具体的には pH7. 0以上 10. 0以下、さらに具体的には pH7. 6以上 9. 0 以下、さらにまた具体的には pH8. 0とすることができる。
[0029] また、本明細書にぉ 、て規定するところの「活性エステル基」は、その定義にっ 、て 厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコー ル側に酸性度の高 、電子求引性基を有して求核反応を活性ィ匕するエステル群、す なわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば 高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合 成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成 の基礎と実験」、 1985年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はァ ミノ酸またはペプチドの C末端を活性ィ匕する方法の一つとして用いられて 、る。
[0030] 実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエス テルよりも活性ィ匕されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基 、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フ ノールエステル類 、チォフエノールエステル類、 N ヒドロキシァミンエステル類、シァノメチルエステル 、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに 高 ヽ活性を有する活性エステル基として知られて ヽる。
[0031] ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場 合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえば p -トロフエニル基、 N ヒ ドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、 5 ノルボルネン 2, 3 ージカルボキシイミド基等が挙げられる力 たとえば p -トロフエニル基が好ましく用 いられる。
[0032] 表面にプライマーが固定化される基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体 的な構成の組み合わせとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステ ルより誘導される基を含む第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン 基を有し、活性エステル基力 ¾—ニトロフエ-ル基である構成とすることができる。
[0033] また、本実施形態の基板のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の 親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に 他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的に は、高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こう することにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸 着性をさらに好適に確保することができる。
[0034] 具体的には、高分子物質を、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC )基を有する第一単量体と、 p -トロフエ-ルォキシカルボ-ルポリエチレングリコー ルメタタリレート (NPMA)基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（BMA)基を 有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体である poly ( MPC - co - BM A - co - NPM A) (PMBN)は、模式的に下記一般式（2)で示さ れる。
[0035] (化 5)
(2)
Figure imgf000013_0001
p—ニトロフ:ニルォキシカルボニル —メタクリロイルォキシェチル 一ブチルメタクリレート
ポリエチレングリコールメタクリレート ホスホリルコリン （
[0036] ただし、上記一般式（2)にお 、て、 a、 b、および cは、それぞれ独立して、正の整数 である。また、上記一般式 (2)において、第一〜第三単量体がブロック共重合してい てもよ 、し、これらの単量体がランダムに共重合して 、てもよ!/、。
[0037] 上記一般式 (2)で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、铸型 DN A断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定ィヒする性質とのバランスと に、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基 板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティング された基板上への铸型 DNA断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさら に確実に共有結合により固定ィ匕して基板上に導入することができる。
[0038] なお、上記一般式（2)で示される共重合体は、 MPC、 BMA、および NPMAの各 単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一 般式 (2)で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、 Ar等の 不活性ガス雰囲気にて、 30°C以上 90°C以下の温度条件で溶液重合を行うことがで きる。
[0039] 溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール ゝイソプロノ ノーノレ等のァノレコーノレや、ジェチノレエーテノレ等のエーテノレ、クロロホノレム 等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジェチ ルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶媒とすることができる。 [0040] また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用され るものを用いることができる。たとえば、ァゾビスイソブチ口-トリル (AIBN)、ァゾビス バレロ-トリル等のァゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化べンゾィル、 t ブチルペルォキシネオデカノエート、 t ブチルペルォキシビバレート等の油溶性の有機過酸ィ匕物；
などが用いられる。
[0041] さらに具体的には、ジェチルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶 媒および AIBNを用い、 Ar中、 60°Cにて 2〜6時間程度重合を行うことができる。
[0042] なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有 する例を説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を 含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の 高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導 される基を含む第一単位とブチルメタタリレート基を含む第三単位とを有する第二の 高分子物質を含んで 、てもよ 、。
[0043] なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位と は同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子 物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の 第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異な る構造であってもよい。
[0044] このような第二の高分子物質は、铸型 DNA断片の非特異的吸着を抑制するポリマ 一として用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が 30モ ル0 /0、ブチルメタタリレート基が 70モル0 /0の割合で含まれて 、るものである MPCポリ マー（日本油脂社製)を用いることができる。
[0045] なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、こ れらの高分子物質が混合されて 、る構成とすることができる。各々の高分子物質のポ リマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混 合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
[0046] 以上のような高分子物質力 なるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状 に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得 られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸潰し、乾燥してもよい。
[0047] また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対す る柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができる という観点力も好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性およ び量産性の観点から、熱可塑性榭脂を用いることができる。
[0048] 熱可塑性榭脂としては、蛍光発生量の少な 、ものを用いることができる。蛍光発生 量の少ない榭脂を用いることにより、 DNA鎖の検出反応におけるバックグランドを低 下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の 少ない熱可塑性榭脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポ リ才レフイン；
環状ポリオレフイン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフインは、耐熱性、耐 薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適 であり、基板の材料として好ましく用いられる。
[0049] ここで、飽和環状ポリオレフインとは、環状ォレフィン構造を有する重合体単独また は環状ォレフィンと aーォレフインとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。 前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジェン、テトラシクロドデセ ンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合 して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体 はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、 1—ブテン、 3—メチル 1—ブテン、 1—ぺ ンテン、 3—メチル 1—ペンテン、 1—へキセン、 1—オタテン等の α ォレフィンと 環状ォレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される 飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの 榭脂は単独で用いてもよく、 2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であつ てもよい。また、環状ォレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環 状ポリオレフインだけでなぐ環状ォレフィン構造を有する単量体の付加重合により得 られる飽和環状ポリオレフインを用いることもできる。
[0050] 以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料力もなる基板は、所定の形 状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより 得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸潰し、乾燥してもよい。
[0051] なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフ イルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィル ムとすることもできる。また、基板は、一つの部材カゝら構成されていてもよいし、複数の 部材力 構成されて 、てもよ 、。
[0052] 次に、基板の表面へのプライマー DNA鎖の固定ィ匕方法について説明する。この方 法は、下記の（a)から（c)の工程を含む。
(a)検出の対象となる細菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相同する 塩基配列の一部よりなる DNA伸長用プライマー DNA鎖を基体表面に固定するェ 程、
(b)細菌より調製したリボゾーム DNA鎖、ヌクレオチドモノマー、及び DNA伸長用酵 素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
(c)前記試料溶液中のリボゾーム DNA鎖を铸型にして、基体表面に固定ィ匕されてい る DNA伸長用プライマー DNA鎖を伸長させる工程。
[0053] 工程 (a)では、 DNA伸長用プライマー DNA鎖を基体表面に固定する。
例えば、（i)基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なく とも一部の活性エステル基とプライマー DNA鎖とを反応させて共有結合を形成させ ることにより、基板表面でプライマーを固定ィ匕し、続いて (ii)プライマーを固定ィ匕した 以外の基板表面の活性エステル基を不活性ィ匕する、すなわち残りの活性エステル基 を不活性ィ匕することにより、プライマーを基板の表面に固定することができる。以下、 それぞれの工程にっ 、て説明する。
[0054] 上記工程 (i)にお 、て、铸型 DNA断片とァニールするプライマー DNA鎖を基板上 に固定ィ匕する際には、プライマー DNA鎖を溶解または分散した液体を点着する方 法が好ま 、。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応し て、プライマーの間で共有結合が形成される。 [0055] このプライマー DNA鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性カゝらアルカリ性、 例えば pHが 7. 6以上とすることができる。
[0056] また、点着後、基板表面に固定化されな力 たプライマー DNA鎖を除去するため 、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
[0057] また、上記工程 (ii)に示したように、洗浄後はプライマー DNA鎖を固定ィ匕した以外 のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性ィ匕処理をアルカリィ匕合物、ある 、は 一級アミノ基を有する化合物で行う。
[0058] アルカリィ匕合物としては、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水 素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ 酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
[0059] 一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、 9 アミノアクアジン、アミノブタノ一 ル、 4ーァミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、 5 ァミノ 2, 3 ジヒドロー 1, 4 ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、 2—（2 アミノエチルァミノ）エタノール、リン酸二水素 2—アミノエチル、硫酸水素アミノエチ ル、 4— (2—アミノエチル）モルホリン、 5-ァミノフルォレセイン、 6—ァミノへキサン酸 、ァミノへキシルセルロース、 p アミノ馬尿酸、 2—アミノー 2—ヒドロキシメチル一 1, 3 プロパンジオール、 5 ァミノイソフタル酸、ァミノメタン、ァミノフエノール、 2 アミ ノオクタン、 2 ァミノオクタン酸、 1—ァミノ 2 プロパノール、 3 アミノー 1—プロパノ ール、 3 ァミノプロペン、 3 ァミノプロピオ-トリル、アミノビリジン、 11—アミノウン デカン酸、ァミノサリチル酸、ァミノキノリン、 4—ァミノフタ口-トリル、 3—ァミノフタルイ ミド、 p ァミノプロピオフエノン、ァミノフエ-ル酢酸、ァミノナフタレンなどを用いること ができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
[0060] また、基板に固定ィ匕するプライマー DNA鎖には、活性エステル基との反応性を高 めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応 性に優れるため、ァミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強 固に基板の表面上にプライマーを固定ィ匕することができる。ァミノ基の導入位置はプ ライマー DNA鎖末端ある ヽは側鎖であってもよ!/ヽが、分子鎖末端に導入されて ヽる ことが、相補的な铸型 DNA断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができる という観点からは、好ましい。
[0061] ここで、使用される DNA伸長用プライマー DNA鎖としては、検出の対象となる細 菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相同する塩基配列の一部よりな る DNA鎖が挙げられる。このような DNA鎖の選択は、検出対象となる細菌の 16Sあ るいは 23Sリボゾーム DNA配列から、各菌種特異的な配列をもとに設計する。この プライマー DNA鎖の長さは、検出対象に応じて任意に決定することができ、例えば 5 〜50塩基であるが、 20〜30塩基とすることが DNA鎖の伸長反応のしゃすさの観点 力も好適である。また、この設計され合成された DNA鎖には、前述したように基体表 面の活性エステル基と反応し、強固に固定ィ匕されるよう、末端をァミノ基による修飾を しておく。
[0062] ここで、「検出の対象となる細菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相 同する塩基配列」とは、検出対象となる細菌の特徴的な配列と同一配列を含む塩基 配列をいう。これは、リボゾーム DNA中の配列には、各細菌種に共通な配列部分と 細菌種により異なった配列部分とがあり、この細菌により異なった塩基配列を有する とことを意味する。プライマー DNA鎖としては、このような塩基配列の一部の塩基配 列部分が使用され、検体試料中に、対象となる細菌が存在するとこのプライマー DN A鎖の伸長反応が生じることになる。
[0063] また、プライマー DNA鎖の基体表面への固定に際して、一定の区画内に複数のス ポットを設けておき、各スポットにプライマー DNA鎖を固定化させて、 DNAアレイを 形成しておくことが、細菌の検出にかかる操作を簡便にすることができるため、好まし い。
[0064] 以上により、プライマー DNA鎖が表面に固定ィ匕された基体が得られる。
[0065] 工程 (b)では、上記のように作製された基体表面に、試料溶液を基体表面に接触さ せる。
この試料溶液には、細菌より調製したリボゾーム DNA鎖、 DNA伸長用酵素系およ びヌクレオチドモノマーが含まれる。
[0066] 細菌より調製したリボゾーム DNA鎖は、固定ィ匕されたプライマー DNA鎖にァニー ルさせる铸型 DNA断片として使用され、例えば下記に示したように、調製することが できる。
[0067] まず、検体中に検出しょうとする細菌数が非常に少ないと思われる場合、寒天培地 上にサンプルを注ぎ、培養を行い、細菌のコロニーが出現するまで培養を行う。コロ ニーが出現したら、細菌のコロニーを採取し、この細菌を PBS (—）等中に分散させる 。細菌の分散液中から市販の DNA抽出溶液等を用いて DNA鎖を抽出する。この抽 出操作に際して、現在は DNA抽出用のキットが多数販売されており、これら抽出キッ トを用いるの力 簡便かつ確実であるため、望ましい。
[0068] 検体中に存在する、あるいは上記のようにして抽出された DNA鎖を断片化する。
細菌のリボゾーム DNAは環状でかつ長いため、この断片化の工程が必要になる。断 片化すなわち切り出しの方法の一つに PCR法があげられる。細菌に特異配列を含 む部分を増幅することが可能になるように、 PCR法による増幅のためのプライマー設 計を行い、 PCR法により増幅することにより、 DNA鎖の一部の切り出しを行って、断 片化された DNA鎖を得る。このときに切り出される DNA鎖の長さ力 100〜1000塩 基程度になるように、このプライマーの設計をおこなう。
なお、ここでの PCRの目的は、 DNA断片の切り出しであるから、 DNAの増幅はあ まり必要なく、 5〜 15サイクル程度の増幅でかまわな 、がそれ以上のサイクルであつ てもよい。
[0069] また、 DNA鎖の断片化には、上述の PCR法の他に超音波による破砕も可能である 。しかし、 DNA鎖が細断片化されないような破砕条件にて、破砕を行う必要がある。 また、制限酵素による DNA鎖の断片化も可能である。
[0070] また、導入された試料溶液カゝらなる反応系における DNA鎖伸長用酵素系には、 D NAポリメラーゼまたは DNAリガーゼの!/、ずれかを使用することができ、またバッファ としてはヌクレオチドモノマー（dATP, dCTP, dGTP, dTTPなど）を含有するバッフ ァを用 、ることができる。
[0071] ここで、 DNA鎖伸長酵素系に用いる酵素として、 DNAポリメラーゼ、特に耐熱性細 菌に由来する DNAポリメラーゼである TaqDNAポリメラーゼ、 TthDNAポリメラーゼ 、 PfuDNAポリメラーゼなどを用いることもできる。
[0072] この DNA鎖伸長酵素系に用いる酵素として、铸型 DNA断片に対して耐熱性 DN Aポリメラーゼを用いた具体例を示した力 DNA鎖を铸型として新たな DNA鎖を合 成する酵素であれば特に限定はされない。このような DNAポリメラーゼとしては、ポ ル I型 DNAポリメラーゼ（大腸細菌 DNAポリメラーゼ I、タレノウ断片など）、 α型 DN Αポリメラーゼ（ピロコッカス'フリオサス由来 DNAポリメラーゼ、 VENT DNAポリメラ ーゼ、 KOD DNAポリメラーゼ、 DEEP VENT DNAポリメラーゼ）及び非 α非ポル I型 DNAポリメラーゼ（国際公開第 97/24444号パンフレット記載の DNAポリメラー ゼ)等が挙げられる。
[0073] また、 DNAポリメラーゼの代わりに、 DNAリガーゼを用いても DNA鎖伸長反応を 行うことができるため、 DNA鎖増幅を行うことが可能である。
[0074] また、ヌクレオチドモノマーとしては、 dATP, dCTP, dGTP, dTTPなどが挙げら れ、これらヌクレオチドモノマーは、後述するように修飾されていてもよい。
[0075] 工程 (c)では、工程 (b)にてプライマー DNA鎖が固定された基体上に供給された 試料溶液の上力も必要に応じてカバーガラスをかけ、密閉容器中に収めて、所定の ヒートサイクルにより DNA鎖伸長酵素系およびヌクレオチドモノマーの存在下で加熱 処理を行って、導入した試料溶液中のリボゾーム DNA鎖を铸型にして、基体表面に 固定ィ匕されて 、る DNA伸長用プライマー DNA鎖から、 DNA鎖を伸長させる。
[0076] すなわち、工程 (b)にて試料が導入された反応系の温度を、 DNA鎖の熱変性温 度（melting temperature :Tm)以上、例えば 90°C〜95°Cまで上昇させる。この熱変 性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する铸型 DNA断片 やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
[0077] 続、て、反応系の温度をプライマーと铸型 DNA断片とがァニールする温度 (ァ- ール温度）、例えば 4°C〜65°C、好ましくは 50°C〜65°Cまで下降させる。このァニー ル処理により、铸型 DNA断片の一部と相補的な配列を有するプライマーと、この铸 型 DNA断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行わずにそのまま DNA伸長反応に進める。
[0078] ここで、従来では、ァニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかった DNA断片を除くための洗浄処理が必要であった力 本実施形態では、基体上に非 特異的に吸着する DNA断片が極わずかであるため、および基体表面環境が DNA 鎖伸長に力かる酵素反応に適しているため、基体の表面の洗浄処理が不要になる。 このようにして、試料導入力 DNA鎖の伸長反応までを同一の液相系、すなわち反 応系をそのまま用いることができる。
[0079] DNA伸長では、ァニール処理を行った反応系の温度を、更に一定温度に保つよう に制御することが好ましい。
なお、熱変性処理、ァニール処理、 DNA鎖伸長処理力 なるヒートサイクル数が 1 である場合について説明をした力 このヒートサイクル数が 1以上であってもよい。
[0080] この工程（c)における DNA伸長反応の後に、反応液を除去して、 DNAマイクロア レイを、例えば 0. lwt%の SDS溶液を用いて洗浄して、 DNA鎖の伸長反応は終了 する。
[0081] ここで、工程 (b)に導入する試料溶液中のヌクレオチドモノマーの少なくとも一種を ラベルしておいてもよい。
例えば、 dTTPの塩基の 3位を蛍光ラベルした Cy3— dUTPをヌクレオチドモノマー として用いることで、铸型 DNA断片のアデニン (A)に対応する伸長（プライマー)側 の位置に Cy3— dUTPが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから 形成される DNA断片が Cy3— dUTPで蛍光染色されて、この DNA断片の検出を行 うことがでさるよう〖こなる。
[0082] このように、ヌクレオチドモノマーの何れかに、 Cy3などの蛍光色素を標識しておけ ば、蛍光スキャナ一によりスポットの確認が可能である。
[0083] なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよぐまた複数の種類のヌクレオチド モノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の 導入の方法、放射線ラベルの方法 (P32-ATP、 P32- dATP)、酵素標識などの非放射性 ラベルの方法などによっても DNA鎖を検出することができる。
[0084] また、酵素標識によりヌクレオチドモノマーをラベルする場合には、さらに（d)前記（ b)工程にて標識ィ匕合物が導入された標識ヌクレオチドモノマーに対して、この標識 化合物と結合し、酸化還元酵素が導入された化合物を作用させて、この酸化還元酵 素と発色する基質との間で酸化又は還元反応させて、該基質を発色させる工程を設 けてもよい。 [0085] この酵素標識の方法にお!、ては、例えば工程 (b)にてピオチン (biotin)化およびジ ゴキシゲニン (DIG：ステロイド系天然物）の標識化合物が導入された標識ヌクレオチ ドモノマー（例えば、 biotin- dUTP、 DIG- dUTP)を使用してプライマー DNA鎖を伸張 させた後、酸化還元酵素が導入された化合物、例えば、アルカリフォスファターゼゃ ペルォキシダーゼを導入したアビジンを作用、例えば接触させることにより、ピオチン とアビジンとの間で強固に結合が生じ、伸長後のこの標識ヌクレオチドモノマー部分 に、酸化還元酵素が導入される。そこに、基質として発色試薬、例えば-トロブルー テトラゾリゥム（NBT)と 5—ブロモ—4—クロ口— 3—インドリルリン酸（BCIP)を数時 間作用させることにより基質を発色させて、このときの吸光度やスポットの染色 (色素 の沈着）により、 DNAを検出することができる。
なお、このようにアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼなどの酸 化還元酵素を導入し、ニトロブルーテトラゾリゥム（NBT)と 5—ブロモ— 4—クロ口— 3 —インドリルリン酸 (BCIP)などの基質と反応させることにより、伸長後の DNA鎖を標 識するようにしてもよいが、伸長反応時に導入するヌクレオチドモノマーを、直接蛍光 標識化してもよい。
[0086] このように、ヌクレオチドモノマーの何れかに、ピオチンを標識しておき、 DNA伸長 反応の後、アルカリフォスファターゼを標識したアビジンを反応させることにより、伸長 した DNAにアルカリフォスファターゼを標識した後、 BCIPZNBTなどの発色試薬を 作用させることにより、 DNAが伸長したスポットの可視化が可能となる。可視化された スポットは、 目視での認識が可能である他、デジカメや OAスキャナーで画像を認識し 、画像処理ソフトなどを使って、スポットの強度の解析も可能となる。
実施例
[0087] 以下、実施例を記載する。
[0088] (実験例 1)
以下の手法にて、各菌特異 23Sリボゾーム DNA配列よりなるプライマー DNA鎖を 、本実施形態に対応する基体としてプラスチックおよびガラス基板、および従来の基 体に対応するアルデヒド基板の各基板の表面に固定ィ匕して、各基板上で DNA鎖増 幅反応を行って、プライマーの DNA鎖増幅反応を検出し、細菌の検出能の評価を 行った。
[0089] (プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添 加物（MFR(Melt flow rate)： 21g/10分、水素添カ卩率：実質的に 100%、熱変形温 度 123°C)を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を 2—メタク リロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p 二トロフエ二ルォキ シカルボ-ルポリエチレングリコールメタタリレート共重合体（各基は、モル0 /0で 25： 7 4 : 1)の0. 5重量0 /0エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリ ン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
[0090] (ガラス基板の製造）
通常のガラス基板を、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタク リレートー p 二トロフエニルォキシカルボ二ルポリエチレングリコールメタタリレート共 重合体 (各基は、モル％で25： 74： 1)の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬すること により、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導 入して、ガラス基板を得た。
[0091] (アルデヒド基板の製造）
飽和環状ポリオレフイン榭脂 5 メチル 2 ノルボルネンの開環重合体の水素添 加物（MFR: 21gZlO分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度温度： 123°C) を用い、射出成形によりスライドグラス形状の基板を得た。この成形物に低温酸素プ ラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとして γ— ァミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に 5%の濃度で溶解させたものをァミノ 基導入処理液として調製し、この溶液の中に 2時間浸漬の後、基板を溶液から取り出 し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。ダルタルアルデヒドを PBS ( 一）中に 2%の濃度で溶解させてダルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシ ラン処理を行なった基板をダルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、 4時間放置した後、 基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基 を有するアルデヒド基板が得られた。
[0092] (プライマー固定） 5，末端がァミノ基で修飾された、各菌特異 23Sリボゾーム DNA配列よりなるオリゴ DNA鎖を 0. 25M炭酸バッファ（pH9. 0)を用いて溶解し、 10 Mのオリゴ DNA溶 液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製 Marks- 1)を 用い、 100 m径クロスカットピンでプラスチック基板およびガラス基板、およびアル デヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴ DNAをスポットした各基板を、 2 00 μ l(D0. 25Mリン酸バッファ（pH8. 5)で内部を湿らせた密閉容器（10cm X 15c m X 3cm)中で一昼夜浸して、オリゴ DNA (プライマー）を固定ィ匕させた。
各菌種の 23Sリボゾーム DNA検出プライマー DNA鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌： CTAAGGGCGTTGAAGCATGATCGTA (配列番号 1) SA— 1
AGTAGGATAGGCGAAGCGTGCGATT (配列番号 2) SA— 2 大腸菌： CCCGGTTTAAGCGTGTAGGCTGGT (配列番号 3) ECO— 1
AGTCGCTTCACCTACATATCAGCGTGC (配列番号 4) ECO - 2 CTGATATGTAGGTGAAGCGACTTGCTCG (配列番号 5) ECO - 4 緑濃菌： GTTAATCGACGCAGGGTTAGTCGGTT (配列番号 6) PA— 1 サルモネラ菌： TGTGTGTTCCAGGTAAATCCGGTTC (配列番号 7) SAL - 1 ポジティブコントロール： GACAGCCAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGC (配列番号 8 ) POS
(菌の培養）
以下に掲げる菌株の培養を行った。
使用した菌株名
黄色ブドウ球菌： Staphylococcus aureus ATCC 25923
大月昜菌： Escherichia coli ATCC 25922
緑膽菌： Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
サノレモネラ菌：
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhimurium ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis IID 604
寒天培地を用い、 37°C、一昼夜 (14-18時間)行なった。培地はインスタント培地である "普通ブイヨン栄研〃を用い、液体培地は〃普通ブイヨン栄研〃の指示量を脱塩水に溶 かし、寒天培地はそれに 1.6%の寒天を加え、それぞれオートクレープ後、使用した。
[0094] (23Sリボゾーム DNAの抽出）
上記菌培養における 1つのコロニーを、 200 1の PBS (—）中に分散させ、 DNA抽 出キット（Invitrogen)を用い、 3 1の DNA抽出液を得た。
(PCRによる 23Sリボゾーム DNA鎖増幅反応）
23Sリボゾーム DNAのユニバーサルプライマーを用い、 PCR反応により 23Sリボゾ ーム DNAの増幅をおこなった。
PCRによる増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス : 5 ' - GACAGCCAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGC (配列番号 8) アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
)
25 μ L中に上記プライマー各 を 12. 5pmol、 200 μ Μの dATP、 dCTP、 dGTP、 d TTP、 0. 5Uの DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製 Ex Taq)を PCRバッファ 一中に溶解させ、
サーマルサイクラ一により、熱変性 95°C1分、アニーリング 75°C2分、 DNA鎖の伸長 反応 72°C5分のヒートサイクルで、 10サイクル行い、 PCR産物を得た。
[0095] (基板上での DNAの伸長反応）
PCRバッファー 25 L中に 2 1の上記 PCR産物、 100 μ Μの dATP、 dCTP、 dG
TP、 Cye3標識 dUTP、 0. 5Uの DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製 Ex Taq
)を溶解させ試料溶液とした。
[0096] この試料溶液を、基板上に分注し、カバーガラスをかけ、密閉のできるチャンバ一 中に納め、 95°C7分の熱処理の後、熱変性処理、ァニール処理、伸長反応をそれぞ れ 95°C 1分 (熱変性） - 55°C3分 (ァニールと伸長増幅反応同一温度)サイクル数は 15回で DNA鎖伸長反応を行った。
[0097] DNA伸長反応の後、基板を 0. lwt%の SDS溶液を用いて洗浄して、終了した。
スライド用スキャナー（ScanArrayパーキンエルマ一社製）によりスポットの蛍光強 度を測定した。
各々の菌カも抽出した DNA溶液について、基板上に固定した上記プライマー各 々のスポットの蛍光強度について、各基板での比較をおこなった。スポットの蛍光強 度の比較を表 1〜表 3に示す。
[0098] (表 1) プラスチック基板上でのスポット強度
Figure imgf000026_0001
[0099] (表 2) ガラス基板上でのスボッ ト強度
Figure imgf000027_0001
[0100] (表 3)
アルデヒ ド基板上でのスボッ ト強度
Figure imgf000027_0002
[0101] 本実施形態に対応するプラスチック基板およびガラス基板では、基板上での DNA 鎖伸長増幅により、各々の菌の検出ができ、従来の基板であるアルデヒド基板では D NA鎖伸長せず菌由来のスポットは検出されて 、な 、と考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と 電子求引性の置換基力 Sカルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(a)検出の対象となる細菌の 16Sまたは 23Sリボゾーム DNAの塩基配列に相同す る塩基配列の一部よりなる DNA伸長用プライマー DNA鎖を基体表面に固定するェ 程、
(b)細菌より調製したリボゾーム DNA鎖、ヌクレオチドモノマー、及び DNA伸長用 酵素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
(c)前記試料溶液中のリボゾーム DNA鎖を铸型にして、基体表面に固定化されて V、る DNA伸長用プライマー DNA鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とする細菌の検出方法。
[2] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリ ン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、 ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基の 、ずれかであ ることを特徴とする細菌の検出方法。
[3] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
前記ヌクレオチドモノマーの 、ずれかに標識がなされて 、ることを特徴とする細菌 の検出方法。
[4] 請求項 1記載の細菌の検出方法において、
前記 DNA鎖伸長用酵素力 DNAポリメラーゼ又は DNAリガーゼであることを特徴 とする細菌の検出方法。
[5] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
前記 DNA伸長用プライマー DNA鎖力 前記電子求引性の置換基がカルボ-ル 基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合しているこ とを特徴とする細菌の検出方法。
[6] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、 前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有することを特徴とす る細菌の検出方法。
[7] 請求項 1又は 6に記載の細菌の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステ ルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタタリレート基を含む第三単位とを 有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする細菌の検出方法。
[8] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
前記基体が、プラスチック材料力 なることを特徴とする細菌の検出方法。
[9] 請求項 1に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
前記 (c)の工程が、所定のヒートサイクルで処理することにより行われることを特徴と する細菌の検出方法。
[10] 請求項 9に記載の細菌の検出方法において、
前記ヒートサイクル力 熱変性温度での保持、ァニール処理温度での保持、 DNA 伸長温度での保持を含むことを特徴とする細菌の検出方法。
[11] 請求項 9又は 10記載の細菌の検出方法において、
ヒートサイクル数力 ^以上であることを特徴とする細菌の検出方法。
[12] 請求項 10又は 11に記載の細菌の検出方法にぉ 、て、
ァニール処理温度と DNA伸長温度が同一温度であることを特徴とする細菌の検出 方法。
[13] 請求項 3記載の細菌の検出方法において
標識が蛍光色素であることを特徴とする細菌の検出方法。
[14] 請求項 3記載の細菌の検出方法において、
さらに (d)前記 (b)工程にて標識ィ匕合物が導入された標識ヌクレオチドモノマーに 対して、この標識化合物と結合し、酸化還元酵素が導入された化合物を作用させて、 この酸化還元酵素と発色する基質との間で酸化又は還元反応させて、該基質を発色 させる工程、
を含むことを特徴とする細菌の検出方法。
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