JPH04267896A - 標的ｄｎａ鎖の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、目的とする標的ＤＮＡ
鎖の検出法に関し、詳しくは、ハイブリダイゼーション
操作を必要とせずに、非放射性標識法を用いて目的とす
るＤＮＡ鎖を迅速・簡便に検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医学医療分野において、特に、臨床検査
においては、遺伝子（ＤＮＡ）診断が急速に注目されつ
つある。遺伝子診断は遺伝病や細菌・ウイルスによる感
染症などの病因となる変異や病原体をＤＮＡレベルで検
出することを可能にし、病気の発症前診断や早期診断（
予測）を可能にした。また、糖尿病、高脂血症、ガンな
どの多因子病等への適用も有望である。ＤＮＡによる個
人識別も可能であり法医学面での応用も期待できる。 その他の分野への応用として、動植物の病気診断や育種
等への利用、遺伝子組換え技術（検索）、生物製剤等の
規格試験、食品分野など遺伝子検出技術への応用は限り
無い。

【０００３】従来、ＤＮＡの検出はハイブリダイゼーシ
ョンを利用した方法が正確であり、かつ高検出感度が得
られることで一般的に採用されている。このＤＮＡハイ
ブリダイゼーション検出法はＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖結合
の相補性を利用しているもので、一方の１本鎖にニック
・トランスレーション法、ランダム・プライマー伸長法
、カイネース法、ターミナル・トランスフェラーゼ法等
の手法により３２Ｐや３５Ｓの放射性標識を行い、再度
、相手の１本鎖ＤＮＡ（検体）と２本鎖を形成（ハイブ
リダイゼーション）させることにより、ＤＮＡを検出す
るものである。

【０００４】

【本発明が解決しようとする問題点】従来法は放射能を
使用する事で、施設や利用面での数々の規制、制約が存
在し仕事が制限されることや被爆等の安全面での問題が
存在する。又、従来法は操作時間が長く、結果が得られ
るまでに数日を要するＤＮＡ検出法であり特に、ハイブ
リダイゼーション操作で一昼夜、放射能検出操作で（１
〜数日）を所要するのが現状である。ＤＮＡオリゴマー
に放射性標識することによって、ハイブリダイゼーショ
ン工程を短縮する工夫がなされているが、オリゴマーで
あるため、放射能の取り込みあるいは付加が充分でなく
、高い検出感度を得ることが出来ない。

【０００５】前述したように臨床検査等への応用を想定
した場合、従来法は放射能の使用による長時間操作法で
あるため、実状に即した非放射能法による迅速・簡便操
作法の開発が期待されていた。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、ハイブリダイゼーショ
ン操作を必要とせずに、非放射性標識法により迅速・簡
便に目的とするＤＮＡ鎖を検出する方法を見出し、本発
明に至った。即ち、本発明の方法は、（ａ）検出しよう
とする標的ＤＮＡ鎖に相補性を有するＤＮＡプライマー
を調製する工程、（ｂ）該ＤＮＡプライマーを担体に担
持する工程、（ｃ）担持された該ＤＮＡプライマーと試
料中の標的１本鎖ＤＮＡをアニールする工程、（ｄ）ア
ニールされた標的１本鎖ＤＮＡを鋳型として、ジゴキシ
ゲニン又はビオチンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中
、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシ
リボヌクレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵ
から選ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌクレオ
チド及びＤＮＡポリメラーゼの存在下、該鋳型に相補的
なＤＮＡ鎖を合成する工程、及び、（ｅ）形成された相
補的なＤＮＡ鎖中のジゴキシゲニン又はビオチンをアル
カリホスファターゼと結合させ、該アルカリホスファタ
ーゼとパラニトロフェニルホスフェートとの発色反応に
より検出する工程、から成ることを特徴とする標的ＤＮ
Ａ鎖の検出方法に存する。

【０００７】本発明においては、まず、ＤＮＡ中の目的
遺伝子に相補性のあるＤＮＡプライマーを調製し、これ
を担体に固定する。次いで、検体ＤＮＡを１本鎖として
担体に固定したＤＮＡプローブと直接接触させ、担体の
ＤＮＡプライマーと検体ＤＮＡ中の目的遺伝子とアニー
ル（水素結合による２本鎖形成）させる。これにジゴキ
シゲニン又はビオチンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式
中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵから選ばれる１種の
デオキシリボヌクレオチドを表わす。）、Ｘ１　以外の
３種のデオキシリボヌクレオチド及びＤＮＡポリメラー
ゼにより、目的遺伝子を含むＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ
プライマーの伸長反応を行ないジゴキシゲニン又はビオ
チンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰを取り込ませる。この
反応により取り込まれた標識ｄ−Ｘ１　ＴＰをアルカリ
ホスファターゼとパラニトロフェニルホスフェートとの
発色反応を利用して検出する。このような方法によれば
、ＤＮＡプライマーと目的ＤＮＡ遺伝子とのアニーリン
グに数分、ポリメラーゼ反応によるＤＮＡの標識に３０
分、ＤＮＡの検出に１時間（１ｐｇ）を要するのみで操
作が終了する。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。

【０００９】（ａ）ＤＮＡプライマーの調製ＤＮＡ中の
目的遺伝子を検出する場合、ＤＮＡプローブの配列は任
意であるが、非特異的結合を避けるため、アミノ酸配列
から特徴ある配列を選択するのが好ましい。 又、出来るだけ多く標識出来る様に３′未端域を選択す
ることが有利である。さらに、合成するＤＮＡプライマ
ーの長さは精度の低下（非特異結合）、ＤＮＡプライマ
ー内のアニーリングを避けるためには、２０個前後が適
当であるが特徴のある配列であれば１０個前後でも可能
である。

【００１０】（ｂ）ＤＮＡプライマーの固定方法上記で
得られたＤＮＡプライマーの担持する担体としては、酵
素免疫反応用プレート、ラテックス粒子、カラムクロマ
トグラフィー用樹脂（セルロースセファデックス等）、
蛋白質等の疎水性を有するか、または官能基を有する材
質のものが用いられる。各担体への担持は、該ＤＮＡプ
ライマーの５′未端側をアミノ化後行われる。

【００１１】疎水性材質の担体を用いる場合、アミノ化
ＤＮＡプライマーとの結合は、該疎水性材質に抗原，抗
体，ストレプトアビジン等の蛋白質を被覆し、抗原−抗
体結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合等を介して
行うことができる。例えば、ビオチン−ストレプトアビ
ジン結合を介して行う場合には、まず、アミノ化ＤＮＡ
プライマーにＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ等の市販のビ
オチン化した架橋剤を反応させ、ビオチン化ＤＮＡプラ
イマーを合成した後、これにストレプトアビジンで被覆
した疎水性材質を接触させることによりＤＮＡプライマ
ーを担持させる。

【００１２】官能基を有する担体を用いる場合には、市
販の２官能基を有する架橋剤（ジスクシンイミドスベリ
ン酸等）を加えて結合させる。

【００１３】（ｃ）アニーリング 検体中のＤＮＡが１本鎖である時はそのまま、２本鎖の
ときは９５℃、１０分の加熱により１本鎖として上記で
調製されたＤＮＡプライマーとアニールさせる。アニー
リングの条件は低塩濃度ではやや高い温度を必要とする
。１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２），１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　　ＤＴＴ（ジチオスレイ
トール）を用いるような通常のＤＮＡポリメラーゼ反応
の条件では５６℃で１〜２分であり、１００ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　　ＮａＣ
ｌの条件では常温で１〜２分でアニーリングが行なわれ
る。又、２．５Ｍ　　ＧｕＳＣＮ（グアニジンチオシア
ネート）細胞破壊液を直接プライマーと接触させること
により常温、１〜２分で目的遺伝子とアニールさせるこ
とも出来る。

【００１４】（ｄ）相補ＤＮＡの合成 アニールされた標的１本鎖ＤＮＡを鋳型として、ジゴキ
シゲニンまたはビオチンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（
式中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵで表わされるデ
オキシリボヌクレオチドを表わす。）、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
及びＵから選ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌ
クレオチド及びＤＮＡポリメラーゼの存在下、ポリメラ
ーゼ反応用緩衝液中、３７℃，３０分間反応させ、該鋳
型に相補的なＤＮＡ鎖を合成することができる。通常ｄ
−Ｘ１　ＴＰとしてはジゴキシゲニンで標識されたｄ−
ＵＴＰが用いられるが、ビオチンで標識されたｄ−ＵＴ
Ｐも市販されており利用することができる。

【００１５】（ｅ）標識ｄ−ＵＴＰの検出ポリメラーゼ
反応後、標識ｄ−Ｘ１　ＴＰを取りこんだ相補ＤＮＡに
対し、ポリクローナル羊抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグ
メントにアルカリホスファターゼを結合させた抗ジゴキ
シゲニン抗体−アルカリホスファターゼ複合体を加えて
、免疫反応を行ないアルカリホスファターゼの付加を行
なう。

【００１６】次いで、アルカリホスファターゼの合成基
質であるパラニトロフェニルホスフェート等を加えて、
発色反応を行なう。目的とするＤＮＡが存在していれば
この反応により反応液はパラニトロフェニルホスフェー
トの場合黄色を呈する。

【００１７】（ｆ）ＤＮＡの定量 標準ＤＮＡサンプルの設定または、ＤＮＡ量あるいは目
的遺伝子の大きさなどから目的遺伝子の定量が可能であ
る（ＤＮＡ，８，Ｎｏ．５，ｐｐ３６１−３６７，１９
８９）。求めた検量線に対する反応液の着色量を吸光度
の測定により算出する。

【００１８】

【実施例】本発明について、以下に実施例を挙げてより
詳細に述べるが、その要旨を越えない限り、これらに限
定されるものではない。 （実施例１）ヒト胎盤由来精製ＤＮＡ（ｃ−ｍｙｃ）を
超音波処理（５分）により断片化したのち、加熱処理（
１００℃、１５分）により１本鎖化する。

【００１９】別に、目的ＤＮＡ（ｃ−ｍｙｃ）の一部位
に相補するＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成機（アプライ
ド・バイオシステム社製　　米国）により合成し、５′
未端をアミノリンク−２（商品名）によりアミノ化する
。 次いで、ビオチン付加のための架橋剤であるＮＨＳ−Ｌ
Ｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製　　米国）により
５′未端をビオチン化する。合成したプライマーの配列
は以下の様である。

【００２０】酵素免疫反応用プレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ社製　　米国）に５μｌ（ｍｇ／ｍｌ）のストレプト
アビジン及び９５μｌのカーボネート・バイカーボネー
ト緩衝液（Ｎａ２　ＣＯ３　１．５９ｇ／１，ＮａＨＣ
Ｏ３　２．９３ｇ／１　　ｐＨ９．６）を加えて、プレ
ートをコーティングする（３７℃、１時間）。自動プレ
ート洗浄機（Ｉｎｔｅｒ　　Ｍｅｄ社製　　米国）によ
り、上記緩衝液を排除し、ＰＢＳＴ（０．０５％　　Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）、及びＢｕｆｆｅｒ−１（
１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ
，ｐＨ７．５）で洗浄後、１％　　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　
　Ｒｅａｇｅｎｔ（ベーリンガー・マンハイム山の内社
）を含むＢｕｆｆｅｒ−１でプレートをブロッキング（
３７℃、１時間）する。次いで、ブロッキング溶液を排
除し、過剰のビオチン化オリゴマーを加えてストレプト
アビジン−ビオチン化オリゴマー結合を形成させる（３
７℃、３０分）。 プレートよりビオチン化オリゴマーを回収し、ＰＢＳＴ
、Ｂｕｆｆｅｒ−１で洗浄したのち、Ｂｕｆｆｅｒ−１
により漸次希釈した１本鎖化ヒト胎盤ＤＮＡをプレート
に添加（１００μｌ／Ｗｅｌｌ）して、プライマー（ｃ
−ｍｙｃの一部）と目的ＤＮＡ（ｃ−ｍｙｃ）とをアニ
ーリングさせる（３７℃、３０分）。同ＤＮＡ溶液を排
除し、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１で十分洗浄後、ジゴ
キシゲニン（Ｄｉｇ）で標識されたｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−
ｄＵＴＰ）、ｄＸＴＰ（Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）を含む１
００μｌ／Ｗｅｌｌ　　Ｂｕｆｆｅｒ−２（５０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ　　ＫＣｌ，８ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２　，４ｍＭ　　ＤＴＴ，ｐＨ８．３）を加え
、更に１μｌ（２Ｕｎｉｔｓ）のＤＮＡポリメラーゼを
加えてヒトＤＮＡを鋳型とするＤＮＡオリゴマー伸長反
応による標識ＤＮＡ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）の取り込みを
行なう。 続いて、同反応液を排除、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１
でプレートを洗浄し、抗Ｄｉｇ抗体−アルカリホスファ
ターゼ複合体を含む（４μｌ／２０ｍｌ）Ｂｕｆｆｅｒ
−１を１００μｌ／Ｗｅｌｌ添加し３７℃、３０分イン
キュベートする。同複合体液を排除し、十分のＰＢＳＴ
、Ｂｕｆｆｅｒ−１による洗浄後、アルカリホスファタ
ーゼの基質であるパラニトロフェニルホスフェート５ｍ
ｇを含むＢｕｆｆｅｒ−４（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，１００ｍＭ　　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２　，ｐＨ９．５）２０ｍｌを１００μｌ／Ｗｅｌｌ
ずつプレートに添加して室温に於いて静置する。１時間
以内に、２．５μｇ，１．０μｇ，０．５μｇのヒトＤ
ＮＡを添加したＷｅｌｌは黄色に発色した。又、０．２
５μｇ，０．１μｇのヒトＤＮＡを添加したＷｅｌｌも
一昼夜の放置により黄色に発色した。この結果は、プレ
ートＷｅｌｌ内でヒトＤＮＡを鋳型としてオリゴマーか
ら鎖が伸長して標識ＤＮＡを取り込んだことを示すもの
であり、更に放射能法を上回る高検出感度にてヒトＤＮ
Ａ鎖中の標的ＤＮＡ部位を検出したことを示している。

【００２１】（実施例２） ＣＨＯ細胞を、７．５％ＦＣＳ（子牛血清）を含むＨａ
ｍ′ｓ　Ｆ−１２培地（日本製薬社製）にて増殖させ、
ローラー・ボトル（５００ｍｌ用）に移して１％ＦＣＳ
の同培地にて産生培養する（３７℃、４日間）。ＣＨＯ
細胞はチャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞にＢ型肝炎
ウィルス表面抗原遺伝子を組み込んだ細胞で同培養にお
いて培地中に表面抗原を産生分泌する。培養後、同細胞
をスクレイパーにより集め、５Ｍ　　ＧｕＳＣＮ溶液に
加えて細胞を破壊する。

【００２２】別に、実施例１と同様に表面抗原遺伝子の
３′未端に相補するアンチセンス鎖のプライマーとなる
下記配列のオリゴマーを合成して５′未端をビオチン化
した。

【００２３】ビオチン−−−−ＴＧ　　ＴＡＴ　　ＡＣ
Ｃ　　ＣＡＧ　　ＡＧＡ　　ＣＡＡＡＡＧＡＡＡ　　Ａ
ＴＴ　　ＧＧＴ−３′ 酵素免疫反応用プレートを用意し、５μｇ／Ｗｅｌｌの
ストレプトアビジン、カーボネート・バイカーボネート
緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｇ／Ｗｅｌｌにて、プレ
ートをコーティングする（３７℃、１時間）コーティン
グ溶液を排除して１％のＢｌｏｃｋｉｎｇ　　Ｒｅａｇ
ｅｎｔを含むＢｕｆｆｅｒ−１の２００μｌにてプレー
トをブロッキングする（３７℃、１時間）。Ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇ溶液を排除したプレートに合成したビオチン−オ
リゴマーの過剰量１００μｌ／ＷｅｌｌをＢｕｆｆｅｒ
−１溶液として加えてビオチン−ストレプトアビジン結
合を形成させる（３７℃、３０分）。ビオチン−オリゴ
マー溶液を回収し、ＰＢＳＴ、Ｂｕｆｆｅｒ−１にて十
分洗浄を行ない、このプレートに直接２．５Ｍ　　Ｇｕ
ＳＣＮ細胞破砕液を５０℃、３０分加温して１００μｌ
／Ｗｅｌｌ加える。

【００２４】そして、３７℃、３０分のアニーリング反
応を行なう。続いて、反応液を排除して前述洗浄液にて
十分な洗浄を行なった後、１／５希釈したＤｉｇ−ｄＵ
ＴＰ、ｄＸＴＰ混合液の２μｌを含むＢｕｆｆｅｒ−２
を１００μｌ／Ｗｅｌｌ添加して１μｌのＤＮＡ　　Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅによるオリゴマー鎖の伸長反応を行
なう（３７℃、１時間）。反応後、十分な洗浄を行ない
た４μｇ／２０ｍｌの抗Ｄｉｇ抗体−アルカリホスファ
ターゼ・Ｂｕｆｆｅｒ−１溶液を１００μｌ／Ｗｅｌｌ
加えて抗原抗体反応を行なう（３７℃、３０分）。

【００２５】プレートを十分洗浄後、アルカリホスファ
ターゼの基質であるパラニトロフェニルホスフェート・
Ｂｕｆｆｅｒ−４（５ｍｇ／２０ｍｌ）を１００μｌ／
Ｗｅｌｌ加えて室温で静置する。３０分程経過すると、
プレートは黄色に発色を呈した。これは、ＤＮＡを鋳型
としてオリゴマーの伸長が起こり、取り込まれたＤｉｇ
−ｄＵＴＰに原因するものに他ならない。

【００２６】又、プレート内において、ＤＮＡを精製す
る事なしにＤＮＡ鎖内の一部標的部位を非放射能法によ
り検出出来得ることを示した。

【００２７】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来のように放
射性標識法を利用することなく、高感度かつ安全に目的
とするＤＮＡを検出でき、また、本発明の方法によれば
、従来法のようなハイブリダイゼーション操作が存在し
ないため、労力はもとより、検出時間についても２日以
上から１時間と大幅に改善された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（ａ）検出しようとする標的ＤＮＡ鎖
   に相補性を有するＤＮＡプライマーを調製する工程、（
   ｂ）該ＤＮＡプライマーを担体に担持する工程、（ｃ）
   担持された該ＤＮＡプライマーと試料中の標的１本鎖Ｄ
   ＮＡをアニールする工程、（ｄ）アニールされた標的１
   本鎖ＤＮＡを鋳型として、ジゴキシゲニン又はビオチン
   で標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、
   Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシリボヌクレオチドを
   表わす。）、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵから選ばれるＸ１　
   以外の３種のデオキシリボヌクレオチド及びＤＮＡポリ
   メラーゼの存在下、該鋳型に相補的なＤＮＡ鎖を合成す
   る工程、及び、（ｅ）形成された相補的なＤＮＡ鎖中の
   ジゴキシゲニン又はビオチンをアルカリホスファターゼ
   と結合させ、該アルカリホスファターゼとパラニトロフ
   ェニルホスフェートとの発色反応により検出する工程、
   から成ることを特徴とする標的ＤＮＡ鎖の検出方法。