JPH05505942A - ポリメラーゼ活性測定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリメラーゼ活性測定方法 本発明は、ポリメラーゼ活性測定方法、該方法を行うための試薬および試薬キッ トならびに）（ＩＶ検出のための該方法の使用に関する。本発明は、また、物質 のポリメラーゼ活性への抑制効果を測定する方法、ポリメラーゼに対する抗体を 検出する方法およびプロモーター配列を検出する方法にも関する。

ポリメラーゼは生物にとって基本的に重要な酵素である。それらは、例えば、核 酸の合成およびそれらの蛋白合成に必要なそれらの他の核酸への形質転換の原因 となる。したがって、ポリメラーゼは、例えば細菌を含む全ての種類の細胞にあ る。多くのウィルスでさえそれら自身のポリメラーゼをコードする。１つの特定 の代表例は、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）として知られているポリメ ラーゼである。

最近１０年間のヒト病原レトロウィルスの発見によって（サイエンス（Ｓ　ｃｉ ｅｎｃｅ）（１９８３）、２２０　：　８６８−８７１、プロシーディンゲス・ オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　 ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ。

ＵＳＡ）（１９８０）、７７二７４１５−７４１９およびバイオケミカル・アン ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、Ｘ１９８４）、１２１　：１２６−１３３）、このウィルスのファミ リーの典型的なキー酵素であるリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）の検出は 、ますます重要性を増してきた。その後、ＲＴ活性の測定方法の多くの改良が開 示された（バイｏｏジー（ＶｉｒｏｌｏｇｙＸ１９８５）１４７　：　３２６− ３３５）、ＲＴ試験は以下の３つの状況下で一般に使用される。

１、レトロウィルスとして新規に単離されたウィルスを特徴付水翼なるレトロウ ィルス間で区別する。

２、レトロウィルスに感染されることが知られている被検体または感染され得る 被検体の試験物質からのウィルス単離の成功を測定する。

３　レトロウィルスに関して必須であるこれらの酵素的機能に対する化学治療剤 のイン・ビトロ効果を評価する。

前記適用分野の最初の２つに関しては、冗長な試料調製（超遠心またはＰＥＧ沈 澱、もしそうでなければ、感度は非常に低くてもよい）を含む公知のＲＴ試験は 制限される；第２の適用分野に関しては、感度が良く、安価でかつ簡単な抗原検 出方法（ＥＬＩＳＡ）による競合；前記３つの適用分野の全てを制限するものは 、慣用のＲＴ試験が同位体ヌクレオチドを使用し、かくして、研究室で特別な要 求（装置、許可、人員、廃棄物処理）がなされるという事実である。

文献から知られている、リバーストランスクリプターゼ、特にＨＩＶのリバース トランスクリプターゼの酵素活性を検出する全ての方法は、鋳型の部分的な配列 に相補的なプライマーが標識ヌクレオチドを取り込むことによって伸長するアッ セイに基づく。取り込まれないヌクレオチドは、一般に、トリクロロ酢酸または エタノールの助けによってポリマーを沈殿させ、次いで、濾過方法または正に荷 電された面を有する膜フイルタ−（例えば、ジャーナル・オブ・パイロロジカル ・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ ）１９（１９８８）、１６１−１６８の開示に従って、ＤＥＡＥ）へのポリマー の吸着によって；あるいは負に荷電されたポリマーを負に荷電されたモノマーか ら分離するのに適当な別の方法を使用することによって、水素結合を介して鋳型 に結合される伸長プライマーから分離される。これらの処置は、非常に冗長であ り、さらなる処理工程を必要とする。

Ｗ０９０１０６３７３には、鋳型核酸として固定化核酸を使用する方法が開示さ れている。この方法の欠点は、酵素へのアクセスを妨害せずにこの鋳型核酸の有 意に特異的な固定化が不可能であるということである。故に、該方法は反応性鋳 型核酸の有効量によって制限され得る。さらに、該方法は、異なるハイブリダイ ゼーション条件の結果として鋳型−ＤＮＡを介する固相への結合が非常に変化す る多数の種類の核酸を生じる。さらにまた、固相での反応は、一般に、溶液中で の反応を行うよりも乏しい速度論を呈する。

さらにまた、ＨＩＶ粒子の定量測定について、ＨＴＶ抗原の検出用イムノアッセ イが確実ではないことが判明したにュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メ ディスン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅＸ　１９８９　）、第３２１巻、２４．１６７３−１６７５）。

ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ　、　Ｃｌｉｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）２７（１９８９）、７．１４５３−１４５５および エイズ・リサーチ・アンド・ヒユーマン・レトロバイラシズ（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）５　（１ ９８９）、５３５−５４０には、ＨＩＶに対する抗体の存在下、ポリメラーゼ活 性の測定に基づ＜ＨＩＶ−ＲＴに対する抗体の検出方法が開示されている。ポリ メラーゼによって合成された放射性標識核酸は非特異的方法で膜に固定化される 。

この方法もまた非常に冗長である。

故に、本発明の目的は、迅速で、簡単で、より確実でかつ感度の良い、ポリメラ ーゼ活性に関する試験を提供することであった。この目的は本発明によって達成 された。

本発明の課題は、 鋳型核酸および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸と一緒にポリメラーゼ含有 試料をインキュベートし、 該検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から合成核酸を分離し、核酸に含有され る検出可能なヌクレオチドを検出する工程からなり、該インキュベーション混合 物がさらに固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が固相に接触させられ、該固相が固定化可能なモノ ヌクレオシド三リン酸および該固定化可能なヌクレオチドを取り込む核酸を選択 的かつ実質的に完全に結合する ことを特徴とするポリメラーゼ活性の測定方法である。

また、本発明の課題は、該方法を行うための試薬、物質のポリメラーゼ活性への 抑制効果の測定方法、ポリメラーゼに対する抗体の検出方法およびプロモーター 配列の検出方法を含む。

ポリメラーゼ活性は、鋳型核酸の助けによってモノヌクレオシド三リン酸をヌク レオチド配列に重合させるためのポリメラーゼの酵素的活性であると理解される 。この方法では、該モノヌクレオチドは核酸配列に付加され、核酸配列に相補的 な核酸鎖に取り込まれる。ポリメラーゼによって、得られる生成物は一本鎖核酸 または二本鎖核酸のいずれかである。

本発明の方法で測定され得るポリメラーゼが数種類ある。これらのポリメラーゼ は、基質および／または重合生成物に応じて区別される。例としては、Ｔ３−１ Ｔ７−またはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）−ＲＮＡ−ポリメラーゼのようなりＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（■型）、フレノウ断片のようなりＮＡ依存性ＤＮ Ａポリメラーゼ（■型）、リバーストランスクリブターゼのようなＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ（■型）およびＱβ−およびピコルナウィルス−ポリメラー ゼのようなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（■型）が挙げられる。本発明の方 法では、例えば、ウィルスのリバーストランスクリプターゼ、特にＨＩＶ−リバ ーストランスクリブターゼが分析物として使用される。

本発明では、鋳型核酸なる語は、ポリメラーゼまたは測定されるべき型のポリメ ラーゼの基質として機能する核酸を表す。したがって、■型および■型に関する 基質はデオキシリボ核酸であり、■型および■型に関する基質はリポ核酸である 。デオキシリポ核酸は、■型に関する基質としても供し得る。しかしながら、■ 型と区別を行うために、好ましい基質はリポ核酸である。

■および■型ポリメラーゼに関して、鋳型核酸としてヘテロポリマーおよびホモ ポリマー核酸を使用することができる。■型または■型ポリメラーゼのイン・ビ トロ活性の測定は、一般に、プライマーの添加を必要とする。

■型ポリメラーゼに関する試験には、イー・コ言バＥ、ｃｏｌｉ）ＲＮＡ−ポリ メラーゼについてはイー・コリ由来の１ａｃ−プロモーターまたはＴ７−ＲＮＡ −ポリメラーゼについてはＴ７−ファージ由来のプロモーターのような対応する 特異的なプロモーターを有する核酸の使用を必要とする（チャンバーリン（Ｃｈ ａｍｂｅｒｌｉｎ）およびライアン（Ｒｙａｎ）（１９８２）、シーエンザイム （Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ）、篤Ｘｖ巻、第８７〜１０８頁）。逆に、特異的なプ ロモーターの検出は特異的なポリメラーゼを必要とする。

■型ポリメラーゼ測定用の鋳型核酸は、末端結合蛋白を含む特異的な一次構造、 ある二次構造などを有する。これらの構造はポリメラーゼに依存しており、当業 者に知られている。

モノヌクレオシド三リン酸は、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルも しくはチミンのような天然塩基、または、例えば７−ジアザ−２′−デオキシグ アノンン二リン酸の如き天然塩基のアザ−およびデアザ−アナログのような人工 塩基を含むヌクレオシドの三リン酸エステルである。モノヌクレオシド三リン酸 なる語は、測定されるべきポリメラーゼ活性の型によってモノヌクレオチドリン 酸またはモツプオキシリボヌクレオチド三リン酸を表す。■および■型はりボヌ クレオチドを必要とし、一方、■および■型はデオキシリボヌクレオチドを必要 とする。リバーストランスクリブターゼに関して、リボ−およびデオキシリボヌ クレオチドの両方を使用することができる。しかしながら、鋳型核酸としてリポ 核酸とデオキシリボヌクレオチドとの組合せが■型ポリメラーゼに特異的である ので、デオキシリボヌクレオチドが好ましい。

本発明によって定義された検出可能なモノヌクレオシド三リン酸は、修飾された 三リン酸エステルである。この修飾は、例えば、光度測定的、蛍光測定的、放射 線測定的、酵素的もしくは免疫学的反応で、天然モノヌクレオチドの存在下、モ ノヌクレオチドを選択的に検出させる。好ましい方法では、モノヌクレオシド三 リン酸は共有結合した非放射性化学基を有する。これは、色素、蛍光標識または 抗原、抗体もしくはハプテンのような免疫学的反応の成分である。ハプテンが好 ましく、ジゴキシゲニンがその高い感受性のために特に好ましい。これに関連し て、本発明者らは、ＥＰ−Ａ−０３２４４７４およびＥＰ−、Ａ−０２５４０９ ０の内容を引用記載する。

検出可能なモノヌクレオシド三リン酸に加えて、本発明は、固定化可能なモノヌ クレオシド三リン酸も使用する。これらのモノヌクレオチドの固定化は、例えば 、固相に対して特異的な親和性を有する共有結合した化学基によって達成され得 る。好ましい方法では、該化学基は特異的な組合せの結合相手の一方である。

このような組合せは、例えば、抗原−抗体、／１ブテンー抗体、抗体−抗体、ビ タミン−結合蛋白、補因子−酵素および糖−結合蛋白（レクチン）である。特に 好ましい組合せは、ビタミン−結合蛋白、特にビオチン−アビジンまたはビオチ ンーストレプタビジンであり、ビオチンはリンカ−を介して結合されるモノヌク レオチドの化学基を表す。本発明によって意図される結果を得るために、固定化 可能なモノヌクレオシド三リン酸は検出可能なモノヌクレオチドと異なっており 、かつ区別可能であるべきである。さらに、該方法は、モノヌクレオチドが同一 である場合と比較して、妨害に対して非常に感度が低くかつ取り込まれたヌクレ オチドの量にあまり左右されない。ビオチン−およびジゴキシゲニンーヌクレオ チドに関して示されたように、個々のポリメラーゼは基質として検出可能および 固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を受容しなければならない。

ポリメラーゼの含量に関して試験されるべきいずれの液体も本発明の方法に適し ている試料である。該方法は、好ましい濃度１０−１１〜１０−”ｍｏｌ／Ｉｌ 、　！、に好ましい濃度８Ｘ１０−”〜８　Ｘ　１０−”ｍｏｌ／Ａ’（ＲＴに 関して測定した）の液体中のポリメラーゼを測定するのに適している。このよう な濃度の溶液は、例えば、ポリメラーゼを単離する際に得られるが、ウィルスお よび細菌の溶解物または細胞培養物の上清中にもある。該溶解物は、組織および 血液のような体液由来の両溶解物であり得る。また、溶解物からのポリメラーゼ の単離は必要ではない。このヨ’）　ｆ；ｔ＆料ｆ）ｆＲＨＩ＊、例文ば、バイ オロジー（ＶｉｒｏｌｏｇｙＸ１９８５）１４７　：　３２６；ＰＮＡＳ（１９ ８０）７７．７４１５に開示されている。その高い感度のために、はとんどの場 合、冗長な濃縮工程がもはや必要ではないことが該方法の利点である。

本発明の第１の工程では、鋳型核酸および少なくとも１つの検出可能なモノヌク レオシド三リン酸および１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を試料に 添加する。活性がプライマーの存在に左右されるポリメラーゼが検出されるべき である場合、この使用したプライマーは、鋳型核酸よりも短（、鋳型核酸の一部 分に相補的であり、ポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的である鎖断片によ って伸長され得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。効果的な 条件は、ポリメラーゼをその酵素活性を充分に展開させなければならない。これ らの条件は、ポリメラーゼによって変化するが、当業者には知られている。それ らは、例えば、ｐＨ値をポリメラーゼの最大活性付近に安定化させるｐＨＩＩ衝 液の新液、または、例えば、個々のポリメラーゼ活性に必要な陽イオンの存在を 含む。トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　１００のような洗浄剤またはＥＤＴＡの ような錯形成剤を添加することもできる。最適温度も、当業者に知られている。

好熱性ポリメラーゼ、例えばＥＰ−Ａ−０２５８０１７のＴａｑ−ＤＮＡ−ポリ メラーゼの検出は、例えば、高温で行われ得る。鋳型核酸がホモポリマーである 場合、モノヌクレオシド三リン酸は鋳型核酸のヌクレオチドに相補的なヌクレオ チドからなっていなければならない。ポリアデニレートが鋳型核酸として使用さ れる場合、該三リン酸エステルはチミンまたはウランル残基を含有するのが好ま しい。というのは、後者は、ポリアデニレートに相補的な核酸鎖を形成するため に使用され得るからである。

さらにまた、インキュベーション溶液は、検出可能および／または固定化可能な モノヌクレオシド三リン酸のベースである検出不可能および／または固定化不可 能なモノヌクレオシド三リン酸も含有し得る。

鋳型核酸が全部で４種類のモノヌクレオチドからなるコポリマーである場合、イ ンキュベーション溶液は、検出可能、固定化可能、または検出不可能もしくは固 定化不可能であるかその形態に関係なく、各々の対応する４種類のモノヌクレオ シド三リン酸を含有しなければならない。好ましい場合は、４種類のモノヌクレ オシド三リン酸の濃度はほぼ同一であり、三リン酸エステルの一部分は、その固 定化可能な形態で存在し、同一の三リン酸エステルまたは別の三リン酸エステル の他の部分は、その検出可能な形態で存在する。各三リン酸エステルの好ましい 全濃度は０．０００１〜１０　ｉｍｏｌ／６てあり、特に好ましい濃度は０．０ ０１〜ｌ　Ｑ　ｇａｏｌ／　ｌの範囲である。

約１０”’ｍｏｌａｒの濃度のリバーストランスクリプターゼの検出のためのイ ンキュベーション時間は３５℃で約９０分後に終わらせる；とができる。ＩＱ− １２ＩＩｌｏ１／ｌまでの少量は、インキュベーション期間を２４時間まで延長 すると検出され得る。

インキュベーションは、固定可能なモノヌクレオシド三リン酸または該三リン酸 エステルを含有する核酸が結合できる固相にすでに接触している場合でも、例え ば、微量滴定プレートまたはチューブまたはバイアルのようないずれの利用可能 な予備インキュベーション容器中で行われてもよい。好ましい場合は、予備イン キュベージタン容器は、すでに、該固相を含有しており、故に、該組成物を結合 することができる。そこで、固相と一緒に他のインキュベージタン用容器への移 送はもはや必要ではない。

分離工程の間に、ポリメラーゼ活性によって生産され得、少な（とも１つの取り 込まれた固定化可能および少なくとも１つの取り込まれた検出可能なモノヌクレ オチドを含有する核酸は、固相に結合され、液相は除去される。

固定化モノヌクレオシド三リン酸および該モノヌクレオシド三リン酸を取り込ん だ核酸が結合される固相は、他の結合相手を含有する。特に好ましい方法では、 固相をストレプタビジンで塗布する。固相は、容器の形態で、またはビーズ状態 で存在し得る。典型的かつ好ましい容器はキスベットおよび微量滴定プレートで ある。ビーズを使用する場合、固定化は、予備インキ二ベーション容器を使用し ない限り、インキュベーション混合物を収容するために分離容器を必要とする。

固相は、好ましくは、インキュページ目ン溶液中に含有される固定化可能なモノ ヌクレオシド三リン酸および該固定化可能なヌクレオチドを取り込んだ核酸の全 量の９０％以上を結合し得るに違いない。このために、固相は、少なくとも９０ ％、好ましくは固定化可能なモノヌクレオチドの初期有効量よりも多い結合部位 を含有すべきである。この量は既知であるので、当業者は、必要な面を容易に測 定することができるか、あるいは、逆に、種々の量のモノヌクレオチドを含有す る溶液に関する固相の結合能を測定することによって、固相によって結合される モノヌクレオチドの最大可能量を測定することができる。しかしながら、固相で の結合部位の量がモノヌクレオチドの量を超える場合、該測定を妨害しない。

ＥＰ−Ａ−０３４４５７８に開示されているストレプタビジン被覆面相は特に好 ましい固相である。特異的な結合対の使用は、非常に微量の、非特異的に結合さ れ、標識されたモノヌクレオシド三リン酸を確実に存在させる。前記結合相手、 特に、ビオチン／ストレグタビジンの親和性のために、固定化可能なモノヌクレ オチドはほとんど完全に結合される。

ビオチン／ストシブタビジンの場合、３５℃でのインキュベーション混合物によ る固相のインキュベーションは、２時間未満続く。次いで、例えばデカンテーシ ヨン、ピペッティングまたは吸引除去によって、液体を固相から分離する。取り 込まれない検出可能なモノヌクレオシド三リン酸は、かくして、固定された検出 可能モノヌクレオチドから分離される。完全な分離を確実にするために、洗浄溶 液による後処理が行われ得る。取り込まれた固定化可能なヌクレオチドを含有す る核酸の固相への堅固な結合によりて、固定された核酸は有意には洗浄されない 。可能な洗浄溶液としては、例えば、緩衝化および非緩衝化塩化ナトリウム溶液 のような簡単な塩溶液が挙げられる。かくして、従来技術では必要であった、鋳 型核酸の新しく形成される核酸へのハイブリダイゼーションを維持する洗浄溶液 の使用は必要ない。

結果として、固相に結合した核酸は、取り込まれた検出可能なヌクレオチドの助 けをかりて測定される。測定は使用した検出可能なヌクレオチドのタイプに左右 される。好ましい場合、モノヌクレオチドの検出可能な基が免疫学的反応の一部 分である場合は、面相は該免疫学的反応の他の成分と反応する。この第二成分は 、例えば酵素または蛍光標識で、標識されるのが好ましい。ホースラディツシュ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダ ーゼのような酵素で標識するのが特に好ましい。好ましい場合は、第一成分がハ ブテンであり、第二成分がこのハブテンに対する標識抗体である。これに関連し て、本発明者らは、ＷＯ２９１０６６９８およびＥＰ−Ａ−０２０９８７５を引 用記載する。該標識が色素または蛍光色素のような直接標識である場合、検出可 能なモノヌクレオチドは可視的または自動分析によって直接測定され得る。後者 の場合は、光度計または蛍光光度計を用いる。酵素標識を使用すると、固相はこ の酵素に関する基質と反応し、該反応は光度測定的または蛍光測定的にモニター される。

本発明の方法では、ポリメラーゼの量もしくは存在またはポリメラーゼのタイプ は固相の検出可能なモノヌクレオチドの量または存在から理解され得る。定量分 析は、ポリメラーゼの含量が既知である試料によって得られた検量線に基づき得 る。

個々のポリメラーゼおよび／または種々のポリメラーゼが検出可能および固定化 可能なモノヌクレオチドを取り込む条件が変化すると、個々のポリメラーゼ間お よび種々のポリメラーゼ間で区別が可能である。故に、本発明の方法は、１つの タイプのポリメラーゼの測定を他のタイプのポリメラーゼの存在下で行う選択的 方法である。

標識核酸が非常に簡単かつ完全な方法で標識モノヌクレオシド三リン酸から分離 され得ることが本発明の方法の利点である。さらにまた、この方法は１つの単一 容器で行われ得る。異なる容器への移送はもはや必要とされない。非放射性アッ セイ法の使用はさらに利点を有する：すなわち、該反応はあまり装置を必要とせ ず、自動化が容易であり、例えば微量滴定プレートで、多（の試料を平行測定で きる。固定可能なヌクレオチドおよび該ヌクレオチドを含有する核酸だけが面相 に結合されるので、該方法は非常に特異的である。故に、最大よりも低い純度を 有する試料は本発明の方法に許容される。例えば、細菌の存在下での測定でさえ 可能である。ジゴキシゲニンのようなハブテンが検出可能なモノヌクレオチドと して使用される場合、鋳型核酸から新しく形成された鎖を分離するのが必要では ない。本発明の方法は、ポリメラーゼ反応の生成物の長さが１つの修飾モノヌク レオチドだけを使用する場合よりも結果への影響が低いので非常により信頼でき る。種々の修飾モノヌクレオチドを使用すると、固定化可能なモノヌクレオチド の量は固相への定量的に特異的な結合のために低（維持され得るが、一方、検出 可能なモノヌクレオチドの量は、より高い感度に関して比較的高く維持され得る 。

リバーストランスクリブターゼを測定する方法の好ましい具体例では、該試料を 、鋳型核酸としてのポリアデニレート、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸 としてのビオチニル化ｄＵＴＰ（ＥＰ−Ａ−００６３８７９）および検出可能な モノヌクレオシド三リン酸としてのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（ＷＯ８９１０ ６６９８）およびプライマーとしてのオリゴｄＴと反応させる。約３５℃で９０ 分間インキュベートした後、該混合物をストレブタビジン被覆キュベツトに移す 。約６０分間インキュベートした後、液体を廃棄し、キュベツトを洗浄溶液で洗 浄する。次いで、ジゴキシゲニンに対するＰＯＤＩＩＩ！抗体の溶液を添加する 。

約６０分間の後、液体を再度廃棄し、キュベツトをもう１回洗浄する。次いで、 ＡＢＴＳ’溶液を添加し、着色を４０５ｎｍで測定する。

本発明の他の課題は、本発明方法で使用するための試薬および少なくとも１つの 検出可能および少なくとも１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有 する鋳型核酸である。該試薬はポリメラーゼを含まないのが好ましい。検出可能 および固定可能なモノヌクレオシド三リン酸は、例えばウリジンのような同一の モノヌクレオチドまたは例えばアデノシン（固定化可能）およびウリジン（検出 可能）のような興なるモノヌクレオチドに基づく種々の化合物である。鋳型核酸 が例えばポリアデニレートのようなホモポリマー核酸である場合、検出可能およ び固定可能なモノヌクレオシド三リン酸について１つのタイプのモノヌクレオチ ドだけが必要とされる。すなわち、核酸のヌクレオチドに相補的な塩基（この例 ではウリジンまたはチミジン）を含有するものである。鋳型核酸が全ての天然塩 基を含有する場合、個々の相補モノヌクレオチドは三リン酸エステルとして存在 しなければならない。好ましい方法では、該試薬は、溶媒としての水、ｐＨ緩衝 剤、洗浄剤、安定化剤またはポリメラーゼに対する補因子を含む添加剤を含有す る。ｐＨ緩衝剤は、該試料に試薬を添加した後、検出されるべきポリメラーゼが 、存在する場合に、活性であると予想されるｐＨを確実にするために含まれる。

水溶液の形態の試薬は前記成分を以下の濃度で含有する。

鋳型核酸　０．１　〜２０００μｇ／諺！モノヌクレオシド三リン酸（合計）　 ０．０００１〜１０　冨ｍｏｌａ！好ましくは　０．００１　〜１０　ｇａｏｌ ／７検出可能なモノヌクレオチド　０．０００１〜１０　菖ｌ１０１／ｌ好まし くは　０．００１　〜１　冨ｍｏｌ／Ａ’固定化可能なモノヌクレオチド　０． ０００１μｍｏｌ／Ａ’〜０．１關０１／ｌプライマーは必要な場合は、ｌｏｎ ｇ／ｍｌ〜１０＋ｅ／ｍＡの濃度で、好ましくは１０〜２０００μｇ／ｍｌの濃 度で存在するべきである。固定化可能なモノヌクレオチドとしてビオチン−ｄＵ ＴＰおよび検出可能なモノヌクレオチドとしてジゴキシゲニンーｄＵＴＰを使用 する場合、２つの物質は該反応において１：１〜１：５００００のモル比で使用 され、リバーストランスクリブターゼに関しては、好ましいモル比は１：５〜１ ：５０、特に好ましくは１：１０〜１：３０（ビオチン：ジゴキシゲニン）であ る。別の方法で修飾されるヌクレオチドを使用する場合、当業者は、結果的に、 値を最適化することができる。ポリメラーゼ活性への依存性および壁の結合部位 の数の値も最適化することができる。さらに、該試薬は、使用前に希釈しなけれ ばならない濃縮溶液の形態で使用することができる。

凍結乾燥物としての貯蔵も可能である。後者の場合、該試薬は溶液の助けをかり て再構成される。

本発明の他の課題は、ポリメラーゼ活性の検出用試薬キットである。該キットは 分離容器に以下の成分 鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および少な（とも１つの固定化可能なモノ ヌクレオシド三リン酸、 該固定化可能なモノヌクレオチドを選択的かつ実質的に完全に結合するための容 器、および 洗浄溶液 を含有する。

所望により、プライマーは（好ましくは、鋳型核酸との混合物状態で）試薬キッ トに含まれる。この試薬のほかに、該キットは、さらに、該方法を行うのに必要 な容器および洗浄溶液を含有する。さらにまた、該キットの好ましい具体例は、 検出可能なモノヌクレオチドの検出用試薬を含有する。例えば、検出可能なモノ ヌクレオチドに標識を結合するための免疫学的組合せを使用すると、このキット は検出可能なモノヌクレオチドに結合される免疫学的組合せの成分の対応する標 識相手を提供する。酵素標識を使用する場合、該キットは酵素基質および所望に より必要なｐＨ緩衝剤と一緒になっている。全ての試薬が安定であり、比較的小 さい貯蔵空間を必要とし、それらの使用および適用が従来技術の公知の試薬と比 較して非常に簡単であることが本発明の試薬キットの利点である。

試薬キットの好ましい具体例は： ａ）鋳型核酸、ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシド三リン酸、ビオチン標識モ ノヌクレオシド三リン酸、ｐＨ緩衝剤、洗浄剤、錯形成剤、補因子、塩および抗 酸化剤を含有する容器 ｂ）ストレブタビジン被覆キュベツト、チューブ、ベレットまたは微量滴定プレ ート、 Ｃ）洗浄溶液、 ｄ）ジゴキシゲニンに対するＰＯＤＩＩＩ識抗体の溶液、ｅ）緩衝溶液中のＰＯ Ｄ基賀、例えば、２．２′−アジノービス−［３−エチルベンゾチアゾリン−６ −スルフェート］（ＡＢＴＳ’）を含有する。

■型または■型ポリメラーゼの検出については、好ましい方法では、ａ）はプラ イマーも含有する。試薬キットの全成分は安定であり、拡大された貯蔵安定性を 有し、それらの製造および処理は共に安価でありかつ簡単である。

ポリメラーゼ活性の検出ための本発明の方法は、このようなポリメラーゼ活性が 試料の組成物への情報を明らかにする如何なる分野においても使用され得る。

これは、例えば、体液または処理された酵素単離体のような試料中のポリメラー ゼの検出、さらにポリメラーゼ含有微生物、特に未知のポリメラーゼを特徴付け るためおよびそれらのポリメラーゼへの抑制効果を試験するための細菌およびウ ィルスの検出における場合である。さらに、物質の添加による既知のポリメラー ゼ活性の低下は、抑制の指標として供され、抗菌性物質または抗ウイルス性物質 としての該物質の可能な治療学的使用を示す。

本発明の他の課題は、ＨＩＶを検出する方法であり、該方法は、ポリメラーゼを 検出する方法に基づいている。次いで、ＨＩＶが存在すると予想される試料の溶 解物を調製する。

鋳型リポ核酸、少なくとも１つの検出可能および１つの固定化可能なモノデオキ シヌクレオシド三リン酸および添加剤をこの溶解物に添加し、インキュベーショ ン後、該混合物を、固定化可能なモノヌクレオチドおよび取り込まれた固定化可 能なヌクレオチドを選択的および実質的に完全に結合する容器中に移し、 過剰の検出可能なモノヌクレオシド三リン酸を分離し、結合された検出可能なモ ノヌクレオチドを検出する。

最初のインキュベーションは、ＨＩＶ−ＲＴがプライマー依存性■型ポリメラー ゼであるので、プライマーの存在下で行うのが好ましい。混合物のインキュベー ションはそれ自体が結合可能である容器中で行うこともできる。

同様に、該方法はポリメラーゼに結合される他のウィルスの検出に適用される。

この場合、ウィルス単離体、例えばペレットは試料として供し得る。

本発明の他の課題は 鋳型核酸、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼと一緒に検 出されるべき抗体を含有する試料をインキュベートし、合成された核酸を検出可 能なモノヌクレオシド三リン酸から分離し、核酸に含有される検出可能なヌクレ オチドを検出することからなり、該インキュベーション混合物がさらなる固定化 可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該 固定化可能なモノヌクレオチドを取り込む核酸を選択的および実質的に完全に結 合することができる固相に接触するかまたは接触させられることを特徴とする、 ポリメラーゼに対する抗体を検出する方法である。

この方法は、上記本発明のポリメラーゼ活性の検出に基づいている。その反応混 合物は、あるポリメラーゼ活性を示す。該ポリメラーゼ活性を、このポリメラー ゼに対する抗体を含有すると予想される試料の添加後に存在するものと比較する 。このポリメラーゼに対して指向される抗体が存在する場合、活性は抗体が存在 しない活性と比較して低いであろう。使用した試料物質は血液、血清、単離体、 細胞培養物上清などであり得る。

したがって、使用される試薬の量およびタイプは、ポリメラーゼを検出する方法 で使用されるものと実質的に同一である。ポリメラーゼの濃度も、検出されるべ き抗体の量に左右される。しかし、当業者は、予めこの目的のためのいくつかの 試験を行うことによって適当な希釈を見いだすことができる。本発明のポリメラ ーゼ検出方法に関する検出範囲はこの場合に参照として供し得る。

さらに、ポリメラーゼを添加する前に抗体含有試料中にもともと存在するポリメ ラーゼ活性を消去することが有利であり得る。他の一般的な反応条件は、例えば 、ジャーナル・サブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ　、　Ｃｌ　ｉｎ 、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙＸ　１９８９　）第２７巻、７、第１４５３〜 １４５５頁およびエイズ・リサーチ・アンド・ヒユーマン・レトロバイラシズ（ Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕａ＋ａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕ ｓｅｓ）（１９８９）第５巻、第５３５〜５４０頁から、当業者に知られている 。

■型および■型ポリメラーゼに対する抗体の検出は別の対応するプライマーを必 要とする。

ＨＩＶ−ＲＴに対する抗体を検出する方法の好ましい具体例では、鋳型核酸、固 定化可能なモノヌクレオシド三リン酸としてのビオチニル化ｄＵＴＰ（ＥＰ−Ａ −００６３８７９）および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸としてのジコキ シケニンー標ｗＲｃｌＵＴＰ（Ｗｏ　８９１０６６９８）およびウィルス溶解物 からまたは遺伝子工学によって得られる所定量のポリメラーゼ、例えば、リバー ストランスクリプターゼを、３７℃で約６０〜９０分間、分析されるべき血清と 一緒に直接インキュベートする。インキュベーション後、該混合物をストレプタ ビジン被覆キュベツトに移す。約６０分間インキュベートした後、液体を廃棄し 、キュベツトを洗浄溶液で洗浄する。次いで、ジゴキシゲニンに対するＰＯＤ標 識抗体の溶液を添加する。約６０分後に液体を再度廃棄し、該キュベツトを再度 洗浄する。次いで、ＡＢＴＳ’溶液を添加し、着色を約４０５ｎｉで測定する。

本発明の方法では、固相での検出可能なモノヌクレオチドの量または存在は、ポ リメラーゼに対する抗体の量または不在に従う。定量評価は、例えば、既知の量 の抗体を含有する試料で得られた検量線の助けをかりて可能である。

個々のポリメラーゼまたは種々のポリメラーゼが検出可能および固定化可能なモ ノヌクレオチドを取り込む条件が変化すると個々のポリメラーゼに対する抗体間 および種々のポリメラーゼに対する抗体間で区別することができる。故に、本発 明の方法は選択的方法である。例えば、１つのタイプのポリメラーゼに対する抗 体を他のタイプのポリメラーゼに対する抗体の存在下で測定することができる。

本発明の方法は、例えば、ＨＩＶの如きウィルスのような、ポリメラーゼを含有 するかまたはポリメラーゼの生産に関する情報を含有する微生物による感染の検 出のために使用され得る。該方法は、ポリメう−ゼ活性を検出する方法と同様に 優れている。すなわち、それは公知の方法よりも簡単で、迅速で、確実で、およ び感度がより高い。冗長なＩｇＧ−調製物を必要としないことが該方法のさらな る利点である。血清は試料として直接使用され得る。

本発明の別の課題は、 検出可能なモノヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼ反応を開始するための プロモーター配列を必要とするポリメラーゼと一緒に検出されるべきプロモータ ー配列を含有する試料をインキュベートし、検出可能なモノヌクレオシド三リン 酸から合成核酸を分離し、核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する 工程からなり、該インキュベーション混合物がさらなる固定化可能なモノヌクレ オシド三リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該 固定化可能なモノヌクレオチドを取り込む核酸を選択的におよび実質的に完全に 結合することができる固相に接触するかまたは接触させられることを特徴とする プロモーター配列を検出する方法である。

この方法は本発明のポリメラーゼ活性の測定に基づ（。しかし、この方法は、所 定量のポリメラーゼを添加するが、一方、鋳型核酸を、検出されるべき試料に存 在し、かつプロモーター配列を含有し得る核酸に加えて添加しない点で後者とは 区別される。添加されたポリメラーゼを開始することができるプロモーターが存 在すると、ポリメラーゼ反応が生じるであろうし、標識核酸が検出され得る。

検出され得るプロモーターとしてはＳＦ３、Ｔ７−およびＴ３−プロモーターが 挙げられる。次いで、個々のポリメラーゼ、すなわち、５Ｐ６−ＲＮＡ−ポリメ ラーゼ、Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼおよびＴ３−ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用 する。該試験は、個々のプロモーターに対して特異的である。分子生物学では、 このような試験は、例えば、核酸構築物の検出において好都合に使用される。好 ましい試料はＤＮＡ単離体である。

個々の試薬に関する濃度値および条件は、基本的には、本発明のポリメラーゼ測 定方法で与えられた値に左右される。

本発明の好ましい具体例では、試料を、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸 としてのビオチニル化ｄＵＴＰ（ＥＰ−Ａ−００６３８７９）および検出可能な モノヌクレオシド三リン酸としてのジゴキシゲニン標謙ｄＵＴＰ（ＷＯ８９１０ ６６９８）と、ならびにプロモーターに対して特異的なポリメラーゼと反応させ る。約３５℃で９０分間インキュベートした後、該混合物をストレプタビジン被 覆キュベツトに移す。約６０分間インキュベートした後、液体を廃棄し、キュベ ツトを洗浄溶液で洗浄する。次いで、ジゴキンケニンに対するＰＯＤ標識抗体の 溶液を添加する。約６０分後、液体を再度廃棄し、キュベツトをもう１回洗浄す る。次いで、ＡＢＴＳ”溶液を添加し、着色を豹４Ｑ５ｎｍで測定する。

本発明の方法では、ポリメラーゼに対するプロモーターの長さもしくは存在また はポリメラーゼのタイプは固相での検出可能なモノヌクレオチドの量または存在 に従う。

検出可能および固定化可能なモノヌクレオチドを取り込むための条件が個々のポ リメラーゼまたはポリメラーゼ・サブタイプについて異なる場合、個々のプロモ ーター間で区別できる。故に、本発明の方法は、選択的方法である。例えば、１ つのポリメラーゼ・サブタイプのプロモーターを別のポリメラーゼ・サブタイプ のプロモーターの存在下で測定することができる。■型の真核ポリメラーゼは異 なるプロモーター・タイプを認識する異なるサブタイプ（ＲＮＡ−ｐａｌ　Ｉ、 ■、ＩＩＩ）に存在する。そして、次に、各々個々のポリメラーゼ・サブタイプ はさらなる因子への依存性において異なるプロモーターを認識する。

本発明の別の課題は、ポリメラーゼに対する抗体の検出のための試薬キットであ る。該試薬キットは、鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および少なくとも１ つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および検出されるべき抗体を指向す るポリメラーゼを含有する。好ましいさらなる成分は添加剤、および、所望によ り、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該三リン酸エステルを含有す る核酸を選択的にかつ実質的に完全に結合する容器または他の固相である。好ま しい方法では、少なくともポリメラーゼは分離容器中で利用可能である。

第１図は２種類のウィルス溶解物濃度に関する抗ＨＩＶ陽性および抗ＨＩＶ陰性 血清（１：４０）によるＲＴ抑制のパーセント（横座標）を示す。

第２図は組換えＲＴ（約１　：　２７０００）に関する抗ＨＩＶ陽性および抗Ｈ ＩＶ陰性血清（１：　４０）によるＲＴ抑制のパーセント（横座標）を示す。

第１図および第２図におけるｎは血清の数を表す。

以下の実施例は非常に詳細に本発明を説明する。

ＨＩＶウィルス培養物の細胞を含まない上清またはライスル単離体溶液２〜３ｍ ｌを得る。次いで、２００００ｇで２時間、超遠心して、細胞オルガネラおよび （陽性の場合）ウィルス粒子のベレットを形成させる。

ｂ）ペレット化ウィルスの溶解 べ１ノツト化ウイルスを溶解緩衝液４０μｌに溶解する。溶解緩衝液１．４−ン チオエリトリトール（ＤＴＴ、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダームスタット）２．５ 冨Ｍ： ＥＤＴＡ（メルク、ダームスタット）　０．７５翼Ｍ：ＫＣ１（メルク、ダーム スタット）８０ｍＭ；トリスＨＣ／（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））　５０ｍＭ；ｐＨ８，０（２２℃） トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ”）　Ｘ−１００（ジグ７　（Ｓ　ｉｇｍａ）、セント ・ルイス）　０５％別法としては、ウィルス含有上清３５μｌに８倍に濃縮した 溶解緩衝液５μｌを添加することもできる。

２℃で、このウィルス溶解物は活性を有意に低下させずに約１週間貯蔵され得る （溶解物を乾燥から保護する）。

Ｃ）インキュベーション／ポリメラーゼ反応以下の組成の溶液２０μｌを前記溶 解物に添加する。

ＤＴＴ　１０冨Ｍ： ＫＣｌ　２９０露Ｍ： ＭｇＣｈ　３０菖Ｍ； ｄＴＴＰ　８．３μＭ； ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム、Ｃａｔ、Ｎｏ、　１　 ０９３０７０）　１２５ＤＭ； ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム、Ｃａｔ、Ｎｏ、１　０９ ３　０８８）　２．５μＭ。

ポリアデニル酸・ペンタデカチミジル酸（ポリＡ）・（ｄＴ）＋ｓ（ベーリンガ ー・マンハイム、Ｃａｔ、Ｎｏ、１０８　６７７）　７００Ｕ／ｌ［３５μｇ／ ｍｌ］　；トリス（Ｔｒｉｓ）　５Ｑ＋ｓｍｏｌ／Ｊ　ｐＨ８，０（２２℃）。

該混合物を３５℃で９０分〜２４時間および所望の試験感度に応じてさらに長イ ンキュベーション後、該反応混合物をストレブタビジン被覆９６ウエルＥＬＩＳ Ａ’７’レート（ＥＰ−Ａ　Ｏ３４４５７８１：従って製造した、ＳＪｉ約２０ ｎｇビオチン／ａｄ、すなわち、６０μｌ中ビオチン約１．２ｎｇ）のウェルに 移し、次いで、３５℃で６０分間インキュベートする。

ｅ）紗 次いで、該ウェルを洗浄溶液（塩化ナトリウム０．８５ｍｏｌ）で５回洗浄する 。次いで、該ウェル中に残存する溶液をプレート上でタッピングして除去する。

ｆ）ＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体によるインキュベーション以下の組成のコ ンジュゲート溶液２００μ！をウェルの各々にピペットで移す：抗ジゴキンゲニ ンーＰＯＤ（Ｆａｂ断片、Ｃａｔ、Ｎｏ、１　２０７　７３３、ベーリンガー・ マンハイム）　２００Ｕ／ｌ。

トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　０．５％塩化ナトリウム　０．８５Ｍ ０．１ｍｏｌ／Ａ’リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５中。

該コンジュゲート溶液を６０分後にデカントし、ウェルを洗浄溶液（ＮａＣＪＯ ，８５Ｍ）で５回洗浄する。

ｇ）比色反応 ＡＢＴＳ’緩衝液（Ｃａｔ、Ｎｏ、１　１１２５９７、ベーリンガー・マンハイ ム）中１９／ｌ基質溶液（ＡＢＴＳ’　（２，２−アンノーン−［３−エチルベ ンゾチアゾリンスルホネート（６））］　［５ｉｃｌ）　２００μｌをウェルの 各々にピペットで移す。３５℃でさらに６０分間反応を生じさせた後、４５０Ｄ ｍに対して４０５Ｄｍで光度計で着色を測定する。

ｈ）試験の感度 本発明の方法の感度は、陽性対照（天然Ｔ細胞の連続培養物を生産するウェルの 上渭約２１７からのペレット化ＨＩＶ−Ｉ−粒子の溶解物）の微量試料の連続希 釈で試験した。

第１表 ウィルス希釈　ＯＤ４０５ｎｍ　ウィルス希釈　ＯＤ４０５ｎｍ１：５　＞２． ５００　１：２５　１．９００＞２．５００　＞２．５００ ＞２．５００　＞２．５００ ＞２．５００　＞２．５００ ＞２．５００　１．８４７ ＞２．５００　１．６９１ ＞２．５００　＞２．５００ ＞２．５００　１．９３５ １：５０　０．７３０　１：１２５　０．６０２０、８６８　０．６３３ ０、７９３　０．５９９ ０、８８０　０．６１３ ０、８１２　０．５０６ ０、８３８　０．４９６ ０．７６９　０．４５３ ０、９９０　０．４５５ １・２５０　０．３５０　１：５００　０．２４３０．３４８　０．２２８ ０、３４０　０．２７４ ０．４０４　０．２５２ ０、３０７　０．２４７ ０．３０８　０．２３０ ０．２４２　０．１６３ ０．２４５　０．１４７ 陰性対照　ＯＤ４０５ｎｍ　ブランク　ＯＤ４０５ｎｍ１：２　０．１３０　０ ．０７２ ０．１６０　０．０７５ ０、１３８　０．０６８ ０．１１９　０．０９０ ０．１３３　０．０８３ ０．１８７　０．０７３ ０．１２１　０．０６５ ０、１８３　０．０７１ ０Ｄ”４５０Ｄｍに対して４０５Ｄｍで測定した光学密度。

ブランクズ未反応基賞の光学密度。

上記測定値は、興なる日に行った４つの実験の最小値で得られる。試験の間で、 使用する反応混合物を一２０℃で貯蔵した。興なる日に調製した少な（とも２つ のバッチを使用した。最大シグナル（ＯＤ＞２．５）は、１：５の希釈までで規 則的に、１：２５の希釈まででさえ幾つかの試験操作で生じた。該シグナルの連 続減少および希釈の同時増加すると、リバーストランスクリプターゼの検出限界 は、９０分間の反応時間後、約１　：　５００の希釈で到達される。２４時間の 反応時間について、該制限は、１　：　３０００〜１　：　７５００の希釈であ る（感度は６〜１５倍高い）。異なる試験操作におけるＯＤ値間の偏差は典型的 には２未満の因子においてである。慣用の方法と比較して、反応時間９０分を有 する新規試験は、少な（とも慣用の方法と同様に感度が高（、より簡単な取り扱 いによって区別される。さらに、慣用の方法と比較して、本発明の方法のこの特 異性は、少な（とも２４時間まで反応時間を延長し、故に、非常により高い感度 を得る。溶解された赤血球由来のヘモグロビンまたは細菌で塊状に汚染される試 料でさえ、限界を超えるブランクを示さない。種々のウィルス単離体溶液（約３ 冨ｌ上清のペレット）の直接比較において、新規な方法はその高い確実性で確侶 される。

実施例２ リバーストランスクリプターゼの検出方法およびそれらのポリメラーゼへの可能 な抑制効果について試料を試験する方法実施例１と同様に、この試験はリバース トランスクリブターゼに関する試験に基づいている。

ａ）試料調製 抑制剤の存在について試験されるべき試料は、一般に、純粋なりＭＳＯ（ジメチ ルスルホキシド）中１〜１０ｕ／Ｉの濃度で溶解される。これらの貯蔵溶液は、 ＲＴ−緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ％ｐＨ７，９；　５０ｇＭ　ＫＣＩ ；　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ；１■Ｍ　ＤＴＴ）で希釈することによる希釈（通常、 ２０〜２００倍希釈）に基づ該試験はストレプタビジン被覆９６ウエルーＥＬＩ ＳＡプレート（ＥＰ−Ａ−０３４４５７８に従って製造した）において直接行わ れる。

プレートのウェル中に以下の溶液を連続してピペットで添加する：陽性対照に関 する希釈試料溶液またはＲＴ−緩衝液　２０μ１ＲＴ−緩衝液　２０μ１ ＲＮＡ−鋳型（ＨＩＶ−ＬＴＲ−５°−ｇａｇ断片）１μ９および以下の配列： 配列番号１（５’−ＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ−３’）の１８−＋ ＋＋ｅｒＤＮＡ−プライマー２１．３ｎｇからなる鋳型／プライマー錯体（水浴 中、６６．５℃で５０倍濃縮形態で混合物状態の同成分をインキュベートした後 、該混合物を３０℃にゆっくりと冷却し、該混合物をＲＴ緩衝液で１０倍に希釈 する）　２０μｌ均買に精製されたイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）においてクロー ン化および発現される公知の方法に従って製造され（ヘテロダイマー、ｐ６６／ ｐ５１、サイエンス（ＳｃｉｅｎｃｅＸ１９８６）、２３１　：１２８９−１２ ９１）、ＲＴ−緩衝液中１μＧ／菖ｌの濃度で溶解した、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＴ　２ ０μ！以下の成分からなる反応開始溶液　２０μＩ！：ＲＴ−緩衝液（前記参照 ） ５ｎＭ　ｄＡＴＰ ５ｎＭ　ｄＣＴＰ ５ｎＭ　ｄＧＴＰ ５ｎＭ　Ｄｉｇ　１ｌ−ｄＵＴＰ ｏ、２５μＭ　ビオチン−１６−ｄＵＴＰｏ、１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｒ）　Ｐ　４０　（ピアス（Ｐ　１ｅｒｃｅ）、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２８３２４ ）。

Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼの助けをかりてイン・ビトロ転写によって公知の方 法に従って、鋳型として供される１０７８塩基長さのＨＩＶ−ＬＴＲ−５°−ｇ ａｇＲＮＡ断片を調製した。

次いで、該混合物を、３７℃で１時間、水浴中、平坦な底部を有する微量滴定プ レート（結合ビオチンを結合するための許容量的２０ｎｇ／ｍｌ、すなわち、１ ００μ！中ビオチン約２　ｎｇ）においてインキュベートする。この微量滴定プ レートはＥＰ−Ａ−０３４４５７８に従って製造された。該微量滴定プレートを 接着ホイルで被覆する。

Ｃ）該ウェルを５回、毎回、洗浄溶液（ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳ（Ｃａ ｔ。

Ｎｏ、２１０３４０、ベーリンガー−７ンハイム）、Ｔｗｅｅｎ　２０（Ｃａｔ 、　Ｎｏ、　１７０−６５３１、パイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、０．０５ ％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））　０．３　ｍｌで洗浄する。

ｄ）１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｐＨ７，９；　１５ＣｂＭ　ＮａＣ１の溶 液中に含有される抗ジゴキシゲ＝ンーＰＯＤ（Ｆａｂ断片、Ｃａｔ、Ｎｏ、１　 ２０７　７３３、ベーリンガー・マンハイム）１００μｌを各ウェルに添加する 。室温で３０分間インキュベーションを行う。

ｅ）各ウェルを５回、各洗浄工程について洗浄溶液０．３ｍｌで洗浄する。

ｆ）以下の溶液１００μｌを各ウェルに添加する・ＡＢＴＳ”緩衝液中ＡＢＴＳ ”１ｇ／７（Ｃａｔ、Ｎｏ、１　１１４　４９７、ベーリンガー・マンハイム） 。

次いで、該溶液を室温で２０〜３０分間振盪しつつインキュベートし、次いで、 ＥＬＩＳＡ−光度計（ＭＲ５０００、ダイナチック（Ｄ　ｙｎａｔｅｃｈ）、参 照フィルター６３Ｏｎ１ｍ）で４０５ｎｍで着色を測定する。４Ｑ５ｎｍでの着 色が遅延または消失する場合にはポリメラーゼ抑制剤が存在する。

実施例３ ＤＮＡ上の特異的なりＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ−ポリメ ラーゼに関する特異的なプロモーター配列の検出５Ｐ６−ＲＮＡ−ポリメラーゼ 、Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼまたはＴ３−ＲＮＡ−ポリメラーゼに関するプロ モーターを含有する３つのＤＮＡ断片は、転写反応においてリボヌクレオチドの 混合物と一緒にインキュベートされる。後者は、ＤｉｇＵＴＰおよびＢｉｏＵＴ Ｐならびに５Ｐ６−ＲＮＡ−ポリメラーゼまたはＴ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼも 含有する。プロモーターおよびポリメラーゼが特異的に適合する両アッセイでは 、ヌクレオチドはＤＮＡに相補的であり、ＲＮＡ−鎖に取り込まれる。インキュ ベーション後、該反応溶液をストレプタビジン被覆９６ウエルＥＬＩＳＡプレー トのウェルに移す。取り込まれたビオチン残基および取り込まれなかったビオチ ン残基はストレブタビジンに結合するであろう。ＲＮＡ−ポリメラーゼ活性は、 抗ジゴキシゲニン抗体の助けをかりてビオチン−ヌクレオチドに共有結合される ジゴキシゲニンーヌクレオチドまたはジゴキシゲニンーハプテンを検出すること によって検出され得る。したがって、ポリメラーゼに対して特異的なプロモータ ーを検出することができる。

ａ）転写反応 鋳型−ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＡ’）　Ｉμｉ’（１００ｎ９）Ｄｉｇ−Ｂｉｏ −ヌクレオチド−Ｍｉｘ　１０ｘ　２ｕｌＲＮＡｓｉｎ（５０Ｕ／μＪＳＣａｔ 、Ｎｏ、７９９０１７、ベーリンガー・マンハイム）０．５μ１（２５Ｕ）転写 緩衝液１０×　２μ！ ファージ−ＲＮＡ−ポリメラーゼ　Ｘμ１（２０Ｕ）Ｈ２Ｃ全量２０μｌまで ２０μ！ 鋳型−ＤＮＡ： 適当なプロモーター配列を含有するプラスミドを制限酵素によって切断し、アガ ロースゲル上で電気泳動によって分離した。プロモーターを含有するＤＮＡ断片 を該ゲルから溶離し、鋳型−ＤＮＡとして使用した。

ａ）ＳＦ３−プロモーターを有する鋳型ｐｓＰＴ１８プラスミド（Ｃａｔ、Ｎｏ 、９０９　７９３、ベーリンガーー７ン／＼イム）をＥｃｏ　ＲＩ　＋　Ｓｓｐ 　Ｉで消化し、９５１ｂｐの断片を単離した。転写物の長さ＋５８ｂ０ ｂ）Ｔ７−プロモーターを有する鋳型 ｐｓＰ７１８プラスミド（Ｃａｔ−Ｎｏ、９０９　７９３、ベーリンガー−７ン ハイム）をＨｉｎｄ　ｍ　＋　Ｓｓｐ　Ｉで消化し、２２０４ｂｐの断片を単離 した。転写物の長ｐＴ３Ｔ７１ａｃプラスミド（Ｃａｔ、Ｎｏ、１　０１４６９ ２、ベーリンガー・マンハイム）をＥｃｏ　ＲＩ　＋　Ｓｃａ　Ｉで消化し、１ ８１５ｂｐの断片を単離した。転写物の長さ＋６０ｂ。

Ｄｉｇ−Ｂｉｏ−ヌクレオチド−Ｍｉｘ　ｌＱｘ：１００肩Ｍ　ＡＴＰ　５μｌ 　（１０麿Ｍ）１００層Ｍ　ＧＴＰ　５μｌ　（１０１Ｍ）１００冨Ｍ　ＣＴＰ 　５μｌ　（１０諷Ｍ）１００１Ｍ　ＵＴＰ　３．２５μＩＶ　（６，５１Ｍ） １ｍＭ　Ｂ１ｏ−１ｌ−ＵＴＰ　８．７５ｕｌ　（１７５ｎＭ）１０諺Ｍ　Ｄｉ ｇ−１１−ＵＴＰ　１６．５μＩ　（３，３１Ｍ）ＩＭＴｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ ７，９）　４００ｔｔｌ　（４０（ｂＭ）Ｉ　Ｍ　ＭＦＩＣｌｚ　６０μｌ　（ ６０鳳Ｍ）ＩＭＤＴＴ　１００μｌ　（１００厘Ｍ）１Ｍスペルミジン　２０μ ｌ　（２０寓Ｍ）Ｈ２Ｏ４２０μ１ １菖ｌ ファージ−ＲＮＡ−ポリメラーゼ： ５Ｐ６−ＲＮＡ−ポリメラーゼ、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８１０２６６、ベーリンガ ー・マンハイム Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼ、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８８１　７６７、ベーリンガ ー・マンハイム ４ｍＭを超えるスペルミジン濃度を有するＤＮＡが沈殿できるので、１０ｘ−転 写緩衝液を、酵素の添加の直前に添加した［クリーグ、ピー・エイ（Ｋｒｉｅｇ 、　Ｐ。

Ａ、）、メルトン、ディ・エイ（Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ、　Ａ、　Ｘ　１９８７　 ）、メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　）　１５ ５コ。Ｈ，ＯをＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）で処理してＲＮ　Ａ　ｓ ｅｓを不活性化した。

３０℃で２時間インキュベーション ［クリーグ、ピー・エイ（１９９０）　：ヌクレオチド・アン・ソズ・オブ・リ サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１８．６４６３の後］。

ｂ）微量滴定プレートにおける転写物のストレブタビジンへの結合転写反応をＴ Ｅ（１０ｍｍｏｌ／Ａ’　ＴｒｉｓＨＣｊｌ！、１ｍ＋ｍｏｌ　ＥＤＴＡ、ｐＨ ８，０）で１００μｌに充填した。希釈した転写反応２０μｌの一部分をストレ プタビジン被覆９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ＥＰ−Ａ−０３４４５８７に従 って製造）の平底ウエルニヒヘットテ移し、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔ＋ ｗｅｅｎ　２０溶液１８０μｊ’を添加した。全ての以下の結合および反応工程 の間、該プレートを蓋で覆った（ヌンク（Ｎ　ｕｎｃ）、Ｃａｔ、Ｎｏ、２６３ ３３９）。

結合は、１時間、振盪しつつ３７℃で行う。

未結合反応成分を、６回の洗浄工程で、各工程で０．９％ＮａＣｊ！溶液３００ μｌを使用して、除去する。

Ｃ）抗ジゴキシゲニンー抗体コンジュゲート体による検出および着色反応実施例 １の記載に従って、抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ（２０００／１ＳＣａｔ、Ｎｏ。

１２０７７３３、ベーリンガー・マンハイム）２００μ！を添加する。６０分後 、毎回０．９％ＮａＣ１溶液を使用して６回の洗浄工程を行う。実施例１の記載 に従って、基質溶液（ＡＢＴＳ”）２００μｌを、３７℃で、５〜６０分間ウェ ル中でインキュベートし、着色を４０５止で光度計で測定する。

実施例４ 患者の血清中でのＨＴＶ−ＲＴに対する抗体の検出、該抗体はＲＴの機能への抑 制効果を有する。

この検出は、ＨＩＶ感染に関する予後因子として供し、興なる種類のＨＩＶ（Ｈ ＩＶＩおよびＨＩＶ２）間での区別に供し得る。

希釈血清（溶解緩衝液中１：１０．実施例１を参照）１０μｌをポリメラーゼ（ ウィルス溶解物または一般に処理されたリバーストランスクリブターゼから得ら れる）３０μｌに添加し、ＩＸ濃縮溶解緩衝液中に希釈し、３５℃で６０〜９０ 分間インキュベートする。次いで、反応溶液（実施例１のＣに記載された）２０ μｌを添加し、３５℃で２４時間インキュベートする。残りの方法は、実施例１ の記載と同様である。該試料がリバーストランスクリプターゼの機能を抑制する 抗体を含有する場合、シグナルは抑制されるかまたは部分的に低下させられるで あろう。

ＲＴ抑制抗体を含まない血清試料は、使用されるＲＴの量に相当するシグナルを 生成する。

ａ）予備試験： 最適な血清およびウィルス濃度を測定するためにい（つかの試験を行った。これ らの試験では、各々、１：３２および１：６４に希釈した６つのＨＩＶ−１−陽 性およびＨＩＶ−陰性血清を、１：２５０に希釈した標準的なウィルス溶解物（ ＨＩＶ−１感染Ｈ９−細胞のウェル生産細胞培養物の上清約１＠ｌから溶解され たＨＩＶ−１）ｔ’試験した。別の試験では、各々、１：３２．１：６４および １゜１２８の濃度に希釈した３つのさらなるＨＩＶ−１−陽性およびＨＩＶ−陰 性血清および各々、１　：１２５．１：２５０および１：５００の標準的ウィル ス溶解物希釈液を試験した。一般的に処理した（組換え）ＲＴ（ミクロゲン（Ｍ ｉｋｒｏｇｅｎ）、ムニッヒ、ＦＲＧ）の調製物の異なる希釈液によるさらなる 試験も行った。最適なポリメラーゼ希釈は、試験が開始される前にＲＴ−抑制能 が特徴付けられた血清の助けで判明した。組換えＲＴの約１　＋　２５０００の 希釈が最も適していると証明された。

得られた値は全ＨＩＶ−１陽性血清によるＲ７機能の有意な抑制を示したが、一 方、ＨＩＶ陰性血清によるＲ７機能は損なわれた。相対的なシグナル抑制は、１ ：３２および１：６４の血清希釈液で最も明確である。本発明者らの標準的なウ ィルス溶解物の理想的な希釈は１　：１２５〜１＋２５０間の範囲であることが 判明した。

ｂ）患者の血清による試験原理の確認 予備試験からの体験に基づいて、各々１：４０に希釈した３４個のＨＩＶ−１− 陽性血清および２６個のＨＩＶ−陰性血清を２つのバッチで試験した。１つのバ ッチは１：１２５に希釈したウィルス溶解物を有しており、別のバッチは１：２ ５０に希釈したウィルス溶解物を有する。結果を第１図に示す。さらに試験原理 を確認するために、多量の血清（９８個の抗−ＨＩＶ−１−陽性血清および７６ 個の抗−ＨＩＶ−陰性血清）を、組換えＲＴ（希釈約１　：　２７０００）によ って抗体を抑制することについて試験した。組換えＲＴで得られた全体的な結果 を第２図に示す。

ｃ）ＲＴ抑制抗体の予後値を確立するための試験１３２個の抗−ＨＩＶ−１−陽 性血清の幾つかから、本発明者らは患者（無症候性ＬＡＳ／ＡＲＣ，ＡＩＤＳ） の臨床症状を知り、幾つかから本発明者らは血清または血漿を用いてｐ２４−抗 原−ＥＴＡ（アポ・ソト・ラボラトリーズ（Ａ　ｂｂｏｔｔＬ　ａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）、ノース・シカゴ、ＵＳＡ）で得られた試験結果を知った。第３のグ ループでは、ウェスターン・プロット（ＷＢ）における反応ノくターンを使用し て、異なる症状間で区別することができる；すなわち、血清変換（初期感染）後 、有意でない抗体プロフィルを有する患者は抗−９２４レベルの増加および後期 を開始する。ＲＴ−抑制血清抗体の予後値を試験するために、血清の割合は５０ ％を超えるＲＴ−抑制であり、平均ＲＴ−抑制は全てのグループの比較で計算さ れた（第２表を参照）。

実施例５ ＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性の検出任意にプライムされた標識化反応 で、熱変性ＤＮＡ断片およびプライマーとして供し得る全ての可能な配列の六量 体からなる六量体の混合物と一緒にフレノウ−ポリメラーゼをインキュベートす る。非標識ヌクレオチドに加えて、ポリメラーゼはまたＤＩＧｄＵＴＰおよびＢ ｉｏｄＵＴＰを取り込む。ポリメラーゼ活性によって生産された二重標！ｌＤＮ Ａは、次に、ストレプタビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートにおいて定量的に測定さ れ得る。

ａ）反応混合物： ＆さ３５６ｂｐｃＤＤＮＡ断片２ｕｑを、Ｈ２Ｏ１５ｕｌ中で９５℃で１０分間 変性させ、次いで、直後に氷上に置（。これらの１５μｌに以下の成分をピペッ ト添加する。

１０ｘ反応緩衝液（ランダム・プライムド・ディ・エヌ・エイ・ラベリング・キ ット（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｋｉｔ）か ら、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１００４７６０、ベーリンガー・マンハイム）　２μ１ １０ｘヌクレオチド−Ｍｉｘ　２ｔｔｌクレノウー酵素（ランダム・プライムド ・ディ・エヌ・エイ・ラベリング・キットから、Ｃａｔ、Ｎｏ、１００４７６０ 、ベーリンガー・７：／／゛イＡ）　Ｉ　ｌ１１ １０ｘヌクレオチド−Ｍｉｘ：　ｄＡＴＰ　２ｍＭｄＣＴＰ　２冨Ｍ ｄＧＴＰ　２属Ｍ ｄＴＴＰ　１．７５舅Ｍ ＤＩＧｄＵＴＰ　Ｏ，２５露Ｍ ＢｉｏｄＵＴＰ　１２５ｎＭ 反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で１＝１０に希釈する。

対照反応は、混合物がＢｉｏｄＵＴＰを含有しないこと以外は同一の方法を行う 。

ＴＥ−緩衝液２００μｌに含有される、標識反応に使用されるＤＮＡ断片の、各 々、２０ｎｇおよび６０ｎｇを含有する希釈反応混合物２μ！および６μ！の一 部分を、ストレプタビジン被覆微量滴定プレートに移し、３７℃で１時間インキ ュベートする。

次イテ、該プレートを０，５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｖｅｅｎ　２０を有するＰ ＢＳ−緩衝液３００μｌで３回洗浄する。

次いで、抗−ジゴキシゲニン−ＰＯＤ（１５ＣｈＵ／ｍｌ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、 　１２０７７３３、ベーリンガー・マンハイム）２００μｌを添加する。１時間 後、各々、０゜５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｖｅｅｎ　２０を有するＰＢＳ−緩衝 液３００μ！で、あと３回の洗浄工程を行う。次いで、前記実施例に従って、Ａ ＢＴＳ’−基質溶液２００μｌを添加し、３０分のインキュベーション期間後、 ４０５止で着色を測定する。

配列番号１： 配列の長さ：　１８塩基 配列の型：　ヌクレオチド 鎮の数：　−末鎖 トポロジｍ：　直鎖状 ＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ患者の血清の数 ＲＴ−抑制（％）　−１０−２０−３０−＠ｏ　−５０−５０−７０，−１３０ −９０−４００四　抗−Ｈ１ｙ　−陽性１！−＠（Ｄｄｎ清０数ＲＴ−抑制（％ ） 要　約　書 ポリメラーゼを、鋳型核酸、１つの検出可能なモノヌクレオシド三リン酸および １つの固定化可能なヌクレオシド三リン酸と一緒にインキュベートし、固相に固 定化可能なヌクレオチドを結合し、結合された検出可能なヌクレオチドを検出す ることによるポリメラーゼ活性の測定方法およびそれに基づいた試験。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．鋳型核酸および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸と一緒にポリメラーゼ を含有する試料をインキュベートし、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から 該核酸を分離し、該核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する工程か らなり、さらに、インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレオシド三 リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および 該固定化可能なモノヌクレオチドを取り込む核酸を選択的および実質的に完全に 結合する固相に接触するかまたは接触させられることを特徴とする、ポリメラー ゼ活性の測定方法。
2. ２．鋳型核酸がＤＮＡであり、それがポリメラーゼに対して特異的であるプロモ ーターを含有し、モノヌクレオシド三リン酸がリボヌクレオシド三リン酸である 請求項１記載の方法。
3. ３．鋳型核酸がＤＮＡであり、さらに、オリゴヌクレオチドがインキュベーショ ン混合物に添加され、該オリゴヌクレオチドが鋳型核酸の一部分に実質的に相補 的であり、モノヌクレオシド三リン酸がデオキシリボヌクレオシド三リン酸であ る請求項１記載の方法。
4. ４．鋳型核酸がＲＮＡであり、モノヌクレオシド三リン酸がデオキシリボヌクレ オシド三リン酸である請求項１記載の方法。
5. ５．鋳型核酸がＲＮＡであり、かつプライマー構造を含み、モノヌクレオシド三 リン酸がリボヌクレオシド三リン酸である請求項１記載の方法。
6. ６．ポリメラーゼ抑制剤がインキュベーション混合物に添加される請求項１記載 の方法。
7. ７．ポリメラーゼがリバーストランスクリプターゼである請求項４記載の方法。
8. ８．リバーストランスクリプターゼがＨＩＶ粒子由来である請求項７記載の方法 。
9. ９．分離容器に、 鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および少なくとも１つの固定化可能なモノ ヌクレオシド三リン酸、 固定化可能なモノヌクレオチドが選択的かつ実質的に完全に結合され得る容器、 および 洗浄溶液 を含有するポリメラーゼ活性検出用試薬キット。
10. １０．別の容器に検出可能なモノヌクレオチドの検出用試薬を含有する請求項９ 記載の試薬キット。
11. １１．固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有することを特徴とする、鋳 型核酸および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有するポリメラーゼ活性 検出用試薬。
12. １２．ＨＩＶが存在すると予測される試料から溶解物が調製され、この溶解物に 、鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および１つの固定化可能なモノヌクレオ シド三リン酸および添加剤が添加され、あるインキュベーション期間の後、該混 合物が、固定化可能なモノヌクレオチドおよび該モノヌクレオチドを含有する核 酸を選択的かつ実質的に完全に結合する容器に移され、 過剰の検出可能なモノヌクレオシド三リン酸が分離され、結合された検出可能な モノヌクレオチドが検出されることを特徴とするＨＩＶ検出方法。
13. １３．溶液中、鋳型核酸およびモノヌクレオシド三リン酸の存在下でポリメラー ゼと一緒に物質をインキュベートし、 得られた核酸の量を検出することからなり、インキュベーション溶液が１つの検 出可能および１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有し、 過剰の、取り込まれない検出可能なモノヌクレオシド三リン酸由来の核酸であっ て、該核酸が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該モノヌクレオシド 三リン酸が取り込まれる核酸を選択的かつ実質的に完全に結合する固相に接触さ せられることを特徴とする、物質のポリメラーゼ活性への抑制効果の測定方法。
14. １４．検出されるべき抗体を含有する試料を、鋳型核酸、検出可能なモノヌクレ オシド三リン酸およびポリメラーゼと一緒にインキュベートし、得られた核酸を 検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から分離し、合成核酸に含有される検出可 能なヌクレオチドを検出することからなり、該インキュベーション混合物がさら に固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該 固定化可能なモノヌクレオチドが取り込まれる核酸を選択的かつ実質的に完全に 結合する固相に接触するかまたは接触させられることを特徴とする、ポリメラー ゼに対する抗体の検出方法。
15. １５．検出可能なモノヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼ反応を開始する ためにプロモーター配列を必要とするポリメラーゼと一緒に検出されるべきプロ モーター配列を含有する試料をインキュベートし、検出可能なモノヌクレオシド 三リン酸から該核酸を分離し、該核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検 出する工程からなり、該インキュベーション混合物がさらに固定化可能なモノヌ クレオシド三リン酸を含有し、 該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該 モノヌクレオチドが取り込まれる核酸を選択的かつ実質的に完全に結合する固相 に接触するかまたは接触させられることを特徴とする、プロモーター配列の検出 方法。
16. １６．分離容器中に 鋳型核酸ならびに少なくとも１つの検出可能および少なくとも１つの固定化可能 なモノヌクレオシド三リン酸、 検出されるべき抗体が指向されるポリメラーゼを含有するポリメラーゼに対する 抗体の検出用試薬キット。