SE520315C2 - Förfarande för bestämning av aktiviteten av ett nukleotidpolymeriserande enzym i ett prov - Google Patents

Description

520 315 2 målet vid försöken att finna effektiva antiviraler mot HIV. Många försök har gjorts att finna selektiva hämmare av detta enzym. Även om man ännu inte har hittat någon bot för AIDS uppnår man en värdefull effekt genom att behandla patienter med Bïazido-Sïdeoxi-tymidine (AZT). Det har dock visat sig att behand- ling med enbart AZT på ganska kort behandlingstid (3 månader till 1 år) fram- kallar terapiresistent HIV, med muterat RT. RT-tester används för närvarande för att utvärdera reaktionsmekanismen hos potentiella antiviraler. Ett annat stort potentiellt användningsområde för RT-analys är följaktligen karaktärisering av enzym fi-ån terapiresistenta muterande virus.

Konventionell mätning av RT-aktivitet utförs med enzymet i lösning, en artificiell template/primer-konstruktion och tritierat deoxinukleoid-trifosfat som nukleotidsubstrat (se t.ex. Baltimore 1971, Moon & Lee). Detta system är baserat på att detektera införlivande av radioaktivitet i RNA/DNA-hybrider som kan fällas ut med triklorättiksyra (TCA). Användning av ß-emitterande nukleotider gör att scintillationsvätskor kan användas för att detektera radioaktivitet, men detta leder ofta till dålig reproducerbarhet beroende på utsläckningsproblem.

Standardtestet är förhållandevis arbetskrävande och kan inte enkelt anpassas till storskalig undersökning av ett stort antal prover. Det är också mycket känsligt för effekterna av störande faktorer i enzymprovema. De sistnämnda är ofta den kritiska faktorn för bestämning av RT-aktivitet i extrakt från infekterade cellkulturer eller HIV -infekterade individer. Dessutom utgör aktiviteten av cellulärt gammapolymerasenzym ett potentiellt specificitetsproblem.

Under de senaste åren har den intensiva forskningen avseende HIV gjort att RT-testerna har förbättrats med användning av olika tekniker.

Införandet av 125I-märkt substrat gav bättre känslighet och eliminerade släckning och användning av scintillationsvätskor (Gronowitz m.fl. 1990).

Införandet av templates eller primers kopplade till fasta faser förenklade separationen mellan substrat och produkt, förenklade behovet av fällning med TCA och resulterade i ett "enrörs RT-test" (se t.ex. Gronowitz 1991, Urabe m.fl. 1992). Man har också på flera håll försökt att göra testsystemen mindre känsliga för störande faktorer.

Enligt Porstmann m.fl. 1991 utnyttjas en monoklonal antikropp mot HIV 1- RT, som binds till en brunn i en mikroplatta för att isolera RT före analysen.

Denna metod har dock bara använts för att bestämma RT-aktiviteten i viruspro- ver, som redan har renats genom fällning med PEG och efterföljande centrifuge- ring. Efter immobilisering av RT används dessutom en omständlig procedur för 520 515 3 att separera nukleosidsubstratet och den lösliga märkta produkten. Gronowitz m.fl. 1991 utnyttjar prA/odT, som är bundet till plastbärare, for affinitetsrening av HIV-RT i ett steg direkt från cellextrakt. Samma prA/odT-konstruktion används sedan som primer/template i det eñerfdljande RT-teststeget.

På senare tid har man undvikit att använda radíoaktivitet som markör vid RT-analys genom atti stället använda modifierade nukleotidbaser, som innehåller antigeniska epitoper eller strukturer, som har hög afñnitet för definierade ligander. N ärvaron av dessa epitoper eller strukturer i den nyligen syntetiserade RNA/DNA-hybriden används sedan for att binda antikroppar eller ligander som har konjugerats med Eg ELISA-enzymer. Mängden bundna ELISA-enzymer har sedan bestämts med ett sekundärt enzymtest. Porstmann m.fl., 1991, utnyttjar S-brom-deoxiuridin (BrdU)-trifosfat som nukleotidsubstrat vid RT-analys.

Mängden infórlivat BrdU bestäms i ett andra steg med ett immuntest under användning av monoklonala anti-BrdU-antikroppar.

Beery & Scieb, 1992, mäter infórlivandet av dioxigenin-märkt dUTP i nysyntetiserat DNA i stället for radioaktivt märkt dTTP. För att kunna separera de ej infdrlivade nukleotidema från nysyntetiserat DNA tillsätts också biotin- märkt dUTP till reaktionsblandningen. Efter omvänd transkription immobiliseras det nysyntetiserade dubbelmärkta DNA på streptavidinbelagda ELISA-brunnar och bestäms fotometriskt genom bindning av peroxidaskonjugerade anti-digoxige- min-antikroppar. Denna metod har utort basen for en RT-testsats som salufors av Boehringer, Mannheim.

Urabe m.fl. har utvecklat ett icke-radioaktivt RT-test, som är baserat på infdrlivande av biotin-dUTP i en immobiliserad odT/prA-konstruktion. Mängden infórlivat nukleotidsubstrat mäts fotometriskt efter tillsats av strept-avidin- konjugerat alkalifosfatas (AP).

En annan kommersiellt använd princip för att påvisa RT-akivitet är att utnyttja en serie specifika sonder för att detektera nysyntetiserat cDNA. Denna enzymatiska reaktion utnyttjar en heteropolymer RNA-molekyl med en 20-bas oligonukleotid-primer, som är komplementär med RNA-sekvenserna nära 5'- änden. Under RT-reaktionen produceras en komplett cDNA-sträng. Efter hydrolys av template-RNA hybrídiseras cDNA med två olika oligonukleotidsonder, infång- nings- ("capture") resp. detekteringssonderna. Infángningssonden används för att binda cDNA till brunnar i en mikroplatta. Detekteringssonden konjugeras till pepparrotsperoxidas, vilket ger en färgreaktion efter tvättning for att ta bort oanvänt nukleotidsubstrat och fria sonder. 520 315 4 Ett syfle med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för kvantitativ bestämning av vissa polymerasaktiviteter, vilket undanröjer de flesta av nackdelarna med de tidigare kända metoderna. Ett annat syfte är att tillhandahålla ett kit för specifik bestämning av olika polymerasaktiviteter.

Uppfinníngen avser även användning av nämnda förfaranden och produkter för nya ändamål.

Dessa och andra syften med uppfinningen och hur de uppnås, förklaras och illustreras närmare i den efterföljande beskrivningen och utföringsexemplen.

Uppñnningen illustreras speciellt i samband med bestämning av HIV 1 RT- och Herpes Simplex DNA-polymerasaktivitet, men den kan även tillämpas vid alla högproccessiva polymeraser såsom retro RT, DNA-virus-polymeraser, cellulärt gamma- och delta-polymeras och liknande.

Sammanfattnirg av ggpfinninggg Ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla förfaranden, medel och anordningar för att diagnosticera och övervaka vissa sjukdomar, som är förknippade med retrovirusinfektioner.

Ett annat syfte med uppfinningen är att tillhandahålla ett känsligt testsystem, som kan detektera mycket små mängder av retroviralt RT i kropps- vätskor från människa eller djur, cellprover eller prover från virusföröknings- kulturer, vilket system också är konstruerat så att man minimerar effekterna av de störande faktorer, som förekommer i ovannämnda provtyper. Ännu ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla ett förfarande för att eliminera effekten av de cellulära polymeraserna t.ex. gamma-polymeras, som kan ge olämpligt hög bakgrundsaktivitet vid känsliga RT-tester.

Ett ytterligare syfte med uppfinningen är att detekter andra nukleotidpoly- meriserande enzymer som kännetecknas av hög proccessivitet, vilket utnyttjas enligt uppfinningen.

De ovanstående och andra syften med uppfinningen kommer att förklaras mera detaljerat i den efterföljande beskrivningen av bestämningsmetoden och dess tillämpningar enligt uppfinningen.

Uppñnningen tillhandahåller sålunda ett förbättrat analyssystem för vissa nukleotidpolymeriserande enzymer. Den kännetecknas av att man 1) i ett initialt infångningssteg använder en monoklonal antikropp, som är immobiliserad på en fast fas och har förmåga att binda minst ett enzym utan att menligt påverka enzymaktiviteten, 520 315 2) avlägsnar föroreningar och störande faktorer i ett efterföljande steg, företrädesvis genom att tvätta bort dem, 3) startar reaktionen genom att tillsätta en reaktionslösning, som innehål- ler en primer/template-konstruktion, nukleotidsubstrat och företrädesvis essen- tiella salter och cofaktorer, varvid reaktionsbetingelserna väljs så att de gynnar permanent association mellan antikropp-enzym- och primer/template-konstruk- tionerna, 4) vid behov tvättar bort obehandlat nukleotidsubstrat, primer/template och reaktionslösning och ) pà i och för sig känt sätt bestämmer mängden nukleotider, som har införlivats i den nysyntetiserade polymeren.

Denna bestämning kan ske exempelvis genom radioaktiv märkning, i vilket fall mätningen kan ske direkt, eller exempelvis ha formen av olika typer av modifierade baser, i vilket fall bestämningen kan ske genom sekundära reaktio- ner.

Kärnpunkten i uppfinningen ligger i steget 3. Förutsatt att man använder lämpliga reaktionsbetingelser kommer enzymerna att bindas starkt till pri- mer/template-konstruktionen och den nya märkta sträng som produceras förblir bunden till det immobiliserade enzymet. Detta gör det möjligt att separera substrat från produkt genom ett enkelt tvättningssteg, såsom nämnts ovan.

Kort ritningsbeskrivning Figur 1 visar mängden RT-aktivitet utvunnen på Mab-pärlor som funktion av absorptionstid och temperatur.

Figur 2 är ett diagram, som visar beroendet template/primer (prA/odT) för optimal RT-aktivitet och linjäritet i tiden.

Figur 3 visar linjäriteten med tiden och enzymmängden för RT-infáng- ningstestet.

Figur 4 visar en jämförelse mellan substratkinetiken för fritt resp. immobiliserat HIV 1 RT.

Figur 5 är ett diagram som visar fördelningen av RT-reaktionsprodukten mellan Mab H2-pärlor och reaktionslösning.

Figur 6 är ett diagram som illustrerar processiv DNA-syntes över tem- plate-gränserna vid RT-infångningstest.

Figur 7 är en jämförelse mellan elfekterna av lyrnfocytextrakt på RT- infångningstest resp. lösligt test. 520 315 6 Figur 8 är ett diagram som jämför två produktdetekteríngssystem vid RT- infångningstest.

Figur 9 visar användning av ett infångningstest till mätning av Herpes Simplex typ I DNA-polymeras, varvid de olika symbolerna representerar fyra olika Mab.

Sammanfattning av de i ritningarna illustrerade försöken Resultaten enligt Figur 1 erhölls genom att HIV 1 RT (2,7 x 10 inkuberades vid 8°C (Ü) eller vid 20°C (I) med Mab H2 bundet till pärlor. Bind- ningsbufferten togs bort från Mab-pärlorna vid angivna tidpunkter och fördel- ningen av RT mellan Mab-pärlor och bindningsbufferten bestämdes.

A) RT-infånggingstest: Mab-pärlorna tvättades och den RT-aktivitet som bundits till MAB-pärlorna bestämdes genom en RT-reaktion under 2h med användning av 1,5 x 10'7M av 3H-TTP (60 Ci/mmol) som dNTP-substrat. Redovi- sade data avser cpm som faktiskt utvunnits på varje pärla.

B) Lösligt RT-test i känd teknik; Kvarvarande RT-aktivitet i bindningsbuffer- ten bestämdes vid angivna tidpunkter med användning av ett konventionellt RT- test med 1,5 x l0'7M av 3H-TTP (60 Ci/mmol) som dNTP-substrat. RT-aktiviteten omräknades som procentandel av en kontroll bestående av RT i bindningsbuifert, '15 mol) som förvarats vid 8°C utan tillsats av några Mab-pärlor. vid det i Figur 2 iuustrerade försöket inkuberades Hiv-i RT (1,8 x 1045 mel/prov) med Mab HZ-pärlor under 3h vid 20°C. Mab-pärlorna tvättades sedan och man tillsatte reaktionslösningar som innehöll 1,5 x 10'7M av 3H-TPP (78 Ci/mmol) och olika koncentrationer av prA300 och odTzo. Reaktionslösningarna inkuberades vid 33°C och proverna togs ut efter 2 (I), 4 (D) resp. 16 ( O) timmar.

A) Mängden reaktionsprodukt, som utvunnits från reaktionslösningar innehållande 20 mg prA/ml och angiven mängd av odT20.

B) Mängden reaktionsprodukt som utvunnits från reaktionslösningar innehål- lande angiven prA-koncentration vid användning av ett konstant förhållande prA/odT av 100/ 1.

Resultaten som visas i Figur 3 avser seriespädning av HIV -1 RT från 2,5 x 1046 till 2,6 x 10'13 moler enzym per prov, inkuberade med Mab HZ-pärlor under 3h vid 20°C. MAB-pärlorna tvättades och man tillsatte en reaktionslösning som innehöll 1,5 x 10'7M 3H-TPP (78 Ci/mmol). Reaktionslösningama inkubera- des vid 33°C och proverna togs ut vid angiven tidpunkt.

A) Symboler (mol enzym per prov): 2,5 x 1046 (D), 1,0 x 1045 (O). 4,0 X 1045 »520 315 7 (o), 1,6 x 1o'14, 6,4 x 1044 (e) och 2,6 x 10 B) Symboler (tid i timmar): 2 (I), 4 (Ü), 16 (O) och 32 (O).

Figur 4 visar initiala reaktionshastigheter vid olika substratkoncentra- tioner för HIV -1 RT som bundits till Mab H2-pärlor ( ° ) och för fritt HIV -1 RT (o).

Värdena har erhållits genom att mäta reaktionshastigheten vid tre olika enzym- mängder (1,28 x 1044 mol/prov, 2,56 x 164 mol/prov och 4,52 x 1044 mol/prov) och fem olika substratkoncentrationer (från 1,1 x 10'7M till 3,2 x 10'5M) med infângningstest respektive med konventionell RT-test. Erhállna försöksdata har 0-4 '13 m. omräknats till samma enzymmängd (4,52 x 1 mol/prov).

Diagrammet i Figur 5 visar fördelningen av märkt nyproducerat DNA mellan Mab H2-pärla och reaktionslösningen efter polymeriseringsreaktion.

Mätningarna har orts vid tre olika enzymkoncentrationer (se Fig. 4) och fem substratkoncentrationer (se Fig. 4). Proverna togs efizer 2, 4 resp. 18h. Prover som inte gav linjäritet vid RT-infångníngstestet, beroende på utarmning av nukleosid- substratet, ñck ingå i analysen, medan prover som inte gav signifikant detekte- ring (mindre än tre gånger bakgrunden vid infángningstestet) exkluderades.

Vid det försök som illustreras i diagrammet i Figur 6 inkuberades först HIV-i RT (4,6 x 1o'15 moi/prev) med Mab Hz-pdrier under ah vid 2o°c, ebundet enzym avlägsnades genom tvättning av pärlorna och enzymreaktionen startades genom tillsats av en komplett reaktionslösning som innehöll 7,1 x 1O°7M TTP (12,1 Ci/mmol), prA (20 mg/ml) och odT (200 ng/ml). Mängden tillgängliga A-baser på varje pärla, när alla bundna enzymrnolekyler binder en template (300 baser), motsvarar 8,2 x 1043 mol.

A) Den första reaktionslösningen, som innehöll fri prA/odT, togs bort från pärlorna efter 2 timmars inkubation (vid 33°C) och ersattes sedan med nya lösningar, som innehöll 3H-TTP och de angivna ytterligare komponenterna, prA/odT (O), prA (I), odT (O) ingen (Ü) resp. inget prA/odT mellan 2 och 4h och prA/odT tillsattes efter 4 timmars inkubation (A). Proverna togs ut vid angivna tidpunkter och omräknades till antal moler TMP som införlivats i DNA.

B) Den första reaktionslösningen togs bort från pärlorna efizer inkubation under lh och ersattes med nya reaktionslösningar, som innehöll prA/odT och antingen omarkt TTP (Cl, I) eller 1,8 x 10'5M ddTT (O, O) som trinuklosidsubstrat.

Dessa reaktionslösningar togs bort efizer inkubation under ytterligare 2h (visas inte på x-skalan i figuren) och ersattes med nya lösningar som innehöll 3H TTP och antingen prA (D, O) eller odT/prA (I, O)i standardkoncentrationer. Proverna togs ut vid angivna tidpunkter och omräknades till antal mol införlivat TMP. 520 315 8 Resultaten som redovisas i diagrammet i Figur 7 erhölls genom att rekombinant HIV-1 RT (2,5 x 1044 mel/prov) blandades med angiven mängd extrakt från perifera blodlyrnfocyter och RT-aktiviteten i varje prov bestämdes med RT-infångningstest resp. lösligt RT-test. Symbolerna har följande betydelser: standardinfångningstest (I), infångningstest med 2 mM fenylmetyl-sulfonylklorid (PMSF) och 20 g prA inkluderat under enzymbindningssteget (El), lösligt stan- dardtest (O), lösligt test med tillsats av 2 mM PMSF till reaktionslösningen (O).

Figur 8 visar hur tre spädningar av HIV -1 RT (6,4 x 1046 '15mo1/prov och 6,4 x 10'14 mol/prov) inkuberades med mab H2-pärlor under 3h vid 20°C. Den mängd RT, som bands vid varje enzymspädning, bestämdes med användning av två RT-testsystem. Det ena var ett standardtest med 1,5 x 3'7M 3H-TTP som nukleoisidsubstrat och direkt detektering av infórlivat 3H-TMP. Det andra testet utfördes med BrdUTP som nukleoisidsubstrat och immunologisk detektering av reaktionsprodukten. I båda fallen användes en inkubationstid av 150 minuter vid 33°C för polymerisationssteget. För Ap-reaktionen användes mol/prov, 6,4 x inkubation vid 20°C under 50 minuter.

Sammanfattning av de i Tabellerna redovisade försöken Karaktärisering och selektering av Mab fór RT-infångnings- testet.

Pärlor med immobiliserade monoklonaler inkuberades vid 20°C under 2h med rekombinant HIV -1 RT i bindningsbuffert -/+O,5 M KCl. Mängden infångat RT på Mab-pärlor redovisas som 3H-TMP som införlivats i bundna resp. fria nukleinsyror. Kvarvarande RT-aktivitet i bindningsbuffert utan salt bestämdes Tabell 1. med användning av lösligt RT-test och omräknades till % av en kontroll beståen- de av HIV -1 RT som inkuberats med non-HlV-pärlorna. Förmågan hos varje monoklonal att hämma RT-aktivitet kontrollerades i ett separat försök. Varje ascitesvätska inkuberades med rekombinant HIV l-RT. Kvarvarande RT-aktivitet bestämdes med användning av lösligt RT-test och omräknades till % av HIV -1 RT som inkuberats med non-HIV-ascites.

Tabell 2. Ling' äriteten med tiden i närvaro av cellextrakt.

Angivna mängder rekombinant HIV -1 RT blandades med olika mängder av ett extrakt från perifera blodlyrnfocyter. Utvinningen av RT-aktivitet bestämdes med RT-infångningstestet och korrelationskoefñcientema mellan mängden bildad produkt och försökstiden beräknades. Mängden bildad produkt omräknades också Å . . . > t 520 315 9 till % av utvinningen från en kontroll, som innehöll motsvarande mängd RT men inget cellextrakt.

Tabell 3. Lim' äriteten med enzymmängden i närvaro av cellextrakt.

En uppsättning om sju olika 4-faldiga spädningar av rekombinant HIV -1 RT (från 7,81 x 1047 till 8,00 x 1044 mol/prov) blandades med ett extrakt från 1,00 x l0'6 perifera blodlymfocyter (PBL). Utvinningen av RT-aktivitet bestämdes med RT-iníångningstestet och korrelationskoefficienterna mellan mängden använt enzym och mängden bildad produkt beräknades direkt från erhållna cpm-värden.

För de använda minimi-, median- och maximikoncentrationerna av enzymet omräknades produktutvinningen också till % av utvinningen i en kontroll, som innehöll motsvarande mängd RT men inget cellextrakt.

Infångningstestets förmåga att utvinna HIV-l RT från olika typer av prover.

Olika komponenter såsom antikoaguleringsmedel, Ficol, en proteashäm- mare (PMSF) och cellextrakt tillsattes till bindningsbufferten. Koncentrationerna av antikoaguleringsmedlen var de som används för rutinmässig plasmaprovtag- Tabell 4. ning. Ficol-koncentrationen var 50% av den totala bindningsbufferten och 2 mM PMSF och 20 pg prA användes som skyddande medel. Pärlorna inkuberades under 3h vid 33°C med HIV -1 RT och de olika komponenterna tvättades och den utvunna RT-aktiviteten bestämdes i ett 2,5h test. Erhállna data omräknades som % av en på identiskt sätt behandlad kontroll, utan några tillsatser till bindnings- buñerten. Den övre delen av tabellen visar effekten av angivna komponenter i frånvaro eller närvaro av extrakt från tvättade helblodceller, som isolerats från citratblod och omsuspenderats i bindningsbuffert till hälften av koncentrationen i ursprungligt blod. Den undre delen visar effekten av att angiven typ av cell- extrakt medtagits i bindningsbufferten.

Utforingsexemgel Det här beskrivna RT-infångningstestet ger möjlighet till direkt mätning eller detektering av RT även i orena prover och förenklar den slutliga separe- ringen av substrat och produkt. Testet omfattar tre huvudsteg: först immuno- affinitetsrening av RT, sedan polymerisationsreaktion och slutligen separation av substrat och produkt. -20 315 Selektering av RT-bindande monoklonaler och bindnings- betingelser för immunoreningssteget.

De välkända problemen med mätning av DNA-polymeriserande enzymer i orena biologiska prover är utgångspunkten för de problem, som föreliggande uppfinning avser att lösa. Den ursprungliga tanken var att konstruera ett system för att ta bort HIV RT från varje ogynnsam miljö genom att fånga in enzymet med användning av en immobiliserad antikropp mot enzymet. Störande faktorer såsom RNA-ser, DNA-ser, nukleotidaser, proteaser och konkurrerande templates- primers skulle då enkelt kunna tas bort genom en enkel tvättning av antikropp- bäraren. De optimala antikropparna för detta syfte skulle ha förmåga att snabbt infånga RT i råprover från praktiskt taget alla kända HIV -1-isolat. De skulle vidare också kunna fylla denna funktion utan att menligt påverka den polymeri- serande aktiviteten av RT. Flera forskargrupper har producerat paneler av monoklonaler mot HIV RT (Örvell m.fl. 1989, Restle m.fl 1992, Szilvay m.fl. 1992). En uppsättning om 18 mab screenades beträffande förmåga att snabbt infånga RT från HIV-1 i råprover och interferens med aktiviteten hos det infångade RT-enzymet. De olika Mab-klonerna var reaktiva med sju olika epitoper av HIV -1 RT-proteinet (Tabell 1, spalt II).

Den totala återvinningen av radioaktiv reaktionsprodukt vid infångnings- testet (Tabell 1, spalterna IV -VID är en funktion av både bindningseifektiviteten hos angivna Mab och den slutliga aktiviteten av det bundna enzymet. Förmågan hos varje Mab att infånga RT kan utläsas från Tabell 1, spalt III, som visar kvarvarande obunden RT-aktivitet i bindningsbuiferten efter inkubation med de olika Mab-pärlorna. Effekten av bindningen av varje fri Mab till HIV 1 RT i lösning bedömdes i ett separat RT-hämningstest (Tabell 1: VIII). Mab-pärlan mot epitopen 1, 4, 5 och 6 visade sig inte binda RT på ett tillfredsställande sätt. Mab- pärlor mot epitop 3 kunde binda RT, men det bundna enzymet saknade förmåga att effektivt syntetisera DNA-produkt på grund av partiell hämning av RT- aktiviteten (Tabell 1:VIII). Två Mab mot två olika delar av HIV 1 RT, H2 mot p51 och Q7 mot p15 (Örvell m.fl. 1989) visade sig vara lämpliga för vårt syfte och utvaldes för fortsatta studier. Dessa Mabzs befanns vidare vara icke-konkurreran- de och visade sig ge en additativ effekt vid infångningstestet. En kombination av H2 och Q7 på varje pärla användes för analys av kliniskt material.

Den andel av RT, som utvanns på Mab-pärlorna, var också beroende av absorptionstiden och temperaturen som användes vid bindningssteget, som man kan se i Figur 1. RT inkuberades med Mab HZ-pårlan under angiven tid och vid 520 315 11 två olika temperaturer. Mängden RT-aktivitet på pärlan ökade med inkubations- tiden, vilket medförde proportionell minskning av den återstående obundna RT- aktiviteten i bindningsbufferten (Figur 1).

Polgerisationsreaktionens beroende av primer och template vid infånggingstest Relationen mellan odT primer-koncentration, reaktionshastighet och linjäritet med tiden på Mab H2-pärlor exemplifieras i Figur 2A. Kravet på primer visade ett ganska brett optimum och reaktionshastigheten nådde ett maximum vid 10-1000 ng odT/ml vilket motsvarar 0,1-10 odT 20 primers/template. Använd- ning av mindre mängder primer ledde till minskad reaktionshastighet och även dålig linjäritet i tiden. Om reaktionslösningen helt saknade primer uppstod bara en obetydligt detekterbar reaktion (Figur 2A).

Reaktionshastigheten som funktion av template-koncentrationen vid ett konstant förhållande prA/odT av 10011 visas i Figur 2B. Ett mättat system, i vilket template-koncentrationen inte begränsade reaktionshastigheten och linjäriteten i tiden, uppnåddes när man använde minst 20 mg prA/ml, motsvaran- de 1,08 x 10'8 mol A-baser/rör. Kombinationen av 20 mg/ml prA och 0,2 mg/ml odT20 visade sig vara lämplig som standardbetingelser för vårt RT-infångnings- líßSß.

Utvärdering av de enzvmatiska egenskaperna hos det immobiliserade HIV 1 RT vid infånggingsförsöket Förhållandet mellan mängden bildad produkt och reaktionstiden för RT illustreras i Figur 3A. Enzymreaktionen var linjär åtminstone upp till 16h så länge som man inte använde mer än 1,6 x 1044 mol HIV 1 RT i varje försök.

Högre enzymkoncentrationer leder till substratutarmning vilket gör att tiden för linjär enzymreaktion blir kortare. Vid användning av en analystid som är kortare än 4h och av 1,5 x 10'7 M 3H-TTP (80 Ci/mmol) som substrat observeras ett linjärt förhållande mellan införlivad markör och enzymmängden, upp till 6,4 x 10' 14 mol HIV 1 RT vid varje test (Figur 3B). I Figur 4 visas Menten-diagram, som illustrerar nukleotidsubstratkinetiken för fritt och immobiliserat HIV 1 RT. De initiala reaktionshastigheterna vid fem koncentrationer av TTP, från 1,1 x 10'7 till 3,2 x l0'5, bestämdes med ett konventionellt, lösligt RT-test resp. med RT- infångningstestet enligt uppfinningen, varvid identiskt lika reaktionsbetingelser användes. Fritt HIV 1 RT i lösligt test gav ett Km-värde av 1,21 x 10'6 M, vilket » » ~ 1 . . 520 315 12 kan jämföras med 1,18 x 10'6 M för HIV 1 RT som immobiliserats på Mab 2- pärlor. När reaktionshastigheterna omräknades till lika mängder RT, tillsatta till båda testsystemen (4,52 x 1044 mol/prov, Figur 7), gav fritt och immobiliserat enzym Vsat-värden av 2,04 x 10'9 resp. 1,18 x 10'9 M/min., dvs. Vsat-värdet verkar vara cirka 40% lägre för det immobiliserade enzymet. Man måste dock hålla i minnet att jämförelsen av reaktionshastigheterna enligt Figur 4 är baserad på tillsats av likstora mängder av RT vid varje försök. Bindningen av RT till immobiliserad H2-mab är en tids- och temperaturberoende reaktion. Som framgår av diagrammet i Figur 2 kommer cirka 40% av totalt RT som tillsätts till provet att stanna kvar i lösning vid de bindningsbetingelser, som beskrivs i anslutning i Figur 6 (0,5 M KCl, 20°C och 3h inkubationstid). Nukleosidsubstrat- kinetiken ändras uppenbarligen inte väsentligt genom immobiliseringen av enzymet. Detta gör att RT-infàngningstestet enligt uppfinningen kan användas för karaktärisering av tänkbara antivirala substanser.

Separation av substrat och produkt vid RT-infänggingstest.

I det sista steget av RT-infàngningstestet separeras kvarvarande TTP- substrat från TMP, som införlivats i DNA-produkten, genom en enkel tvättning av bärarkulan. Inte bara substratet, utan också all DNA-produkt som har frisätts från det immobiliserade enzymet under reaktionen, kommer då inte att detekte- ras. Denna faktors inverkan på produktåtervinningen bestämdes genom analys av fördelningen av RT-reaktionsprodukten mellan Mab HZ-pärlor och reaktions- lösningen inom ett brett intervall av produktmängder, såsom illustreras i Figur .

Som man kan se av denna Figur var dessa variabler korrelerade (r = 0,46, m = 45, p < 0,005). Ökning av mängden bunden produkt ledde till ökad mängd i den fria produkten. Den funna kvoten mellan fri och bunden reaktionsprodukt låg mellan 2 x 10'6 och 1,7 x 10"? (medianvärde 2,3 x 10'3). Mängden fri märkt nukleinsyra var dock aldrig större än 1,7% bunden nukleinsyra, detta trots mer än 250-faldig variation av mängden bildad produkt.

Processiv DNA-sfites över template-gränser vid RT-infángginggtest.

En av de mera överraskande egenskaperna hos enzymtestet enligt uppfin- ningen är att praktiskt taget all produkt från enzymreaktionen utvinns som immobiliserat enzym/produkt-komplex. Frisättning av templaten från det 520 315 13 immobiliserade enzymet är uppenbarligen en mycket sällsynt händelse när förlängningsreaktionen väl har startat. När man startar på en primad, cirka 300 A-baser lång template har RT-infångningstestet enligt uppfinníngen förmåga att åstadkomma linjärt införlivande av BH-TTTP under minst 32h. En beräkning av den totala längden av de immobiliserade T-strängar, som produceras under 16h med användning av 4,6 x 1045 mol HIV 1 RT/prov, ger ungefär 11.000 baser. Det är visserligen känt att processiviteten av HIV-1 RT på prA-templates är ovanligt hög (Majumdar m.fl. 1988, Huber m.fl. 1989), men produkten är mer än 30 gånger längre än den använda templaten.

Vid det försök, som illustreras i Figur 6, skapas först ett immobiliserat enzym-primer/template-komplex under 3 timmars inkubation vid 20°C. Efiekten av tillsatsen av reaktionskomponenter bedöms sedan under en andra inkubations- period. Mängden införlivad TMP-produkt per molekyl bundet enzym befanns vid långtidsförsök (16h) för reaktionerna med överskott av prA överstiga den mängd, som är möjlig att införliva vid en enda template (300 A-baser), mer än 30-faldig.

Borttagande av templaten från reaktionslösning reducerade reaktionshastigheten dramatiskt, medan tillsats av ny template återställde hastigheten (Figur 7A).

Enzymreaktionen utnyttjar uppenbarligen fria A-strängar som templates för den växande, immobiliserade pdT-strängen. En tänkbar förklaring av dessa observa- tioner är att reaktionen startar från den initiala primem, fortskrider utmed den första template-sträckningen till template-gränsen. Ãnden av en ny prA-template införlivas sedan i den växande hybriden och enzymreaktionen kommer att fortsätta. Denna sekvens kommer sedan att upprepas för nästa template-gräns och så vidare "i all evighet".

En bekräñelse av denna idé är att det har rapporterats (Hubert m.fl. 1989) att HIV -1 RT har förmåga att bilda långa överskjutande enkelsträngade DNA- strängar över template-gränserna. Samma forskare har också antytt att enzymet förblev bundet till den förlängda prímerns ände.

Det immobiliserade enzymets förmåga att byta primer undersöktes i särskilt försök. Ett immobiliserat enzym template/primer-komplex producerades under en första inkubation. Denna förlängda primer görs oanvändbar genom en andra inkubation med 1,75 x 10'5 M ddTTP. Effekten av tillsats av ny pri- mer/template kontrollerades sedan, efter borttagande av överskott av ddTTP, genom tvättning av det immobiliserade enzymkomplexet. Resultaten visade att praktiskt taget all aktivitet hos det immobiliserade enzymet hade försvunnit och inte kunde återställas genom tillsats av ny prA eller prA/odT (Figur 6B). 520 315 14 Sammantaget visar våra data oväntad hög processivitet för RT-enzymet.

Separatíonen av substrat och produkt är enkel. Tvätta bara kulorna. Detta har möjliggjorts genom att analysbetingelserna har optimerats för att undvika dissociation av enzym-primer/template-komplexet. Viktiga faktorer är använd- ningen av en prA-template, låg jonstyrka och införlivande av en RNas H-häm- mare (t.ex. dextransulfat) i reaktionslösningen.

Jämförelse mellan RT-infånggingstest och lösligt RT-test i närvaro av cellextrakt Rekombinant HIV -1 RT blandades med angivna mängder av ett extrakt av perifera blodlymfocyter och kvarvarande RT-aktivitet bestämdes med RT-infäng- ningstestet enligt uppfinningen resp. lösligt RT-test. Den mängd cellextrakt, som hämmade 50% av RT-aktiviteten, motsvarar cirka 10.000 celler vid det lösliga testet, att jämföras med cirka 50.000 celler vid RT-infångningstestet (Figur 7). En analys av de hämmande effekterna av cellextrakt på infångningstestet avslöjade närvaro av proteolytiska enzymer under RT-bindningssteget. Införlivande av 2 mM fenyl-metylsulfonyl-fluorid (PMSF) och prA (20 g/ml) vid RT-bindningssteget eliminerade de mesta av cellextraktets hämmande effekter på infângningstestet.

Tillsats av samma komponenter till reaktionsblandningen av det lösliga testet hade ingen effekt (Figur 7).

Som man utläsa ur Tabell 4 har RT-infångningstestet liknande förmåga att utvinna RT ur andra typer av cellextrakt. Vad gäller ficol och olika typer av antikoagulationsmedel ger tabellen en indikation pá att EDTA inte är särskilt lämplig för provning av blodceller med RT-infångningstestet.

Tabell 2 visar linjäriteten med tiden i närvaro av cellextrakt. Av tabellen, som analyserar effekten av en konstant mängd av HIV -1 RT, kan man se att produktutvinningen är linjär med tiden upp till l4,5h, förutsatt att extrakt frán högst 500.000 PBL celler/prov finns närvarande. Tillsats av mer cellextrakt ledde till minskad produktutvinning vid långtidsfórsök.

Immunologisk bestämning av reaktionsgrodukten.

Analyssystemet enligt uppfinningen kan kombineras med olika typer av system för produktbestämning. Figur 8 visar en jämförelse mellan vårt standard- system för detektering, med användning av radiomärkt nukleosidsubstrat och ett kolorimetriskt system baserat på Ap-konjugerade rått-antikroppar. Som man kan se i Figur 8 var relationen linjär mellan värdena i de två systemen. Detta visar 520 515 att RT-infångningstestet enkelt kan avpassas för kolorimetrisk produktdetekteé ring. Detekteringskänsligheten i dagens kolorimetriska system är en funktion av inkubationstiden vid RT-test-steget, men också av tiden vid den slutliga Ap- analysen. Od405-värdena i Figur 8 erhölls efter 50 minuters Ap-reaktion.

Starkare signal kunde erhållas vid användning av längre inkubationstid.

Infångningstest för Herpes Simplex typ 1 DNA-pol@eras Fem mus-Mabs som producerats mot herpesvirus typ 1 UL42-polymeras- komplexet (Wilcock 1991) immobiliserades på plastpärlor med användning av samma procedur som beskrivits ovan for anti-HIV-l RT-pärlor. Extrakt från BHK21-13S-celler som infekterats med HSV 1 (stam C42) producerades enligt tidigare känd teknik (Gronowitz och Källander 1980).

Proverna späddes 1:1 i en buffert som innehöll: 10 mM Tris, pH 7,6; MgClz, 4 mM; KCl, 0,15 M; Triton-X 100, 0,5%; och NaN3, 0,05 mg/ml. I det forsta analyssteget inkuberades en uppsättning rör, som innehöll en polystyrenpärla med immobiliserade anti UL42 MAb och 200 ul provspädníngsrör, vid 33°C under 1,5h for att låta MAb binda till ULßIZ-polymeras-komplexet. Pärlorna tvättades sedan fyra gånger med en buffert bestående av 3 mM Tris, pH 7,6 och 0,1% Triton-X 100, för att ta bort störande faktorer härrörande från proverna. I nästa inkubationssteg startades polymerisationsreaktionen genom tillsats av 200 ul av en komplett DNA-polymerasreaktionsblandning per rör, till det immobiliserade MAb-UL42-polymeras-komplexet. Slutkoncentrationerna för de ej hastighets- begränsande komponenterna var som följer: Tris-HCl, 10 mM, pH 7,6; MgClz, 4 mM; KCl, 200 mM; DTE 10 mM; Spermidine, 1 mM; Triton-X 100, 0,5%; GTP, 100 uM; bovint serumalbumin, 0,5 mg/ml. odT22 (1 ug/ml) användes som primer, pdAßoo (io rig/mn som tempiate och 1,5 x 1o'7M av 3H-dTTP (specifik aktivitet 40-80 ci/mmol) som nukleotidsubstrat. Den fortsatta behandlingen av pärlorna utfördes som vid HIV RT-infångningstestet. 520 315 16 Tabell 1 Kvarv. Utvinnglg av infórlivgcjkracitic; RT- RT- akt. efter RT-infånggtest häm- akt. nings- efter test bindn. Mab-gärlor i fria nuklein- kvar. till ggg sgor med: akti- Epi- Mab- Inget Inget vitet top pärlør salt KC1 salt KC1 (%) Klon nr.* (%) (cpm) (cpm) (cpm) (cpm) Spalt I II III IV V VI VII VIII Non-HIV (a- - 100 705 270 543 110 100 urokinas) A1 (940C6) 1 103 1806 501 2480 106 78 Bl (950C11) 1 109 128 126 413 106 69 C2 (1.148F2) 2 85 26650 17509 683 973 60 D2 (1.149B6) 2 51 8893 54436 1200 2753 72 E2 (1.150E2) 2 52 30235 58691 2160 1303 112 F 2 (1.158E9) 2 45 25546 35764 2983 2363 60 G2 (1.158F7) 2 89 14922 10708 4560 543 76 H2 (1.166C2) 2 57 44665 64770 2550 2696 90 J3 (1.151F8) 3 101 1122 282 1066 196 38 KB (1.152B3) 3 55 20827 2759 1073 193 59 L3 (1.158E2) 3 88 3905 497 3636 376 36 M3 (1.163C4) 3 88 3560 2302 2536 476 17 N4 (1.153G10) 4 104 149 23 153 103 75 05 (996E5) 5 94 80 63 1420 220 74 P6 (1.009G9) 6 93 3579 1001 3560 703 129 Q7 ( 1.158E10) 7 60 35591 37476 1810 1230 89 R7 (1.160B3) 7 62 28440 13199 2836 993 61 S7 (1.162D10) 7 70 26469 12210 1683 930 70 H2 + Q7 2+7 45 71097 99309 1136 1456 101 E2 + Q7 2+7 59 66193 75114 2350 2486 109 H2 + R7 2+7 56 65562 72965 3256 1630 73 H2 + S7 2+7 50 63654 79184 2303 1910 ND D2 + Q7 2+7 57 44525 70799 933 2176 76 *Enligt Örvell mil. 1989. 520 315 17 Tabell 2 Linjäritet med tiden i närvaro av cellextrakt Korrelkoeff. mel- Produktutvínning vid lan mängden bil- Mängd RT- Mängd PBL- angiven tid, % av en dad produkt och enzym extrakt kontroll utan extrakt test-tid Kon- mol/prov celler/prov 2,5h 14,5h 38,5h Prov troll 250111014 2,o0x106 94% 49% ND 0,972 0,992 2,50x10'14 1,00x106 86 63 ND 0,984 0,992 2,s0x10'14 50011105 100 100 ND 0,995 0,992 2,s0x10'14 25011105 110 97 ND 0,996 0,992 25011044 1251105 109 105 ND 0,999 0,992 Tabell 3 Produktutv. vid angiven mängd HIV i Konzkoeffl* mellan varje prov (% av cellfrí kontroll) enzym och produkt- Test- mängd om 7,s1x10'17 50021045 s,00x10'14 Prov Kooofoll 108 74 65 0,976 0,991 4 80 70 86 0,991 0,968 16 57 51 86 0,998 0,910 38 14 17 65 0,994 0,810 *Beräknat från sju observationer 520 315 18 Tabell 4 RT-aktivitet efter tillsats av angiven komponent till bindningsbuffert, omräknat som % av kontroll utan tillsats Komponent i bindnings- Ingen Blodceller Blodceller, PMSF, buffert prA RT 100 15 45 RT + PMSF + prA 98 _ 45 RT + EDTA 96 19 40 RT + citrat 68 28 97 RT + heparin 61 55 120 RT + Ficol 112 51 96 Tillsats av angivet cellmaterial blodceller (EDTA) 100 ND 64 211106 PBL (Ficol) 1oo s sz mos PBL (Ficol) ioo 9 so 111106 .aktiverad PBL* 1oo ND 72 *Normala perifera lymfocyter som isolerats med Ficol gradientcentrifugering aktiverat med PHA och används som negativ kontroll for HIV-isolering.

RT-infångningstestets förmåga att detektera RT-aktivitet i RT-infekterade cellkulturer 18 blindkodade kulturer, som infekterats med 16 olika HlV-isolat som represen- terar stor variation av biologiska egenskaper, analyserades efter expression av RT och P24-antigen. De analyserade proverna togs ut varannan dag och RT-analys utfördes genom tillsats av 100 ul av rå cellstruktursuspension till infángnings- tetset, medan 22,5 ml överstående vätska användes i P24 ELISA. Data som redovisas i Tabell 4 visar nästan perfekt överensstämmelse mellan resultaten i de två testerna. Det fanns en stark korreletation mellan RT-akiviteten och de funna mängderna p24 (r = 0.947, p < 0.01, n = 17) när analysen begränsades till prover som gav signifikanta värden i båda testerna. Alla de prover, som var positiva vid p24-testet, var också positiva vid RT-infångningstestet, medan 9 prover som inte var signifikanta eller gav gränsfallsvärden vid p24 ELISA, var positiva vid vid infångningstestet. Detta visar att testerna hade likartad dekte- _ _.. u - n ,. . . « ~ -v ,» »» | . i. . , - . z. v i _, 1 . . t » « n = 1 _ _) , __, . . . .. f _ . » 1 1 4 . .i , - -1 I l Q . _ __ , , V; U 19 ringskänslighet för de undersökta ísolaten. När "koden bröts" efter fem dagar visade det sig att alla HIV l-isolat, som hade betecknats "rapid high" enligt deras uppträdande under isoleringen av dem, redan hade framkallat markant RT- aktivitet. Fem av de sju HIV -isolaten som betecknats "slow low", dvs, som vid isolering växte långsamt och gav låga titrar, uppvisade markant RT-aktivitet efter 6 dagars inkubation. Ingen aktivitet kunde påvisas i de oinfekerade kontrollkul- turerna eller de två HIV -2-infekterade kulturerna.

Claims (7)

10 15 20 25 . n - . ~ i 520 315 20 P.ans. 9502765-2 PATENTKRAV

1. Förfarande för bestämning av aktiviteten av ett nukleotidpolymeriserande enzym i ett prov, varvid man på i och för sig känt sätt a) fångar in det för bestämning avsedda enzymet med hjälp av en monoklonal antikropp, som är immobiliserad på en fast bärare och har förmåga att binda nämnda enzym utan att menligt påverka enzymaktiviteten, b) avlägsnar förekommande föroreningar och/eller störande faktorer, c) startar nukleotidpolymerisation genom att tillsätta en reaktionslösning, som innehåller en primer/template-konstruktion och nukleotidsubstrat, kånnetecknat av att 1 d) reaktionsbetingelserna väljs så att de gynnar permanent association mellan enzym och primer/template-produktkomplex, e) nukleotidsubstrat, primer/template och reaktionslösning vid behov tvättas bort från den nysyntetiserade polymeren, och f) den mängd nukleotid, som har införlivats med polymeren, bestäms på i och för sig känt sätt, och g) enzymets aktivitet fastställs med ledning av denna bestämning.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att det för bestämning avsedda enzymet är ett DNA-polymeras.

3. : F örfarande enligt patentkravet 2, kännetecknat av att DNA-polymeraset är ett omvänt transkriptas.

4. F örfarande enligt något av patentkraven 1-3, kännetecknat av att avlägsnandet av föroreningar och störande faktorer i steg 2) sker genom tvättning av antikropp-bäraren. f . > - - u 520 315 2!

5. Förfarande enligt något av patentkraven 1-4, kännetecknat av att reaktionslösningen i steg 3) även innehåller essentiella saltr och co-faktorer.

6. F örfarande enligt något av föregående patentkrav, kånnetecknat av att ezymet har hög processivitet.

7. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, kännetecknat av att enzymet är immobiliserat.