KR20190026179A - 간암 예후진단을 위한 바이오 마커로서의 sord - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 환자로부터 얻은 생물학적 시료로부터 SORD 마커를 검출하는 것에 의하여, 간암 환자의 수술 후 예후를 조기에 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

간암 예후진단을 위한 바이오 마커로서의 SORD {SORD as a biomarker for prognosis of liver cancer}

본 발명은 간암 예후진단을 위한 바이오 마커로서의 SORD에 관한 것이다.　더 상세하게는 본 발명은 간암 환자로부터 얻은 생물학적 시료로부터 SORD 마커를 검출하는 것에 의하여, 간암 환자의 수술 후 예후를 조기에 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

최근의 바이오 마커 발굴 과정을 살펴보면 개발비용은 증가하는 반면, 성공 비율은 감소하는 경향을 보이고 있다. 이는 일정부분 기초연구와 임상연구 간의 괴리감에 기인한다. 기초연구자들은 실험의 편의성을 위하여 세포주를 사용하여 실험을 진행하는데 세포주에서 나타나는 현상은 개체 수준에서 나타나는 반응과 상당한 차이점을 보이고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 개체의 환경과 유사하게 세포주를 배양하는 3차원 입체 배양 시스템이 각광을 받고 있으며, 기초연구와 임상연구 간의 괴리감을 좁힐 방안으로 대두되고 있다.

단층 배양(2D 배양, 배양세포가 배지 상에서 한 층으로 펴져 있는 것)과 달리 세포를 생체와 비슷한 3차원 환경에서 배양할 수 있는 3차원 입체 배양(3D 배양)은 비교적 높은 효율로 세포 및 조직의 특이적인 기능을 오랜 기간 유지하는 특징이 다수의 논문에서 보고되고 있으며, 독성 약물에 대한 민감도를 2D배양과 3D배양, 그리고 in vivo system과 비교해 보았을 때, 3D배양의 결과는 놀라울 정도로 in vivo system과 유사함이 논문으로 보고되고 있다.

한편, 간암 또는 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 성인 암에서 가장 흔한 유형으로, 수술로 절제가 불가능한 경우는 1년 내 사망하는 경우가 많고, 치료를 하는 경우에도 예후가 극히 나쁜 암 중의 하나로 알려져 있다. 이러한 임상적 현실을 고려할 때 암의 예후를 조기에 예측할 수 있는 기술은 암 치료의 가장 현실적 대안이고 차세대 간암 진료의 가이드라인이라고 할 것이다.

현재 간암관련 진단, 예후판정, 치료평가 바이오마커로 가장 잘 알려진 마커는 AFP, PIVKA(Protein Induced by Vitamin K Absence)-II 등이 있으나 특이도, 민감도에서 만족스럽지 못하다. 간세포암 진단에 있어서 혈중 알파 태아 단백질(alpha-fetoprotein, AFP)의 유용성은 잘 알려져 있다. 진행된 간세포암의 진단뿐만 아니라 간경변증 환자에서 자연경과 중 매년 3-10%에서 간세포암이 발병하기 때문에 조기발견을 위한 정기적인 AFP 측정이 필요하다. 그러나 AFP는 간세포암뿐만 아니라 알콜성 간염, 만성 간염이나 간경변증과 같은 양성질환에서도 고농도로 상승하기 때문에 위양성이 많고 실제 양성율이 50-60%에 지나지 않는다. PIVKA-II는 DCP(des-r-carboxyprothrombin) 즉 응고작용이 없는 비정상 프로트롬빈으로 혈청 AFP와는 독립적으로 간세포암의 진단에서 각각 48.2% 및 95.9%의 민감도와 특이도가 보고되고 있다. 이러한 생물학적 지표들은 현재 임상적으로 이용되고 있으나 모든 간암의 생물학적 특성을 반영하지 못하고 있다.

또한, 간세포암 수술 직후에 예후를 정확하게 예측해 낼 수 있는 바이오 마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 있다고 하더라도 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

미국 공개특허공보 제2010/0304372호

본 발명자들은 간암 예후를 조기 진단할 수 있는 방법, 특히 간암 환자가 수술 후 생존 또는 재발할 확률을 조기에 진단할 수 있는 분자 진단법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 SORD (L-iditol-2 dehydrogenase) 단백질이 간암 예후와 밀접한 관련이 있으며, 수술 후 간암 예후의 진단 바이오 마커로 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 SORD 마커를 검출하여 간암 예후를 조기에 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 SORD 마커를 검출하는 간암 예후 조기 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은 간암 치료 후 예후진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 환자로부터 얻은 생물학적 시료로부터 SORD (L-iditol-2 dehydrogenase) 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 예후 바이오 마커는 치료 후 환자의 전체 암 결과에 대한 정보를 제공하는 바이오 마커를 말한다. 예후 바이오마커는 치유적 치료(curative treatment)를 받는 환자에서의 재발에 대한 정보를 제공할 수 있는데, 몇몇의 실시형태에서 조직에 따른 예후 바이오마커의 변경된 발현은 간암 환자의 치료 후 생존과 상관관계가 있다. 본 발명자들은 간암 조직에서 SORD의 발현 레벨이 높을 경우, 수술 후 예후가 매우 좋은 것을 확인하였으며 반대로 주변 정상(nomral) 조직에서 높을 경우는 좋지 못한 예후(예를 들면, 감소된 생존 확률)를 가진다는 것을 밝혀내었다.

예후 예측을 위한 바이오 마커의 발현 레벨은 종양 조직 샘플(예를 들면, 생검) 및 주변 정상 조직 샘플 중의 바이오 마커의 절대량 또는 상대량을 직접적으로 또는 간접적으로 측정함으로써 환자에서 측정할 수 있다.

특히 본 발명은 암 조직 vs. 암 조직 중의 바이오 마커 발현 레벨을 비교하는 것이 아니라, 암 조직 vs. 정상 조직 중의 발현 레벨을 비교한다는 점에서 기존의 방식과 차별화되는 특징을 갖는다.

이러한 특징으로 인하여, 본 발명은 간암 예후를 조기에 진단하는 현저한 효과를 가지게 된다. 요컨대 본 발명은 간암 치료 후 재발암 조직 내에서의 마커 발현을 측정하고 비교하는 것이 아니라, 치료 전 1차 간암 세포 내에서의 마커의 발현을 주변 정상 세포에서의 발현과 비교하는 것에 의하여 예후를 판정하므로, 간암의 예후를 조기에 예측하는 기술을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명의 간암 예후 조기 진단 방법은 (i) 환자의 간암 조직 및 주변 정상 조직에서의 SORD 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 레벨을 검출하는 단계; 및 (ii) 상기 간암 조직에서의 발현 레벨을 주변 정상 조직에서의 발현 레벨과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 간암 조직에서의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 발현 레벨보다 높을 경우 치료 후 예후가 매우 좋은 것으로 판정하게 된다.

치료 후 좋은 예후란 간암 수술 시, 간암을 가지고 치료 요법을 받지 않은 환자와 비교하여 증가되거나 개선된 전체 생존, 증가된 무진행 생존, 종양 퇴행, 및 감소된 종양 재발 확률로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효과를 보여주는 것을 의미한다. 개선된 생존 시간은 약 1주, 2주, 4주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 60개월, 80개월, 100개월, 120 개월 또는 간암 치료를 받지 않은 환자와 비교하여 보다 긴 생존을 의미한다.

반대로 간암 조직에서의 발현 레벨을 주변 정상 조직에서의 발현 레벨과 비교해본 결과, 간암 조직에서의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 발현 레벨보다 낮을 경우에는 치료 후 예후가 나쁜 것으로 판정하게 된다.

치료 후 나쁜 예후란 감소된 전체 생존, 감소된 무진행 생존, 종양 성장, 환자에서의 종양 재발, 생존 기간 감소 및 사망률 증가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효과가 포함된다.

본 발명의 예후 진단 방법에 있어서, SORD 단백질의 발현 레벨을 분석하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 분석은 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 등의 문헌에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체(상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체)가 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 상기 마커-특이 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤, 또는 마이크로타이터 플레이트 등이 있다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용될 수 있고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 상기 분자 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 상기 분자 마커에 대한 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있는데, 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

한편, 본 발명의 방법은 종래의 유세포 분석 방법(flow cytometry; Ormerod, M. G., ed. 1990, Flow Cytometry: A Practical Approach. IRL Press), MACS(magnetic-activated cell sorting; Robert David, et al., Stem Cells, 23:477-482(2005) 또는 면역친화성 정제방법(Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)에 따라 실시될 수 있다.

상기 분자 마커에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 간암 예후를 진단할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 SORD를 코딩하는 유전자의 검출은 상기 유전자의 mRNA를 검출하여 실시할 수 있다.

mRNA의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 이 경우 프라이머 또는 프로브가 이용될 수 있다.

프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 조직시료)에서 상기 마커의 mRNA 양을 조사하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.

이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 상기, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시될 수 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 상기 마커의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다.

이러한 프라이머의 디자인은 상기 마커의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

이렇게 증폭된 상기 마커의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다.

이러한 증폭 반응을 통하여, 간암 조직에서 SORD 유전자의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 유전자 발현 레벨보다 높을 경우, 수술 후 예후가 좋은 것으로 진단한다.

상기 마커의 cDNA에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 간암 예후를 진단할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마커의 cDNA에 혼성화 되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다.

상기 마커의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 상기 마커의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.

상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 간암 예후를 진단할 수 있다. 즉, 간암 조직에서 SORD cDNA에 대한 시그널이 주변 정상 시료에서의 시그널과 비교하여 보다 강하게 나오는 경우에는 예후가 좋은 것으로 진단된다.

본 발명의 다른 관점은 SORD (L-iditol-2 dehydrogenase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 간암 예후 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 키트는 간암 조직 및 주변 정상 조직 시료에 적용될 수 있으며, 간암 조직에서의 SORD 단백질 또는 유전자의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 발현 레벨보다 높을 경우 치료 후 좋은 예후를 판정함을 지시하는 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 인간 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 간암 예후 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

지난 몇십 년 동안 치료법의 향상 및 의료기기의 발전, 방사선학과 수술기술의 (진보)발달과 간이식 시술과 같은 치료법들의 개발로 간세포 암종의 치료가 개선되고 있으나, 이러한 간세포 암종과 관련된 발병률과 간암관련 사망률은 여전히 증가 추세에 있다.

간세포 암종으로 절제술을 받는 환자의 80%에서 재발이 관찰되며, 이러한 간암의 재발은 사망으로까지 연결되고 있는 실정이다.

본 발명의 연구에서 도출된 SORD를 환자 예후 진단 마커로 사용할 경우, 간암재발 환자 맞춤형 치료을 위한 대비책을 모색할 수 있으므로, 수술 후 간암 환자의 생존률을 높힐 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 본 발명은 간암 치료 후 재발암 조직 내에서의 마커 발현을 측정하고 비교하는 것이 아니라, 치료 전 1차 간암 세포 내에서의 마커의 발현을 주변 정상 세포에서의 발현과 비교하는 것에 의하여 예후를 판정하므로, 간암의 예후를 조기에 예측하는 기술을 제공한다.

도 1은 간암 환자 조직에서 SORD, AKR1C4, AKR1C1 의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 간암 조직 및 주변 정상 조직에서의 SORD 단백질의 발현 패턴과 간암 환자의 수술 후 예후와의 상관 관계를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

(1) 마커 후보군 선정을 위한 데이터 마이닝

간암세포주(Huh7)의 단층배양과 3차원 입체배양 조건에서 conditioned medium(CM)을 획득하고 분비체(secretome)를 분석하였다.

2D 전기영동을 통해 3차원 입체배양에서 많이 분비되는 단백질들을 확인하였고, 생물정보학 분석 방법을 사용하여 3차원 입체배양 조건에서만 발현이 증가하고, 바이오 마커로서 연구가 되어 있지 않은 SORD, AKR1C4, AKR1C1 3개의 단백질을 후보물질로 선별하였다.

(2) 마커 후보군에 대한 검증

면역 블롯팅법(Immunoblotting)을 통해 100명의 간암 환자 조직에서 SORD, AKR1C1, AKR1C4의 발현 정도를 확인하였다. 구체적으로 각각의 마커 후보군에 항체를 처리하고, 겔 전기 영동　단계를 거친 후 블롯팅법에 따라 염색된 밴드를 관찰하였고, 이렇게 얻어진 각각의 단백질의 발현 정도를 바탕으로 69명의 간암 환자의 예후를 비교 분석하여 새로운 예후 진단 바이오 마커로서의 가능성을 타진하였다.

실험결과

100명의 간암 환자 조직에서 SORD, AKR1C4, AKR1C1 의 발현 정도를 확인한 결과를 도 1에 표시하였다.

도 1에서 나타나는 바와 같이, 간암 환자들은 크게 아래의 3개의 그룹으로 분류됨을 확인할 수 있었다.

1) 본 단백질이 주변조직(N)보다 종양조직(T)에 많은 경우 (N<T),

2) 종양조직(T)보다 조변조직(N)에 많은 경우 (N>T), 및

3) 주변조직(N)과 종양조직(T)이 같거나 발현이 안 될 경우 (N.A)

SORD, AKR1C1, AKR1C4의 발현 정도를 바탕으로 69명의 간암 환자의 예후를 비교 분석한 결과, AKR1C4와 AKR1C1의 경우는 단백질의 발현 패턴과 간암 환자 69명의 수술 후 예후와의 상관관계는 없는 것으로 확인하였다.

그러나, SORD의 경우는 간암 조직에서 SORD의 발현 레벨이 높을 경우, 수술 후 예후가 매우 좋은 것을 확인하였으며 반대로 주변조직에서 높을 경우는 약 30%정도 사망하는 경향을 보이는 것을 확인하였다(도 2).

따라서 SORD의 발현 정도에 따라 간암 환자의 수술 후 예후를 예측할 수 있고, 이는 예후 진단 바이오 마커로서의 기능을 수행함을 의미한다.

Claims (10)

1. 간암 치료 후 예후진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 환자로부터 얻은 생물학적 시료로부터 SORD (L-iditol-2 dehydrogenase) 마커를 검출하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 간암 조직 및 주변 정상 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 방법은
   (i) 환자의 간암 조직 및 주변 정상 조직에서의 SORD 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 레벨을 검출하는 단계; 및
   (ii) 상기 간암 조직에서의 발현 레벨을 주변 정상 조직에서의 발현 레벨과 비교하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 간암 조직에서의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 발현 레벨보다 높을 경우, 간암 치료 후 좋은 예후를 진단하는 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는 SORD 마커 검출방법.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 SORD 단백질의 검출은 면역분석법(immunoassay) 또는 면역염색법(immunostaining)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 면역분석법(immunoassay) 또는 면역염색법(immunostaining)은 SORD에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제3항에 있어서, 상기 SORD를 코딩하는 유전자의 검출은 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. SORD (L-iditol-2 dehydrogenase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 간암 예후 진단용 키트.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 간암 조직 및 주변 정상 조직 시료에 적용되는 것을 특징으로 하는 간암 예후 진단용 키트.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 키트는 상기 간암 조직에서의 SORD 단백질 또는 유전자의 발현 레벨이 주변 정상 조직에서의 발현 레벨보다 높을 경우, 간암 치료 후 좋은 예후를 진단함을 지시하는 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 예후 진단용 키트.
    

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