KR20140095027A - 알츠하이머 질환에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머 질환 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) TGFBI(Transforming growth factor-β-induced)을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 (b) TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트 및 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 바이오마커인 TGFBI의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 정상인보다 알츠하이머 환자에서 특이적으로 증가한다. 따라서, 본 발명의 마커인 TGFBI를 이용하면 정상인과 알츠하이머 환자를 확실하게 구별하여 알츠하이머를 조기 진단할 수 있다.

Description

알츠하이머 질환에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머 질환 진단 방법{Biomarker Indicative of Alzheimer’s Disease and Diagnosis Method Using the Same}

본 발명은 알츠하이머 질환에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

알츠하이머 질환은 노화에 따라 수반되는 뇌 질환으로서 아직은 조기진단이 불가능한 질환으로 현재까지 많은 연구를 통하여 발병기전의 연구와 치료제 개발에 많은 투자가 이루어졌지만 확실한 조기진단 바이오마커가 없는 실정이다. 이런 원인으로 현재까지 다음과 같은 진단법과 진단법 연구개발이 진행 중이다. MRI(magnetic resonance imaging) 또는 CT(computed tomography)를 이용한 뇌 영상 진단, 뇌척수액(Cerebrospinal fluid, CSF) 또는 혈액에서 타우(tau) 단백질, 베타-아밀로이드(beta-amyloid)의 양을 측정한 진단, 유전적 위험요소로서 APOE-e4 유전자 다양성형 분석 등이 알츠하이머 질환의 진단 방법으로 이용되고 있으나 알츠하이머 조기진단을 위한 분자 마커는 아직까지 알려져 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 알츠하이머 질환을 신속하고 정확하게 분자 진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, TGFBI(Transforming growth factor-β-induced)가 알츠하이머 질환을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 알츠하이머 질환 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 TGFBI(Transforming growth factor-β-induced)를 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 TGFBI 단백질 또는 TGFBI의 뉴클레오타이드 서열(유전자)의 발현을 검출하는 방법을 통해 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 알츠하이머 질환을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상술한 분자 마커가 알츠하이머 질환을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

알츠하이머의 발병에는 치매의 특성이자 주요원인인 아밀로이드 플라크(amyloid plaques), 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangles) 형성을 비롯하여 프리세닐린(presenilin), 베타-APP(beta-amyloid precursor protein), ApoE(apolipoprotein)등과 같은 유전적 요인 및 그 외의 여러 다른 요인들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 알츠하이머의 대표적인 특성 중에 하나인 베타-아밀로이드 플라크는 신경세포(neuron)간에 존재하며 비정상적인 단백질 베타-아밀로이드의 축척에 의해 형성되는데 일반적으로는 베타-아밀로이드는 약 695-770 아미노산의 베타-APP로부터 BACE-1(beta-secretase)에 의해 형성되는 40-아미노산의 단백질 단편으로서 생성된 베타-아밀로이드는 분해되어지나 알츠하이머 환자의 뇌에 있어서는 생성되는 베타-아밀로이드의 약 10%가 42-아미노산인 비정상적인 베타-아밀로이드로서 분해되어지지 않고 그대로 축척되어 플라크를 형성한다. 이렇게 형성된 베타-아밀로이드는 산화성 자유 라디칼 생성 및 마이크로글리아와 같은 면역세포에 작용하여 염증반응(inflammatory response)을 유발시키고 칼슘(Ca²⁺) 채널 등을 파괴함으로써 결과적으로 신경세포에 해로운 작용을 한다. 또한, 베타-아밀로이드의 증가는 상대적으로 기억 및 학습능력 관련 신경전달물질인 아세틸콜린 수치를 감소시킴으로써 이로 인해 치매환자는 기억력, 판단력기능 감퇴증상을 보이게 된다.

상술한 바와 같이, 알츠하이머 질환 환자의 뇌에는 BACE1이 증가되어 베타-아밀로이드를 증가시키는 것으로 잘 알려져 있으며, BACE1의 양을 측정함으로써 알츠하이머 질환을 진단할 수 있으나 뇌의 BACE1의 양을 측정하는 것은 사후에만 가능하다는 단점이 있다. 본 발명자들은 실험을 통해 BACE1의 양이 TGFBI 발현 양과 일치 한다는 것을 발견하고, TGFBI의 발현 양을 혈액 및 소변 등의 체액으로부터 측정함으로써 이를 알츠하이머 질환 조기진단 바이오마커로 사용할 수 있음을 규명하였다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 알츠하이머 질환의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 실시예에 따르면, BACE1의 발현양에 따라 TGFBI의 발현양도 증가 또는 감소하는 것을 알 수 있다(참조: 도 2).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 정상 시료와 알츠하이머 환자의 시료 중에서 알츠하이머 환자의 시료만을 선택적으로 진단 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TGFBI를 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TGFBI 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 알츠하이머 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 알츠하이머 질환을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 엠비진 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 알츠하이머를 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 알츠하이머로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 TGFBI 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 알츠하이머 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 알츠하이머 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 알츠하이머 질환 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 알츠하이머 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 췌장 조직세포)보다 강하게 나오는 경우에는 알츠하이머로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 알츠하이머 질환 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 췌장 조직, 혈액 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오는 경우에는 알츠하이머로 진단된다.

따라서 본 발명의 알츠하이머 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 알츠하이머 질환에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포와 비교하여 1.5-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 알츠하이머로 판정한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다

(ⅱ) 본 발명의 바이오마커인 TGFBI의 mRNA 또는 단백질의 발현량은 정상 조직보다 알츠하이머 환자 조직에서 특이적으로 증가한다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 마커인 TGFBI을 이용하면 정상조직과 알츠하이머 환자 조직을 확실하게 구별하여 알츠하이머의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

도 1은 APP 가공과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 각막세포에서 다양하게 발현되는 세크리타아제에 의해 가공되는 APP와 CTF의 양을 웨스턴 블롯 분석법으로 확인한 결과이다.
도 3은 소변에서 TGFBIp양을 측정한 결과이다.
CNT: TGFBIp의 마커로 사용된 각막세포에서 발현되는 TGFBIp. KEK: 60대 남자, MYS: 30대 남자, OJM: 30대 남자, OJY: 30대 남자, JJY: 30대 남자, CSI: 50대 남자 소변.
도 4는 miRNA을 세포에 각각 발현시킨 후 TGFBIp와 BACE1의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

각막세포 샘플

각막간질세포는 각막이상증 환자와 정상인 각막으로부터 분리하여 배양하였다. 배양된 세포를 원심분리기로 회수한(1,000 rpm에서 3분간) 후 4^oC RIPA 어세이(Radio Immuno Precipitation Assay) 버퍼(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40)를 첨가하여 볼텍스(vortex)로 1분간 용해하였다. 시료를 3분간 얼음에 방치한 후 4^oC 하에서 원심분리(10,000 rpm으로 10분간)한 후 웨스턴 블롯을 위하여 상층액을 BCA(Bicinchoninic Acid)법으로 단백질 정량을 하였다(Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit, 미국).

웨스턴 블롯 분석

준비한 세포 샘플로부터 단백질을 추출하고, SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, 미국)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블록킹하였다. 그 다음, 각각의 멤브레인을 1차 항체 와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 1차 항체는 래빗 폴리클로날 APP(Sigma, 미국), 래빗 폴리클로날 BACE1(Sigma, 미국), 고트 폴리클로날 TGFBI(R&D Systems Inc., 미국) 마우스 모노클로날 β-액틴(Sigma, 미국)을 사용하였다. 1차 항체와 반응한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)이 접합된 2차 항체 래빗 폴리클로날(PIERCE, 미국), 래빗 모노클로날(PIERCE, 미국) 및 고트 폴리클로날(Jackson, 미국) 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 ECL(Enhanced chemiluminescence) 시스템(PIERCE, 미국)을 이용하여 검출하였다.

miRNA 발현 유도

miRNA 형질감염(transfection)은 제놀루션(한국) 회사의 방법에 따라 수행하였다. 즉 사람의 각막 간질세포(corneal fibroblast)를 형질감염 하루 전에 6 웰 플레이트에 20-30% 차도록 플레이팅 한다. 각 1.5 ml 튜브에 siRNA를 각각 20 nM 용량 분주한다. 상기 튜브에 G-펙틴(fectin) 2 μl를 첨가 후 총 용량이 200 μl가 되게 PBS를 첨가해서 잘 섞은 후 상온에서 10분 동안 배양한다. 10분 후 형질감염 혼합물을 준비된 세포에 바로 넣어준다. 24-48 시간 이후 TGFBIp의 발현을 웨스턴 불롯으로 분석하였다.

실험결과

웨스턴 블롯

APP 가공과정을 살펴보면(도 1) 정상인에서는 알파-세크리타아제가 많아서 먼저 절단되어 알파-CTF 많아져 알츠하이머를 일으키는 베타-아밀로이드(Aβ 40-42)가 적게 만들어 진다. 그러나 베타-세크리타아제(BACE1)가 많아지면 베타-CTF가 많이 만들어지고 최종적으로 Aβ가 많아져서 알츠하이머 질환이 진행된다.

여러 사람으로부터 분리된 각막세포에서 다양하게 발현되는 세크리타아제(secretase)에 의해 가공(processing)되는 APP와 CTF의 양, 특히 TGFBI 발현양과 BACE1의 발현양에는 상관관계가 존재한다. TGFBI 양이 증가하면 BACE1도 증가되어 β-CTF가 많이 생성되며, 그 결과로 알츠하이머 질환의 원인이 되는 베타-아밀로이드(Aβ)가 많아짐을 예측할 수 있다(도 2). 즉, TGFBI의 증가된 발현양을 갖는 사람은 앞으로 알츠하이머 질환으로 진행될 수 있음을 예측할 수 있다. 따라서 TGFBI를 노인이 되기 전에만 측정하여도 노인시기에게서 발병되는 알츠하이머 질환을 조기에 진단할 수 있다.

6명의 건강한 사람의 소변(30 μl)으로부터 TGFBIp의 양을 웨스턴 블롯으로 분석하여 각기 다른 사람에서 다른 발현 양을 보이는 TGFBIp을 측정할 수 있었다(도 3).

어떤 기전으로 BACE1과 TGFBIp가 같은 발현을 나타내는지 알아보기 위하여 두 유전자를 동시에 조절 가능한 miRNA을 세포에 각각 발현시킨 후 TGFBIp와 BACE1의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. miRNA 9-5p, 21-5p, 590-5p, 181a-5p, 181a-3p와 181a-2-3p이 두 유전자 발현을 동시에 조절하였고, 그중에 miRNA 9-5p, 590-5p 와 181a-5p가 주된 조절 miRNA 이었다. 따라서 이들 miRNA의 발현을 알츠하이머 질환을 진단하는 바이오 마커로 이용할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Biomarker Indicative of Alzheimer Disease and Diagnosis Method Using the Same <130> PN120623 <150> KR 10-2013-0007432 <151> 2013-01-23 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2716 <212> DNA <213> Homo sapiens transforming growth factor, beta-induced <220> <221> gene <222> (1)..(2716) <220> <221> CDS <222> (55)..(2103) <400> 1 gccgcccgct tgcccgtcgg tcgctagctc gctcggtgcg cgtcgtcccg ctcc 54 atg gcg ctc ttc gtg cgg ctg ctg gct ctc gcc ctg gct ctg gcc ctg 102 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 ggc ccc gcc gcg acc ctg gcg ggt ccc gcc aag tcg ccc tac cag ctg 150 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 gtg ctg cag cac agc agg ctc cgg ggc cgc cag cac ggc ccc aac gtg 198 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 tgt gct gtg cag aag gtt att ggc act aat agg aag tac ttc acc aac 246 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn 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tgactgccta tgccaagtcc ctggaaaagg 2420 agcttcagta ttgtggggct cataaaacat gaatcaagca atccagcctc atgggaagtc 2480 ctggcacagt ttttgtaaag cccttgcaca gctggagaaa tggcatcatt ataagctatg 2540 agttgaaatg ttctgtcaaa tgtgtctcac atctacacgt ggcttggagg cttttatggg 2600 gccctgtcca ggtagaaaag aaatggtatg tagagcttag atgtccctat tgtgacagag 2660 ccatggtgtg tttgtaataa taaaaccaaa gaaacataaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2716

Claims (9)

1. (a) TGFBI(Transforming growth factor-β-induced)을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 (b) TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 TGFBI 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
8. 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 TGFBI 단백질 또는 TGFBI의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.

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