KR19990064358A - 하이브리드화용 고체 지지체의 제조 방법 및 비-특이적 배경의 감소 방법 - Google Patents

하이브리드화용 고체 지지체의 제조 방법 및 비-특이적 배경의 감소 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이브리드화용 고체 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 고체 지지체의 제조 방법, 및 하이브리드화 검정에 있어서 고체 지지체상의 비-특이적 배경을 감소시키기 위한 이들의 용도를 제공한다. 비-특이적 배경을 감소시킴으로써 비-특이적 결합에 의해 통상적으로 차폐되는 낮은 수준의 특이적 결합을 검출할 수 있다. 본 방법은 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함하여, 여러가지 표적 리간드와 프로브에 적용시킬 수 있다.

Description

하이브리드화용 고체 지지체의 제조 방법 및 비-특이적 배경의 감소 방법
하이브리드화 기술은 상호간의 상보적 관계가 있는 분자쌍을 확인하기 위한 강력한 도구이다. 상기와 같은 기술은 핵산 및 단백질을 포함하여, 여러가지 타입의 분자에 적용되고 있다. 예를들면, 핵산 하이브리드화는 숙지되어 있으며 문서화된 특이적 핵산 서열의 확인 방법이다. 핵산 하이브리드화는 상보적인 핵산 쇄의 염기 쌍화를 기본으로 한다. 일본쇄 핵산을 적합한 완충액중에서 항온처리할 경우, 상보적인 염기 서열은 이본쇄의 안정한 분자를 형성한다. 상기와 같은 쌍화의 존재 또는 부재는 당해 분야에 숙지된 수많은 방법으로 검출할 수 있다. 상기한 바와 같은 대부분의 하이브리드화 검정법은 문헌: Dunn and Hassell in Cell 12:23 (1977)에 기술된 바와 같은 하이브리드화 기술과 같이 다단계를 포함한다.
핵산의 복합 집단중에서 표적 핵산을 검출하기위한 전형적인 하이브리드화 검정 프로토콜은 일반적으로 다음과 같이 설명할 수 있다. 표적 핵산은 겔 매트릭스상에서 크기별로 분리하거나 (전기영동법), 클로닝하여 단리시키거나, 푸울(pool)로 세분하거나, 복합 집단으로 사용한다. 이어서 표적 핵산을 나일론막 또는 니트로셀룰로오스막과 같은 고체 지지체상으로 옮기거나, 점적하고, 달리 고정화시킨다 (이런 "고정화"를 "배열 (arraying)"이라고도 언급할 수 있다). 이어서 고정화된 핵산을 가열 단계 또는 UV 조사시켜 핵산을 비가역적으로 고정화시킨다. 이후 상기 막을 1개 이상의 전통적인 "차단제"중에 침지시키는데, 상기 차단제는 덴하르트 시약 (Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23:641 (1966)), 헤파린 (Singh and Jones, Nucleic Acids Res. 12:5627 (1984)), 및 탈지분유 (Jones et al., Gene Anal. Tech. 1:3 (1984))를 포함한다. 종종, 이들 시약을 일본쇄 DNA 및 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)와 같은 세제와 함께 사용한다. 풍부하지 않은 서열의 노던 분석법, RNA 프로브를 사용하는 하이브리드화, 또는 단일-카피 써던 하이브리드화의 경우, 덴하르트 시약을 일반적으로 0.5% SDS 및 단편화된 변성 DNA 100 ㎍/㎖와 함께 사용한다. (50x 덴하르트 시약은 1% w/v Ficoll (type 400, Pharmacia), 1% w/v 폴리비닐피롤리돈, 1% w/v 소혈청 알부빈 (분획 5)로 이루어져 있다). 차단제는 일반적으로 니트로셀룰로오스가 사용되는 경우 예비 하이브리드화 단계 및 하이브리드화 단계 모두에 포함된다. 그러나, 핵산이 나일론막에 고정화된 경우, 고농도의 단백질이 프로브를 이의 표적 핵산에 어닐링시키는데 방해가 되기 때문에 일반적으로 하이브리드화 용액으로부터 차단제를 제외시킨다. 상기와 같은 문제점은 특히 올리고뉴클레오티드와 같이 짧은 프로브가 사용되는 경우 현저하다. 이어서 표적 핵산을 전형적으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표지된 "시그날" 핵산으로 프로브화한다. 이후 시그날 핵산은 종종 리간드쌍 구성원 중 하나를 갖는 접합 효소를 사용하여 검출한다. 시그날 핵산은 다른 구성원의 리간드쌍을 함유한다. 비결합 효소를 세척하고 막을 기질 용액에 침지시킨다. 이어서 시그날을 비색계 방법, 형광 또는 화학발광으로, 기질 타입에 따라서 검출한다. 짧은 형태로, 하이브리드화 검정법 프로토콜을 다음과 같이 요약할 수 있다: 표적 핵산을 고체 지지체상에 고정화시킨다. 고체 지지체를 차단제로 처리하여 프로브의 잡종 결합 (비-특이적 결합; 또한 "배경"으로도 공지되어 있다)을 방지한다. 이어서 고체 지지체를 프로브화하고 시그날을 여러가지 방법으로 검출한다.
비-특이적 결합을 감소시키기 위하여 차단제를 사용하는 것은 비-특이적 결합이 차단되지 않을 경우 비-특이적 결합에 의해 차폐되는 매우 낮은 수준의 특이적 결합을 검출할 수 있는 것과 같은 여러가지 이유로 필수적이다. 불행하게도, 상기 기술된 바와 같은 전통적인 차단제를 사용하여 재현가능한 방법은 하나도 없었다. 상기 주제에 대해 문헌에 기술되어 있지만, 피콜 (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma), 분획화된 단일 핵산, 유제품 등으로 이루어진 차단제의 혼합물 또는 칵테일을 사용하여 예를들어, 8 인치에서 12 인치까지의 니트로셀룰로오스 또는 나일론막을 실질적으로 균일하게 "차단"시킬 수는 없다. 본 명세서에 기술되는 본 발명의 방법은 선행 방법의 상기와 같은 제한을 극복하는 것이다.
하이브리드화 반응에 있어서 비-특이적 배경을 감소시키기위한 통상의 방법과 관련된 문제점으로 인하여, 당해 기술 분야에서는 신규한 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시키고, 또한 기타 관련된 잇점을 제공한다.
발명의 요약
간략하게 언급해서, 본 발명은 하이브리드화 고체 지지체의 제조 방법 및 하이브리드화 반응에 있어서 이들의 용도를 제공한다. 하나의 양태로, 본 발명은 (a) 하이브리드화용 고체 지지체에 표적 리간드를 고정화시키기에 충분한 조건하에서 표적 리간드와 고체 지지체를 접촉시키는 단계; 및 (b) 고정화된 표적 리간드를 함유하는 고체 지지체를 비-특이적 부위를 차단시키기에 충분한 조건하에서 하기 화학식 I 내지 VIII의 화합물 중 하나와 반응시켜 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체를 제조하는 단계를 포함하는, 비-특이적 배경을 감소시키는 하이브리드화 고체 지지체의 제조 방법을 제공한다:
상기식에서
R1내지 R17은 독립적으로 H, OH, CH3, CH2-CH3, CH〓CH-CH3, X, CH2X, CHX2, CH2-CH2X, CH2-CHX2, CX3, CX2-CX3, CX2-CX2-CX3및 C(〓O)CH3로부터 선택되고,
R1과 R3, R2와 R4또는 R5와 R6는 함께 〓CH2일 수 있으며, R5와 R6는 함께 〓O일 수 있고,
X는 독립적으로 할로겐으로부터 선택된다.
바람직한 양태로, 상기 방법은 추가로, 단계 (b)후에, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체와 반응하지 않은 화합물을 거의 모두 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법에 따라서 제조된, 고정화된 표적화 리간드를 함유하는 고체 지지체를 포함하는 키트가 본 발명내에서 제공된다.
다른 양태로, 본 발명은 (a) 하이브리드화용 고체 지지체에 표적 리간드를 고정화시키기에 충분한 조건하에서 상기 고체 지지체를 표적 리간드와 접촉시키는 단계; (b) 비-특이적 부위를 차단시키기에 충분한 조건하에서 고정화된 표적 리간드를 함유하는 고체 지지체를 화학식 I 내지 VIII의 화합물 중 하나와 반응시켜 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체를 제조하는 단계; (c) 고정화된 표적 리간드에 대해 특이적으로 결합시키기에 충분한 조건하에서 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체를 프로브와 접촉시키는 단계 및 (d) 고체 지지체상에서의 프로브의 존재를 검출하여, 표적 리간드와 프로브간의 하이브리드화를 측정하는 단계를 포함하는, 하이브리드화 반응에 있어서 비-특이적 배경을 감소시키는 방법을 제공한다:
화학식 I
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 V
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
상기식에서
R1내지 R17은 독립적으로 H, OH, CH3, CH2-CH3, CH〓CH-CH3, X, CH2X, CHX2, CH2-CH2X, CH2-CHX2, CX3, CX2-CX3, CX2-CX2-CX3및 C(〓O)CH3로부터 선택되고,
R1과 R3, R2와 R4또는 R5와 R6는 함께 〓CH2일 수 있으며, R5와 R6는 함께 〓O일 수 있고,
X는 독립적으로 할로겐으로부터 선택된다.
바람직한 양태로, 본 방법은 단계 (b)와 (c) 사이에, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체와 반응하지 않은 화합물을 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 양태로, 본 방법은, 단계 (c)와 (d) 사이에, 상기 고정화된 표적 리간드에 결합하지 않은 상기 프로브를 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 양태로, 상기 방법은 단계 (b)와 (c) 사이에, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체와 반응하지 않은 화합물을 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함하며, 단계 (c)와 (d) 사이에, 상기 고정화된 표적 리간드에 결합하지 않은 상기 프로브를 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 양태로, 화합물은 R1및 R2가 둘다 CH〓CH-CH3또는 CH2X 또는 CX3또는 CX2-CX3또는 CX2-CX2-CX3이고, 각각의 X는 독립적으로 할로겐으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R1내지 R4가 H이거나; R1이 CH3이고 R2내지 R4가 H이거나; R2및 R4가 H이고 R1및 R3가 함께 〓CH2이거나; R1및 R2가 H이고 R3및 R4가 C(〓O)CH3인 화학식 II의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R1내지 R4가 H이거나; R1이 CH3이고 R2가 H이거나; R1및 R2가 CH3이거나; R1이 X이고 R2가 H이거나; R1및 R2가 X이고; 각각의 X가 독립적으로 할로겐으로부터 선택되는 화학식 III의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R1내지 R6가 H이거나; R1내지 R5가 H이고 R6가 CH3이거나; R1및 R3가 CH3이고 R2, R4, R5및 R6가 H이거나; R1내지 R4가 H이고 R5및 R6가 CH3이거나; R1내지 R4가 H이고 R5가 CH3이며 R6가 CH2CH3이거나; R1내지 R6가 X이거나; R1및 R2가 H이고 R3및 R4가 C(〓O)CH3이며 R5및 R6가 함께 〓O인 화학식 IV의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R7내지 R9가 H인 화학식 VI의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R10내지 R13이 H인 화학식 VII의 화합물이다. 다른 바람직한 양태로, 화합물은 R14및 R17이 X이고 R15및 R16이 H이거나; R14내지 R17이 X이거나; R14가 OH이고 R15내지 R17이 H인 화학식 VIII의 화합물이다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 다음 상세한 설명을 참고로하여 자명해질 것이다.
본 발명은 일반적으로 하이브리드화 반응에 사용하기 위한 고체 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 상세하게는 비-특이적 배경(bockground)을 지지체의 화학적 처리에 의해 감소시키기 위한 하이브리드화 고체 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, 전통적인 차단제를 사용하여 하이브리드화 고체 지지체에 대한 비-특이적 결합을 균일하게 차단시키기위한 재현가능한 방법은 없었다. 본 발명의 방법은 니트로셀룰로오스 또는 나일론막과 같은, 하이브리드화 고체 지지체상의 비-특이적 부위를 균일한 수준으로 차단시킴으로써 선행 기술 방법의 상기 단점을 극복한 것이다. 본 발명은 비-특이적 배경을 감소시킴으로써 실질적으로 시그날 대 노이즈 비율을 증가시키는 하이브리드화 분야에 있어서의 확실한 개선을 나타낸다. 이는, 예를들어, 방사선표지된 프로브를 형광 또는 화학발광 시그날 시스템과 비교할 수 있는 화학적으로 표지된 프로브로 대체시킬 수 있도록 한다. 또한, 전통적인 차단제에 대한 필요성을 없앰으로써, 본 발명은 뉴클레아제 또는 프로테아제 오염 위험도를 저하시키고 대규모 하이브리드화를 수행하는데 있어서의 단가를 낮추는, 추가의 잇점을 제공한다.
하이브리드화 검정법은 선택된 분자에 결합할 수 있는 분자를 확인하는데 있어서 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "하이브리드화"는 2개의 분가간의 특이적 결합을 언급하는 것으로, 예를들어, 2개의 핵산 분자간의 결합을 포함한다. 상기와 같은 하이브리드화 검정법은 일반적으로 상기와 같이 기술할 수 있는 일련의 단계를 전형적으로 포함한다. 요약하면, 분자(예; 표적 리간드)는 고체 지지체상에 고정된다. 고체 지지체는 차단제(들)로 처리하여 프로브 분자의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 고정화된 표적 분자를 함유하는 고체 지지체는 후보 결합 파트너 (즉, 프로브 분자)로 프로브화한다. 고체 지지체에 결합된 프로브 분자의 존재 또는 부재를 검출하여, 표적 리간드와 프로브 사이에 하이브리드화가 일어났는지 결정한다.
상기 나타낸 바와 같이, 프로브화 단계전에, 표적 분자를 고체 지지체에 고정화하고 비-특이적 결합 부위를 차단하도록 고체 지지체를 제조한다. 여러가지 고체 지지체를 본 발명내에서 하이브리드화 매트릭스로서 사용할 수 있으며 당해 분야에 숙지되어 있다. 결합 파트너와의 결합능을 현저하게 손상시키지 않고 표적 리간드를 고정화시킬 수 있는 고체 지지체라면 어떤 것이라도 적합하다. 표적 리간드를 고정화시키기위하여 예비-활성화된 표면을 갖는 고체 지지체가 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있으며 상업적으로 입수가능하다. 고체 지지체는 다공성 및 비-다공성 고제 지지체 모두를 포함한다. 다공성 고체 지지체로는 다공질막이 있다. 다공질막의 예로는 니트로셀룰로오스막 (예, Schleicher and Schuell, Keene, NH) 및 나일론막 (예, Amersham, Arlington Heights, IL, 또는 Schleicher and Schuell, Keene, NH)이 있다. 비-다공성 고체 지지체로는 마이크로비드, 유리 표면 및 융합된 실리카가 있다. 비-다공질 마이크로비드의 예로는 자성 비드, 폴리스트린, Teflon: 등록상표, 나일론, 실리카 및 라텍스가 있다. 자성 비드는 PerSeptive Diagnostics (Cambridge, MA) 또는 Dynal (Oslo, Norway)로부터 수득할 수 있다. 라텍스, 실리카 및 기타 타입의 비드는 Polysciences (Warrington, PA)로부터 수득할 수 있다. 표적 리간드가 핵산인 경우, 특히 바람직한 고체 지지체는 니트로셀룰로오스막, 나일론막 또는 유리 표면이다. 표적 리간드가 단백질인 경우, 특히 바람직한 고체 지지체는 니트로셀룰로오스막 또는 나일론막이다.
표적 리간드를 상기한 바와 같은 고체 지지체상에 고정화시킨다. 여러가지 분자를 본 발명내에서 표적 리간드로 사용할 수 있다. 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있는 분자라면 어떤 것이라도 적합하다. 표적 리간드로는 핵산, 단백질 및 작은 유기 또는 생체-유기 (예, 천연 생성물) 분자가 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "핵산"으로는 데옥시리보핵산 (게놈성 DNA 및 cDNA를 포함한 DNA), 리보핵산 (mRNA, rRNA 및 tRNA를 포함한 RNA), 올리고뉴클레오티드 및 핵산 유사체가 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단백질"로는 단백질 (효소 및 항체), 폴리펩티드, 펩티드 (즉, 2개 이상의 아미노산), 단백질 복합체 및 아미노산 유사체가 있다. 음으로 하전된 "단백질"이 바람직한 단백질 표적 리간드이다. 표적 리간드는 상업적인 공급원, 생물학적 원료로부터의 정제, 재조합 생산법 및 합성 화학 제조법을 포함한 여러가지 방법으로 수득할 수 있다.
상기한 바와 같은 표적 리간드의 선택하여, 고체 지지체상에 고정화시킨다. 여러가지 고정화 방법이 본 발명내에서 사용될 수 있으며 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 결합 파트너를 결합시키는 능력을 현저하게 손상시키지 않고 표적 리간드를 침착시키거나 부착시키는 고정화 방법이라면 어느것이다 적합하다. 고체 지지체에 대한 전통적인 고정화 방법은 가열 또는 UV 조사이다. 가열에 의해 고정화시킬 경우 (예를들어, 진공하에서의 베이킹), 온도 범위는 전형적으로 약 1분 내지 60분 동안 약 50 ℃ 내지 100 ℃이다. 조사에 의한 고정화의 경우, UV 동력 범위는 전형적으로 약 10초 내지 5분 동안 약 1,000 내지 1,000,000 마이크로주울/㎠이다. 표적화 리간드의 존재하에서 고체 지지체를 상가와 같은 여러가지 반응 조건 중 하나로 처리함으로써, 표적화 리간드는 고체 지지체상에 비가역적으로 고정화된다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 하이브리드화 반응에 사용하기위하여 제조된 고체 지지체상의 비-특이적 결합 부위를 차단시키기위한 상이한 방법을 제공한다. 비-특이적 결합 부위는 고체 지지체상에 고정화된 표적 리간드와는 독립적인 방식으로 고체 지지체에 후보 결합 파트너 (프로브)가 결합하도록 한다. 고정화된 표적 리간드를 갖는 고체 지지체에 대한 프로브의 비-특이적 결합은 프로브가 표적 리간드에 대한 결합 파트너라는 징후를 제공한다. 본 발명내에서, 고체 지지체상에 표적 리간드를 고정화시킨 다음, 고체 지지체를 하기한 바와 같은 화합물 1종 이상과 반응시켜 고체 지지체상의 비-특이적 결합 부위를 차단시킨다. 본 발명에서 사용할 수 있는 화합물로는 다음 화학식 I내지 VIII로 표시되는 무수물이 있다:
화학식 I
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 V
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
화학식 I 내지 VIII로 나타내는 화합물은 상기한 바와 같이 치환체 R1내지 R17을 갖는다. R1내지 R17각각은 다음 치환체로부터 각각 독립적으로 선택된다 (즉, 다른 치환체의 선택과는 상관없이 치환체를 선택할 수 있다): H, OH, CH3, CH2-CH3, CH〓CH-CH3, X, CH2X, CHX2, CH2-CH2X, CH2-CHX2, CX3, CX2-CX3, CX2-CX2-CX3및 C(〓O)CH3. 각각의 "X"는 할로겐, 즉, F, Cl, Br 및 I로부터 독립적으로 선택된다. 또한, 동일한 환 탄소에 부착되어 있는 치환체는 함께 〓CH2 또는 〓O일 수 있다. 예를들어, R1과 R3, R2와 R4또는 R5와 R6는 함께 〓CH2일 수 있다. 유사하게, 예를들어, R5와 R6는 함께 〓O일 수 있다. 여러가지 무수물을 상업적으로 입수할 수 있거나 (예, Aldrich, Milwaukee, WI), 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다 (예, March 및 상기에 언급된 문헌에 기술되어 있는 방법: J. March, Advanced Organic Chemistry, 2nd edition, McGraw-Hill, New York, N.Y. (1977)). 상기 화합물에 대한 변화가 본 발명에 의해 고려되며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 기재가 소유된 경우 본 발명의 정신과 범주내에 있다는 것이 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 적합한 화합물을 비-특이적 부위를 차단시키기에 충분한 조건하에서 고정화된 표적화 리간드를 함유하는 고체 지지체와 반응시킨다. 간략해서, 화합물을 일반적으로 극성 용매와 같은 용매와 혼합한다. 상기 용액을 일반적으로 약 수분 내지 수시간 범위의 시간 동안 일반적으로 약 실온 내지 용매의 비점 이하의 온도 범위에서 고체 지지체에 가한다. 예를들어, 숙신산 무수물을 혼합하여 최종 농도가 ㎖ 당 약 0.01 ㎎ 내지 10 ㎎이 되도록 하고, m-피롤, 아세토니트릴 또는 기타 극성 용매와 같은 용매는 pH 약 7 내지 9에서 약 0.01 내지 0.5M 붕산나트륨을 함유한다. 고체 지지체와의 반응을 약 20 내지 37 ℃에서 약 2 내지 60분간 수행한다. 특정 표적화 리간드를 화합물과 반응시킬 수 있고 상기와 같은 반응이 표적화 리간드의 프로브 결합능력에 현저하게 영향을 줄수 있는 경우, 표적화 리간드와 화합물간의 상기와 같은 반응에 대해 보호시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 표적화 리간드를 보호하거나 화합물이 고정화된 표적화 리간드를 함유하는 고체 지지체와 반응하는 조건을 조정하는 것을 포함한 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 예를들면, pH를 고체 지지체와 화합물과의 실질적인 반응은 허용하지만, 표적화 리간드와 화합물과의 실질적인 반응은 허용하지 않는 pH로 조정할 수 있다. 별법으로는, 예를들어, 화합물과 반응성일 수 있는 표적화 리간드상의 작용성 기를 가역적으로 보호시킬 수 있다. 표적화 리간드를 화합물과의 반응을 방지하는 보호성 화학물질 1종 이상과 반응시키고, 화합물을 고정화된 표적화 리간드를 함유하는 고체 지지체와 반응시킨후 보호성기를 표적화 리간드로부터 제거한다. 분자상의 작용성기의 가역적 보호방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다 (예, procedures described in Greene and references cited therein: T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, New York, N.Y. (1981)).
상기 나타낸 바와 같이, 비-방향족 및 방향족 화합물이 본 발명내에서 사용될 수 있다. 화합물의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 이소부티르산 무수물, 발레르산 무수물, (s)-(+)-메틸부티르산 무수물, 트리메틸아세트산 무수물, 헥사노산 무수물, 헵타노산 무수물, 데카노산 무수물, 라우르산 무수물, 팔미트산 무수물, 스테아르산 무수물, 도코사노산 무수물, 크로톤산 무수물, 메타크릴산 무수물, 올레산 무수물, 리놀레산 무수물, 클로르아세트산 무수물, 요오도아세트산 무수물, 디클로로아세트산 무수물, 트리플루오로아세트산 무수물, 클로로디플루오로아세트산 무수물, 트리클로로아세트산 무수물, 숙신산 무수물, 펜타플루오로프로피온산 무수물, 헵타플루오로부티르산 무수물, 메틸숙신산 무수물, 2,2-디메틸숙신산 무수물, 시스-1,2-시클로헥산디카복실산 무수물, 트랜스-1,2-시클로헥산디카복실산 무수물, 프탈산 무수물, 이타콘산 무수물, 2-도데센-1-일숙신산 무수물, 디카복실산 무수물, 시스-아콘산 무수물, s-아세틸머캅토숙신산 무수물, (+)-디아세틸-L-타르타르산 무수물, 말레산 무수물, 시트라콘산 무수물, 2,3-디메틸말레산 무수물, 말레산 무수물, 글루타르산 무수물, 벤조산-, 2,3-디페닐말레산-, 2-페닐글루타르산-, 호모팔산-, 이사토산-, N-메틸이사토산-, 5-클로로이사토산-, 프탈산-, 2-술포벤조산 시클릭-, 4-메틸프탈산, 3,6-디플루오로프탈산-, 3,6-디클로로프탈산-, 4,5-디클로로프탈산-, 테트라플루오로프탈산-, 테트라브로모프탈산-, 3-히드록시프탈산-, 카복실산-무수물, 3-니트로프탈산-, 4-니트로프탈산-, 디펜산- 및 나팔산-무수물.
바람직한 화합물은 다음과 같다: 크로톤산 무수물, 클로로아세트산 무수물, 디클로로아세트산 무수물, 트리플루오로아세트산 무수물, 클로로디플루오로아세트산 무수물, 트리클로로아세트산 무수물, 펜타플루오로프로피온산 무수물, 헵타플루오로부티르산 무수물, 숙신산 무수물, 메틸숙신산 무수물, 2,2-디메틸숙신산 무수물, 이타콘산 무수물, 말레산 무수물, 시트라콘산 무수물, 2,3-디메틸말레산 무수물, 1-시클로펜텐-1,2-디카복실산 무수물, 3,4,5,6-테트라히드로프탈산 무수물, 브로모말레산 무수물, 디클로로말레산 무수물, 글루타르산 무수물, 3-메틸글루타르산 무수물, 2,2-디메틸글루타르산 무수물, 3,3-디메틸글루타르산 무수물, 3-에틸-3-메틸글루타르산 무수물, 헥사플루오로글루타르산 무수물, 3,5-디아세틸테트라히드로피란-2,4,6-트리온, 디글리콜산 무수물, 3,6-디플루오로프탈산 무수물, 3,6-디클로로프탈산 무수물, 테트라플루오로프탈산 무수물, 테트라클로로프탈산 무수물, 테트라브로모프탈산 무수물, 3-히드록시프탈산 무수물 및 2,3-디브로모말레산 무수물.
하이브리드화 반응중에 "차단된" 고체 지지체 (표적 리간드를 함유함)를 사용하기 전에, 고체 지지체와 반응하지 않은 차단 화합물을 거의 모두 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 범주내에서 여러가지 방법을 사용하여 상기 제거 단계를 수행할 수 있다. 예를들면, 미반응 화합물은 화합물을 함유하지 않는 용액으로 고체 지지체를 세정하는 것과 같이 세척할 수 있다. 유사하게, 반응 용액으로부터 고체 지지체를 물리적으로 제거함으로써 미반응 화합물을 제거할 수 있다. 달리는, 미반응 화합물은 화학적 퀀칭 반응에 의해 제거할 수 있다. 예를들면, 가수분해 또는 반응 용액에 첨가되는 아민과 반응시킴으로써 미반응 무수물을 비-반응성 형태로 전환시킬 수 있다. 이들 기술은 다른 기술과 함께 또는 모두 함께 사용할 수 있다. 미반응 화합물의 제거는 고정화후 또는 중간 시간 경과후에 즉시 수행할 수 있다. 시간 간격이 충분히 긴 경우, 무수물이 이미 비-반응성 형태로 가수분해될 수 있기 때문에 어떤 조치도 취할 필요가 없다. 또한, 미반응 화합물의 존재가 고정화된 표적화 리간드를 함유하는 고체 지지체의 특정 용도에 방해가 되지 않는 경우가 있을 수 있다.
고정화된 표적화 리간드와 차단된 비-특이적 부위를 함유하는 고체 지지체를 제조한 다음, 고체 지지체를 프로브 (후보 결합 파트너)와 접촉시켜 프로브가 표적화 리간드와 하이브리드화될 수 있는지를 측정한다. 표적화 리간드로서 사용가능한 상기 분자 어느것도 프로브로 사용할 수 있다. 따라서, 프로브는 핵산, 단백질 및 작은 유기 또는 생체-유기 (예, 천연 생성물) 분자를 포함한다. 예를들면, 프로브가 핵산인 경우, 핵산은 메신저 RNA (mRNA)로부터 또는 cDNA로부터, 유기체 게놈의 전체 서열 또는 이의 일부로부터 수득할 수 있다. 일단 적합한 서열을 결정한 다음, 상업적으로 입수가능한 방법과 장치 (예, Applied BioSystems, Foster City, CA)를 사용하여 DNA 프로브를 화학적으로 바람직하게 합성한다. 예를들어, 고체상 방법을 사용하여 15 내지 50개 염기 사이의 짧은 프로브를 생산할 수 있다 (Caruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Qunat. Biol. 47:411 (1982)).
하이브리드화 배지는 일반적으로 표준 완충액과 세제를 함유한다. 시트르산나트륨, Tris HCl, PIPES 또는 HEPES와 같은 완충액을 약 0.01 M 내지 0.2 M의 농도로 사용할 수 있다. 하이브리드화 배지는 또한 전형적으로 약 0.01% 내지 0.5%의 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 또는 Sarkosyl (Sigma, St. Louis, Missouri)과 같은 이온성 또는 비이온성 세제, 약 1 내지 10 mM 사이의 EDTA 및 약 0.1 내지 1M NaCl을 함유한다. 음이온성 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트와 같은 여러가지 극성 수용성 제제, 및 덱스트란 술페이트 등과 같은 하전된 사카라이드성 중합체를 포함하는 용적 배척제와 같은 다른 첨가제를 포함시킬 수 있다. 본 발명의 하이브리드화 검정법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법으로 또는 본 명세서의 안내문에 제공된 면역검정법 방법론과 유사하게 수행할 수 있다. 하이브리드화 검정법은 전형적으로 약 4 ℃ 내지 70 ℃ 범위의 온도에서 전형적으로 약 1 시간 내지 72 시간 범위의 기간 동안 수행한다. 하이브리드화 온도는 하이브리드화를 지지시키는 용액중에 존재하는 염, 혼란입자(chaotrope) 등의 농도에 따르는 것으로 공지되어 있다. 바람직한 검정 방법은 샌드위치 검정법 및 이의 변형 방법, 및 경쟁 또는 치환 검정법이다. 하이브리드화 기술은 일반적으로 문헌에 기술되어 있다: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames and Higgins (eds.), IRL Press (1985); Gall and Pardue. Natl. Acad. Sci. USA. 63:378(1969) 및 John et al., Nature 223:582 (1969). 하이브리드화가 개선됨에 따라, 이들을 용이하게 적용시킬 수 있다.
하이브리드화의 특이성 (엄격성) (즉, 표적화 리간드에 대한 프로브의 결합)은 당해 분야에 공지된 수많은 여러가지 방법으로 조절할 수 있다 (예, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press (1989)). 예를들면, 염 농도, 항온처리 시간 및(또는) 항온처리 온도를 변화시켜 특이성을 조절할 수 있다. 결합 반응시 또는 세척 단계시 또는 둘다일때 특이성을 조절할 수 있다. 예를들면, 고체 지지체상에 고정화된 표적 리간드와 함께 프로브를 항온처리하는 조건은 엄격한 결합만이 허용될 수 있도록 할 수 있다. 별법으로는, 결합 반응에 대한 조건은 덜 엄격할 수 있지만, 세척 (결합 반응 이후 단계)은 고정화된 표적 리간드를 통하여 고체 지지체에 결합된 상태로 남아있는 특이성을 조절하기에 엄격한 조건하에서 수행할 수 있다. 본 발명의 범주내에서, 고정화된 표적 리간드에 대한 프로브의 결합 특이성은 상기한 방법을 포함한, 여러가지 방법으로 조절할 수 있다.
예를들면, 사용되는 특정 하이브리드화 용액에 적합한 온도 및 기간 동안 하이브리드화시킨 후, 프로브 핵산-표적 핵산 복합체가 부착되어 있는 고체 지지체를 하이브리드화 용액에 제공되는 것과 유사한 시약 (예, NaCl, 완충액, 유기 용매, 및 세제)을 전형적으로 함유하는 용액중에 도입시킨다. 이들 시약은 하이브리드화 용액중에서와 유사한 농도일 수 있지만, 하이브리드화에서 높은 엄격도가 요구되는 경우 통상적으로 더 낮은 농도일 수 있다. 세척 기간은 약 수분에서부터 수시간까지 변화될 수 있다. 하이브리드화 또는 세척 매질은 엄격할 수 있다. 적절하게 엄격히 세척한 후, 정확한 하이브리드화 복합체를 표지물의 특성에 따라서 검출할 수 있다.
하이브리드화 정도의 측정은 당해 분야에 숙지된 방법으로 수행할 수 있다. 검출가능한 하이브리드화가 없는 경우, 하이브리드화 정도는 0이다. 하이브리드화는 "직접적으로" (즉, 프로브가 리포터기를 함유하는 경우) 또는 "간접적으로" (즉, 리포터기가 프로브의 존재를 검출하기위하여 사용되는 분자상에 존재하는 경우) 검출할 수 있다. 여러가지 표지물 (시그날)이 본 발명내에서 사용하기에 적합하다. 표지물은 표적 서열과 이의 상보적인 시그날 서열간의 이합체 형성을 검출하기위한 리포터기로서 작용한다. 본 발명에서 사용되는 리포터기는 관찰, 측정 또는 검출할 수 있는 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 기이다. 색상 변화, 발광, 형광 또는 방사성과 같은 특성에 의해 검출가능성이 제공될 수 있거나, 또는 리간드 인식 부위로서 작용하는 리포터기의 능력에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로, 예를들어, 표지된 시그날 핵산 프로브를 사용하여 핵산 하이브리드화를 검출할 수 있다. 상보적인 핵산 (시그날 프로브)은 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는데 전형적으로 사용되는 여러가지 방법 중 하나로 표지시킬 수 있다. 예를들어, 표지된 핵산 프로브는 닉 해독(nick translation)에 의해 표지된 이본쇄 DNA, 재조합 M13 박테리오파아지에 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 프라이머 연장에 의해 제조된 일본쇄 DNA, 방사성표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 바이오틴 또는 다이곡신 표지된 합성 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 원핵세포 DNA-의존성 RAN 폴리머라제 (예, 박테리오파아지 SP6, T7, 또는 T3 RNA 폴리머라제)를 사용하여 시험관내에서 합성시킨 RNA를 포함한다. 이들 프로브의 합성 방법 및 사용 방법은 예를들어 하기 문헌에 기술되어 있다: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press (1989). 가장 통상적인 검출 방법은3H,125I,35S,14C,32P-표지된 프로브 등에 대한 방사선 사진술을 사용하는 것이다. 다른 표지물로는 표지된 항체, 형광단, 화학발광제, 효소에 결합하며, 표지된 리간드에 대해 특이적인 결합쌍 구성원으로서 제공될 수 있는 리간드가 있다. 표지물의 선택은 감응도 요구조건, 프로브와의 접합 용이성, 안정성 요구조건 및 입수용이성 요구조건에 따른다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
비-동위성 프로브는 시그날 (형광단, 화학발광제, 효소 및 효소 기질과 같은)로 직접 표지시키거나 결합되어 있는 검출가능한 시그날을 갖는 잔기에 결합할 수 있는 리간드와 접합시켜 간접적으로 표지시킬 수 있다. 예를들면, 프로브에 공유결합되어 있는 바이오틴은 효소 또는 광반응성 화합물과 같은 검출가능한 시그날에 공유결합하는 스트렙타비딘을 결합시킬 수 있다. 리간드와 수용체 혼합물은 광범위하게 변화될 수 있다. 리간드가 천연 "수용체" (즉, 바이오틴, 티록신 및 코르티솔과 같은 리간드)를 갖는 경우, 이는 표지된, 천연의 수용체와 함께 사용할 수 있다. 별법으로는, 합텐(hapten) 또는 항원은 적합하게 표지된 항체와 함께 사용할 수 있다.
비-방사성 프로브는 통상적으로 간접적인 방법으로 표지시킨다. 일반적으로 리간드 분자를 프로브에 공유결합시킨다. 이후 리간드는 본질적으로 검출가능하거나 검출가능한 효소, 형광성 화합물 또는 화학발광성 화합물과 같은 시그날 시스템에 공유결합되어 있는 안티리간드 분자에 결합한다. 리간드와 안티리간드는 광범위하게 변화시킬 수 있다. 리간드가 천연 안티-리간드, 예를들어, 바이오틴, 티록신 및 코르티솔을 갖는 경우, 천연의 안디-리간드와 함께 사용할 수 있다. 별법으로는, 합텐 또는 항원 화합물은 항체와 함께 사용할 수 있다.
시그날로서 사용하기에 적합한 효소로는 가수분해효소 (특히 포스파타제), 에스테라제, 우레아제, 글리코시다제, 옥시도리덕타제 (특히 페리옥시다제)가 있다. 적합한 형광성 시그날로는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실 움벨리페론 등이 있다. 본 발명내에서 유용한 화학발광제로는 루시페린, 루미놀, 및 1,2-디옥세탄이 있다.
하이브리드화 용액중에 존재하는 표지된 프로브의 양은 광범위하게 변화될 수 있다. 일반적으로, 표적 리간드에 대한 프로브의 결합 비율을 향상시키기 위해서는 표적 리간드의 양보다 실질적 몰 과량의 프로브를 사용한다.
시그날 검출 수단은 선택된 시그날에 의해 결정된다. 예를들어, 표지물이 방사성 동위원소인 경우, 포획되어 표지된 프로브-표적 리간드 복합체를 함유하는 지지체 표면을 X-선 필름에 노출시키거나 섬광 또는 감마 계수기중에서 분석할 수 있다. 표지물이 형광성인 경우, 복합체를 특정 파장의 광선으로 조사시키고 표지된 복합체에 의해 흡수시켜, 검출되는 더 낮은 파장의 광선을 방출시킨다. 표지물이 효소인 경우, 복합체를 효소에 대해 적합한 기질과 함께 항온처리한 다음, 발생된 시그날은 예를들어, 착색된 침전물, 착색되거나 형광성 가용성 화합물 또는 물질, 또는 생체발광 또는 화학발광에 의해 발생되는 광자일 수 있다.
프로브는 표지물에 직접 접합시킬 수 있다. 예를들어, 프로브가 방사성인 경우, 프로브를 이의 상보체와 함께 X-선 필름에 노출시킨다. 표지물이 형광성인 경우, 먼저 특정 파장의 광에 조사시킨 다음 검출기로 광 방출을 검출하여 시료를 검출한다 (Freifelder, Physical Biochemistry, W.H. Freeman & Co. (1982), p. 537). 표지물이 효소인 경우, 효소에 대해 적합한 기질상에서 항온처리하여 시료를 검출한다. 발생된 시그날은 착색된 침전물, 착색되거나 형광성인 가용성 물질 또는 생체-발광 또는 화학발광에 의해 발생되는 광자일 수 있다. 예를들어, 알칼린 포스파타제는 탈포스포릴레이트 인독실 포스페이트이며 이는 이후 환원 반응으로 침전물이 되어 테트라졸륨염을 고도로 착색되고 불용성인 포르마잔으로 전환시킨다.
표지물은 또한 하이브리드화 복합체의 간접적인 검출을 가능케 한다. 예를들어, 표지물이 합텐 또는 항원인 경우, 항체를 사용하여 시료를 검출할 수 있다. 이들 시스템에서, 형광성 또는 효소 분자가 항체에 부착됨으로써 시그날이 발생되고, 어떤 경우에는, 방사성 화합물에 부착됨으로써 발생된다 (Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon and van Knippenberg (eds.), Elsevier (1985), p. 9).
프로브를 검출하기전에, 고정화된 표적 리간드에 결합하지 않은 프로브를 실질적으로 모두 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명내에서 여러가지 방법을 사용하여 상기 제거 단계를 수행할 수 있다. 예를들어, 고체 지지체를 세정함으로써 미결합 프로브를 세척할 수 있다. 유사하게, 하이브리드화 반응 용액으로부터 고체 지지체를 물리적으로 제거하여 미결합 프로브를 제거할 수 있다. 별법으로는, 퀀칭 반응 (즉, 미결합 프로브를 더 이상 검출가능하지 않은 형태로 전환시킴)에 의해 미결합 프로브를 제거할 수 있다. 이들 방법은 다른 방법과 함께 또는 모두 조합하여 사용할 수 있다.
다음 실시예는 설명을 위하여 제공되며 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1
비색계 리포터를 사용하여 덴하르트 시약 차단된 니트로셀룰로오스와 비교한 숙신산 무수물 차단된 니트로셀룰로오스에 대한 배경 감소의 증명
본 실시예에서는, DNA를 니트로셀룰로오스 필터에 점적하여, 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 이어서 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 비색계 기질을 사용하여 스트렙타비딘/알칼린 포스파타제로 검출한다. 니트로셀룰로오스의 화학적 차단 수단을 전통적인 차단제와 비교한다.
플라스틱-베이킹시킨 니트로셀룰로오스 (Schleicher and Schuell, part #76489, Keene, NH)를 1x3 ㎝ 단편으로 절단한다. 이어서 니트로셀룰로오스를 한쪽 말단을 침지시켜 에탄올 용액을 통하여 밀어넣어 50% 에탄올에 간단히 침지시킨다. 상기 쉬트를 물로 간단하게 3회 세척한 다음 진탕시키면서 2xSSC (20xSSC는 pH 7.0에서 최종 용적이 물을 넣어 1ℓ가 되도록 용해시킨 NaCl 175.3 g 및 시트르산나트륨 88.2 g임)에 5분간 침지시킨다. 람다 이본쇄 DNA (dsDNA) 100 ng을 300 μ 간격으로 점적시킨다. λ 이본쇄 DNA(dsDNA) 100ng을 300μm 간격으로 점적한다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 상기 쉬트를 50% EtOH로 습윤시킨 다음, 물로 2회 세척한다. 이어서 상기 쉬트를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척하여, 물로 일단 세척한 다음 쉬트를 종이 타월로 두드리며 건조시킨다. DNA를 다시 UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 처리한다. 상기 쉬트를 50% 에탄올로 5분간 다시 수화시키고, 물로 2회 세척한다.
이후, 상기 쉬트를 별개의 "차단" 공정을 위하여 2개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 하나의 컨테이너에는 화학제제 숙신산 무수물로 차단시킨 니트로셀룰로오스 쉬트가 들어있다. 상기 쉬트를 숙신산 무수물로 차단시키기 위하여, 숙신산 무수물 2.5 g을 m-파이롤 25 ㎖에 용해시키고 0.1M Na붕산염 pH 8.5 125 ㎖를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 제2 컨테이너중의 쉬트는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5 g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris pH, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 당 1분간 1xSSC/0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% 사르코실)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/알칼린 포스파타제 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다 (1:10,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 상기 쉬트에 인가한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액으로 4회 세정하고, 검출 완충액 (0.1M NaCl, 0.01M Tris pH 8.5, 0.05M MgCl2)으로 5분간 1회 세정한다. BCIP/NBT 정제 (Schleicher and Schuell, part #78349, Keene, NH)를 dH2O 30 ㎖에 용해시켜 알칼린 포스파타제 기질을 제조한다. 실온에서 4시간 동안 반응을 수행한다. 이어서 쉬트를 물로 세정하여 건조시킨다.
숙신산 무수물 차단 덴하르트 차단
1 내지 10의 스케일에 대한 배경의 색상 1 7
상기 결과 (표 1)는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 숙신산 무수물로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 낮음을 나타낸다.
실시예 2
형광성 리포터를 사용하여 덴하르트 시약 차단된 니트로셀룰로오스와 비교한 숙신산 무수물 차단된 니트로셀룰로오스에 대한 배경 감소의 증명
본 실시예에서는, DNA를 니트로셀룰로오스 필터에 점적하여, 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 4-메틸-움벨리페릴 포스페이트 (4-히드록시-메틸 쿠오마린)을 사용하여 스트렙타비딘/알칼린 포스파타제로 검출한다. 니트로셀룰로오스의 화학적 차단 수단을 전통적인 차단제와 비교한다.
플라스틱-베이킹시킨 니트로셀룰로오스 (Schleicher and Schuell, part #76489, Keene, NH)를 1x3 ㎝ 단편으로 절단한다. 이어서 니트로셀룰로오스를 한쪽 말단을 침지시켜 에탄올 용액을 통하여 밀어넣어 50% 에탄올에 간단히 침지시킨다. 상기 쉬트를 물로 간단하게 3회 세척한 다음 진탕시키면서 2xSSC에 5분간 침지시킨다음, 람다 이본쇄 DNA (dsDNA) 100 ng을 300 μ 간격으로 점적시킨다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 상기 쉬트를 50% EtOH로 습윤시킨 다음, 물로 2회 세척한다. 이어서 상기 쉬트를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척하여, 물로 일단 세척한 다음 쉬트를 종이 타월로 두드리며 건조시킨다. DNA를 다시 UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 처리한다. 상기 쉬트를 50% 에탄올로 5분간 다시 수화시키고, 물로 2회 세척한다. DNA를 함유하는 상기 쉬트는 DNA를 함유하지 않는 대조군 쉬트와 상이하게 표시한다.
이후, 상기 쉬트를 별개의 "차단" 공정을 위하여 2개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 하나의 컨테이너에는 화학제제 숙신산 무수물로 차단시킨 니트로셀룰로오스 쉬트가 들어있다. 상기 쉬트를 숙신산 무수물로 차단시키기 위하여, 숙신산 무수물 2.5 g을 m-파이롤 25 ㎖에 용해시키고 0.1M Na붕산염 pH 8.5 125 ㎖를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 제2 컨테이너중의 쉬트는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5 g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris pH 7.2, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 당 1분간 1xSSC, 0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% 사르코실)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/알칼린 포스파타제 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다 (1:10,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 상기 쉬트에 인가한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액으로 4회 세정하고, 검출 완충액 (0.1M NaCl, 0.01M Tris pH 8.5, 0.05M MgCl2)으로 5분간 1회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 개별적으로 0.5 mM 4-메틸-움벨리페릴 포스페이트 (4-히드록시-메틸 쿠오마린) 1 ㎖와 함께 항온처리한다. 실온에서 4시간 동안 반응을 수행한다. 상기 용액의 일부를 회수하여 (150 ㎕) 검정색 미세역가판 (Dynatek Laboratories, Chantilly, Va.)에 놓는다. 이어서 Fluoroskan II 형광계 (Flow Laboratories, McLean, Va.)를 사용하여 360 nm의 여기 파장을 사용하고 456 nm에서의 방출을 모니터하여 상기 판을 직접 판독한다.
쉬트# 숙신산 무수물 차단 덴하르트 차단
+DNA 425 rfu 619 rfu
-DNA 20 rfu 395 rfu
상기 결과 (표 2)는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 숙신산 무수물로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 더 낮음을 나타낸다.
실시예 3
화학발광성 리포터를 사용하여 덴하르트 시약 차단된 니트로셀룰로오스와 비교한 숙신산 무수물 차단된 니트로셀룰로오스에 대한 배경 감소의 증명
본 실시예에서는, DNA를 니트로셀룰로오스 필터에 점적하여, 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 화학발광성 기질 Lumingen을 사용하여 스트렙타비딘/알칼린 포스파타제로 검출한다. 니트로셀룰로오스의 화학적 차단 수단을 전통적인 차단제와 비교한다.
플라스틱-베이킹시킨 니트로셀룰로오스 (Schleicher and Schuell, part #76489, Keene, NH)를 1x3 ㎝ 단편으로 절단한다. 이어서 니트로셀룰로오스를 한쪽 말단을 침지시켜 에탄올 용액을 통하여 밀어넣어 50% 에탄올에 간단히 침지시킨다. 상기 쉬트를 물로 간단하게 3회 세척한 다음 진탕시키면서 2xSSC에 5분간 침지시킨다음, 람다 이본쇄 DNA 100 ng을 300 μ 간격으로 점적시킨다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 상기 쉬트를 50% EtOH로 습윤시킨 다음, 물로 2회 세척한다. 이어서 상기 쉬트를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척하여, 물로 일단 세척한 다음 쉬트를 종이 타월로 두드리며 건조시킨다. DNA를 다시 UV 조사(30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 처리한다. 상기 쉬트를 50% 에탄올로 5분간 다시 수화시키고, 물로 2회 세척한다. DNA를 함유하는 상기 쉬트는 DNA를 함유하지 않는 대조군 쉬트와 상이하게 표시한다.
이후, 상기 쉬트를 별개의 "차단" 공정을 위하여 2개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 하나의 컨테이너에는 화학제제 숙신산 무수물로 차단시킨 니트로셀룰로오스 쉬트가 들어있다. 상기 쉬트를 숙신산 무수물로 차단시키기 위하여, 숙신산 무수물 2.5 g을 m-파이롤 25 ㎖에 용해시키고 0.1M Na붕산염 pH 8.5 125 ㎖를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 제2 컨테이너중의 쉬트는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5 g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris pH 7.2, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 당 1분간 1xSSC, 0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% 사르코실)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/알칼린 포스파타제 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다 (1:10,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 상기 쉬트에 인가한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액으로 4회 세정하고, 검출 완충액 (0.1M NaCl, 0.01M Tris pH 8.5, 0.05M MgCl2)으로 5분간 1회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 개별적으로 Lumingen (Lumingen Inc., Detroit, MI) 1 ㎖와 함께 항온처리한다. 실온에서 4시간 동안 반응을 수행한다. 상기 용액의 일부를 회수하여 (200 ㎕) 5 ㎜ x 40 ㎜ 폴리프로필렌관에 놓는다. Turner TD 20e 형광계 (Turner Designs, Sunnyvale, CA)를 사용하여 1분간의 적분시로 시그날을 측정한다.
쉬트# 숙신산 무수물 차단 덴하르트 차단
+DNA 680 rfu 725 rfu
-DNA 200 rfu 580 rfu
상기 결과 (표 3)는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 숙신산 무수물로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 더 낮음을 나타낸다.
실시예 4
차단제로서 숙신산 무수물을 사용하여 나일론 및 니트로셀룰로오스막 둘다에 대한 배경 감소의 증명 (하이브리드화된 프로브의 존재는 비색계 리포터를 사용하여 검출함)
본 실시예에서는, DNA를 상이한 타입의 필터상에 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 비색계 기질을 사용하여 스트렙타비딘/알칼린 포스파타제로 검출한다. 니트로셀룰로오스의 화학적 차단 수단을 전통적인 차단제와 비교한다.
본 실시예에서 사용되는 막 필터는 프로트란 니트로셀룰로오스 (Protran Nitrocellulose), 플라스틱-베이킹된 니트로셀룰로오스 (part #76489), OptitranTM니트로셀룰로오스, NytranR나일론막 (Schleicher and Schuell, Keene, NH) 및 HybondTM-N 및 HybondTM-N+ 나일론막 (Amersham, Arlington Heights, IL, 60005)이 있다.
니트로셀룰로오스와 나일론막을 1x1 ㎝ 단편으로 절단한다. 이어서 니트로셀룰로오스를 한쪽 말단을 침지시켜 에탄올 용액을 통하여 밀어넣어 50% 에탄올에 간단히 침지시킨다. 상기 쉬트를 물로 간단하게 3회 세척한 다음 진탕시키면서 2xSSC에 5분간 침지시킨다음, 람다 이본쇄 DNA 100 ng을 300 μ 간격으로 점적시킨다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 상기 쉬트를 50% EtOH로 습윤시킨 다음, 물로 2회 세척한다. 이어서 상기 쉬트를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척하여, 물로 일단 세척한 다음 쉬트를 종이 타월로 두드리며 건조시킨다. DNA를 다시 UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 처리한다. 상기 쉬트를 50% 에탄올로 5분간 다시 수화시키고, 물로 2회 세척한다.
이후, 상기 쉬트를 별개의 "차단" 공정을 위하여 2개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 하나의 컨테이너에는 화학제제 숙신산 무수물로 차단시킨 니트로셀룰로오스 쉬트가 들어있다. 상기 쉬트를 숙신산 무수물로 차단시키기 위하여, 숙신산 무수물 2.5 g을 m-파이롤 25 ㎖에 용해시키고 0.1M Na붕산염 pH 8.5 125 ㎖를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 제2 컨테이너중의 쉬트는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris pH, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 당 1분간 1xSSC, 0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% Tween 20)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/알칼린 포스파타제 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다 (1:10,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 상기 쉬트에 인가한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액으로 4회 세정하고, 검출 완충액 (0.1M NaCl, 0.01M Tris pH 8.5, 0.05M MgCl2)으로 5분간 1회 세정한다. BCIP/NBT 정제 (Schleicher and Schuell, part# 78349, Keene, NH)를 dH2O 30 ㎖에 용해시켜 알칼린 포스파타제 기질을 제조한다. 실온에서 0.5 내지 4시간 동안 반응을 수행한다. 상기 쉬트를 물로 세정하여 건조시킨다.
막 타입 숙신산 무수물 차단 덴하르트 차단
프로트란 니트로셀룰로오스 1 3
플라스틱-베이킹된 니트로셀룰로오스 1 6
OptitranTM니트로셀룰로오스 1 3
NytranR나일론막 1 4
HybondTM-N 나일론막 1 4
HybondTM-N+ 나일론막 1 5
여기서 배경의 강도는 1 내지 10의 스케일로 등급화되며, 1은 거의 변화되지 않는 표면 색상(백색)을 나타내고 10은 강력하게 착색된 표면(암갈색)을 나타낸다.
상기 결과 (표 4)는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 숙신산 무수물로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 더 낮음을 나타낸다.
실시예 5
비색계 리포터를 사용하여 덴하르트 시약 차단된 니트로셀룰로오스와 비교한 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 차단된 니트로셀룰로오스에 대한 배경 감소의 증명
본 실시예에서는, 3가지 타입의 무수물을 비교한다. 무수물 타입을 비교하기 위하여, DNA를 니트로셀룰로오스 필터에 점적하여, 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 이어서 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 비색계 기질 (4-메톡시-나프톨, 4MN)을 사용하여 스트렙타비딘/서양고추냉이 퍼옥시다제 (SA/HRP)로 검출한다. 니트로셀룰로오스의 화학적 차단 수단을 또한 전통적인 차단제와 비교한다.
플라스틱-베이킹시킨 니트로셀룰로오스 (Schleicher and Schuell, part #76489, Keene, NH)를 1x3 ㎝ 단편으로 절단한다. 이어서 니트로셀룰로오스를 한쪽 말단을 침지시켜 에탄올 용액을 통하여 밀어넣어 50% 에탄올에 간단히 침지시킨다. 상기 쉬트를 물로 간단하게 3회 세척한 다음 진탕시키면서 2xSSC에 5분간 침지시킨다. 람다 이본쇄 DNA 100 ng을 300 μ 간격으로 점적시킨다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 상기 쉬트를 50% EtOH로 습윤시킨 다음, 물로 2회 세척한다. 이어서 상기 쉬트를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척하여, 물로 일단 세척한 다음 쉬트를 종이 타월로 두드리며 건조시킨다. DNA를 다시 UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 처리한다. 상기 쉬트를 50% 에탄올로 5분간 다시 수화시키고, 물로 2회 세척한다.
이후, 상기 쉬트를 별개의 "차단" 공정을 위하여 5개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 각각의 컨테이너는 화학제제 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 또는 숙신산 무수물로 차단시킨 니트로셀룰로오스 쉬트가 들어있다. 상기 쉬트를 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 또는 숙신산 무수물 중 하나로 차단시키기 위하여, 각각의 화합물을 최종 농도가 1M이 되도록 m-파이롤 25 ㎖에 용해시킨다. 이어서 등용적의 0.1M Na붕산염 pH 8.5를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 5번째 컨테이너중의 쉬트는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5 g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 쉬트에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 쉬트를 0.01M Tris pH, 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 당 1분간 1xSSC/0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% 사르코실)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/HRP 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다(1:2,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 상기 쉬트에 인가한다. 이어서 상기 쉬트를 세척 용액으로 4회 세정하고, 인산염 완충 염수 (PBS)으로 5분간 1회 세정한다. 4-메톡시-나프톨 25 ㎎을 MeOH 7.5 ㎖에 용해시켜 HRP 기질을 제조하는데 이는 이후 30% 과산화수소 33 ㎕를 함유하는 PBS 42. 5㎖에 가한다. 실온에서 15분간 반응을 수행한다. 이어서 쉬트를 물로 5회 세정하여 건조시킨다.
결과는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 무수물 중 하나로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 낮음을 나타낸다.
차단 단계의 타입 배경의 상대적인 색상(스케일 1 내지 10)
프로피온산 무수물 2
부티르산 무수물 2
디플루오로프탈산 무수물 3
숙신산 무수물 1
덴하르트 시약 7
배경의 스케일은 스케일 1 내지 10으로 나타내는데 1은 가장 밝은 색상 강도이고 10은 가장 어둡거나 가장 강력한 배경을 나타낸다. 결과는 덴하르트 시약 차단과 비교하여 니트로셀룰로오스 쉬트를 4가지 타입의 무수물 중 하나로 화학적으로 차단시킬 경우 배경이 실질적으로 감소됨을 나타낸다. 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물 및 디플루오로프탈산 무수물이 숙신산 무수물 만큼 효과적이지는 않지만, 이들은 덴하르트 용액보다는 개선된 것이다.
실시예 6
비색계 리포터를 사용하여 덴하르트 시약 차단된 슬라이드와 비교한 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 차단된 유리 슬라이드에 대한 배경 감소의 증명
본 실시예에서는, 3가지 타입의 무수물을 비-다공성 고체 지지체 (유리 슬라이드)를 사용하여 비교한다. 무수물 타입을 비교하기 위하여, 올리고뉴클레오티드를 가교결합제를 사용하여 슬라이드에 공유결합식으로 고정화시키고, 상보적인 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 프로브화한다. 이어서 하이브리드화된 시그날 올리고뉴클레오티드를 비색계 기질 (4-메톡시-나프톨, 4MN)을 사용하여 스트렙타비딘/서양고추냉이 퍼옥시다제 (SA/HRP)로 검출한다. 유리 슬라이드의 화학적 차단 수단을 또한 전통적인 차단제 (덴하르트 용액)와 비교한다.
슬라이드 (SectionlockTMPolyscience, Warrington, PA로부터 구입)를 물로 3회 세척한 다음 2xSSC에 4시간 동안 항온처리한다. 람다 이본쇄 DNA 100 ng을 마이크로피펫터를 사용하여 슬라이드상에 점적시킨다. UV 조사 (30초에 걸쳐 120,000 마이크로주울/㎠)시켜 DNA를 비가역적으로 고정시킨다. dsDNA를 변성시키기위하여, 슬라이드를 변성 용액 (0.1N NaOH, 0.05 mM EDTA)에 실온에서 1분간 침지시키고, 물로 신속하게 세정하고, 중화 용액 (0.1M Tris pH 7.2, 0.05mM EDTA)중에서 간단하게 3회 세척한다.
이후, 상기 슬라이드를 별개의 "차단" 공정을 위하여 5개의 컨테이너중으로 스플리팅시킨다. 각각의 컨테이너는 화학제제인, 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 또는 숙신산 무수물 중 하나로 차단시킨 슬라이드가 들어있다. 상기 슬라이드를 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물, 디플루오로프탈산 무수물 또는 숙신산 무수물 중 하나로 차단시키기 위하여, 각각의 화합물을 최종 농도가 1M이 되도록 m-파이롤 25 ㎖에 용해시킨다. 이어서 등용적의 0.1M Na붕산염 pH 8.5를 가한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 슬라이드에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 10분간 항온처리한다. 이어서 상기 슬라이드를 100% m-파이롤로 2회 세척한 다음 0.01M Tris 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다. 5번째 컨테이너중의 슬라이드는 덴하르트 용액으로 5회 차단시킨다. 이는 덴하르트 용액 50x 스톡 (Ficoll 5 g (type 400, Pharmacia), 폴리비닐피롤리돈 5 g, 소혈청 알부민 (분획 5, Sigma) 5 g, 및 물을 가하여 전체 용적이 500 ㎖) 10 ㎖를 물 90 ㎖에 넣고 단편화된 일본쇄 청어 정자 DNA를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하여 수행한다. 상기 용액을 잘 혼합한 다음 슬라이드에 가한다. 부드럽게 혼합하면서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 슬라이드를 0.01M Tris pH 및 0.005 EDTA로 5회 세척한다.
바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 (DMO 469 (GTTTAACATACTTTCATTT))를 신속한 하이브리드화 용액 (Rapid-Hyb, Amersham, Arlington Heights, IL) 1000 ㎕에 10 ng/㎖의 최종 농도로 가한다. 하이브리드화물을 42 ℃에서 60분간 가열한다. 이어서 상기 슬라이드를 세척 당 1분간 1xSSC/0.1% SDS로 4회 세정한다. 이어서 상기 슬라이드를 세척 용액 (0.01M Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.005M EDTA, 0.1% 사르코실)으로 2회 세척한다.
스트렙타비딘/HRP 접합체 (Vector, Burlingame, CA)를 세척 용액중에 희석시킨다 (1:2,000). 이어서 상기 용액을 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 슬라이드의 각각의 세트에 인가한다. 이어서 상기 슬라이드를 세척 용액으로 4회 세정하고, 인산염 완충된 염수 (PBS)으로 5분간 1회 세정한다. 4-메톡시-나프톨 25 ㎎을 MeOH 7.5 ㎖에 용해시켜 HRP 기질을 제조하는데 이는 이후 30% 과산화수소 33 ㎕를 함유하는 PBS 42.5 ㎖에 가한다. 실온에서 15분간 반응을 수행한다. 이어서 슬라이드를 물로 5회 세정하여 건조시킨다.
결과는 덴하르트 시약으로 차단시킨 쉬트와 비교하여 무수물 중 하나로 처리한 쉬트상에서의 "배경" 색상의 수준이 현저하게 낮음을 나타낸다.
차단 단계의 타입 배경의 상대적인 색상 (스케일 1 내지 10)
프로피온산 무수물 1
부티르산 무수물 2
디플루오로프탈산 무수물 2
숙신산 무수물 1
덴하르트 시약 4
배경의 스케일은 스케일 1 내지 10으로 나타내는데 1은 가장 밝은 색상 강도이고 10은 가장 어둡거나 가장 강력한 배경을 나타낸다. 결과는 덴하르트 시약 차단과 비교하여 시판되는 슬라이드를 4가지 타입의 무수물 중 하나로 화학적으로 차단시킬 경우 배경이 실질적으로 감소됨을 나타낸다. 부티르산 무수물 및 디플루오로프탈산 무수물이 프로피온산 무수물 또는 숙신산 무수물 만큼 효과적이지는 않지만, 이들은 덴하르트 용액보다는 개선된 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허원은 각각이 공보 또는 특허원이 상세하게 개별적으로 참고로 인용되는 경우와 동일한 정도의 참고로 본 명세서에서 인용된다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 본 명세서중에 기술되었지만, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 다양하게 변형시킬 수 있음이 자명하다.

Claims (20)

  1. (a) 하이브리드화용 고체 지지체에 표적 리간드를 고정화시키기에 충분한 조건하에서 표적 리간드와 상기 고체 지지체를 접촉시키는 단계 및
    (b) 고정화된 표적 리간드를 함유하는 고체 지지체상의 비-특이적 부위를 차단시키기에 충분한 조건하에서 상기 고체 지지체와 하기 화학식 I 내지 VIII의 화합물 중 하나와 반응시켜, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체를 제조하는 단계를 포함하는, 비-특이적 배경(background)을 감소시키는 하이브리드화 고체 지지체의 제조 방법.
    화학식 I
    화학식 II
    화학식 III
    화학식 IV
    화학식 V
    화학식 VI
    화학식 VII
    화학식 VIII
    상기식에서
    R1내지 R17은 독립적으로 H, OH, CH3, CH2-CH3, CH〓CH-CH3, X, CH2X, CHX2, CH2-CH2X, CH2-CHX2, CX3, CX2-CX3, CX2-CX2-CX3및 C(〓O)CH3로부터 선택되고,
    R1과 R3, R2와 R4또는 R5와 R6는 함께 〓CH2일 수 있으며, R5와 R6는 함께 〓O일 수 있고,
    각각의 X는 독립적으로 할로겐으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 따른 단계 (a) 및 (b)와, 추가로
    (c) 고정화된 표적 리간드에 특이적 결합시키기에 충분한 조건하에서 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체를 프로브와 접촉시키는 단계 및
    (d) 상기 고체 지지체상의 프로브의 존재를 검출하여, 표적 리간드와 프로브 사이에 하이브리드화를 측정하는 단계를 포함하는, 하이브리드화 반응에 있어서 비-특이적 배경을 감소시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b) 후에, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체와 반응하지 않은 화합물을 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 단계 (c)와 (d) 사이에, 고정화된 표적 리간드에 결합하지 않은 프로브를 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 단계 (b)와 (c) 사이에, 고정화된 표적 리간드를 함유하는 차단된 고체 지지체와 반응하지 않은 화합물을 거의 모두 제거하는 단계 및 또한, 단계 (c)와 (d) 사이에, 상기 고정화된 표적 리간드에 결합하지 않은 프로브를 거의 모두 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드가 핵산인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 고체 지지체가 니트로셀룰로오스막, 나일론막 또는 유리 표면인 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드가 단백질인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 고체 지지체가 니트로셀룰로오스막 또는 나일론막인 방법.
  10. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드가 핵산이고 프로브가 핵산 또는 단백질인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 고체 지지체가 니트로셀룰로오스막, 나일론막 또는 유리 표면인 방법.
  12. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드가 단백질이고 프로브가 단백질 또는 핵산인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 고체 지지체가 니트로셀룰로오스막 또는 나일론막인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R1및 R2가 모두 CH〓CH-CH3, CH2X, CX3, CX2-CX3또는 CX2-CX2-CX3이고, 각각의 X가 독립적으로 할로겐으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물인 방법.
  15. 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R1내지 R4가 H이거나; R1이 CH3이고 R2내지 R4가 H이거나; R2및 R4가 H이고 R1및 R3가 함께 〓CH2이거나; 또는 R1및 R2가 H이고 R3및 R4가 C(〓O)CH3인 화학식 II의 화합물인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R1내지 R4가 H이거나; R1이 CH3이고 R2가 H이거나; R1및 R2가 CH3이거나; R1이 X이고 R2가 H이거나; 또는 R1및 R2가 X이고; 각각의 X가 독립적으로 할로겐으로부터 선택되는 화학식 III의 화합물인 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R1내지 R6가 H이거나; R1내지 R5가 H이고 R6가 CH3이거나; R1및 R3가 CH3이고 R2, R4, R5및 R6가 H이거나; R1내지 R4가 H이고 R5및 R6가 CH3이거나; R1내지 R4가 H이고 R5가 CH3이며 R6가 CH2CH3이거나; R1내지 R6가 X이거나; 또는 R1및 R2가 H이고 R3및 R4가 C(〓O)CH3이며 R5및 R6가 함께 〓O인 화학식 IV의 화합물인 방법.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R7내지 R9가 H인 화학식 VI의 화합물 또는 R10내지 R13이 H인 화학식 VII의 화합물인 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 R14및 R17이 X이고 R15및 R16이 H이거나; R14내지 R17이 X이거나; 또는 R14가 OH이고 R15내지 R17이 H인 화학식 VIII의 화합물인 방법.
  20. 제1항 또는 제3항의 방법에 따라 제조된 고체 지지체를 포함하는 키트.
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