JP2015072153A - バイオセンサ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】体液中に存在する生体関連物質を簡便な方法で精度よく定量するバイオセンサを提供する。
【解決手段】水晶基板２２と、該水晶基板の一面に固着された複数の第１の電極２４ａ，２４ｂと、他面に固着された第２の電極２６とを有する水晶振動子２８を備えてなり、複数の第１の電極の少なくとも１つの表面には、特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化され、残りの第１の電極の少なくとも１つの表面には、当該捕捉物質が固定化されていない。複数の第１の電極の表面には、体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するためにブロッキング剤及び／又はカゼインが好適に固定化されている。
【選択図】図２

Description

本発明は、体液中に存在する生体関連物質を定量するバイオセンサ及びその製造方法に関する。更に、当該バイオセンサを用いて生体関連物質を定量する方法に関する。

ヒトを含む動物個体の健康状態を知る上で様々な有益な情報をもつマーカーが血液などの体液に微量ながら存在する。体液を採取するにあたり、例えば血液の場合、注射針を用いて吸引するには技術を要し煩雑であると同時に個体への負荷が大きいため定常的な採取が難しい。乳や尿などは採取が簡便なので定常採取に向いているが、マーカーの濃度が、例えば血液に比べて著しく低いことが知られている。
一般的に、マーカーの検出法としては、マーカーが持つ固有のアフィニティを利用してマーカーのみを分離し計測する高速液体クロマトグラフィーや特定のマーカーのみを捕捉する抗体を利用した抗原抗体反応を用いる酵素免疫測定法などがある。しかしながら、これらの方法は、前処理工程が多く、高感度を実現するためには長時間の作業や反応時間が必要となる。また、標識化した抗体が必要なため測定キットの価格が高い。簡便な検出手法としてイムノクロマト法が知られているが、定量性に欠けるという問題がある。

分子間相互作用に基づく計測技術として表面プラズモン共鳴法があるが、多くはゴニオメータを用いた光学系を利用するため装置が大がかりになる（例えば、非特許文献１参照）。同様に、分子間相互作用に基づく計測技術としてＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance：水晶振動子マイクロバランス）法があり、バイオセンサとして注目されている（例えば、特許文献１及び２参照）。

特開平７−１２６９５号公報 特開２００５−０８４０２８号公報（段落［００１８］）

J. S. Mitchell，T. E. Lowe，J. R. Ingram，Analyst, p.380-386, 2008

しかしながら、ＱＣＭ法は、水晶振動子が外乱の影響を受けやすいためノイズが大きいという課題がある。特許文献１記載の発明は、水晶振動子電極表面上にゼラチン薄膜を形成してレセプターの固定化膜を形成するものであるが、外乱の影響によるノイズの低減が不十分である。

本発明は、上記のような従来技術の課題を解決するものであり、体液中に存在する生体関連物質を簡便な方法で精度よく定量するバイオセンサを提供することを目的とする。

したがって、本発明の態様は、以下のとおりである。
［１］ 生体関連物質を検出するバイオセンサであって、水晶基板と、該水晶基板の一面に固着された複数の第１の電極と、他面に固着された１つの第２の電極とを有する水晶振動子を備えてなるバイオセンサ。
［２］ 複数の前記第１の電極の少なくとも１つは、表面に特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化されており、残りの１つは、表面に前記捕捉物質が固定化されていない上記［１］記載のバイオセンサ。
［３］ 複数の前記第１の電極は、表面に体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するために１又は複数種類のブロッキング剤が固定化されている上記［２］記載のバイオセンサ。
［４］ 前記ブロッキング剤の１つは、カゼインを含む液体であり、カゼインが前記第１の電極の表面に固定化されている上記［３］記載のバイオセンサ。
［５］ 前記ブロッキング剤の１つは、合成樹脂を主成分とし、動物由来の物質を含まない上記［３］又は［４］記載のバイオセンサ。
［６］ 前記水晶基板に固着され、且つ前記第１の電極上に液体を保持するためのケースを有し、該ケースが液体を注入する注入口を備える上記［１］ないし［５］のいずれかに記載のバイオセンサ。
［７］ 複数の前記第１の電極の少なくとも１つは、前記生体関連物質とは異なる生体関連物質を捕捉するために、表面に該異なる生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化されている上記［２］ないし［６］のいずれかに記載のバイオセンサ。
［８］ 前記捕捉物質は、生体関連物質との特異的な結合を解離させる再生液によって当該生体関連物質との結合が解離したものを含む上記［２］ないし［７］のいずれかに記載のバイオセンサ。
［９］ 生体関連物質を検出するバイオセンサを製造する方法であって、水晶振動子を構成する水晶基板の一面に複数の第１の電極を、他面に１つの第２の電極を固着し、複数の前記第１の電極の少なくとも１つに特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質を固定化し、前記第１の電極のすべてに体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するブロッキング剤を固定化する各ステップを含むバイオセンサの製造方法。
［１０］ 前記ブロッキング剤が、合成樹脂を主成分とし、実質的に動物由来の物質を含まないブロッキング剤、及び／又はカゼインであることを特徴とする上記［９］記載のバイオセンサの製造方法。
［１１］ 上記［１］ないし［７］のいずれかに記載のバイオセンサを用いて生体関連物質を定量する方法であって、特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質によって固定化された前記第１の電極（本明細書において「検体電極」ということがある。）に生じる周波数と該捕捉物質によって固定化されていない前記第１の電極（本明細書において「参照電極」ということがある。）に生じる周波数の差によって特定の生体関連物質を定量する方法。
［１２］ 競合阻害法によって特定の生体関連物質を定量する上記［１１］記載の方法。

本発明のバイオセンサ及びその製造方法によれば、水晶振動子を構成する水晶板の一面に複数の第１の電極を有するので、検体電極に生じる周波数と参照電極に生じる周波数の差を計測することによって、体液中に存在する生体関連物質を簡便な方法で精度よく定量することができる。

第１の実施形態のバイオセンサの外観図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。 第２の実施形態のバイオセンサの外観図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。 測定装置の一例を示すブロック図である。 バイオセンサによる測定結果（時間と周波数の関係）を示す図である。 コルチゾールにＢＳＡを固定化したトレーサーの測定結果（時間と周波数の関係）を示す図である。 コルチゾール濃度と差分周波数の関係を示す図である。

本発明において、生体関連物質とは、ヒトを含む動物の体液中に含まれる物質をいい、一般に、生命体を構成している要素あるいは生物が産生する物質であるアミノ酸、タンパク質、核酸、糖類、酵素、精子、血球などや、生物に対して生理作用ないしは薬理作用を発現する、ビタミン等の物質単体および化合物群及びストレスマーカーとしてのコルチゾール等を挙げることができる。生体から直接抽出されたものだけでなく、これらを化学処理あるいは化学修飾等したものも含まれる。また、各個体の状態を知る上で有益な情報をもつマーカーとして血液などの体液に微量ながら存在するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、その他のタンパク質が含まれる。

本発明において、被測定物質とは、測定対象の生体関連物質をいう。捕捉物質とは、被測定物質に対して特異的に結合する性質を有する物質であり、例えば被測定物質が核酸である場合には、当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸である。捕捉物質と被測定物質の組合せの例としては、抗体に対する抗原やその逆の組合せ、リガンドに対するレセプタやその逆の組合せ、転写因子等の遺伝子発現制御タンパク質に対する制御配列含有核酸分子やその逆の組合せなどであり、これらの組合せの特異的な結合は、例えば、特定の物質間で選択的に形成される、例えば水素結合、クーロン力、ファンデルワースル力などの分子間力に基づく結合を意味する。

以下、図を参照しつつ本発明のバイオセンサ及びその製造方法について詳細に説明する。
図１は、本発明の第１の実施形態によるバイオセンサを示し、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
バイオセンサ１０は、水晶基板１２を共振させるために、水晶基板１２の一面に４つの第１の電極１４ａ〜１４ｄと、他面に１つの第２の電極１６がそれぞれ固着された水晶振動子を備えてなる。
本発明のバイオセンサを使用する生体関連物質の測定法（ＱＣＭ法）とは、水晶振動子の電極表面に物質が付着すると、その重量に応じて周波数が低下する現象を利用する方法である。その周波数の変化は、固有周波数の２乗及び付着した物質の重量に比例する。従って、固有周波数が大きいほど高感度な測定に適している。

水晶振動子は、一般的に固有周波数が１×１０³Ｈｚから３×１０⁷Ｈｚまでのものが使用される。周波数を制限するものではないが、バイオセンサとして使用するためには固有周波数が高いほど高感度となる。現在市販されているものでは、例えば日本電波工業株式会社のＰＳＡ-ＳＢ-２００２ＴやＰＳＡ-ＳＥ-３００２Ｔなどの公称周波数３０ＭＨｚが最も高い。水晶基板１２としては、公称周波数３０ＭＨｚを使用した。

電極の材質は、導電性のあるものであれば特段規定するものではないが、例えば金、白金、銀、銅、クロム、チタン、タングステン、アルミニウム、酸化チタン、インジウムスズ酸化物などが挙げられる。腐食を防ぐために金や白金、又は表面が金や白金でコーティングされたものが好ましい。
第１の電極１４ａ〜１４ｄ及び第２の電極１６は、金でコーティングされている。

図２は、本発明の第２の実施形態によるバイオセンサを示し、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
バイオセンサ２０は、水晶基板２２を共振させるために、水晶基板２２の一面に２つの第１の電極２４ａ，２４ｂと、他面に１つの第２の電極２６がそれぞれ固着され、第１の電極２４ａ，２４ｂはケース２９で覆われている。ケース２９は、それぞれ液体を注入する注入口２９ｉと排出する排出口２９ｏを備える。その他の構成、水晶基板２２及び電極２４ａ，２４ｂの材料等は、バイオセンサ１０と同じである。ケース２９の容量は１００ｎＬ以上が好ましい。
バイオセンサ２０では、電極２４ａ，２４ｂを覆うケース２９が備えられているので、その中に試料溶液を入れ、あるいは通液しながら、電極２４ａ，２４ｂの表面に試料溶液中の被測定物質を接触させることができる。

図３は、測定装置７０のブロック図の一例を示す。バイオセンサとしては、上記第２の実施形態のバイオセンサ２０が組み込まれている。
溶液は、シリンジポンプ７２によってインジェクションバルブ７４を介してバイオセンサ２０の注入口２９ｉからケース２９（図２参照）内に供給され、排出口２９ｏから排出される。検体を注入するときには、インジェクションバルブ７４を介して溶液とともに一定量の検体がバイオセンサ２０のケース２９へ供給される。検体がバイオセンサ２０に到達すると、第１の電極２４ａ表面に固定化された捕捉物質に被測定物質が結合することで水晶振動子の質量が増加し、固有周波数が変化する。その変化が周波数カウンタ７６で測定され、パソコン７８でデータの取得が行われる。
溶液としては、例えば、リン酸緩衝溶液（Phosphate Buffered Saline；ＰＢＳ）又は、トリス緩衝溶液等の従来公知の緩衝溶液を用いることができる。緩衝溶液のｐＨは特に限定されないが、通常ｐＨ５．５〜８．５であり、好適にはｐＨ７〜８である。

本発明の第３の実施形態によるバイオセンサでは、複数の第１の電極は、少なくとも１つの表面に特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化されており、残りの１つの表面に捕捉物質が固定化されていないものであり、第１の電極のすべての表面に体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するブロッキング剤が固定化されているのが好ましい。
生物学的親和性を利用する測定法においては、被測定物質の捕捉物質に対する結合能の有無を特異的に検出できることが重要であるとともに、非特異的に吸着する非特異的吸着物質（夾雑物質）をいかに除去するかが重要である。一般的に動物由来のブロッキング剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルクやそれに近い材料を含有する試薬が使われている。これらの他に、合成樹脂を主成分とし、実質的に動物由来の物質を含まないブロッキング剤、例えば、日油株式会社の免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１，Ｎ１０２、及びLipidure（登録商標）が好ましい。

本発明のバイオセンサでは、第１の電極は、そのすべての表面がカゼインを含む液体で塗布され、カゼインが該表面に固定化されているのが好ましい。カゼインを含む液体は、例えば、スキムミルク（脱脂粉乳）、市販品の牛乳、カゼインのみを溶解した溶液などカゼインを０．１重量％以上含む溶液が好ましい。カゼインを電極表面に安定化させるためには、例えば、上記カゼイン含有溶液を第１の電極に接触させ、その後１０分以上保持することによって行う。

本発明のバイオセンサでは、捕捉物質は、生体関連物質との特異的な結合を解離させる再生液によって当該生体関連物質との結合が解離したものを含む。つまり、生体関連物質と結合した捕捉物質は、その結合を解離させる再生液の接触によりその結合を解離し、捕捉物質が生体関連物質と結合する前の状態にもどることが好ましい。このことによって、バイオセンサを複数回再生使用することができる。

本発明に係るバイオセンサの製造方法において、複数の第１の電極の少なくとも１つに、例えば被測定物質に対する抗体を含有した溶液と接触させ、５〜３０分間保持して当該電極表面に抗体を固定化する。次に、すべての第１の電極に対してブロッキング剤を接触させ、１０〜６０分間保持して電極表面に固定化する。カゼインの固定化は、その後、例えば、スキムミルク（脱脂粉乳）、市販品の牛乳、カゼインのみを溶解した溶液などからなるカゼインを、好ましくは０．１〜１０重量％含む溶液を溶液をすべての第１の電極と接触させ、５〜３０分間保持し、最後にこれら電極の表面を、例えば生理食塩リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄する。このようにして製造されたバイオセンサを上述の測定装置７０（図３参照）に組み込んで被測定物質を定量する。

本発明に係るバイオセンサを用いて生体関連物質を定量する方法において、上記バイオセンサの検体電極に付着する物質の重量によって生じる周波数の低下と参照電極に付着する物質の重量によって生じる周波数の低下の差によって特定の生体関連物質を定量する。
また、本発明では、上記バイオセンサの第１の電極に抗カゼイン抗体を含む液体を塗布した場合には、抗原抗体反応により抗体が付着されるので該第１の電極の重量が増加することによって周波数低下が生じる。

分子量が小さい被測定物質、例えば、ストレスマーカーであるコルチゾールを定量するときには、ＱＣＭ法における抗原抗体反応のうち直接法では高感度な測定が困難であるので、分子量の大きい蛋白質、例えば、ＢＳＡ、ヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin）、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）、西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP）などのうち少なくとも１種類を固定化した競合物質（トレーサー）を利用した競合法を利用するのが好ましい。競合法は、一定濃度の競合物質存在下において、被測定物質が微量に含有されている場合には、分子量の大きな競合物質が電極表面の抗体に吸着する量が多いため、周波数変化が大きくなる。逆に、被測定物質が多く含まれている場合には、競合物質が抗体に吸着する量が少なくなるため、周波数変化が小さくなるという原理による。

以下、具体的実施例を挙げて、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
−実施例１−
（バイオセンサの製造）
バイオセンサ２０の第１の電極２４ａに被測定物質に対する抗体を塗布し、１０分間保持して電極２４ａ表面に抗体を固定化した。次に、第１の電極２４ａ，２４ｂの双方に対して免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０２を３倍に希釈して塗布し、３０分間保持して電極表面に固定化した。その後、カゼインを１．０重量％含む溶液を塗布し、１０分間保持した後、これら電極の表面を生理食塩リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を用いて洗浄した。

（測定）
上記の方法で製造されたバイオセンサ２０が設置された測定装置７０（図３参照）に、ｐＨ７．４のＰＢＳをシリンジポンプ７２によってインジェクションバルブ７４を介してバイオセンサ２０に供給した。次に、測定検体として市販の牛乳を、インジェクションバルブ７４を介してＰＢＳによって１０倍希釈となる量をバイオセンサ２０へ供給した。
測定検体の供給開始から約６．５分経過後、測定検体の供給を止めた。同時に、ＰＢＳに替えて、再生液Glycin-NaOHを供給した。

（結果）
図４は、バイオセンサによる測定結果（時間と周波数の関係）を示す。
測定検体（牛乳）がバイオセンサ２０に到達すると、第１の電極２４ａ（検体電極）と第１の電極２４ｂ（参照電極）はともに、周波数が低下し、測定検体の到達から約２分後には、ほぼ一定値（−１００Ｈｚ）となった。これは、検体電極と参照電極の表面に牛乳中の生体関連物質が結合することで水晶振動子の質量が増加し、その周波数が低下したためと考えられる。図４において、差分は、検体電極と参照電極の周波数の差を示す。差分がほとんど０Ｈｚであるのは、検体電極、参照電極ともにほぼ同量の非特異吸着が生じたためと考えられる。
また、測定検体の供給を止め再生液を供給すると、検体電極と参照電極はともに、一時的に大きくその周波数が低下するが、２分程度でほぼ一定値（−３０Ｈｚ）に戻った。このことは、再生液が注入されたことにより電極表面から吸着物質が外れたことが考えられ、再生可能であることがわかった。このとき差分はほぼゼロであった。

−実施例２−
本実施例では、ストレスマーカーであるコルチゾールを定量した。コルチゾールは、分子量が３６２と小さいため、分子量の大きい蛋白質であるＢＳＡを固定化したトレーサーを利用した競合法を利用した。
（バイオセンサの製造）
抗体としてコルチゾール抗体を塗布し、電極表面に抗体を固定化した。他は、実施例３と同じ条件で、バイオセンサを製造した。

（測定）
上記の方法で製造されたバイオセンサ２０が設置された測定装置７０（図３参照）を使用し、測定検体としてコルチゾールに分子量の大きい蛋白質であるＢＳＡを固定化したトレーサーを用いた。その他は実施例１と同様な条件とした。
（結果）
図５は、バイオセンサによる測定結果（時間と周波数の関係）を示す。
測定検体がバイオセンサ２０に到達すると、検体電極と参照電極はともに、その周波数が低下するが、検体電極が参照電極より大きな周波数低下を示した。その差分は、測定検体の到達から約４分後には、ほぼ一定値（−１００Ｈｚ）となった。これは、検体電極に固定化されているコルチゾール抗体に測定検体が結合することで水晶振動子の質量が増加し、その周波数が低下したためと考えられる。図４において、差分は、検体電極と参照電極の周波数の差を示す。差分がほとんど０Ｈｚであるのは、測定検体中に抗体と結合する物質が少なかったためと考えられる。

つまり、検体電極ではトレーサー、コルチゾール及び微量の非特異的吸着が生じるが、参照電極では微量の非特異的吸着のみが生じる。各電極の差分を計測することで、非特異的吸着に左右されない吸着量を得ることができることがわかる。
また、測定検体の供給を止め再生液を供給すると、検体電極と参照電極はともに、一時的に大きくその周波数が低下するが、約２分後にはほぼ一定値となり、検体電極と参照電極ともに測定検体の供給前の周波数に戻った。再生液の注入により電極表面から吸着物質が外れたことが考えられ、バイオセンサは再生された。

（競合法による定量）
トレーサー濃度を一定とし、市販の牛乳を１０倍に希釈した検体にコルチゾール濃度を ０．１〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲で変化させて検体電極と参照電極の周波数を測定した。
図６は、コルチゾール濃度と差分周波数の関係を示す。図６に示すように、コルチゾール濃度が増加するに従い、差分周波数が低下した。このことにより、競合法による測定が行われていることが確認された。

本発明に係るバイオセンサ及び本発明の方法で製造されたバイオセンサは、生体関連物質として比較的大きな分子量を持つ免疫グロブリンＧ（IgG）や酵素、ウシ血清アルブミンなどの計測、抗原抗体反応のうち直接反応法を用いる場合や、高感度計測のためのサンドイッチ法に使用できるほか、分子量が比較的小さいコルチゾールなどの物質を計測するための競合法にも使用できる。特に動物個体のストレスを評価する場合には、侵襲的手法による検体採取、例えば注射などは、その行為に対するストレスが発生するため、得られた検体に含まれるストレスマーカーの濃度が過去の環境によるストレスを正確に反映しているかという点で信頼性に疑問が残るが、本発明に係るバイオセンサは、体液に微量に存在する生体関連物質を定量することができるので、非侵襲下で採取された体液について測定することができることがメリットである。

発明の詳細な説明の項においてなされた実施形態及び実施例は、本発明の技術内容を明らかにするものであって、上述の実施形態及び実施例に限定して解釈されるべきものではなく、本発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々の変更、修正、改良を加え得るものである。

本発明のバイオセンサは、動物個体の健康状態を知る上で様々な有益な情報をもつ生体関連物質が関連するストレスや疾病に対する検査や診断等に利用することができる。

１０，２０ バイオセンサ
１２，２２ 水晶基板
１４，２４ 第１の電極
１６，２６ 第２の電極
１８，２８ 水晶振動子
２９ ケース
２９ｉ 注入口
２９ｏ 排出口
７０ 測定装置
７２ ポンプ，シリンジポンプ
７４ インジェクションバルブ
７６ 周波数カウンタ
７８ パソコン

Claims (12)

1. 生体関連物質を検出するバイオセンサであって、
   水晶基板と、該水晶基板の一面に固着された複数の第１の電極と、他面に固着された１つの第２の電極を有する水晶振動子を備えてなるバイオセンサ。
2. 複数の前記第１の電極の少なくとも１つは、表面に特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化されており、残りの１つは、表面に前記捕捉物質が固定化されていない請求項１又は請求項２記載のバイオセンサ。
3. 複数の前記第１の電極は、表面に体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するために１又は複数種類のブロッキング剤が固定化されている請求項２記載のバイオセンサ。
4. 前記ブロッキング剤の１つは、カゼインを含む液体であり、カゼインが前記第１の電極の表面に固定化されている請求項３記載のバイオセンサ。
5. 前記ブロッキング剤の１つは、合成樹脂を主成分とし、実質的に動物由来の物質を含まない請求項３又は請求項４記載のバイオセンサ。
6. 前記水晶基板に固着され、且つ前記第１の電極上に液体を保持するためのケースを有し、該ケースが液体を注入する注入口を備える請求項１ないし５のいずれか１項記載のバイオセンサ。
7. 複数の前記第１の電極の少なくとも１つは、前記生体関連物質とは異なる生体関連物質を捕捉するために、表面に該異なる生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質が固定化されている請求項２ないし６のいずれか１項記載のバイオセンサ。
8. 前記捕捉物質は、生体関連物質との特異的な結合を解離させる再生液によって当該生体関連物質との結合が解離したものを含むことを特徴とする請求項２ないし７のいずれか１項記載のバイオセンサ。
9. 生体関連物質を検出するバイオセンサを製造する方法であって、
   水晶振動子を構成する水晶基板の一面に複数の第１の電極を、他面に１つの第２の電極を固着し、
   複数の前記第１の電極の少なくとも１つに特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質を固定化し、
   前記第１の電極のすべてに体液中に含まれる生体関連物質の非特異的吸着を防止するブロッキング剤を固定化する
   各ステップを含むことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
10. 前記ブロッキング剤が、合成樹脂を主成分とし、実質的に動物由来の物質を含まないブロッキング剤、及び／又はカゼインであることを特徴とする請求項９記載のバイオセンサの製造方法。
11. 請求項１ないし７のいずれか１項記載のバイオセンサを用いて生体関連物質を定量する方法であって、特定の生体関連物質と特異的に結合する部位を有する捕捉物質によって固定化された前記第１の電極に生じる周波数と該捕捉物質によって固定化されていない前記第１の電極に生じる周波数の差によって特定の生体関連物質を定量する方法。
12. 競合阻害法によって特定の生体関連物質を定量する請求項１１記載の方法。