CN103026234A - 用于在免疫测定中减少白细胞干扰的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法和装置。在一个实施方案中，提供了包括如下步骤的方法：利用一种或多种减少或消除白细胞的代谢活性的杀白细胞试剂修正生物样本例如全血样本，并且对所述修正样本进行免疫测定以测定所述样本中分析物的浓度。优选地，利用一种或多种酶以及任选地一种或多种酶底物和辅因子修正所述样本。

Description

用于在免疫测定中减少白细胞干扰的试剂

发明领域

本发明涉及在通过免疫测定法测定血液样本的分析物的存在或浓度的装置和方法中减少或消除来自血沉棕黄层组分特别地白细胞的干扰。具体地，本发明涉及通过利用减少或消除白细胞的活性的杀白细胞(leukocidal)试剂修正(amend)血液样本来减少或消除白细胞免疫传感器干扰。

发明背景

对生物样本进行许多针对目标分析物的实验室免疫测试以除其它原因以外，进行诊断、筛选、疾病分期、法医分析、妊娠试验和药物测试。虽然少数定性测试例如妊娠试验已被简化成供患者家庭使用的简单试剂盒，但大多数定量测试仍然需要受过训练的技术人员在实验室环境中使用尖端仪器的专门技术。实验室测试增加了分析成本并且延迟了患者的结果接收。在许多情况下，该延迟对患者的病况或预后例如表示心肌梗塞和心力衰竭的标志物的分析可以是有害的。在这些和相似的临床状况下，有利的是即时、精确、经济地以及以最短的延迟进行此类分析。

已描述了许多类型的免疫测定装置和方法。例如，用于成功地测量血液样本中的分析物的一次性使用的传感装置由Lauks公开于美国专利No.5,096,669中。用于成功地测量特征(例如凝血时间)的其它装置由Davis等公开于美国专利No.5,628,961和5,447,440中。这些装置利用读出设备和适合放入读出设备以测量作为时间的函数的血液样本中的分析物浓度和粘性改变的测试盒(cartridge)。将美国专利No.5,096,669、5,628,961和5,447,440的整个内容和公开内容通过引用整体并本文。

Miller等的美国专利申请公布2006/0160164描述了利用免疫-参考电极的免疫测定装置；Miller等的美国专利No.7,682,833描述了具有改进的样本闭包(sample closure)的免疫测定装置；EmersonCampbell等的美国专利申请公布2004/0018577描述了多重混合免疫测定；以及Davis等的美国专利No.7,419,821描述了用于分析物测量和免疫测定的设备和方法，所述专利申请公布或专利的每一个是共同拥有的并且通过引用整体并入本文。

非竞争性双位免疫测定(Non-competitive two-site immunoassay)，也称为夹心型免疫测定，通常用于测定生物测试样本中的分析物浓度，以及用于例如由Abbott Point of Care Inc.开发的即时分析物检测系统i-STAT

免疫测定系统。在典型的双位酶联免疫吸附测定(ELISA)中，将一种抗体结合于固体载体以形成固定或捕获抗体，并且将第二抗体缀合于或结合于信号发生试剂例如酶以形成信号或标记抗体。在与包含待测量的分析物的样本反应后，分析物“被夹在”固定抗体与信号抗体之间。在洗去样本和任何非特异性结合的试剂后，测量保留在固体载体上的信号抗体的量，并且该量应当与样本中的分析物的量成正比。

电化学检测也已被用于免疫测定，在所述电化学检测中分析物的结合直接或间接引起邻近电极的电活性种类的活性的改变。关于电化学免疫测定的综述，参见Laurell等，Methods in Enzymology，第73卷，“Electroimmunoassay”，Academic Press，New York，339，340，346-348(1981)。

在电化学免疫传感器中，分析物与其同源抗体的结合使电极上的电活性种类的活性产生变化，将所述电极保持在适当的电化学电位下以引起电活性种类的氧化或还原。存在许多满足这些条件的构型或排列。例如，可将电活性种类直接连接于分析物，或可将抗体共价连接于从无电活性底物产生电活性种类或破坏电活性底物的酶。关于电化学免疫传感器的综述，参见，M.J.Green(1987)，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，316：135-142。

差分安培计测量(differential amperometric measurement)的概念在电化学领域是熟知的。参见，例如，Cozzette等的共同拥有的美国专利No.5,112,455，将其通过引用整体并入本文。一种形式的差分安培计传感器组合公开于Cozzette等的共同拥有的美国专利No.5,063,081(“‘081专利”)，将其通过引用整体并入本文。‘081专利还公开了选择性渗透层用于电化学传感器的用途和成膜性胶乳用于固定生物活性分子的用途。聚(乙烯醇)(PVA)在传感器制造中的用途描述于Davis等的美国专利No.6,030,827中，将其通过引用整体并入本文。Vikholm等的美国专利申请公布2003/0059954(将其通过引用整体并入本文)教导了直接连接于表面的抗体，所述表面在其上的抗体之间的空隙中具有生物排斥或生物分子排斥涂层，例如PVA。Johansson等的美国专利No.5,656,504教导了其上固定有抗体的固相，例如PVA，并将所述专利通过引用整体并入本文，以及Davis等的美国专利No.6,030,827和6,379,883教导了用于使PVA层形成图形的方法，并将所述专利通过引用整体并入本文。

在本领域熟知免疫测定易于受各种形式的干扰。共同拥有的未决的美国申请No.12/411,325(“‘325申请”)例如阐明了通过将IgM包含在IgG试剂混合物中减轻来自异嗜性抗体的干扰。‘325申请通过引用整体并入本文。

随着免疫测定技术日益适合进入即时测试市场，将全血用作测试介质相对于血浆和血清(通常用于中心实验室测试)已得到增加。当分析全血时，红细胞和血沉棕黄层组分存在于测定介质中。本领域技术人员公认血沉棕黄层是当将血液离心时在红细胞上方形成的一层白细胞和血小板。

已发现，在某些测定中，可针对白细胞有效地使各种测定组分例如珠粒和电极表面接受调理素作用。例如，对于电极表面，Hill等(FEBS  191，257-263，1985)利用人IgG使微伏安电极(microvoltammetric electrode)接受调理素作用，以基于超氧离子的电化学检测观察人嗜中性粒细胞的呼吸暴发。

美国专利申请公布2006/0160164(‘164申请)(上文中引用的)论述了电化学免疫传感器，全血与血浆之间的偏差，并且提供了标记物例如肌钙蛋白等的免疫测定通常被测量和报告为血浆或血清值。‘164申请教导：当将这些免疫传感器用于分析全血时，需要使用消除偏差的校正系数或装置。‘164申请还教导：该偏差的某些方面可被消除，包括在全血电化学免疫测定中与血沉棕黄层的组分相关的偏差，以及还有与样本之间的血细胞比容变化相关的偏差。

如‘164申请中提供的，白细胞(或白血细胞(white cell))干扰在具有用分析物抗体例如肌钙蛋白抗体包被的珠粒的免疫传感器上发生，并且对照实验已显示该正偏差在血浆样本和其中已除去血沉棕黄层的血液样本中不存在。因此，白细胞似乎能够粘附免疫传感器并且促进酶标记抗体的非特异性结合，所述酶标记抗体甚至在洗涤步骤后仍然结合。在‘164申请中，已显示该偏差可通过在珠粒制备过程中将少量抗体添加至人血清白蛋白来部分消除。因此，当样本接触经修饰的珠粒时，来自样本的白蛋白快速地涂覆珠粒并且一旦它们被涂覆一层天然白蛋白，白细胞应当不将珠粒识别为易受调理素作用的表面。

‘164申请描述了解决白细胞干扰问题的另外的办法，其中通过将血液样本的盐浓度从约140mM的正常钠离子浓度增加至高于约200mM，优选增加至约230mM来消除偏差。造成减少的干扰的机制可能是盐引起白细胞的渗透皱缩。该解释与白细胞与公开的免疫传感器相互作用的能力受损一致。

虽然已有上述文献，但在至少下列领域仍然需要用于在免疫测定中减小白细胞活性的影响的改进的方法：免疫传感器干扰，最明显的是在即时测试的背景中；电化学免疫测定；免疫传感器与免疫-参考传感器结合的共同使用；全血免疫测定；一次性使用盒式免疫测定(single-use cartridge based immunoassay)；仅利用单个洗涤步骤的非连续免疫测定；和干试剂涂层。

发明概要

本发明涉及减少或消除试剂盒、装置以及使用试剂盒和装置的方法(包括免疫测定)中的白细胞干扰。根据本发明的各个实施方案，可用一种或多种减少或消除白细胞活性的杀白细胞试剂修正含目标分析物的样本，然后可在免疫测定中分析所得的修正样本以测定分析物含量和/或浓度而无显著的白细胞干扰。

在一个实施方案中，本发明为进行血液样本中靶分析物的免疫测定的方法，包括使血液样本与杀白细胞试剂接触，其中所述试剂大体上抑制样本中白细胞的活性，以及对样本进行免疫测定以检测靶分析物。在一些实施方案中，免疫测定为通过使样本与免疫传感器接触而进行的夹心测定，所述免疫传感器包含固定的针对靶分析物的第一抗体和标记的针对靶分析物的第二抗体。在其它实施方案中，免疫测定为通过使样本与免疫传感器接触而进行的竞争性测定，所述免疫传感器包含固定的针对靶分析物和针对标记的靶分析物的第一抗体。

在另一个实施方案中，本发明是用于进行全血样本中的靶分析物的免疫测定的试剂盒。试剂盒包括能够大体上抑制样本中白细胞活性的杀白细胞试剂和用于检测靶分析物的免疫测定试剂。在一些实施方案中，免疫测定为夹心测定并且其中免疫测定试剂包括包含固定的针对靶分析物的第一抗体和标记的针对靶分析物的第二抗体的免疫传感器。在其它实施方案中，免疫测定为竞争性测定，并且免疫测定试剂包括包含固定的针对靶分析物和针对标记的靶分析物的第一抗体的免疫传感器。

在优选的实施方案中，将被抑制的白细胞活性为吞噬作用。在本发明的某些实施方案中，杀白细胞试剂为氧消耗试剂和/或葡萄糖消耗试剂。例如，试剂可包括葡糖氧化酶。在另外的实施方案中，杀白细胞试剂包括葡糖氧化酶和葡萄糖。在一些实施方案中，杀白细胞试剂包括葡糖氧化酶和葡萄糖，并将试剂与样本混合以提供高于约3IU/mL的葡糖氧化酶活性和高于约500mg/dL的葡萄糖浓度。在其它实施方案中，杀白细胞试剂包括葡糖氧化酶和电子受体。在其它实施方案中，杀白细胞试剂包括己糖激酶和腺苷-5’-三磷酸(ATP)源。在其它实施方案中，试剂包括己糖激酶、肌酸激酶、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。在一些实施方案中，杀白细胞试剂包括葡糖脱氢酶，并且在其它实施方案中，试剂包括葡糖脱氢酶、NAD、NADH氧化酶和电子受体。在本发明的其它实施方案中，杀白细胞试剂为氧消耗试剂。在特定的实施方案中，杀白细胞试剂为选自连二亚硫酸酯、葡糖氧化酶和抗坏血酸氧化酶的氧消耗试剂。在另外的实施方案中，杀白细胞试剂为线粒体电传递抑制剂并且在其它实施方案中，试剂为线粒体膜解偶联剂。在其它实施方案中，杀白细胞试剂选自氰化物、抗霉素、鱼藤酮、丙二酸酯、羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙、2，4-二硝基酚和寡霉素。在其它实施方案中，杀白细胞试剂为两亲性试剂。在其它实施方案中，杀白细胞试剂为两亲性试剂并且为皂苷。在其它实施方案中，试剂为杀白细胞素，并且在其它实施方案中，试剂为粘多糖。在某些实施方案中，杀白细胞试剂为AHN-1抗体，并且在其它实施方案中，试剂为脂皮质素-1。

在一些实施方案中，除了与杀白细胞试剂接触外，还可使样本与针对白细胞易受调整素作用的珠粒接触。例如，在一个方面，杀白细胞试剂包括葡糖氧化酶和葡萄糖，并且使样本与针对白细胞易受调理素作用的珠粒接触。在本发明的优选实施方案中，样本为全血样本。可利用抗凝剂修正样本。在一些任选的实施方案中，分析物选自TnI、TnT、BNP、NTproBNP、proBNP、HCG、TSH、NGAL、茶碱、地高辛和苯妥英。

附图简述

本发明的这些和其它目的、特征和优势在下列特定实施方案的详细描述中进行了描述并且在下列附图中进行说明，其中：

图1为免疫传感器测试盒罩(cartridge cover)的等距顶视图；

图2为免疫传感器测试盒罩的等距底视图；

图3为免疫传感器测试盒的带衬垫(tape gasket)的布局的顶视图；

图4为免疫传感器测试盒底座的等距顶视图；

图5为免疫传感器测试盒的布局的图解视图；

图6为免疫传感器测试盒内的流体和空气路径，包括利用干燥试剂修正流体的位置的图解视图；

图7说明包含IgM的电化学免疫传感器的操作原理；

图8为电化学免疫传感器的构造的侧视图，其中抗体-标记的颗粒未按比例绘制；

图9为免疫传感器测试盒的电导计电极和免疫传感器电极的掩模设计的顶视图；

图10说明包含针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒的电化学免疫传感器的操作原理；

图11(a)显示具有正向倾斜输出信号的脑钠肽(BNP)测试盒的预料之外的波形；图11(b)显示具有负向倾斜输出信号的BNP测试盒的预料之外的波形；图11(c)显示对于低分析物浓度具有接近0的斜率的正常反应；和图11(d)示出仅在高分析物浓度下预期负斜率，在所述高分析物浓度下测量可变成底物限制的而非酶限制的；

图12显示在洗涤步骤过程中氧化电极脉冲对(a)正常样本和(b)异常棕黄样本的影响；

图13为电活性种类的酶促再生的示意图；

图14说明区段形成装置；

图15为免疫传感器测试保盒的优选实施方案的顶视图；

图16为免疫传感器测试盒的优选实施方案的流控技术的图解视图；

图17(a)和(b)显示在样本中(a)存在和(b)不存在牺牲颗粒的情况下测定高棕黄样本中的BNP后免疫传感器的显微照片；

图18说明利用滑动密封元件在闭合位置闭合样本进口的测试盒装置；

图19说明利用滑动密封元件在开放位置闭合样本进口的测试盒装置；

图20说明在分析过程中发生的信号发生反应：(a)碱性磷酸酶对底物的裂解，产生电活性的对氨基苯酚和(b)对氨基苯酚的氧化；

图21显示试剂中掺入(小批2和3)和未掺入(小批1)牺牲微粒的高棕黄(左)和正常全血(右图)样本中对免疫传感器斜率的影响的图解数据；

图22(a)和(b)显示图17(a)和(b)中的相关免疫传感器显微照片的分析器波形；

图23说明不充分的洗涤(不能用分析流体替代传感器结构内的样本流体)对安培计波形的影响；

图24说明竞争性免疫测定，其可用根据本发明的一个实施方案的牺牲珠粒修正；

图25显示免疫传感器的电流对时间曲线；

图26显示葡糖氧化酶在减小白细胞活性对免疫传感器的信号输出斜率的影响中的用途；

图27显示未处理样本和处理的样本的散布图和白细胞活性对信号输出斜率的影响；

图28(a)显示葡糖氧化酶在减小白细胞活性对免疫传感器的信号输出斜率的影响中的用途，其中将样本保留在相对环境空气开放的密闭容器中；

图28(b)显示葡糖氧化酶在减小白细胞活性对免疫传感器的信号输出斜率的影响中的用途，其中将样本保留在相对环境空气开放的密闭容器中；

图29显示葡糖氧化酶对模拟动脉血液样本的影响；和

图30显示通过使用皂苷产生的全血样本中吞噬作用的减弱。

发明详述

本发明涉及杀白细胞试剂用于在免疫测定中减少或消除因白细胞的存在而引起的干扰的用途。在优选的实施方案中，本发明可用于下列领域的一个或多个：免疫传感器，最明显的是在即时测试的背景中；电化学免疫测定；免疫传感器与免疫-参考传感器共同使用；全血免疫测定；一次性使用盒式免疫测定；仅利用单个洗涤步骤的非连续免疫测定；和干试剂涂层。值得注意地，虽然上文提及的美国专利申请公布2006/0160164(‘164申请)基于添加抗-人血清、在免疫传感器上涂覆白蛋白抗体和向测定介质添加盐解决了一定的与白细胞相关的干扰，但本说明书公开了与白细胞相关的偏差的其它来源并且提供了用于减小所述偏差的新型溶液。正如本领域技术人员将理解的，本文中公开的一般概念适用于许多免疫测定方法和平台。

本发明允许使用具有大量分析物传感器和用于将修正的样本连续呈递至免疫传感器或分析物阵列的装置的测试盒快速原位测定分析物。在优选实施方案中，本发明用于被设计来利用读出设备操作的测试盒，例如1992年3月17日公布的Lauks等的美国专利No.5,096,669(上文中引用的)中公开的或2008年9月2日公布的Davis等的美国专利No.7,419,821(上文中引用的)中公开的测试盒，将所述两个专利通过引用整体并入本文。本发明在本说明书中获得最好的理解。因此，首先描述用于即时免疫测定系统的适当的装置和操作方法，然后描述系统是如何最佳地适合于在全血免疫测定中进一步减少或消除白细胞干扰。

在各个实施方案中，本发明用于基于在电极表面上或其附近形成夹层的非均相电化学免疫测定。然而，在其它实施方案中，本发明为其它形式的免疫测定。例如，本发明的杀白细胞试剂可用于基于非均相或均相珠粒的测定，以及用于非竞争性(夹心)免疫测定或竞争性免疫测定。在此情况中，术语“非均相”和“均相”是指捕获步骤。因此，对于均相测定，捕获步骤在液体介质中发生，然而在非均相测定中，捕获步骤在肉眼可见表面例如传感器表面上发生(以竞争性或非竞争性方式)。在这些实例的每一个中，当在血液样本中进行测定时，固定测定珠粒将易于受到白细胞的攻击。在竞争性和非竞争性测定中，这种作用可通过添加杀白细胞试剂和任选地针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒来减小。

在非均相竞争性测定中(图24中说明的)，存在于样本中的(未标记的)分析物与标记分析物竞争固体表面例如传感器元件上的结合位点。利用一些由缀合于标记的相同分析物即标记分析物组成的试剂修正被怀疑包含目标分析物(样本分析物)的样本。标记可以是染料或任何信号发生元件例如酶例如ALP。在一些示例性实施方案中，标记分析物可利用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光种类、离子载体(ionophore)和电活性种类的标记物进行标记。在另一个实施方案中，标记分析物利用选自荧光素、二茂铁(任选地羧化二茂铁或二羧化二茂铁或氨基二茂铁)和对氨基苯酚的标记物进行标记。

通常通过竞争性测定来鉴定和/或测量的分析物包括治疗剂例如地高辛、茶碱和生物标志物例如C反应蛋白(CRP)以及苯巴比妥、苯妥英、丙戊酸和万古霉素。在优选方面，样本分析物选自地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶碱、丙戊酸和万古霉素。在本发明的一个实施方案中，使修正样本与其上固定有针对目标分析物的抗体的固体表面接触。样本携带的分析物与标记分析物在该固体表面上竞争结合，这样标记分析物的量和从而从其产生的信号的量将与原始样本中的分析物的浓度成反比。在从传感器表面洗涤非特异性结合的材料后，测量标记物的量；在酶标记的情况下，这可包括给酶提供适当的底物和例如通过电化学或光学检测产物。当用于非均相竞争性免疫测定中时，在接触固体表面即传感器之前优选用杀白细胞试剂修正血液样本。需要时，可在接触固体表面之前用针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒(例如，IgG-涂覆的微粒)进一步修正血液样本，如美国专利申请12/620,179和12/620,230(两者都是2009年11月17日提交的，将其完整内容通过引用并入本文)中描述的。

I.测试盒

在一个实施方案中，本发明涉及用于处理液体样本以测定样本中分析物的存在或量的测试盒和方法。测试盒优选包含计量装置，其允许引入未计量体积的样本，通过所述计量装置，测试盒及其相关读出设备可处理计量的量。因此，医生或操作者从测量之前手工测量样本的体积解脱出来，从而节省了时间、努力和增加了精确度及重现性。在一个实施方案中，计量装置包括以毛细管终端(capillary stop)界定并且沿着其长度具有空气进入点的细长样本室。施加在空气进入点上的气压驱动计量体积的样本通过毛细管终端。计量体积由空气进入点与毛细管终端之间的样本室的体积预先确定。

测试盒可具有用于以气密方式密封样本口(sample port)的闭合装置。该闭合装置优选地相对于测试盒体是可滑动的并且可提供移除位于样本口区域的过量样本，从而可靠地将一部分样本封闭在进口与毛细管终端之间的保持室(holding chamber)中的剪切作用。参见，例如，美国专利No.7,682,833，将其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，可以例如通过以如下方式在测试盒的表面上方滑动地移动密封元件来密封测试盒：从样本孔(sample orifice)移除过量流体样本，将一定体积的流体样本密封在内部流体样本保持室内，并且抑制流体样本过早穿越内部毛细管终端。通过该可滑动闭合装置获得的密封优选地是不可逆的并且阻止了过量血液被截留在测试盒中，因为闭合装置在血液通过其进入测试盒的孔的平面中移动并且提供将血液密封在进口(entry port)的平面下方，从而将过量血液(即，孔的平面上方的血液)从进口移开并且任选地移至废液室的剪切作用。

本发明的一个实施方案的示例性闭合装置示于图1中，并且包括罩子1的集成元件2、3、4和9。在该实施方案中，闭合装置2围绕铰链旋转直至钩子3砰然关闭，从而封闭样本口4。包括图1中罩子1的集成元件2、3、4和9的闭合装置的另一选择显示为图18和19中的单独的可滑动元件200。图18和19显示测试盒装置，其包括通过图3中显示的间隔粘接层21附接至与图4中的底座相似的底座的图1的罩子的改进形式以及单独的可滑动闭合元件200。图19显示处于开放位置的闭合装置200，其中样本进口4可接收样本例如血液。图18显示处于闭合位置的闭合装置200，其中其以气密方式封闭样本进口。在操作中，在已将样本例如血液添加至进口并且其进入保持室34后，将元件200从开放位置手动开动至闭合位置。在显示的实施方案中，进口区域的任何过量血液被移入溢流室201或相邻的保留区或腔中。该室或区域可包括流体吸收垫或材料以保留过量样本例如血液。

样本进口4可以是为圆形孔(如图19中显示的)或椭圆形的孔，并且孔的直径通常在0.2-5mm，优选1-2mm的范围内，或对于椭圆形具有1-15mm的直径。孔周围区域可被选择为疏水性的或亲水性的以控制所使用的样本的液滴形状，以有助于其进入进口。图18和19中显示的闭合装置的一个优势是其防止样本被推挤出保持室34的末端上的毛细管终端元件25。对于测量分析物的体积浓度并从而不依赖于样本体积的测试，少量样本例如血液在毛细管终端外部存在是不明显的。然而，对于其中样本的计量通常是有利的免疫测定应用，密封元件提高了装置的计量精确性并且确保当分析仪将样本驱入测试盒管道时，样本的测定区段相对于免疫传感器被正确定位。

在操作中，当将样本例如血液添加至测试盒中时，其移动至毛细管终端。因此，当从毛细管终端至样本进口的区域即保持室34包含样本时，存在充足的用于测定的样本。在填充保持室的过程中，一些样本可保留在进口孔的平面上方。当将密封元件从开放位置移向闭合位置时，位于进口上方的任何样本被剪切掉而不在闭合的动作中捕获额外样本，从而确保样本不移动至毛细管终端25之外。在优选的实施方案中，密封元件200被置于图3的带衬垫21的表面上方数千分之一英寸内。通过随后将200的表面降至胶带衬垫(此时其与锁定装置(locking feature)212和213啮合)来密封进口。由于带基本上不可压缩时并且孔具有小的直径，因此用户不小心施加至密封元件的任何压力不会引起样本移动至毛细管终端外。

在某些使用数滴样本的测试盒实施方案中，期望保持室中不形成气泡，因为这可影响测定。因此，已开发了用于将超过一滴样本例如血液引入保持室34而不夹带气泡的可靠方法。根据本发明的一个实施方案，样本进口可被设计来接收多滴样本，通过首先用电晕放电(Corona)和/或试剂混合物处理保持室使连续液滴在保持室34不引发禁锢气泡形成。

电晕放电处理在一次性使用医疗设备上的使用在本领域是熟知的，并且是增强几乎任何材料例如用金属处理的表面、箔、纸、硬纸板块或塑料例如聚乙烯、聚丙烯、尼龙、乙烯树脂(vinyl)、聚氯乙烯(PVC)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的表面活性的有效方式。电晕放电处理使材料更易接收墨、涂层和粘着剂。在实践中，将所处理的材料暴露于放电或“电晕放电”。放电区域(discharge area)中的氧分子断裂成原子并且键合于所处理的材料中的分子，从而产生化学活化表面。用于电晕放电的适当的设备可商购获得(例如，Corotec Corporation，Farmington，Connecticut，USA)。工艺变量是熟知的，并且包括处理材料所需的功率的大小、材料速度、待处理的侧面的宽度、数目以及具体材料对电晕放电处理的反应性，所述变量可由技术人员来确定。安装电晕放电处理的典型位置遵照打印、涂覆或成片工艺。另一个常见的安装是直接在吹膜挤出机(blown film extruder)或流延膜挤出机(castfilm extruder)上，因为新鲜材料更易接受电晕放电处理。

II.信号发生反应

如上所述，非竞争性(夹心)免疫测定形式是最广泛使用的免疫测定方法，并且其在本文中论述的分析装置例如测试盒中也是优选形式。在该实施方案中，将一种抗体(固定抗体)结合于固体载体或免疫传感器，并且将第二抗体(信号抗体)缀合/结合于信号发生试剂，例如酶，例如碱性磷酸酶。

简而言之，图20说明了在分析过程中发生的信号发生反应，其中图20(a)显示了底物被碱性磷酸酶裂解从而产生具电活性的对氨基苯酚，并且图20(b)显示对氨基苯酚的氧化。图20(a)中的反应在传感器结构的上层发生，而图20(b)中的反应在金电极表面上发生。图20(a)中的插图说明碱性磷酸酶催化的水解的pH依赖性。中间插图描述了在暴露于样本之前免疫传感器结构的总体特征。

信号发生试剂(例如，用于非竞争性测定的信号抗体或用于竞争性测定的标记分析物)可以为分析装置中的干试剂涂层的部分(如下面所描述的)，并且优选在样本到达免疫传感器之前溶解在生物样本中。对于非竞争性测定，在洗掉样本和非特异性结合的试剂后，保留在固体载体上的信号发生试剂(例如，信号抗体)的量原则上应当与样本中的分析物的量成正比。对于竞争性测定，如上所述，在洗掉样本和非特异性结合的试剂后，保留在固体载体上的信号发生试剂(例如，标记分析物)的量原则上应当与样本中的分析物的量成反比。然而，这些测定构型的一个限制是易受由存在于血液样本中的白细胞引起的干扰。

III.杀白细胞试剂

虽然白细胞干扰已被Miller等的共同拥有的美国专利申请公布2006/0160164(上文引用的)中公开的方法减少，但现已发现：对于某些血液样本，通过添加一种或多种杀白细胞试剂，样本例如血液样本中的杀白细胞活性可被令人惊讶地和预料之外地减少或消除。因此，与用于减少白细胞干扰的常规方法相反，在本发明的各个实施方案中，可利用杀白细胞试剂(在本文中被定义为能够代谢地或两亲性地(amphipathically)减少或消除白细胞活性的任何组合物)显著地减少或消除白细胞活性。如下文中所述，杀白细胞试剂的实例的非限定性名录包括酶及其共试剂(co-reagent)、皂苷、细胞毒素、粘多糖、杀白细胞素和抗-白细胞抗体。在许多实施方案中，杀白细胞试剂为有机的、任选地非离子种类，然而在其它实施方案中，试剂可以为无机和离子种类(例如，氰化物、含二氰酸酯试剂或连二亚硫酸酯种类)。

不受理论束缚，吞噬作用的过程包括由白细胞引起的氧化暴发(oxidative burst)，产生攻击异生物体实体例如细菌的氧自由基种类例如超氧化物和羟基自由基。由于吞噬作用为氧依赖性过程，因此降低样本中体积氧浓度(bulk oxygen concentration)可用作在免疫测定中防止或减少白细胞干扰的方法。同样地，以其它方式阻这些细胞的代谢途径也是减少白细胞干扰的有用方法。在其它实施方案中，如下文所述，可将牺牲珠粒与杀白细胞试剂组合使用以减少或消除杀白细胞活性。

几种方法可能用于白细胞的代谢抑制。在一个实施方案中，可以例如通过使用添加的酶例如葡糖氧化酶消耗葡萄糖和产生过氧化氢来剥夺白细胞在血浆中获得的氧。这剥夺了细胞的氧，所述氧是呼吸链中的末端电子受体。注意，样本中的任何过氧化物将会迅速被过氧化氢酶歧化成氧和水，但反应的净驱动力大体上从样本去除了所有氧。

在另一个实施方案中，将绝大部分葡萄糖从样本的血浆级分除去。一般地，血液样本中的体积氧浓度通常比葡萄糖浓度低得多([O₂]～100μM；[葡萄糖]～5-10mM)。因此，期望添加葡糖氧化酶的可容性电子受体例如二茂铁单羧酸、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulphate)或N，N，N’，N’-四甲基-对苯二胺来除去绝大部分葡萄糖。或者，可使用葡糖脱氢酶(GDH)；然而需要添加辅因子NAD+，除了GDH需要PQQ辅因子外。在该实例中，还可将NADH氧化酶(黄递酶)与电子受体一起添加，如上文中指示的。在另一个实施方案中，可添加己糖激酶，其使样本中可获得的葡萄糖磷酸化。此时需要ATP来源，其优选通过添加磷酸肌酸、ADP和肌酸激酶来原位制备。在该实例中，仅体积葡萄糖浓度受到影响，但氧浓度不受影响。

通常，已发现在样本的血浆级分中除去绝大部分氧比除去绝大部分葡萄糖更有效。这与这样的事实相关：细胞已贮存了能量(还原当量)，但明显缺乏“氧贮存(oxygen store)”。具体的实施方案涉及通过化学方法(例如通过添加过量的连二亚硫酸酯)，或通过添加抗坏血酸氧化酶(其将氧直接还原成水)酶促地消除氧。

在一些实施方案中，本发明涉及进行血液样本中的靶分析物的免疫测定的方法。在一个方面，该方法包括以下步骤：使样本例如血液样本与杀白细胞试剂接触，其中试剂大体上抑制样本中的白细胞的活性，并且对样本进行免疫测定以检测靶分析物。在本发明的某些实施方案中，试剂为氧消耗试剂或葡萄糖消耗试剂或两者。在一个方面，试剂包含葡糖氧化酶。在其它方面，试剂包含葡糖氧化酶和葡萄糖。在其它实施方案中，杀白细胞试剂包含葡糖氧化酶和葡萄糖，并且将杀白细胞试剂与样本混合以提供高于约3IU/mL的葡糖氧化酶活性和高于约500mg/dL的葡萄糖浓度。

如上文中所指出的，另一个减少白细胞干扰的方法是使用抑制白细胞中的线粒体的电子传递抑制剂或解偶联剂。因此，在一个方面，杀白细胞试剂包含电子传递抑制剂。适当的电子传递抑制剂和解偶联剂包括但不限于鱼藤酮、抗霉素、氰化物、丙二酸酯(琥珀酸脱氢酶抑制剂)、2，4-二硝基酚(DNP)、羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙(FCCP)和寡霉素(氧化磷酸化的抑制剂)。虽然可将丙二酸酯和氰化物直接添加至样本(例如，在免疫测定装置的试剂涂层中)，但其它电子传递抑制剂和解偶联剂可能需要添加乙醇或类似溶剂来帮助在血浆级分中溶解。

不受理论束缚，电子传递抑制剂通常通过沿着电子传递链结合来起作用，从而阻止电子按顺序从一个分子传递至下一个分子。抑制的机制可以是沿着NADH途径、琥珀酸途径或共同途径。例如，氰化物是作为共同途径中的末端酶的细胞色素氧化酶的有效可逆抑制剂。具体地，约1mM的浓度的KCN(任何地从0.5至50mM)应当足以大体上抑制存在于人血液样本中的线粒体的氧消耗。

解偶联剂通过干扰化学渗透梯度来起作用。例如，2，4-二硝基酚用作质子离子载体，结合膜的一侧上的质子，并且由于是亲脂性的，其将质子转运通过膜。因此，阻止了呼吸链维持跨膜质子梯度。羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙(FCCP)也以此方式起作用。寡霉素具有相关作用并且通过以例如阻断质子通道的方式结合ATP合酶来起作用，从而抑制氧化磷酸化。此类试剂的使用对于减少基于任何厌氧白细胞活性的干扰也是有益的。具体地，除非使用解偶联剂，否则即使当细胞被剥夺了氧，葡萄糖至乳酸的转化仍然产生ATP。

在本发明的一些实施方案中，试剂为葡糖氧化酶和电子受体。在其它实施方案中，试剂包括己糖激酶和腺苷-5’-三磷酸(ATP)的源。在其它实施方案中，试剂包括己糖激酶、肌酸激酶、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。在一些实施方案中，试剂包括葡糖脱氢酶，并且在其它实施方案中，试剂包括葡糖脱氢酶、NAD、NADH氧化酶和电子受体。在本发明的其它实施方案中，试剂为氧消耗试剂。在其它实施方案中，试剂为选自连二亚硫酸酯、葡糖氧化酶和抗坏血酸氧化酶的氧消耗试剂。在另外的实施方案中，试剂为线粒体电子传递抑制剂，并且在其它实施方案中，试剂为线粒体膜解偶联剂。在其它实施方案中，试剂选自氰化物、抗霉素、鱼藤酮、丙二酸酯、羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙、2，4-二硝基酚和寡霉素。在其它实施方案中，试剂为两亲性试剂。

用于减少或消除白细胞针对免疫传感器的吞噬活性的优选方法基于作为两亲性试剂的皂苷(例如来自皂树树皮)的添加。皂苷用作表面活性剂和溶血剂，其增加蛋白质或其它大分子通过细胞膜的运输。

在本发明的替代性实施方案中，杀白细胞素可用作杀白细胞试剂。杀白细胞素为一种类型的来自细菌的细胞毒素，例如潘顿-瓦伦丁杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin)。杀白细胞素为能够杀死白细胞的穿孔毒素。参见，例如，Hongo等，Journal of Infectious Diseases200，715-723，(2009)。

在另一个实施方案中，粘多糖例如肝素可用于诱导白细胞裂解。参见，例如，Adachi等，J Pharmacobio-Dyn 9，207-210(1986)。

在某些实施方案中，杀白细胞试剂为AHN-1抗体。在本发明的其它实施方案中，杀白细胞试剂为脂皮质素-1或其等同物。

在其它实施方案中，可将本文中描述的杀白细胞试剂与针对白细胞易受调理素作用的珠粒共同使用。在一个优选实施方案中，杀白细胞试剂包括葡糖氧化酶和葡萄糖，并且将杀白细胞试剂与针对白细胞易受调理素作用的珠粒共同使用。

在优选实施方案中，将一种或多种杀白细胞试剂掺入干试剂涂层，然而在其它实施方案中，将杀白细胞试剂提供于单独的试剂流体中，例如提供于用于与样本混合的流体小袋(fluid pouch)中。如果以干试剂的形式提供，可将一种或多种杀白细胞试剂提供于包含信号发生试剂(例如，信号抗体(对于非竞争性测定)或标记分析物(对于竞争性测定))的相同干试剂涂层中。因此，在本发明的一个实施方案中，分析装置包括干试剂涂层，其包含如下的一种或两种：(a)一种或多种杀白细胞试剂，和/或(b)信号发生试剂例如信号抗体或标记分析物。可从试剂混合物形成干试剂涂层，所述试剂混合物优选地包含如下的一种或两种：(a)一种或多种杀白细胞试剂，和/或(b)信号发生试剂例如信号抗体或标记分析物。在一些实施方案中，试剂涂层和/或混合物还包含如下的一种或多种：(a)用于减少由异嗜性抗体引起的干扰的IgM或其片段，如在共同未决的美国申请No.12/411,325(上文中引用的)中公开的，和/或(b)针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒(下文中论述的)，如在先前论述的美国专利申请12/620,179和12/620,230中描述的。优选首先对将在其上沉积试剂混合物的表面进行电晕放电处理以提供将促进被打印的混合物扩散的带电荷表面基团。

在一些实施方案中，用于形成干试剂涂层的试剂混合物还可包含如下试剂的一种或多种：水溶性蛋白质、氨基酸、聚醚、包含羟基的聚合物、糖或碳水化合物、盐和任选地染料分子。在一个实施方案中，混合物包含牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、盐、甲氧基聚乙烯二醇、蔗糖和任选地显色剂例如溴酚蓝以提供帮助使打印过程可见的颜色。在另一个实施方案中，将1至20μL的混合物打印在分析装置的期望的表面(例如，保持室或其它管道内的)上，并使其风干(加热或不加热)，然后装配其罩子。在优选实施方案中，试剂混合物和从其形成的干试剂涂层包含乳糖醇、DEAE-葡聚糖、盐例如氯化镁和氯化钠、IgG/IgM、肝素、表面活性剂和罗丹明。

在本发明的其它实施方案中，测试盒可包括多个干试剂涂层(在该情况下，涂层可分别称为第一试剂涂层、第二试剂涂层等，以区分它们)。例如，杀白细胞试剂可被包含在第一试剂涂层内，该涂层例如可紧邻包含信号发生元件(例如，信号抗体(对于非竞争性测定)或标记分析物(对于竞争性测定))的第二试剂涂层。在这方面，第二试剂涂层可位于第一试剂涂层的上游或下游，虽然包含信号发生元件的试剂涂层优选位于包含牺牲珠粒的试剂涂层的下游。在优选的实施方案中，利用包含杀白细胞试剂和任选地减少各种形式的干扰的其它试剂例如牺牲珠粒的第一试剂涂层涂覆保持室。在这方面，包含信号发生元件的第二试剂涂层优选地位于保持室的上游，例如，正好在免疫传感器的上游。

在一些实施方案中，优选将试剂混合物配制为包含杀白细胞试剂和任选地其它干扰减少试剂例如牺牲珠粒的可打印水溶液。在导入生物样本例如血液后，在测定的第一步骤中样本优选地与试剂混合。在一些实施方案中，试剂还可包括无机盐和表面活性剂以在化学和流体属性上最优化测定性能。在其它实施方案中，试剂可包括任选的添加剂例如抗凝剂或抗凝试剂(例如，肝素)以确保足够的抗凝作用和/或显影剂(例如，染料或着色剂)以使打印后试剂的位置可见。还任选地提供了稳定剂例如用于抑制微生物生长的叠氮化钠以及用于稳定蛋白质的乳糖醇和二乙氨乙基-葡聚糖(Applied Enzyme Technologies Ltd.，Monmouth House，Mamhilad Park，Pontypool，NP4 0HZ UK)的混合物。一旦沉积在装置中，可以例如在暖气流中将沉积的试剂干燥30至60分钟。在一个实施方案中，使用自动打印设备将试剂打印在装置的样本进口中，并将试剂干燥以形成包含杀白细胞试剂的涂层。

IV.牺牲珠粒

如上文中指出的，除了使用一种或多种杀白细胞试剂外，还可用牺牲或诱饵珠粒修正样本例如血液样本，所述珠粒与样本均匀地混合，并且其中针对白细胞使珠粒接受特异性调理素作用。

在本发明的一个实施方案中，利用从动物种类分离的非人IgG(IgG种类免疫球蛋白)或其片段涂覆牺牲珠粒。如本文中所用，术语“片段”是指来源于指定的分子的任何具有表位的片段。因此，IgG片段可以包含例如具有表位的F(ab’)2或Fab片段或Fc片段。此外，短语“IgG或其片段”意欲包括单独的IgG、单独的IgG片段(即，IgG的F(ab’)2片段、Fab片段和/或Fc片段的一个或多个)，或IgG和IgG片段的组合。可利用多种表面涂层实现期望的作用，只要使表面涂层接受调理素作用，或在暴露于待测定的样本后表面能够接受调理素作用。

如上文中所指出的，在优选的实施方案中，可将牺牲珠粒掺入干试剂涂层，所述涂层在一些实施方案中可以是包含信号发生试剂(例如，信号抗体(对于非竞争性测定)或标记分析物(对于竞争性测定))或杀白细胞试剂的相同干试剂涂层。因此，在本发明的一个实施方案中，分析装置包括干试剂涂层，所述涂层包含如下的一种或两种：(a)杀白细胞试剂；(b)适用于减少白细胞的作用的组分，例如涂覆有IgG或其片段的珠粒和/或(c)信号发生试剂例如信号抗体或标记分析物。

V.添加剂

在本发明的一些实施方案中，可将添加剂包含在测试盒中或与测试共同使用。在某些实施方案中，可添加抗凝剂。例如，在一些实施方案中，可添加肝素以在其中样本未被收集在肝素化管中或未在肝素化管中适当地混合的情况下改善性能。添加充足量的肝素以便新鲜未肝素化的血液在测试盒的测定周期(通常在2至20分钟的范围内)过程中保持不凝固。在其它实施方案中，可添加山羊和小鼠IgG以对抗免疫测定领域中已知的异嗜性抗体问题。在其它实施方案中，可添加proclin、DEAE-葡聚糖、tris缓冲剂和乳糖醇中的一种或多种作为试剂稳定剂。在其它实施方案中，可添加表面活性剂例如聚山梨酯20(Tween-20)以减少蛋白质对塑料的结合，所述塑料是用于测试盒的优选材料。表面活性剂的添加也有利于试剂在塑料表面上的均匀涂覆并且用作使糖例如乳糖醇的结晶降至最低的杂质。在本发明的其它实施方案中，可添加抗菌剂或杀虫剂(例如，叠氮化钠)以抑制细菌生长。

VI.打印混合物的制备及打印

在优选的实施方案中，如下制备用于1升(L)批次的基本打印混合物：将蛋白质稳定溶液(PSS，AET Ltd.，50％固体，100.0g)添加至200-250mL的氯化钠(8.00g)和叠氮化钠(0.500g)的水溶液，并将所得的溶液转移至1L容量瓶中。通过将鼠IgG(0.9g)添加至75mL的去离子水，并搅拌15-60分钟直至完全溶解来制备鼠IgG的溶液。以相同的方式制备等浓度的羊IgG溶液，并将两种溶液通过1.2μM过滤器过滤。从供应商(例如，Sigma-Aldrich)获得液体形式的鼠IgM。利用分光光度计在280nm测量三种免疫球蛋白(Ig)原液各自的蛋白质浓度。计算提供鼠IgG(0.75g)、羊IgG(0.75g)和鼠IgM(25mg)所需的这些Ig溶液的质量，并将这些量添加至打印溶液。通过将DEAE-葡聚糖(2.5g)添加至50-100mL的去离子水并搅拌30分钟来制备二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)溶液。将DEAE-葡聚糖溶液添加至打印溶液。向该溶液中添加肝素钠(10,000IU/mL，3.00mL)、Tween-20(3.00g)和5％(w/v)罗丹明水溶液(200μL)。利用去离子水将所得的溶液稀释至1.000L，并将其在冰箱或冷藏箱中贮存直至使用。当包含用于减少白细胞干扰的IgG涂覆的微粒时，可添加所述微粒，然后再进行该终稀释。同样地，可在终稀释之前或即将沉积在测试装置例如图1-6中显示的一般类型的测试盒之前添加上述类型的杀白细胞试剂。

在本发明的各个实施方案中，将打印混合物和类似液体打印以在测试盒的组件上形成干试剂涂层优选地是自动的，并且基于微分配系统(microdispensing system)，包括对齐组件的照相机和计算机系统，如Cozzette等的美国专利No.5,554,339(“‘339专利”)中公开的，将所述专利通过引用整体并入本文。在‘339专利中，硅片夹(wafer chuck)按轨道复位以将塑料测试盒底座传递至分配头(dispensing head)。轨道以预定的方向将底座呈递至分配头以确保一致的位置分配。

VII.收集和分析

根据本发明的各个实施方案，可将杀白细胞试剂和(如果使用的话)牺牲珠粒掺入样本收集装置，例如毛细管、Vacutainer^TM或注射器。在一些实施方案中，在收集装置的内壁上形成杀白细胞试剂涂层。这样，在一个实施方案中，本发明为用于进行免疫测定的试剂盒，其包括杀白细胞试剂，首先将所述杀白细胞试剂用于修正第一容器或位置中的血液样本，并且随后将样本传递至具有捕获和信号抗体的第二容器或位置。

在另一个实施方案中，可将杀白细胞试剂包含在溶液中并且与生物样本例如血液混合，并且将所得的修正样本引入分析装置例如测试盒中。在一个实施方案中，例如，可将血液样本与杀白细胞试剂(和任选地牺牲珠粒)混合以形成修正样本，随后将该修正样本引入分析装置例如测试盒。在另一个方面，装置在其中包括装有包含杀白细胞试剂和任选地牺牲珠粒的液体的小袋，可在装置中将所述液体与血液样本混合，随后如本文中所述进行处理以形成用于分析物检测的测定，例如夹心测定。

在另一个实施方案中，将电湿润用于混合包含杀白细胞试剂的第一液体与液体生物样本例如血液。在该实施方案中，可提供用于操作小滴的装置。所述装置例如可具有单侧电极设计，其中将所有导电元件包含在一个可在其上操作小滴的平面上。在其它实施方案中，为了包含待操作的小滴，可与第一表面平行地提供另外的表面。通过进行基于电湿润的技术来操作小滴，在所述技术中，可以以受控方式将包含或包埋在第一表面中的电极连续通电和断电。装置可允许许多小滴操作过程，包括将两个小滴融合和混合在一起，将小滴分成两个或更多个小滴，通过从液流形成可单独控制的小滴对连续液流进行取样，并且反复地二进制或数字混合小滴以获得期望的混合比率。这样，可将包含杀白细胞试剂和其它试剂(例如，牺牲珠粒)的第一液体的小滴与液体生物样本例如血液仔细地且可控地融合和混合。(参见，例如，Pamula等的美国专利No.6,911,132，将体整体通过引用并入本文)。

VIII.免疫传感器实施方案和与其相关的方法

虽然本发明广泛地适用于免疫测定系统，但在i-STAT免疫测定系统(Abbott Point of Care Inc.，Princeton，New Jersey，USA)的情况中其得到最充分的理解，如在以上引用共同拥有的未决的和公布的专利中所述。也参见2009年12月18日提交的标题为“Foldable CartridgeHousings for Sample Analysis”的美国专利申请No.61/288,189，将其整体通过引用并入本文。在各个实施方案中，为了评估测定过程中非特异性结合(NSB)发生的程度，系统使用免疫-参考传感器(参见，例如，Miller等的美国专利申请公布2006/0160164，如上文中引用并通过引用整体并入本文)。NSB可因洗涤不充分或因干扰的存在而增加。来自测定的净信号由从通过减去从免疫-参考感染器产生的非特异性信号而校正的从分析物免疫传感器产生的特异性信号组成。免疫-参考传感器上的信号的量受限于由质量控制算法确定的极限。

本发明的实施方案提高了i-STAT免疫测定形式对由白细胞引起的干扰的抗性；然而，此类实施方案同样地适用于标准ELISA形式，其中细胞存在于分析介质中。在一些实施方案中，利用优选与本发明的杀白细胞试剂组合的牺牲珠粒修正样本以提供减少的或消除的白细胞干扰。

应当指出，虽然常规夹心测定对于具有高白细胞水平的生物样本可产生错误结果，但先前的i-STAT

系统测定先前未报导这些样本的不准确结果，因为系统包括检测伪信号，利用错误代码警告用户和阻止结果显示的算法。这是用于可靠的即时测试的质量系统的一个实施方案。这样，就维持了分析系统的质量和完整性。

令人惊讶地和预料之外，当测试包含杀白细胞试剂的改进的测试盒并且将结果与缺乏这些材料的常规测试盒相比较时，结果显示，当使用杀白细胞试剂时，可精确地分析在常规测试盒中显示白细胞干扰的血液样本。

关于本发明的主题，已发现某些免疫测定测试盒，特别地BNP测试盒，显示因先前未知的干扰机制而产生的预料之外的正向和负向倾斜波形。分别参见例如图11(a)和(b)。这导致基于关于在洗涤步骤中将电极脉冲至正电位的作用的实验的关于干扰机制的假说。如图11(c)和(d)中显示的，基于理论基础预期的正常免疫传感器反应在低分析物浓度时具有接近0的斜率，并且仅在高分析物浓度时预期负斜率，其中测量可变成底物限制的而非酶限制的。

存在几个引起动态(非稳定状态)安培计信号的潜在机制。动态电极活性(改变有效电极面积)是不可能的，由于聚乙烯醇(PVA)层上的固定测定珠粒(微粒)的存在的缘故，电极与形成的元件隔离，其两者都未在血浆样本中显示该效应。动态的层厚度，例如，取决于流体接触，上方组件的膨胀或收缩，是不可能的，因为不存在对于这种引起正斜率和负斜率的现象的驱动力。酶的动态覆盖(例如，ALP，改变酶的表面浓度)被排除，因为在薄层形式中，酶(例如，ALP)在测量的时间量程内从传感器扩散是不可能的。给定分子(其相对较小并且具有相对容易的扩散(D≈5×10^-6cm²/s))的尺寸，酶底物例如对氨基苯酚磷酸酯(p-APP)至电极表面的动态运输是不可能的。因此，关于消除的过程，动态ALP活性被认为是动态传感器信号的最可能原因，并且进行进一步研究来评估机制。应指出，ALP对对氨基苯酚磷酸酯的水解是pH依赖性的，其中最佳pH值约为10。在一些实施方案中，在测试盒中，使用9.2的工作pH，因为该略微更低的pH值确保免疫复合物稳定性。此外，电极上对氨基苯酚(p-AP)的氧化是pH依赖性的并且预期pH每降低10就偏移约+59mV，即，在更低的pH时，反应必定更难驱动，即需要增大施加的电位。

在其中微粒打印层因与干扰组分的相互作用达到传感器结构内的样本液体(pH 7.4)不能在洗涤步骤中被分析液体(pH 9.2)完全替换的程度而变得不太可渗透的实施方案中，这导致最适度以下的检测步骤pH，特别是对于在离分析液体的进入点最远的区域发生的电极反应。该受损的液体更换产生随时间而变缓的pH梯度。当酶和电极反应的相对速率改变时，观察到的信号也将改变。该技术评估具有可观的优势：其提供了正向倾斜和负向倾斜的信号的解释。参见，例如，图11(a)和(b)。

通过在洗涤步骤中将脉冲施加至极端电位，例如将脉冲施加至氧化电位来进一步评估观察到的干扰与因微粒层的“阻塞”或“污垢”而引起的不完全洗涤步骤相关的概念。预期正向倾斜波形可能由惰性阻断传感器引起并且可能在分析步骤之前应用脉冲来清理电极。已观察到洗涤步骤过程中在正常样本中施加氧化脉冲对在随后的分析中观察到的信号无影响。参见，图12(a)。然而，在异常高的棕黄样本的情况下，脉冲的影响非常大并且为动态信号，并且此外，对于给定的分析物浓度，这些信号大于预期的信号。参见图12(b)。

在这两种情况下对氧化电位脉冲的反应的差异显示：传感器结构内的流体确实不同。如所预期的，正确的反应因传感器上方存在期望的分析流体引起，然而异常反应因传感器结构上方的流体为血浆或血浆与分析流体的组合引起。可如下理解反应的差异：根据：H₂O→1/2O₂+2H⁺+2e^-，氧化脉冲导致氧气的产生和pH的下降。

在传感器结构包含缓冲至pH 9.2的分析流体的情况下，在电极上产生的质子在缓冲液(100mM碳酸盐，于分析流体中)存在的情况下被迅速消耗。然而，在由分析流体提供的缓冲不存在的情况下，质子继续保留在电极区域，从而导致一缕酸性流体。该酸性液缕导致pAPP被酸催化水解成pAP，从而产生比预期更大的信号。具体地，异常波形由通过酶例如ALP对pAPP的酶促作用以及非酶促酸催化的水解产生的pAP引起。

应当指出，除非当其在低pH下时氨基被质子化，否则对于对氨基磷酸苯酯，酸催化的水解反应不会显著发生。这是因为反应需要对位上的强吸电子取代基(Barnard等，J.Chem.Soc.(1966)，227-235)。如本领域已知的，-NH₂取代基明显为供电子的，然而在质子化后，-NH₃ ⁺取代基变为高度吸电子的(甚至比-NO₂强；例如对于-NH₂，Hammetpara-rho值为-0.66，对于-NH₃ ⁺，所述值为1.70)。

这些实验使观察到的干扰与“高棕黄”样本发生关联，并且可通过利用富集的血沉棕黄层运行全血样本来有意引发。该术语被赋予当离心血液样本时在血浆红细胞边界形成的白细胞与血小板的层。牵涉白细胞和潜在地血小板作为污垢剂(fouling agent)的其它证据示于显微照片图17(a)(不使用牺牲珠粒或杀白细胞试剂的测定)和17(b)(使用牺牲珠粒后的测定)。为了比较，在图20中说明了与血液样本接触前的原始免疫传感器。获得了类似结果，从而提供了杀白细胞试剂用于减少白细胞至传感器的附着的用途的视觉确认。

图17(a)显示了使用具有10分钟的传感器孵育时间的标准测量周期暴露于高棕黄样本(～10⁵个白细胞/μL)的传感器。不将样本暴露于易受调理素作用的牺牲珠粒或任何杀白细胞试剂。很明显，一部分测定珠粒涂覆的传感器表面被不容易通过洗涤步骤除去的细胞附着层覆盖。

相反地，图17(b)显示使用具有10分钟的传感器孵育时间的标准测量周期暴露于高棕黄样本(～10⁵个白细胞/μL)的传感器。然而，与图17(a)中显示的测定相反，图17(b)中显示的样本暴露于易受调理素作用的(IgG涂覆的)牺牲珠粒。很明显，测定珠粒涂覆的传感器表面的部分当在洗涤步骤后与图17(a)相比较具有显著更少的附着细胞。

IgG用作调理素，其为能够标记病原体以例如被白细胞吞噬的物质。IgG通常被添加至免疫测定以处理异嗜性抗体干扰，如共同拥有有的未决的美国申请No.12/411,325中所描述的，并且存在于本文中描述的BNP测试盒的测定珠粒上。因此，IgG的该来源(当存在于免疫测定装置中时)或天然存在于血液样本中的IgG可能可以不期望地使传感器表面针对白细胞接受调理素作用。此外，由于测定珠粒在尺寸上与生物细胞(细菌)相似，所述生物细胞为吞噬作用的天然靶，因此测定珠粒上IgG的积累可能不期望地促进白细胞在这些珠粒上的积累。这与在具有高白细胞计数的样本和可能地具有活化的免疫状态的样本中观察到的干扰一致。本发明提供了对该白细胞干扰的解决方法，其中利用杀白细胞试剂，任选地利用牺牲IgG涂覆的微粒修正样本提供了降低白细胞活性以使其偏离传感器上的初次免疫试剂的方法。

如上文中所指出的，在一些实施方案中，除杀白细胞试剂外，还用牺牲珠粒修正样本。可使用与用于制备测定珠粒的方法类似的方法制备IgG涂覆的微粒。该方法包括将IgG至MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)中的羧化聚苯乙烯微粒的吸附，然后在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)存在的情况下进行交联。

现描述一个用于形成牺牲珠粒的非限定性方法。在优选方法中，通过以18,000RCF(相对离心力)离心20分钟从其基质(10％的水中的微粒，Seradyn)沉淀未加工的微粒，并将其重悬浮于25mM MES缓冲液中至100-200mg/mL的浓度的微粒。随后以等于约1至5％的微粒的重量添加溶解于25mM MES缓冲液中的IgG。在于冷藏箱中进行15-20分钟章动(nutation)后，通过以1300RCF离心20分钟沉淀出微粒，将其重悬浮于新鲜MES缓冲液至75mg/mL的浓度。通过测量280nm处的吸光度(1.4AU/mg/mL蛋白质的有效消光系数)测定来自离心的上清液的蛋白质含量以确认IgG已吸附至微粒上。将新鲜制备的EDAC交联剂(10mM于MES缓冲液中)添加至重悬浮微粒至约2-4mM的终浓度。随后通过在冷藏箱中章动120±15分钟来搅拌混合物。随后可再次通过以1300RCF离心20分钟来沉淀微粒，并将其重悬浮于1/5PPS(磷酸缓冲盐溶液)，并于冷藏箱中章动15-30分钟。在终离心后，可将微粒重悬浮于PBS+0.05％叠氮化钠中或1∶11/5PPB∶PSS(1/5PPB为用4份水稀释的PBS，PSS＝蛋白质稳定溶液，Applied Enzyme Technologies，Ponypool，UK)中至10％固体的浓度。可等分所得的制剂，并优选在-60℃下冷冻贮存。将通过该方法形成的悬浮于PBS中的微粒用于本文中描述的实验，并将其直接配入血液样本。

如下制备富集的或高棕黄层全血样本，如对于用于本文中描述的实验所描述的。从供体抽取新鲜全血至两个6mL EDTA-抗凝Vacutainers^TM中，并将其以2000RCF(标准转子)离心10分钟。当需要BNP“阳性”样本时，在离心前将BNP抗原搀入试管。在除血浆/血沉棕黄层/红细胞界面上方最近1毫米外，取出所有血浆并放置一旁。随后使用移液器取出界面区域(有意尽可能多地除去血沉棕黄层)并且放置一旁。随后除去红细胞，然后放置一旁。通过将血沉棕黄层材料与更少部分的血浆和红细胞级分组合，可能产生高棕黄血液样本同时保留正常样本血细胞比容例如35-55重量％。类似地，可产生具有低或基本上无棕黄材料(白细胞和血小板)存在的样本。

在实验中，利用如下试剂测试BNP测试盒：(i)高棕黄样本，(ii)在即将测试时利用10％体积的10个重量百分比的用PBS中的IgG(μP-IgG)涂覆的微粒的悬浮液处理的高棕黄样本，(iii)高血细胞比容的不含白细胞的样本，和(iv)低血细胞比容的不含白细胞的样本。

图21包括说明白细胞干扰对电化学免疫传感器信号斜率的影响和牺牲微粒处理对斜率的影响的图解数据。右和左图中说明的为作为正常全血样本(右图)和高棕黄血液样本(富集的白细胞，高棕黄，左图)的净信号(x-轴)的函数作图的传感器斜率(y-轴)。左图说明在牺牲微粒不存在的情况下(小批1)在高棕黄样本中观察到的信号斜率的相当的可变性。该可变性在牺牲微粒存在的情况下(小批2和3)被显著减小。在利用和不利用牺牲微粒的情况下在正常全血样本(右图)中观察到最小信号斜率可变性。

测定后传感器的显微观察显示在于高棕黄(HB)中运行的芯片上存在厚沉积，并且在HB/μP-IgG中运行的样本上不存在沉积。免疫传感器的显微照片示于图17(a)和17(b)中，并且它们相关的分析仪波形分别在图22(a)和(b)中进行了说明。很明显，从与图20中说明的血液样本接触之前的原始免疫传感器和利用牺牲珠粒处理的血液接触后的免疫传感器(图17(b))的比较很明显地看到，事实上存在显著的提高，即与图17(a)相比较附着的白细胞的减少。基于许多观察，该视觉提高与免疫传感器性能的实际提高直接相关。

其它实验显示干扰现象在单独的血浆中或包含血小板但不包含白细胞的样本中不存在，但仅存在于包含高棕黄水平的样本中。此外，用IgG涂覆的更小的微粒例如具有小于0.2μm的平均粒度的那些微粒，不具有与更大的颗粒相同的对传感器斜率的干扰减少作用。优选地，如果包含杀白细胞试剂，IgG涂覆的微粒(牺牲珠粒)的平均粒度为0.01至20μm，例如0.1至20μm、1至10μm、0.1至5μm或2至5μm。牺牲微粒的粒度分布优选为单峰的，虽然多峰分布也是可能的。原则上，可使用具有正确尺寸并且能够接受调整理素作用的任何颗粒；然而，聚苯乙烯珠粒是优选的。在本发明的优选的实施方案，使用山羊或绵羊IgG涂布的颗粒，虽然可使用其它IgG来源例如小鼠或兔IgG。一般地，发现微粒的尺寸非常重要，但其组成或IgG的来源不重要。关于牺牲珠粒，珠粒(如果使用的话)优选包括由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成的底物珠粒，并且可具有在约0.01μm至约20μm的范围内的平均粒度，更优选在0.1μm至5μm或约2μm至约5μm的范围内的平均粒度。虽然球状珠粒的使用是优选的，但在其它实施方案中，其它珠粒形状和结构例如椭圆、近球形、圆柱形和其它无规则形状的颗粒也在如本文中使用和定义的术语“珠粒”和“微粒”的含义之内。如本文中所用，术语“平均粒度”是指颗粒的平均最长尺度，例如球状颗粒的直径，如通过本领域熟知的方法测定的。

综上所述，实验数据支持结论：白细胞主要负责其中传感器在洗涤周期中变得不太可渗透的现象以及该免疫测定干扰可通过将牺牲IgG涂覆的颗粒添加至测定介质来减少。

本发明的免疫传感器的优选实施方案的晶片级微细加工(Wafer-level microfabrication)如下。如图9中显示的，基极94在15μm的中心上包含7μm金圆盘的方阵列。阵列覆盖直径约600μm的圆形区域，并且可在由一系列包含Si/SiO₂/TiW/Au的层制造的基底上使厚度为0.35μm的一薄层聚酰亚胺形成光模型来实现。7μm微电极的阵列提供了电活性种类的高收集效率，并且减少了与暴露的金属的电容相关的任何电化学背景电流的供给。在金属表面上包含聚(乙烯醇)(PVA)层显著增强了背景电流的减小。

在一些实施方案中，通过在晶片上的微电极上旋涂PVA+stilbizonium光敏交联剂的含水混合物来制备多孔PVA层。旋涂混合物任选地包含牛血清白蛋白(BSA)。随后使将晶片形成光模型(photo-pattern)以仅覆盖阵列上方和周围的区域，晶片优选具有约0.6μm的厚度。

微分测量的一般概念在电化学和传感领域中是已知的。现描述用于在电化学免疫传感系统中减少干扰信号的新型方法。然而，虽然已描述了成对的安培计电化学传感器，但其在其它电化学传感系统(包括但不限于电位传感器、场效应晶体管传感器和电导计传感器(conductimetric sensor))中具有相同的效用。本发明的实施方案还适用于光学传感器，例如，倏逝波传感器和光学波导器，以及还有其它类型的传感包括声波和温度计传感等。因此，根据本发明的各种实施方案，可将固定抗体附接于选自安培计电极、电位计电极、电导计电极、光学波导器、表面等离子共振传感器、声波传感器和压电传感器的传感器。理想地，在非竞争性测定实施方案中，来自免疫传感器(IS)的信号仅来源于包含固定抗体(Ab1)、分析物和被标记的信号抗体(Ab2)的夹心的形成，其中标记(例如，酶)与底物(S)反应以形成可检测的产物(P)，如下面方案(1)中显示的。

表面-Ab1-分析物-Ab2-酶；酶+S——→P(1)

已知一些信号抗体(Ab2)可非特异性结合表面，如下面方案(2)和(3)中显示的，并且在洗涤步骤过程中可能不能从免疫传感器的区域(达到相距约100微米)完全洗掉，从而产生不为表面-Ab1-分析物-Ab2-酶免疫测定夹心结构的函数的一部分总的检测到的产物，从而产生干扰信号。

表面-Ab2-酶；酶+S——→P(2)

表面-分析物-Ab2-酶；酶+S——→P(3)

如上文中指出的，可将第二免疫传感器任选地可置于测试盒中，所述第二免疫传感器用作免疫-参考传感器(IRS)并且产生与第一免疫传感器上产生的NSB程度相同的(或可预测地相关的)NSB。在一个实施方案中，可通过从第一免疫传感器的信号减去免疫-参考传感器的信号(即，除去信号的NSB组分)来减少干扰，从而提高测定的性能，如下面方案(4)中显示的。在另一个实施方案中，校正可任选地包括减去或加上额外的偏移值。

校正的信号＝IS-IRS         (4)

在本发明的优选实施方案中，除针对分析物(例如，cTnI)的捕获抗体被针对以高浓度天然存在于样本(正常和病理)中的血浆蛋白质的抗体替代外，参考免疫传感器，也称为免疫-参考传感器，在所有重要方面(例如，尺寸、多孔筛选层、胶乳颗粒涂层和金属电极组成)与第一免疫传感器相同。免疫传感器和参考免疫传感器在图9中显示的硅片上可被分别加工为相邻结构94和96。虽然在优选实施方案中描述了肌钙蛋白I和BNP测定，但该结构也用于其它心脏标志物测定，包括例如肌钙蛋白T、肌酸激酶MB、原降钙素、proBNP、NTproBNP、肌红蛋白等，加上用于临床诊断的其它夹心测定，例如PSA、D-二聚体、CRP、HCG、NGAL、髓过氧化物酶和TSH。

结合血浆蛋白的适当的抗体的实例包括针对人血清白蛋白、血纤蛋白原和IgG fc区域的抗体，其中白蛋白为优选的。然而，如果适当的抗体是可获得的，则可使用以大于约100ng/mL的浓度存在的任何天然蛋白质或血液组分。然而，蛋白质应当以足以与进行分析物测定所需的时间相比较快速地涂覆传感器的量存在。在优选实施方案中，蛋白质以在接触血液样本的约100秒内足以结合参考免疫传感器上超过50％的可获得的抗体的浓度存在于血液样本中。一般地，第二固定抗体具有约1×10^-7至约1×10^-15M亲和常数。例如，由于血液样本中白蛋白的高摩尔浓度(其为约1×10^-4M)，因此具有约1×10^-10M的亲和常数的针对白蛋白的抗体是优选的。

根据本发明的各个实施方案，假定被来源于样本的天然白蛋白覆的表面显著地减少了可存在的其它蛋白质和细胞材料的结合。该方法通常优于使用常规封闭试剂使NSB降至最低程度的常规免疫测定，因为此类试剂必须通常被干燥并且在使用之前保持稳定数月或数年，在该时间过程中它们可降解，产生比期望的更粘的表面并且导致随年份而增加的NSB。相反地，本发明的实施方案在使用时提供了新鲜表面。

如下描述了用于心脏脑钠肽(BNP)的免疫传感器(以参考免疫传感器进行微分测量以减小NSB的作用)。在一个实施方案中，利用相同方法制备用抗-BNP和抗-HSA涂覆的羧化修饰的胶乳微粒(由Bangs Laboratories Inc.，Fishers，Indiana，USA或Seradyn Inc.，Indianapolis，Indiana，USA提供)。首先通过离心更换颗粒的缓冲液，然后添加允许被动地吸附至颗粒上的抗体。随后在pH 6.2时利用MES缓冲液中的EDAC活化颗料上的羧基，以与抗体形成酰胺键。通过离心除去任何珠粒聚集体，并将完成的珠粒贮存在冰箱中。

在另一个实施方案中，胶乳珠粒的抗人血清白蛋白(HSA)抗体的饱和覆盖导致约7％的珠粒质量的增加。在另一个实施方案中，使用共价附着从包含7mg抗-HSA和100mg的珠粒的混合物制备涂覆的珠粒。通过使用该制剂，将一滴约0.4nL(包含约1％的去离子水中的固体)微分配至(使用美国专利No.5,554,339(上文中引用的并且通过引用整体并入本文)的方法和装置)覆盖传感器96的形成光模型的多孔PVA选择性渗透层，然后将其干燥。附着至多孔层的干燥颗粒大体上阻止了它们溶解于血液样本或洗涤液中。

在本发明的一个实施方案中，对于BNP抗体，胶乳珠粒表面的饱和覆盖导致约10％的珠粒的质量增加。因此，通过将10mg的抗-BNP与偶联剂一起添加至100mg的珠粒，实现了饱和珠粒覆盖。随后将此类珠粒微分配至传感器94上。

在另一个实施方案中，利用具有血浆蛋白抗体例如抗-HSA和分析物抗体例如抗-BNP的珠粒涂覆免疫传感器94。利用约2mg或更少的抗-HSA/100mg的用抗-BNP饱和涂覆的珠粒制备的胶乳珠粒在免疫传感器上提供了优良的NSB性质。已发现肌钙蛋白测定的斜率(信号对分析物浓度)未受到实质影响，因为在珠粒上存在充足的抗-BNP来捕获可获得的分析物(抗原)。通过测定不同抗体的珠粒饱和浓度和具有仅具有针对靶分析物的抗体的珠粒的免疫传感器的斜率，可测定具有针对给定的分析物和血浆蛋白质的抗体的珠粒的抗体组合的适当比率。

具有参考免疫传感器的免疫传感器的重要方面为由一层血浆蛋白质，优选HSA/抗-HSA组合产生的表面的“人源化”。该表面“人源化”似乎使珠粒不太易于抗体-酶缀合物的NSB并且还似乎减少珠粒的可变性。不受理论束缚，当传感器被样本覆盖时，它们似乎因抗-HSA表面而被天然白蛋白快速涂覆。这产生了与常规封闭材料相比较更优的结果，所述常规封闭材料在制造中被干燥掉，并且通常在长时期贮存后再水化。“人源化”传感器表面的另一个有利方面是其提供了对人抗-小鼠抗体(HAMA)和其它异嗜性抗体干扰的额外抗性模式。HAMA对免疫测定的影响是熟知的。

在另一个实施方案中，免疫-参考传感器用于本发明的装置和方法以监控在分析循环中获得的洗涤效率。如上文中提及的，背景噪声的一个来源为仍然存在于溶液中或非特异性吸附在传感器上以及未被洗涤步骤除去的少量酶缀合物。本发明的该方面涉及使用小体积的洗涤液，通过导入实施例2中提及的空气段来进行高效洗涤步骤。

在优选实施方案(其为安培计电化学系统)的操作中，通过分析仪记录与免疫传感器94和免疫-参考传感器96上由ALP的活性产生的对氨基苯酚的氧化相关的电流。免疫传感器和免疫-参考传感器上的电位相对于银-氯化银参考电极保持在相同的值上。为了除去干扰的影响，分析仪按照上述等式(4)从免疫传感器的信号减去免疫-参考传感器的信号。当在两个传感器之间存在特征性恒定偏差时，也减去该值。免疫-参考传感器不必使所有非特异性性质与免疫传感器的相同，只要免疫-参考传感器在测定的洗涤和NSB部分始终成比例即可。在一个实施方案中，嵌入分析仪的算法可解释两个传感器之间任何其它基本上恒定的差异。

免疫传感器和免疫-参考传感器的差异组合而非单独的免疫传感器的使用提供了下列对测定的改进。在优选的实施方案中，测试盒设计提供了产生约40-50亿个溶解于10μL血液样本中的酶缀合物分子的干试剂。在结合和洗涤步骤结束时，传感器上酶分子的数目为约70,000。在利用优选实施方案的实验中，在免疫传感器和参照免疫传感器上存在平均约200,000(±约150,000)个酶分子作为非特异性结合背景。通过使用免疫-参考传感器的差异测量，消除了约65％的不确定性，显著提高了测定的性能。虽然其它实施方案可具有其它程度的提高，但测定性能的总体提高的基础仍然存在。

任选的免疫-参考传感器的另外用途是检测异常样本状况，例如在管道中到处沉积材料和在免疫传感器和免疫-参照传感器上引起增强的待测量的电流的不适当的抗-凝固样本。该效应与在测量步骤过程中非特异性吸附的酶和保留在覆盖传感器的洗涤液的薄层中的酶相关。

任选的免疫-参考传感器的另一个用途是校正洗涤效率的信号。在某些实施方案中，免疫传感器上信号的水平取决于洗涤的程度。例如，利用更多的液体/空气段转换的更长的洗涤可因部分特异性结合缀合物被洗掉而产生更低的信号水平。虽然这可以是相对小的作用，例如小于5％，但校正可提高测定的总体性能。可基于传感器上的相对信号，或与位于邻近传感器的管道中的电导率传感器(用作检测空气段/液体转换和计数其次数的传感器)结合来实现校正。这为嵌入分析仪的算法校正装置提供了输入。

在利用内源蛋白质例如HSA的参考免疫传感器的另一个实施方案中，可能通过使免疫-参考传感器涂覆以针对外源蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)的抗体来实现相同目标。在该情况下，在与传感器接触之前，需要将一部分BSA(作为额外的试剂提供的)溶解于样本的步骤。可在测试盒的样本保持室中或在外部收集装置例如BSA涂覆的注射器中利用BSA作为干试剂来进行该溶解步骤。该方法提供了某些优势，例如可选择蛋白质的表面电荷、特殊表面基团、糖基化的程度等。这些性质可能不一定存在于可获得的内源蛋白质的选择中。

除了盐以外，其它试剂也可在免疫测定中提高全血精确性。应当以促进快速溶解的方式将此类试剂提供给血液样本。在一些实施方案中，涂覆在血液-保持室(或另一个管道)的壁上的，包括纤维素、聚乙烯醇(PVA)和明胶(或其混合物)的支持基质促进快速溶解，例如在15秒内高于90％的完成。

本发明的测试盒具有这样的优势：样本和第二流体在测定顺序过程中在不同时间接触传感器阵列。样本和第二流体也可利用最初在各自管道内以干涂层提供的其它试剂或化合物来单独地修正。液体在测试盒内的受控运动还允许超过一种物质被修正至每一种液体中，无论样本或流体何时移动至管道的新区域。这样，给每一种流体提供了多个修正，极大地扩展了可进行的自动化测定的复杂性，从而增加了本发明的功用。

在一次性使用测试盒中，优选使包含的液体的量继续减少以使成本和尺寸降至最低限度。因此，在本发明中，管道内的区段也可用于通过使区段的空气-液体界面通过待漂洗的传感器阵列或其它区域至少一次来帮助清洗和漂洗管道。已发现通过该方法实现了与利用更大体积的流体进行的连续漂洗相比较使用更少流体的更高效的漂洗。

管道内的缢缩在本发明中用于几个目的。在一个实施方案中，位于样本保持室与第一管道之间的毛细管终端用于通过在施加足够的压力以克服毛细管终点的阻力之前阻止样本在保持室中移动来帮助在保持室中进行样本计量。在另一个实施方案中，第二管道中的缢缩用于当流体到达缢缩时使洗涤液沿着可选择途径转向废液室。衬垫中的小孔与疏水涂层一起被提供来在施加充足的压力之前阻止从第一管道至第二管道的流动。控制液体在本发明的管道内和之间的流动的部件在本文中统称为“阀门”。

本发明的一个实施方案提供了具有连接于第一管道的样本保持室的一次性使用测试盒，其包括分析物传感器或分析物传感器的阵列。部分地包含流体的第二管道与第一管道连接，并且可将空气段引入第二管道的流体中以将其分段。泵装置被提供来置换第一管道内的样本，并且所述泵将流体从第二管道置换至第一管道中。因此，传感器可首先与样本接触，随后与第二流体接触。

在另一个实施方案中，测试盒包括位于第一管道与废液室之间的可关闭阀门。该实施方案允许仅使用单个连接于第一管道的泵装置将流体从第二管道置换至第一管道中。该实施方案还允许高效洗涤本发明的测试盒的管道，这是小型一次性使用测试盒的重要部件。在操作中，转移样本以接触传感器，并且随后通过可关闭阀门将其转移至废液室中。在浸湿后，可关闭阀密封废液室的开口，从而提供了允许仅使用连接于第一管道的泵装置将第二管道中的流体抽吸至与传感器接触的气密封闭。在该实施方案中，可关闭阀门允许液体以这样的方式转移，并且阻止空气从废液室进入第一管道。

在另一个实施方案中，提供了用于将区段引入管道的可关闭阀门和装置。该实施方案具有许多优势，其中之一是交换在传感器或传感器阵列上方的分段的流体的能力。因此将第一区段或区段组用于漂洗传感器，并且随后新鲜区段替代其以进行测量。只需要一个泵装置(连接于第一管道)。

在另一个实施方案中，在覆盖在分析物传感器上的一层液体薄膜中进行分析物测量。此类薄膜测定优选通过安培计法来进行。该测试盒与前述实施方案相异在于在管道内具有可关闭阀门，当样本通过阀门排出时其被封闭；和排气孔，其允许至少一个空气段随后被引入测量流体，从而增加从传感器漂洗样本的功效，并且还允许在测量之前从传感器除去绝大部分液体，以及还允许成段的新鲜液体被带往通过传感器以允许连续反复测量，以提高精确度和内部重现性检查。

在非竞争性测定实施方案中，如上文中论述的，用于检测低浓度的免疫活性分析物的分析方案依赖于酶标记的抗体/分析物/表面结合的抗体“夹心”复合物的形成。将样本中分析物的浓度转换成成比例的酶的表面浓度。酶能够通过将底物转化成可检测的产物来放大分析物的化学信号。例如，当酶为碱性磷酸酶时，单个酶分子每分钟可产生约9000个可检测的分子，从而提供了与其中将电活性种类联接于抗体(取代碱性磷酸酶)的方案相比较分析物的检测限的数个数量级的提高。

在免疫传感器实施方案中，有利地首先使传感器与样本接触，随后与洗涤液接触，然后记录来自传感器的反应。在一些具体实施方案中，除了被IgG-涂覆的微粒修正以减少白细胞干扰外，还在修正样本接触传感器之前利用结合样本中的目标分析物的抗体-酶缀合物(信号抗体)修正样本。样本中的结合反应产生分析物/抗体-酶复合物。传感器包括紧贴至电极表面的固定的针对分析物的抗体。在与传感器接触后，分析物/抗体-酶复合物结合电极表面附近的固定抗体。在该点上有利地从电极的附近除去尽可能多的未结合的抗体-酶缀合物以使来自传感器的背景信号降至最低。抗体-酶复合物的酶有利地能够转化流体中提供的底物以产生电化学活性种类。该活性种类紧邻电极产生，并且当施加适当的电位(安培计操作)时提供了来自电极上的氧化还原反应的电流。或者，如果电活性种类为离子，其可利用电位计法来测定。在安培计测量中，电位可在测量过程中保持恒定，或根据预定波形变化。例如，三角波可用于扫描极限之间的电位，如在熟知的循环伏安法技术中使用的。或者，数字技术例如方波可用于提高邻近电极的电活性种类的检测的灵敏度。根据电流或电压测量，计算分析物在样本中的量或存在。此类和其它分析电化学法在本领域是熟知的。

在其中测试盒包括免疫传感器的实施方案中，免疫传感器有利地从惰性金属例如金、铂或铱以及覆盖有附着于微粒例如胶乳颗粒的生物活性层的多孔选择性渗透层微细加工而来。微粒被分配至覆盖电极表面的多孔层上，形成附着的多孔生物活性层。生物活性层具有特异性结合目标分析物，或当分析物存在时表现可检测的变化的性质，并且最优选为固定的针对分析物的抗体。

参考图，本发明的测试盒包括罩子，其实施方案示于图1和2中；底座，其实施方案示于图4中；和薄膜粘合衬垫，其实施方案示于图3中，位于底座与罩子之间。参考图1，罩子1由坚硬材料，优选塑料制成，其能够在柔韧的铰链区5、9、10反复变形而不破裂。罩子包括盖子2，通过柔韧的铰链9联接于罩子的主体。在操作中，在将样本引入样本保持室34后，盖子可被固定在样本进口4的入口上方，从而防止样本泄漏，并且通过钩子3将盖子保持在原位。罩子还包括两个浆6、7，其可相对于罩子的主体移动，并且所述浆通过柔韧的铰链区5、10与其联接。此外，在操作中，当通过泵装置操作时，浆6对由腔43组成的气球囊(其覆盖有薄膜衬垫21)施加压力，以置换测试盒的管道内的流体。当通过第二泵装置操作时，浆7对衬垫21施用压力，所述衬垫可因在其中切割的裂缝22而变形。测试盒经改造适合于插入读出设备，并且从而为了该目的而具有多个机械和电连接。在本发明的其它实施方案中，测试盒的手工操作是可能。

在将测试盒插入读出设备后，衬垫就将压力传递至位于腔42中的充满约130μL分析/洗涤溶液(“流体”)的包含流体的箔包装，通过刺突38破裂包装，并且将液体排入管道39，所述管道通过底座中的短连接管道连接于传感器管道。分析流体填充分析管道的前部，首先将液体挤压至用作毛细管终端的带衬垫的小开口上。施加于测试盒的分析仪机械装置的其它动作用于将一个或多个区段在分析管道内的受控位置上注射入分析流体。这些区段用于以最少量的流体帮助洗涤传感器表面和周围管道。

在一些实施方案中，罩子还包括被柔韧薄膜8覆盖的孔。在操作中，施加在膜上的压力将一个或多个空气段通过衬垫中的小孔28排入管道20。

参考图2，底座的下表面还包括第二管道11和第一管道15。第二管道11包括缢缩(constriction)12，其通过给流体的流动提供阻力来控制流体流动。任选的涂层13、14提供疏水表面，其与衬垫孔31、32一起控制第二与第一管道11、15之间的流体流动。底座中的凹陷17提供了管道34中的空气通过衬垫中的孔27通达管道34的途径。

参考图3，薄膜衬垫21包括各种孔和和裂缝以利于流体在底座与罩子中的管道之间的转移，以及当必要时允许衬垫在压力下变型。因此，孔24允许液体从管道11流入废液室44；孔25包括管道34与15之间的毛细管终端；孔26允许空气在凹陷18与管道40之间流动；孔27提供了空气在凹陷17与管道34之间的空气流动；孔28允许流体从管道19通过任选的可关闭阈门41流至废料室44。孔30和33分别允许安装在剖面(cutaway)35和37内的多个电极与管道15中的流体接触。在具体的实施方案中，剖面37安装了接地电极，和/或对-参考(counter-reference)电极，并且剖面35安装了至少一个分析物传感器和任选地电导计传感器。在图3中，带21在22上被裂开以允许被3个切口22围绕的带在仪器施加向下的力以在倒钩38上破裂元件42内校准物小袋时变形。带还在23上被切开，并且这允许带在仪器提供向下的力时向下弯曲至元件43中，将空气从小室43排出并且将样本流体通过管道15移向传感器。图3中的元件29用作带中连接图2的罩子中的区域与图4的底座的开口。

参考图4，管道34为装配测试盒中连接样本进口4与第一管道11的样本保持室。剖面35安装了分析物传感器或分析物反应表面以及任选的电导计传感器。剖面37安装了接地电极(需要时)作为电化学传感器的返回电流路径，并且还可安装任选的电导计传感器。剖面36提供了衬垫孔31与32之间的流体道，以便流体可在第一与第二管道之间通过。凹陷42在装配的测试盒中安装了包含流体的包装，例如可破裂的小袋，其可因在插入读出设备后施加在浆7上的压力而被刺突38刺破。来自刺破的包装的流体流入39上的第二管道。气球囊由其上表面上被衬垫21密封的凹陷43组成。气球囊为泵装置的一个实施方案，并且由施加至浆6的压力驱动，其置换管道40中的空气，并且从而将样本从样本室34置换至第一管道15内。

空气从气球囊进入样本保持室的位置(衬垫孔27)和毛细管终端25一起界定了样本保持室的预定体积。当浆6被压下时，相应于该体积的样本的量被置换至第一管道中。该排列从而为用于将计量量的未计量样本递送至测试盒的管道内的计量装置的一个可能实施方案。

在测试盒的某些实施方案，用于计量样本区段的装置提供于底座塑料部分。区段的尺寸受底座中区室的尺寸以及毛细管终端和带衬垫中通气管孔的位置控制。该体积可容易地从2变化至200μL。样本尺寸的该范围的扩大在本发明的背景中是可能的。

在一些实施方案中，将流体挤压通过通过分析前管道11，所述分析前管道可用于在其呈现在传感器管道19之前将试剂(例如，颗粒、可溶性分子或IgM或其片段)修正进入样本。或者，可将修正试剂置于部分15，部分16之外。挤压样本通过分析前管道还用于将张力引入隔膜泵桨7，这将增强其反应以驱动流体置换。

根据本发明的某些实施方案，如果需要定量分析物，则计量在一些测定中是有利的。为从管道排出的样本和/或流体提供了废液室44，以防止污染测试盒的外表面。还提供了连接废液室与外部大气的排气孔45。测试盒的一个期望的特征为一旦加载样本，可完成分析，并且然后弃去测试盒而无需操作者或其它接触样本。

现参考图5，提供了测试盒及组件的特征的示意图，其中51-57为管道的部分和可任选地利用干试剂涂覆以修正样本或流体的样本室。样本或流体至少在干试剂上通过一次以将其溶解。用于修正样本的试剂可包括如下试剂的一种或多种：抗体-酶缀合物(信号抗体)、一种或多种杀白细胞试剂、IgM和/或其片段、IgG和/或其片段以及其它阻止测定化合物之间特异性或非特异性结合反应的封闭试剂，和/或用于减少白细胞干扰的上述IgG涂覆的微粒。还可提供不溶性的但有助于防止测试组分至测试盒的内表面的非特异性吸附的表面涂层。

在特定的实施方案中，在第一管道与废液室之间提供了可关闭的阀门。在一个实施方案中，该阀门58由利用非渗透性物质涂覆的干海绵材料组成。在操作中，使海绵材料与样本或流体接触导致海绵肿胀以充满腔41(图4)，从而大体上阻断了流体至废液室44的进一步流动。此外，浸湿的阀门也阻断了第一管道与废液室之间的空气的流动，这允许连接于样本室的第一泵装置置换第二管道内的流体，以及以下列方式将来自第二管道的流体置换至第一管道中。

现参考图6，该图举例说明了免疫传感器测试盒的示意性布局，其中提供了3个泵61-63。虽然已以特定实施方案的方式描述了这些泵，但很容易理解，任何能够进行泵61-63的各自功能的抽泵装置可用于本发明中。因此，泵1，61应当能够将样本从样本保持室置换至第一管道内；泵2，62应当能够置换第二管道内的流体；以及泵3，63应当能够将至少一个区段插入第二管道。本申请中设想的其它类型的泵包括但不限于接触籍以将压力施加至气囊的气动装置的气囊、柔韧膈膜、柱塞和汽缸、电动泵(electrodynamic pump)和声泵(sonic pump)。关于泵3，63，术语“泵”包括籍以将一个或多个区段插入第二管道的所有装置和方法，例如用于从气囊置换空气的气动装置、当溶解时产生气体的干化学药品或多个可操作地连接于电源的电解电极。在具体的实施方案中，使用可具有超过一个气球囊(air bladder)或气室(airchamber)的机械区段产生膈膜产生区段。如所显示的，孔8具有连接内膈膜泵与将要向其中注射区段的充满流体的管道20的单个开口。可将膈膜分段以产生多个区段，每一个区段被注射在充满流体的管道内的特定位置中。在图6中，元件64表示其中免疫传感器进行捕获反应以形成包含固定抗体、分析物和信号抗体的夹心的区域。

在替代性实施方案中，使用被动部件(passive feature)注射区段。测试盒的底座中的孔可利用带衬垫来密封。覆盖孔的带衬垫在任一端上具有两个小孔。一个孔是开放的而另一个孔被在与流体接触后湿润的过滤材料覆盖。孔充满了疏松的亲水材料例如纤维素纤维滤器、滤纸或玻璃纤维滤器。该亲水材料通过毛细管作用吸引液体进入底座中的孔，置换先前存在于孔中的空气。空气通过带衬垫中的开口排出，从而产生其体积由孔的体积和疏松的亲水材料的空隙体积决定的区段。可选择用于覆盖至底座中的孔的进口之一的滤器来计量液体充满孔的速度，并且从而控制区段被注射进罩子中的管道内的速度。该被动部件允许许多受控区段被注射在流体道(fluid path)内的特定位置并且需要最小的空间。

IX.用于减少或消除白细胞干扰的装置、试剂盒和方法

基于本文中的公开内容，很明显本发明的实施方案提供了在分析物免疫测定中减少或消除来自白细胞的干扰的方法。

优选的实施方案涉及通过使样本与显著抑制样本中白细胞活性的杀白细胞试剂接触来进行血液样本的靶分析物的免疫测定。还对样本进行免疫测定以检测靶分析物。如本文中所描述的，在一些实施方案中，杀白细胞试剂可以为氧消耗试剂和葡萄糖消耗试剂，例如具有或不具有电子受体的葡糖氧化酶。在其它实施方案中，试剂可由己糖激酶和ATP的来源例如肌酸激酶、ADP和磷酸肌酸组成。另一个选择为葡糖脱氢酶，具有例如NAD、NADH氧化酶和电子受体或GDH-PQQ。在其它实施方案中，可使用氧消耗试剂例如连二亚硫酸酯、葡糖氧化酶(具有或不具有添加的葡萄糖)和抗坏血酸氧化酶。

如果本发明还构成其中杀白细胞试剂为线粒体电子传递抑制剂和/或线粒体膜解偶联剂，例如氰化物；抗霉素；鱼藤酮；丙二酸酯；羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙；2，4-二硝基酚和寡霉素的实施方案。在另外的实施方案中，试剂可以为两亲性试剂例如皂苷、杀白细胞素和粘多糖。另一个选择为使用单克隆抗体AHN-1，其抑制人嗜中性粒细胞的吞噬菌作用，参见Skubitz等，Blood 65，333-339，(1985)，将其通过引用并入本文。

本发明可同样地适用于夹心和竞争性免疫测定。在夹心测定实施方案中，样本接触具有固定的针对靶分析物的第一抗体和标记的针对所述靶分析物的第二抗体的免疫传感器。在竞争性测定实施方案中，样本接触包含固定的针对所述靶分析物的第一抗体和与靶分析物竞争结合的标记靶分析物的免疫传感器。典型的分析物包括但不限于TnI、TnT、BNP、NTproBNP、proBNP、HCG、TSH、NGAL、地高辛、茶碱和苯妥英等。

在本发明的一些实施方案中，首先收集样本例如全血样本，并且随后通过将包含一种或多种杀白细胞试剂和任选地牺牲珠粒的干试剂溶解于样本中来修正样本。在某些实施方案中，将充足的牺牲珠粒用于提供相对于血液样本中的白细胞过量的珠粒。这产生了具有至少5微克/微升的样本，例如至少10微克/微升的样本或至少15微克/微升的样本的溶解的牺牲珠粒浓度的样本，所述浓度足以充分吸引样本中的任何白细胞。就范围而言，干试剂优选溶解于样本中以产生约5微克至约40微克珠粒/微升的样本，优选约10至约20微克珠粒/微升的样本的牺牲珠粒浓度。取决于珠粒的尺寸，这对应于至少约10⁴个珠粒/微升的样本，至少约10⁵个珠粒/微升的样品，或大致约10⁵至约10⁶个珠粒/微升的样本。因此，在一些优选实施方案中，除了杀白细胞试剂外，牺牲珠粒也以足以提供至少10⁴个珠粒/微升的样本，例如，至少约10⁵个珠粒/微升的样本，或约10⁵至约10⁶个珠粒/微升的样本的溶解的牺牲珠粒浓度的量存在。一旦完成该步骤，就可能对修正样本进行免疫测定，例如电化学免疫测定以测定分析物的浓度。

干试剂的溶解和夹心形成步骤可同时发生或以分步方式发生。本发明的方法的实施方案主要涉及为心血管标志物的分析物例如TnI、TnT、CKMB、肌红蛋白、BNP、NT-proBNP和proBNP，但也可用于其它标志物例如β-HCG、TSH、髓过氧化物酶、肌红蛋白、D-二聚体、CRP、NGAL和PSA。为了确保在检测步骤之前隔离大部分白细胞，优选将样本修正步骤进行选择的预定时间(在约1分钟至约30分钟的范围内)。

在优选的实施方案中，在包括免疫传感器、管道、样本进口和样本保持室的测试盒中进行方法，其中用干试剂涂覆这些元件的至少一个的至少一部分。注意，干试剂可包括如下试剂的一种或多种：杀白细胞试剂、牺牲珠粒(用于减少白细胞干扰)、缓冲液、盐、表面活性剂、稳定剂、简单碳水化合物、复杂碳水化合物及各种组合。此外，干试剂还可包括针对分析物的酶标记抗体(信号抗体)。

如果使用牺牲珠粒，如上文中所建议的，除了使用完整IgG分子(其中单个单体是从联接于F(ab′)2区域的Fc区域形成的，其因而包含两个Fab区域)涂覆牺牲珠粒外，或并非使用完整IgG分子涂覆牺牲珠粒，还可能使用IgG的片段。IgG片段可使用二硫键还原(-S-S-至-SH HS-)与酶促胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解的组合以各种方式获得，以产生F(ab′)2片段、Fab片段和/或Fc片段的一些组合。这些片段可通过层析分离以进行单独使用，或组合使用。例如，当封闭位点在Fc片段上时，可使用所述Fc片段而不用完整IgG分子。这同样地可用于Fab片段和F(ab’)2片段。

在实际测定步骤中，在优选的实施方案中，一旦夹心在固定抗体与信号抗体之间形成，则随后将样本介质清洗至废液室，然后将夹心暴露于能够与酶反应的底物以形成能够电化学检测的产物。优选形式为电化学酶偶联免疫吸附测定。

优选地，装置为进行样本例如血液样本的分析物的免疫测定并且减少来自白细胞的干扰的装置。装置安装有电化学免疫传感器、管道和样本进口，其中管道允许样本以受控的方式从进口通过到达免疫传感器。

在一个方面，包含目标分析物的样本可利用一种或多种减少或消除白细胞的活性的杀白细胞试剂来进行修正，如上文中描述的，并且然后在免疫测定中分析所得的修正样本以测定分析物含量和/或浓度而无显著的白细胞干扰。在优选的实施方案中，消弱的活性为吞噬作用。关于本发明的各种优选的实施方案，此类实施方案包括利用葡糖氧化酶和葡萄糖修饰全血样本以产生高于约3IU/mL和500mg/dL的各自样本浓度，利用或不利用约0.5mg/mL的皂苷，以及利用或不利用如本文中所描述的易受调理素处理的诱饵珠粒。

在另一个方面，除了利用一种或多种杀白细胞试剂修正样本外，还可利用可包含非人IgG-涂覆的牺牲珠粒的干试剂涂覆室的至少一部分。重要特征是干试剂能够溶解于样本中并且在结合和优选吞噬作用上吸引白细胞。这通常足以潜在地隔离样本中的干扰白细胞。

在优选实施方案中，装置还包括免疫-参考传感器。免疫传感器优选涉及检测心血管标志物，例如分析物例如TnI、TnT、CKMB、肌红蛋白、BNP、NT-proBNP和proBNP。其中装置运行的系统通常允许样本保持与试剂接触进行预定的时间例如1至30分钟。优选地装置为一次性使用测试盒，例如充填单份样本，用于测试一次并且随后弃去。通常，装置包括能够将样本清洗至废液室的洗涤液，和能够与免疫传感器上的酶夹心反应以形成适用于电化学检测的产物的底物。

更广泛地，本发明涉及在用于其中通常存在白细胞的任何生物样本的分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰。此外，对修正样本进行免疫测定以测定选择的分析物的浓度可基于各种技术，包括电化学技术例如安培计和电位计技术，以及还有光学技术例如吸光技术、荧光技术和发光技术。

本发明的各个实施方案涉及用于进行全血样本中的靶分析物的免疫测定的试剂盒，其包括杀白细胞试剂(其中所述试剂大体上抑制样本中的白细胞的活性)和用于检测靶分析物的免疫测定试剂。本发明的其它实施方案涉及用于进行怀疑存在于血液样本中的分析物的免疫测定的试剂盒，其中所述试剂盒包括一种或多种杀白细胞试剂、针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒、固定的针对分析物的第一抗体和针对分析物的第二抗体。此外，可改进本领域已知的现有免疫测定形式以包括牺牲珠粒，例如通过在样本预处理步骤中在样本中添加珠粒。该预处理可通过将牺牲珠粒掺入血液收集装置、单独的容器中来实现，或可通过将牺牲珠粒掺入装置的测试循环来在分析(免疫测定)装置本身中发生。

虽然已在BNP测试盒的背景中描述了本发明，但其可同样地适用于其中白细胞存并且可以是干扰的原因的任何免疫测定。方法或试剂盒不限于BNP但可适合于任何免疫测定，包括但不限于proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D-二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL、CKMB和髓过氧化物酶。此外，方法和试剂盒适用于这样的测定，在所述测定中利用任何非人IgG或其片段(包括鼠、羊、牛和狼的)涂覆牺牲珠粒(如果使用的话)，以及或者利用活化的人IgG或其片段涂覆牺牲珠粒。牺牲珠粒可包括利用选自蛋白质、细菌、病毒和异生物体的材料或其片段涂覆的基质珠粒(substrate bead)，或可由静止或另外地稳定的细菌细胞、孢子或其片段例如大肠杆菌(E.coli)提供，任选地无基质珠粒。

虽然某些上述测定使用联接于测定珠粒的固定的第一抗体，所述珠粒依次联接于底下是电极的多孔层，可将第一抗体直接固定在电极或任何其它表面上，或固定在可溶性珠粒上。

本发明的试剂盒或方法可包括以可溶性干试剂形式存在的第二标记抗体。在一些实施方案中，可溶性干试剂包括一种或多种杀白细胞试剂和任选地易受调整素作用的牺牲珠粒作为可溶性干试剂的部分，或其中各种组分存在于单独的干试剂位置中。注意，固定和标记抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、其片段及其组合。此外，第二抗体可用各种标记物标记，包括放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光种类以及免疫测定领域内已知的其它标记物。当利用酶标记第二抗体时，其优选为ALP、辣根过氧化物酶或葡糖氧化酶。

试剂盒或方法适用于包含白细胞的任何样本，例如全血，并且可以为利用抗凝剂例如EDTA、肝素、氟化物、柠檬酸盐等修正的血液样本。

当方法或试剂盒用于进行非竞争性免疫测定时，可存在一系列混合步骤，包括：(i)将怀疑包含分析物的血液样本与试剂(包括一种或多种杀白细胞试剂)和任选地易受调理素作用的牺牲珠粒混合；(ii)将血液样本与固定的针对分析物的第一抗体混合，形成固定抗体与所述分析物之间的复合物；和(iii)将血液样本与标记第二抗体混合以与所述分析物和所述固定抗体形成复合物。注意，这些混合步骤可同时或以指定的顺序进行。例如，步骤(ii)和(iii)可同时发生，或步骤(i)和(iii)可在步骤(ii)之前进行。在最后的步骤中，测定固定第一抗体、分析物与标记第二抗体之间形成的复合物的量。

本发明的方法的实施方案涉及显著减少分析物免疫传感器上积累的白细胞。在一些实施方案中，免疫传感器由基于抗体的试剂和/或针对分析物的抗体涂覆的测定珠粒制成。在将怀疑包含分析物的样本与一种或多种杀白细胞试剂和任选地易受调理素作用的牺牲珠粒混合以形成修正样本(其中样本中的白细胞优先被一种或多种杀白细胞试剂减少或寻求优先吞噬牺牲珠粒(如果存在的话))后，随后使修正样本与免疫传感器接触。作为结果，存在最低限度的白细胞积累，并且可获得可靠的测定。

本方法涉及进行怀疑存在于血液样本中的分析物的免疫测定，包括：将怀疑包含分析物的血液样本与一种或多种杀白细胞试剂以及任选地与过量的易受调理素作用的牺牲珠粒混合以形成修正样本，其中利用杀白细胞试剂和/或优先寻求吞噬牺牲珠粒(如果存在的话)来减少样本中的白细胞；使修正样本与包含固定在电极上的针对分析物的抗体涂覆的珠粒的免疫传感器接触；在所述抗体涂覆的珠粒、所述分析物与第二标记抗体之间形成夹心；从所述免疫传感器洗涤所述血液样本；和利用所述免疫传感器测定所述夹心标记的量，并且使所述标记的量与样本中分析物的浓度相关。

本方法还涉及进行怀疑存在于血液样本中的分析物的免疫测定，包括：将怀疑包含分析物的血液样本与一种或多种杀白细胞试剂以及任选地与过量的易受调理素作用的牺牲珠粒混合以形成修正样本，其中利用一种或多种杀白细胞试剂和优先寻求吞噬牺牲珠粒(如果存在的话)减少样本中的白细胞；使修正样本与针对分析物的试剂和/或珠粒接触；在所述试剂和/或珠粒、所述分析物和第二标记抗体之间形成夹心；从所述试剂和/或珠粒洗涤所述血液样本；和测定所述夹心标记的量，并且使所述标记的量与样本中分析物的浓度相关。

本方法还涉及用于进行怀疑存在于血液样本中的分析物的免疫测定的测试盒，其在管道中包括免疫传感器，其中所述免疫传感器具有固定的针对分析物的第一抗体。在一些实施方案中，管道优选具有干试剂涂层或包含一种或多种杀白细胞试剂和任选地针对白细胞易受调理素作用的牺牲珠粒以及针对所述分析物的第二标记抗体的单独的涂层。在操作中，干试剂溶解于所述血液样本中。

实施例

鉴于下列非限制性实施例可更好地理解本发明。

实施例1

图7说明了根据美国申请No.12/411,325(上文中引用的并且通过引用整体并入本文)的特定实施方案的安培计免疫测定用于测定肌钙蛋白I(TnI)(心脏坏死的标志物)的存在和量的原理。将血液样本引入测试盒的样本保持室，并且通过溶解涂覆至样本保持室中的干试剂来修正血液样本。干试剂包括IgM 77，其在溶解入样本后，选择性结合可包含在样本中的互补异嗜性抗体78。如所显示的，干试剂还可包含IgG 79，其还可在溶解于样本中后选择性结合互补抗体78。

图10说明根据美国专利申请12/620,179和12/620,230安培计免疫测定用于测定心脏功能的标志物例如BNP和TnI的存在和量，以及使用易受调理素作用的牺牲珠粒减少白细胞干扰的原理。将血液样本引入测试盒的样本保持室，通过溶解涂覆至样本保持室中的干试剂来修正血液样本。干试剂包括牺牲珠粒102，其在溶解入样本后，选择性结合可包含在样本中的白细胞103。注意，干试剂还可以和优选地包含IgM和IgG，如对于图7所描述的。

此外，图7和10显示包含共价联接于信号抗体71例如多克隆抗-肌钙蛋白I抗体的碱性磷酸酶(AP)的缀合物分子也溶解在样本中。该缀合物特异性结合血液样本中的分析物70例如TnI或BNP，从而产生由结合于AP缀合物的分析物组成的复合物。在捕获步骤中，该复合物结合附着在免疫传感器上或接近其的捕获抗体72(固定抗体)。传感器芯片具有电导率传感器，其用于监控样本到达传感器芯片的时间。流体到达的时间可用于检测测试盒内的泄漏，例如到达的延迟表明泄漏。在一些实施方案中，可使用流体的边缘作为位置标记来主动控制传感器管道内的样本段的位置。当样本/空气界面穿过电导率传感器时，产生可用作流体标记(fluid marker)的精确信号，根据所述流体标记可实现受控流体流程(fluid excursion)。流体段优选在传感器表面边对边(edge-to-edge)地振荡以将整个样本提供给免疫传感器表面。可将第二试剂引入传感器芯片之外的传感器管道，所述试剂在液体振荡过程中变为均匀分布。

传感器芯片包括捕获区或利用针对目标分析物的抗体涂覆的区域。这些捕获区由聚酰亚胺的疏水环或另一个光刻法产生的层确定。将以一些形式(例如结合于胶乳微球)存在的包含抗体的微滴或数个微滴(尺寸约5至40纳米)分配在传感器的表面上或传感器上的选择性渗透层上。光限定的(photodefined)环包含该含水小滴，从而允许抗体涂覆的区域定位达到数微米的精确性。可制造尺寸为0.03至约2平方毫米的捕获区。该尺寸的上限受到本实施方案中的管道和传感器的尺寸限制，并且不是对本发明的限制。

因此，金电极74用生物层73(共价联接的抗-肌钙蛋白I抗体，其可与TnI/AP-aTnI复合物结合)涂覆。AP由此被固定在电极的附近，与最初存在于样本中的分析物的量成正比。除了特异性结合外，酶-抗体缀合物可非特异性结合传感器。非特异性结合提供了来自传感器的背景信号，所述信号是不想要的并且优选使其最小化。如上所述，漂洗方案，特别地将分段液体用于漂洗传感器，提供了使该背景信号最小化的高效方法。在第二步骤中，紧随漂洗步骤，将被例如碱性磷酸酶水解以产生电活性产物76的底物75提供给传感器。在具体的实施方案中，底物由磷酸化二茂铁或对氨基苯酚组成。将安培计电极保持在足以氧化或还原水解的底物的产物(但非直接氧化或还原底物)的固定的电化学电位上，或扫描适当范围的电位一次或多次。任选地，可用其中在制造过程中产生分析物/AP抗-分析物复合物例如TnI/AP-aTnI的层涂覆第二电极以用作测量的参考传感器或校准装置具。

在本实施例中，传感器包括两个安培计电极，其用于检测从4-氨基苯酚磷酸与酶标记碱性磷酸酶的反应酶促产生的4-氨基苯酚。优选从利用聚酰亚胺的光限定层涂覆的金表面产生电极。绝缘聚酰亚胺层中的规则间隔的开口(regularly spaced opening)确定了小金电极网格，在所述电极上以每分子反应2个电子氧化4-氨基苯酚。传感器电极还包括生物层，然而参考电极可以例如从不存在生物层的金电极或从银电极或其它适当的材料构成。不同的生物层可给每一个电极提供检测不同分析物的能力。

可这样选择底物例如对氨基苯酚种类，以便底物与产物的E(1/2)差异不同。优选地，底物的伏安半波电位(voltammetric half-wavepotential)E(1/2)显著高于(更加正)产物的伏安半波电位。当条件满足时，可在底物存在的情况下选择性地通过电化学测量产物。

电极的尺寸和间距在测定敏感性和背景信号中起着重作用。网格中的重要参数包括暴露的金属的百分比和激活电极(active electrode)之间的间距。电极的位置可在抗体捕获区的正下方或偏离捕获区受控的距离。电极的实际安培计信号依赖于传感器相对于抗体捕获位点的定位和分析过程中液体的运动。记录电极上的电流，所述电流取决于传感器附近电活性产物的量。

在本实施例中碱性磷酸酶活性的检测依赖于4-氨基苯酚氧化电流的测量。这在约+60mV的电位对Ag/AgCl接地芯片(ground chip)上获得。所使用的检测的确切形式取决于传感器构型。在传感器的一个形式中，金微电极的阵列位于抗体捕获区的正下方。当分析流体被拉动经过传感器时，位于捕获位点上的酶在酶限制的反应中将4-氨基苯基磷酸转化成4-氨基苯酚。4-氨基苯基磷酸的浓度被选择为过量，例如Km值的10倍。分析溶液为0.1M二乙醇胺、1.0M NaCl，缓冲至pH 9.8。在另外的实施方案中，分析溶液包含0.5mM MgCl₂，其为酶的辅因子。或者，碳酸盐缓冲液具有期望的性质。

在另一个电极几何实施方案中，电极位于离捕获区数百微米。当分析流体的新区段被拉动经过捕获区时，酶产物建立，未因电极反应而丢失。时间过后，将溶液缓慢地从捕获区拉动经过检测器电极，从而产生可从其测定酶活性的电流尖脉冲(current spike)。

碱性磷酸酶活性的灵敏度检测中的重要考虑是与金传感器上发生的背景氧化和还原相关的非-4-氨基苯酚电流。金传感器倾向于在这些电位上在碱性缓冲液中产生显著的氧化电流。背景电流主要取决于缓冲液浓度、金电极的面积(暴露的面积)、表面预处理和使用的缓冲液的性质。二乙醇胺是碱性磷酸酶的特别好的激活缓冲液。在摩尔浓度上，酶促速度增加至非激活缓冲液例如碳酸盐的约3倍。

在替代性实施方案中，缀合于抗体或其它分析物结合分子的酶是尿素酶，并且底物为尿素。在本实施方案中通过使用铵敏感电极检测到通过尿素的水解产生的铵离子。铵特异性电极对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，适当的微细加工的铵离子选择性电极公开于美国专利No.5,200,051中，将所述专利通过引用并入本文。与底物反应以产生离子的其它酶在本领域是已知的，与其一起使用的其它离子传感器在本领域也是已知的。例如，可在磷酸盐离子选择性电极上检测到从碱性磷酸酶底物产生的磷酸盐。

图8说明微细加工的免疫传感器的实施方案的构造。优选地，提供平面绝缘基底80，利用本领域技术人员已知的常规方法或微细加工将导电层81沉积在平面非导电基底上。导电材料优选为贵金属例如金或铂，虽然也可使用其它惰性金属例如铱，也可使用石墨非金属电极、导电聚合物或其它材料的非金属电极。还提供了电连接82。将生物层83沉积在电极的至少一部分上。在本说明书中，“生物层”是指在其表面上包含足够量的分子84的多孔层，所述分子84可结合目标分析物或通过产生能够测量的变化而响应这样的分析物的存在。任选地，可将选择性渗透筛选层插在电极与生物层之间以筛选电化学干扰物，如美国专利No.5,200,051(上文中引用的)中所描述的。

在具体的实施方案中，从具有约0.001至50微米的范围内的比直径的胶乳珠粒构建生物层。通过共价附着符合生物层的上述定义的任何适当的分子来修饰珠粒。本领域存在许多附着方法，包括提供胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯基团以易于偶联蛋白质的赖氨酸或N-末端胺基。在具体的实施方案中，生物分子选自离子载体、辅因子、多肽、蛋白质、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗体、抗原、凝集素、神经化学品受体、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA或适当的混合物。在一些具体的实施方案中，生物分子为被选择来结合人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌红蛋白、肌球蛋白轻链或此类蛋白质的经修饰的片段的一种或多种的抗体。通过至少一个氨基酸的氧化、还原、缺失、添加或修饰(包括利用天然部分或利用合成部分的化学修饰)产生此类经修饰的片段。优选地，生物分子特异性结合分析物，并且具有约10^-7至10^-15M的结合分析物配体的亲和常数。

在一个实施方案中，通过下列方法将生物层附着于传感器，所述生物层包含具有利用适当的分子共价修饰的表面的珠粒。将微分配针用于将小滴，优选约20nL的修饰珠粒的悬浮液，沉积在传感器表面上。使小滴干燥，这在使用过程中在珠粒表面上产生抗移位(displacement)的涂层。

除了其中相对于安培计传感器生物层存在于固定位置上的免疫传感器外，本发明还设想了其中生物层被涂覆在流动的颗粒例如测定珠粒上的实施方案。测试盒可包括能够与分析物相互作用的流动微粒，例如在捕获步骤后被定位至安培计电极的磁性颗粒，由此磁力用于将颗粒集中在电极上以进行测量。在本发明中流动微粒的一个优势是它们在样本或流体中的运动加速结合反应，这使得测定的捕获步骤更快速。对于使用非磁性流动微粒的实施方案，多孔过滤器用于将珠粒捕获在电极上。注意，关于牺牲珠粒，当测定珠粒具有磁性时，牺牲珠粒优选无磁性并且被单独地隔离。此外，当测定珠粒不具有磁性时，牺牲珠粒优选具有磁性并且被单独地隔离。

现参考图9，图中说明了单个基底上的若干电极的掩膜设计。通过掩蔽和蚀刻技术，可沉积单独的电极和导线。因此，可以低成本在紧凑的面积中提供多个免疫传感器94和96和电导计传感器90和92以及用于实现至读出设备的电连接的它们各自的连接垫91、93、95和97。原则上，可以以该方式装配非常大的传感器界阵列，每一个传感器对不同的分析物敏感或用作对照传感器或参考免疫传感器。

在本发明的具体实施方案中，可如下制备免疫传感器。将硅晶片热氧化以形成约1微米厚的绝缘氧化层。将钛/钨层喷溅至氧化层上至100至1000埃的优选厚度，然后再喷溅最优选为800埃厚的一层金。随后，将光致抗蚀剂旋涂在晶片上，并使其干燥，进行适当地烘焙。随后使用接触掩膜例如相应图9中说明的掩膜的接触掩膜暴露表面。对潜像进行显影，并将晶片暴露于金-蚀刻剂。用光可确定的(photodefinable)聚酰亚胺涂覆图案化的金层，进行适当地烘焙，使用接触掩膜进行暴露，将其显影，于氧等离体中进行洗涤，并且优选在350℃下进行酰胺化5小时。可进行晶片背侧的任选的金属化以用作电阻加热元件，其中将以恒温形式使用免疫传感器。随后用抗体涂覆的颗粒打印表面。将小滴(优选约20nL体积并且在去离子水中包含1％的固体内容物)沉积在传感器区域，然后通过风干进行原位干燥。任选地，将抗体稳定化试剂(由SurModica Corporation，Eden Prairie，Minnesota，USA或Applied Enzyme Technology Ltd，Pontypool，UK提供的)涂覆在传感器表面上。

干燥颗粒使它们以阻止包含底物的样本或流体中的溶解的方式附着于表面。该方法提供了适用于以大体积制造传感器芯片的可靠且可重现的固定方法。

实施例2.

关于测试盒的使用方法，在一个实施方案中，将未计量的流体样本通过样本进口4引入测试盒的样本保持室34。毛细管终端25在该阶段阻止样本通达至管道15中，并且保持室34充满样本。关闭盖子2或元件200以防止样本从测试盒泄漏。随后将测试盒插入读出设备，例如Zelin的美国专利No.5,821,399中公开的读出设备，将所述专利通过引用并入本文。测试盒至读出设备的插入激活机械装置，当将包装压靠在尖刺38上时，所述机械装置刺穿位于42的包含流体的包装。流体由此被排入第二管道，按顺序到达39、20、12和11。12上的缢缩阻止流体的进一步移动，因为残留的流体静力压因流体通过第二管道部分11流入废液室44而消散。在第二步骤中，泵装置的操作将压力施加至气球囊43，迫使空气通过管道40，通过剖面17和18，并且在预定的位置27进入管道34。毛细管终端25和位置27划定了原始样本的计量部分的界线。虽然样本在样本保持室34内，但其被包含一种或多种杀白细胞试剂和任选地牺牲珠粒的干试剂涂层以及室的内表面上的任何其它期望的材料修正。随后样本的已计量部分被气球囊43内产生的空气压力排出通过毛细管终端。样本通入管道15并且与位于或位于剖面35内的分析物传感器接触。

在使用位于断流器(cutout)35内的免疫传感器的实施方案中，样本在到达传感器之前被例如酶-抗体缀合物(信号抗体)修正。为了促进分析物与传感器的高效结合，将包含分析物的样本任选地以振荡运动在传感器上方反复通过。优选地，使用约0.2至2Hz，最优选0.7Hz的振荡频率。因此，与信号抗体结合的信号酶被带至安培计电极表面附近，与样本中存在的分析物的量成正比。

一旦已提供分析物/酶-抗体缀合物复合物结合免疫传感器的机会，通过施加至气球囊43的进一步压力喷射样本，并且样本通达废液室44。洗涤步骤随后从传感器室除去非特异性结合的酶-缀合物和牺牲珠粒。通过泵装置43将第二管道中的流体移动至与传感器接触。缓慢地拉动分析流体，直至在电导率传感器上检测到第一空气段。

可通过任何适当的方法在管道内产生空气段，所述方法包括但不限于：(1)被动法，如图14中显示的和下文中描述的；(2)主动法，包括使用泵瞬间降低管道内的压力，空气由此通过皮瓣(flap)或阀门被抽吸至管道中；或(3)通过将预先放置在管道内的化合物溶解，所述化合物在管道中与流体接触后释放气体，其中此类化合物可包括碳酸盐、碳酸氢盐等。该区段在从管道15清除样本污染的流体上极其有效。通过如上所述将一个或多个空气段导入第二管道极大地提高了传感器区域的漂洗效率。将空气段的前缘和/或后缘在传感器上方通过一次或多次以漂洗和重悬浮可以已从样本沉积的外来物。外来物包括除特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合复合物外的任何材料。然而，本发明的目的是不充分延长漂洗或进行剧烈的漂洗以免增加特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物从传感器分离。

将空气段引入流体的另一个优势是将流体分段。例如，在第一段流体用于漂洗传感器后，随后将第二段置于传感器上方，使两段最低限度地混合。该特征通过更高效地除去未结合的抗体-酶缀合物来进一步减少来自传感器的背景信号。在进行前缘洗涤后，缓慢地拉动分析液体直至在电导率传感器上检测到第一空气段。该段在清洗与第一分析流体样本混合的样本污染的流体上特别有效。为了进行测量，使新的部分流体覆盖传感器，并且视操作模式而定，将电流或电位记录为时间的函数。

实施例3

现参考图15，其中显示了免疫传感器测试盒的顶视图。测试盒150包括优选由塑料构成的底座和顶部。两个部分通过薄粘合衬垫或柔韧的薄膜连接。如在先前的实施方案中，装配的测试盒包括其中已通过样本进口167引入了包含目标分析物的样本的样本保持室151。如上所述通过毛细管终端152(优选由连接测试盒的两个部分的衬垫或薄膜中的0.012英寸(0.3mm)激光掏槽孔形成)与位于样本保持室内的预定点上的进入点155(通过泵装置的作用，例如浆挤压样本膈膜156，在该进入点引入空气)的组合动作，样本的计量部分经由样本管道154(第一管道)被递送至传感器153。在接触传感器以允许结合发生后，样本被移动至排气孔157，该处包含芯吸材料，其吸收样本，并且从而密封邻近液体或空气的进一步通道的排气孔。芯吸材料优选为棉纤维材料、纤维素材料或其它具有孔的亲水性材料。在该应用中重要的是材料要具有充足的吸收性(即，具有足够的芯吸速度)以使阀门在与下面描述的样本膈膜驱动装置的随后撤回相称的时期内关闭，以便样本随后不被吸回至传感器芯片的区域。

如在显示的具体实施方案中一样，提供了洗涤管道(第二管道)158，其一端连接排气孔159，另一端连接位于排气孔157与传感器芯片153之间的样本管道的点160上的样本管道。在将测试盒插入读出设备时，流体被引入管道158。优选地，流体最初存在于当驱动装置在小袋施上加压力时被刺穿的箔袋161内。其中还提供了通过衬垫中的小开口163连接流体与管道154的短管道162。第二毛细管终端最初防止流体到达毛细管终端160，以便流体保留在管道158内。

在排气孔157已关闭时，开动泵，在管道154内产生降低的压力。排气孔164，优选地包含在衬垫或膜中切割的皮瓣(flap)，所述皮瓣振动以提供间断的气流，提供了用于空气通过第二排气孔165进入管道158的装置。第二排气孔165优选也包含当浸湿时能够关闭排气孔的芯吸材料，需要时，这允许随后样本膈膜156随后下陷以关闭排气孔165。在样本膈膜156的驱动的同时，流体通过毛细管终端160从管道158被抽入管道154。因为流体的流动被进入排气孔164的空气打断，因此引入了至少一个空气段(区段或区段流)。

样本膈膜156的进一步撤回将包含至少一个空气段的液体抽回穿过传感器芯片153的敏感表面(sensing surface)。液体中气-液边界的存在增强了传感器芯片表面的漂洗以除去剩余样本。优选地，与从安装在传感器芯片内的与分析传感器邻近的电导率电极接收到的信号结合控制样本膈膜156的运动。这样，检测到传感器上方的液体的存在，并且可通过以分开的步骤移动液体进行多次读出。

在本实施方案中有利地仅当流体薄膜覆盖传感器、接地芯片165和传感器与接地电极之间的管道154的连续部分时才进行分析物测量。通过抽出液体(通过操作样本膈膜156)获得适当的薄膜，直至位于紧靠传感器的电导率传感器显示体相流体(bulk fluid)不再存在于管道154的该区域中。已发现，可以以极低(nA)电流进行测量，因增加的接地芯片与传感器芯片之间的薄膜的电阻(与体相流体相比较)而引起的位降不再明显。

接地芯片165优选为银/氯化银。为了避免空气段(其可在相对疏水的氯化银表面上容易地形成)，有利地将接地芯片图案化为其间散布有更亲水区域例如二氧化硅的表面的银/氯化银的小区域。因此，优选的接地电极构型包括密集排列的和散布有二氧化硅的银/氯化银正方形的阵列。如果银/氯化银的区域略微凹陷，则还存在避免无意区段的其它优势。

现参考图16，其中显示了免疫传感器测试盒的优选实施方案的流控技术的图解示图。区域R1-R7代表与特定操作功能相关的管道的特定区域。因此R1代表样本保持室；R2代表样本管道，样本的计量部分通过该管道被转移至捕获区，并且在该管道中样本任选地被涂覆在管道壁上的物质例如一种或多种杀白细胞试剂和任选地易受调理素作用的牺牲珠粒修正；R3代表捕获区，其安装了电导计传感器和分析物传感器；R4和R5代表任选地用于利用涂覆至管道壁上的物质进一步修正液体的第一管道的部分，由此获得更复杂的测定方案；R6代表在将测试盒插入读出设备时流体被引入其中的第二管道的部分；R7包括位于毛细管终端160与166之间的管道的部分，其中可发生进一步修正；以及R8代表位于点160和排气孔157之间的管道154的部分，并且其还可用于修正其中包含的液体。

实施例4.

关于流控技术与分析物测量之间的协调性，在分析顺序过程中，用户将样本放入测试盒，将测试盒置于分析仪中，并且在1至20分钟内，进行一种或多种分析物的定量测量。在分析过程中发生的事件的顺序的非限定性实例如下：

(1)将25至50μL样本引入样本进口167并且充满毛细管终端151，所述毛细管终端151由将罩子与底座组件保持在一起的粘带中的0.012英寸(0.3mm)激光掏槽孔形成。将一个或多个干试剂涂层(包含一种或多种杀白细胞试剂和任选易受调理素作用的牺牲珠粒以及任选地用于减少干扰的其它材料和优选地信号抗体)溶解于样本中。用户旋转装在扣瓣(snap flap)上的胶乳橡胶盘以关闭样本进口167，并且将测试盒置于分析仪内。

(2)分析仪与测试盒接触，并且将马达驱动的柱塞压在箔袋161上，从而迫使洗涤/分析液流出进入中央管道158。

(3)单独的马达驱动的柱塞接触样本膈膜156，从而推动样本的测量区段沿着样本管道(从试剂区域R1或R2)移动。通过电导率传感器在传感器芯片153上检测到样本。传感器芯片位于捕获区R3。

(4)以预定和受控方式利用R2与R5之间的样本膈膜156振荡样本进行受控时间，以促进与传感器的结合。

(5)将样本推向测试盒的废液区(R8)并且与以纤维素或类似吸收芯的形式存在的被动泵157接触。浸湿该芯的动作将芯对气流密封，从而消除其放出由样本膈膜156产生的超压的能力。主动排气孔变成图16的“受控排气孔”。

(6)样本管道的快速撤出(通过从样本膈膜156撤回马达驱动的柱塞实现的)迫使空气(来自排气孔)与洗涤/分析液的混合物从第二管道移动入位于图16中的R5与R4之间的进口。通过重复样本管道的快速撤出，产生一系列空气分隔的液体段，所述液体段被拉动穿过传感器芯片朝向样本进口(从R4至R3至R2和R1)。该洗涤传感器以不含过量试剂并且利用适用于分析的试剂浸湿传感器。源于箔袋的洗涤/分析液体还可通过在中央洗涤/分析流体管道内的R7和R6中添加试剂来进一步修正。

(7)以更慢的速度拉动洗涤/分析流体段朝向样本进口以产生仅包含一薄层分析流体的传感器芯片。在该点上进行电化学分析。优选分析法为电流测定法但也使用电位测定法或阻抗检测。

(8)和机械装置缩回，从而允许测试盒从分析仪取出。

实施例5

在一些实施方案中，装置使用免疫-参考传感器以评估在测定过程中发生的非特异性结合的程度。除免疫试剂为抗-HSA(人血清白蛋白)抗体而非抗-分析物抗体外，以与分析物免疫传感器大体上相同的方式制造免疫-参考传感器。在暴露于人全血或血浆样本后，参考传感器开始用特异性结合的HSA(存在于所有人血液样本中的丰富内源蛋白质)进行涂覆，从而为使用本免疫测定形式进行的所有单个测试提供了共同的参照。因不充分洗涤或因干扰的存在而产生的NSB可通过该第二传感器来监控。

来自测定的净信号由通过减去从参考传感器产生的非特异性信号修正的从分析物免疫传感器产生的特异性信号组成，例如，净信号＝分析物传感器信号-参考传感器信号-偏差，如上述公式4中显示的。“偏差”为解释两个传感器遭到NSB的倾向的差异的系数。事实上，其解释了每一个传感器关于它们非特异性结合缀合物的能力的相对“粘性”并且是基于不含分析物并且无干扰的样本的反应建立的。这通过独立的实验来进行。

参考传感器上耐受的信号的量受限于通过质量控制算法确定的极限，所述算法寻求在低分析物浓度下确保结果的完整性，在所述低浓度下NSB的效应最可能以可在临床环境中改变决策的方式影响测定结果。基本原理是参考传感器上过量信号的存在用作表示NSB存在(因不充分的洗涤步骤或干扰而导致的)的标志。

实施例6.

在BNP测定，特别地i-STATBNP测试盒(Abbott Point of Care，Princeton，New Jersey，USA)或其部分改进的形式上进行下面描述的实验。

在所有这些实施方案中，一种或多种杀白细胞试剂和任选地针对白细胞易受调理素作用的珠粒的使用，如在本申请的其它地方所描述的，可被集成在测定中，例如可用葡糖氧化酶和针对白细胞易受调理素作用的珠粒以及任选地葡萄糖和皂苷修正样本。通常样本为全血样本(例如，静脉的、动脉的和毛细血管的)，其可以已用或可以未用抗凝剂修正。

作为理解白细胞对全血免疫测定的影响的实验性帮助，期望产生富集的棕黄层(血液)样本(EBS)。此处采用的方法是采集一离心管(spun tube)的血液，其中血浆在顶部，红细胞在底部以及薄薄的血沉棕黄层在其间。随后用移液器除去约一半或更多的血浆和红细胞，并且将样本重新混合。在本文描述的实验中，EBS构成了约10倍的棕黄层浓度的增加，即，大约90％的血浆和红细胞被除去。因此样本的红细胞比容(Hct)维持在正常范围内，约50-60％。

图26显示葡糖氧化酶对白细胞活性的影响。作为白细胞干扰的基线指标，使用高于每秒0.05nA的信号变化速率的截断值(参见右侧y-轴，AmpActSlope)。将数据集分成3组EBS+OX+Glu、EBS+OX和EBS+Glu，其中OX为浓度为4.0IU的葡糖氧化酶，并且Glu为浓度为700mg/dL的葡萄糖。在第一组中，预期酶除去绝大多数氧，并且显著过量地添加共反应剂葡萄糖。第二组依赖于已存在于样本中的葡萄糖来与酶反应。第三组是添加葡萄糖但无酶的对照。

图26的y-轴的左侧显示葡萄糖(mg/dL)和氧(PO₂mm Hg)的浓度。图26的x-轴显示“运行起始时间”，其为上述每一组中混合样本与获取该样本的等分并且将其注射入测试盒之间的时间。要指出的是，将i-STAT

CG8+测试盒(Abbott Point of Care，New Jersey，USA)用于测定葡萄糖和氧浓度。

关于第一组(EBS+OX+Glu)，在50分钟后约200mm Hg的初始氧浓度下降至约10mm Hg，并且葡萄糖浓度在相同的时期内从700下降至约100mg/dL。在该时期中，进行免疫测定以测定AmpActSlope值。在该组中，19个被测定的样本中有16个具有低于0.05nA/秒的斜率。AmpActSlope值获自电流对时间信号描记线的分析，如图25中显示的。

如图25中显示的，超过约50秒的点的第一描记线为通常针对免疫传感器具有低或正常白细胞活性的样本的稳定电流值。具体地，免疫传感器包括包含存在于联接于电极的珠粒上的第一捕获抗体和利用ALP标记的第二信号抗体的BNP免疫传感器。该类型的免疫传感器和免疫测定测试盒的一般描述见于Davis等的美国专利No.7,419,821。电流的变化速率显著低于每秒0.05nA的优选阈值。第二描记线通常为针对免疫传感器具有高白细胞活性的样本，例如，EBS。电流的变化速率高于每秒0.05nA的优选阈值。第三描记线在超过50秒的点后是稳定电流值，通常为已用葡萄糖和葡糖氧化酶的组合处理以减少针对免疫传感器的白细胞活性的EBS。要指出的是，电流的变化速率再一次显著低于每秒0.05nA的优选阈值。

关于第二组(EBS+OX)，氧浓度仅下降(从约200mm Hg)至约50mm Hg并且葡萄糖浓度快速下降至低于约20mg/dL，这表明在样本中不存在足以消耗所有氧的葡萄糖。该观察与用作氧缓冲剂的红细胞相关，即随着血浆浓度下降，释放更多的氧。在该时期中，也进行免疫测定以测定AmpActSlope值。在该组中，13个测定的样本中有9个具有低于每秒0.05nA的斜率。

关于第三组(EBS+Glu)，氧浓度仅略微下降并且葡萄糖浓度几乎未改变。在该时期中，进行免疫测定以测定AmpActSlope值。在该组中，8个测定的样本中有3个具有低于每秒0.05nA的斜率。

基于来自3个组的数据，很清楚葡糖氧化酶可帮助促成白细胞活性的降低以及这可通过添加过量葡萄糖至样本来增强。已发现，样本中超过约3IU/mL的葡糖氧化酶浓度对于静脉样本是优选的，并且添加葡萄糖以提供高于约500mg/dL的初始样本浓度是优选的。

为了进一步表征这些效应，对更大的样本供体库(15个供体多重运行)进行研究，如图27中显示的。图27为其中期望的AmpActSlope值小于0.05/秒和大于-0.03nA/秒的散点图。此外，在该具体实施方案中，也将最大期望传感器阈值电流(ParamActDoc)设置在8.0nA。因此期望的结果是使落入靶区域周围的5个区段的样本减少至最少。经处理的EBS+OX样本(方块)明确地显示比未处理的样本(圆形)更优的性能；经处理的N＝287，超过阈值1.0％；未处理的N＝283，超过阈值13.4％；产生92.1％的差异。基于实验结果，葡糖氧化酶的添加使其中观察到高于期望阈值的斜率的测定的数目减少约90％。这是总体测定质量和性能的显著提高。

本领域技术人员将承认，虽然根据免疫测定中具体使用的安培计传感器描述了本发明，但也可将除测量为ΔnA/秒的AmpActSlope外的其它参数用作白细胞干扰的测定，例如，绝对电流值、信噪比用作为信号强度的一部分等。此外，本发明同样地涉及其它免疫传感器，包括基于电位计和电导计测量的电化学免疫传感器和非电化学免疫传感器，例如，表面声波、表面等离子共振、光波导等。此类传感器的每一种具有已知的用于评估对传感器性能的不利影响的标准。可使用EBS法或其变型来评估此类传感器的适合性。

图28A显示进行以进一步表征EBS+OX+Glu处理的样本的用途的另外的研究。获得“样本2”数据组，其中在关闭的注射器中进行处理以防止任何氧气从环境空气引入。在10分钟内，氧气从约200mmHg降至约20mm Hg，并且葡萄糖从约600降至约360mg/dL。对样本进行的全部12个连续免疫测定具有期望的低于0.05nA/秒的AmpActSlope值。“样本3”数据反映了在初始运行后打开注射器约20分钟以允许环境空气进入。将该样本在40分钟标志下运行。此处，白细胞不再被剥夺氧并且增加的免疫测测定测试次数显示AmpActSlope值高于期望的阈值。图28A中的“样本1”数据仅为对照EBS+Glu。图28B以更简单的形式显示数据，其中在1和10分钟的运行时间上的点为注射器样本的数据，并且在40分钟处的点的数据为在通过暴露于空气再氧合后的相同样本的数据。

虽然在实验室中进行的免疫测定中使用的血液样本更常见地抽自静脉，但在进行即时(或床边，例如急救室、手术室)测试时，从动脉抽取样本也是很常见的。很明显，PO₂浓度在后一种类型的样本中通常更高。为了评估动脉样本对本测定的影响，产生和测试模拟动脉。本领域技术人员将承认，直接获得动脉样本涉及内出血的高得多的风险，因此使用模拟样本。使用在EDTA管中收集的静脉血利用眼压计(tonometer)产生模拟样本。眼压计利用预定的空气组分平衡血液。

图29显示模拟动脉样本的数据。要指出的是，此类样本并非如上所述富集的。第一栏的数据(WB)表示眼压计产生的全血样本具有约150mm Hg的初始PO₂和约70mg/dL的初始葡萄糖值，以及两者并未随着8分钟的时间过去而显著改变。以6和12IU/mL(参见WB+6和WB+12柱)添加葡糖氧化酶导致降低的葡萄糖和PO₂。如第四栏WB+Glu中所预期的，葡萄糖升高并且PO₂保持基本未变。第5和第6栏(WB+6+Glu和WB+12+Glu)显示PO₂和葡萄糖的下降。如图29中说明的，以6.0IU和12.0IU/mL(和优选在超过约3.0IU/mL中)添加葡糖氧化酶足以通过其使样本中的氧分压降低至低于约50mm Hg的能力抑制动脉血液中的吞噬作用。

实施例7

如本文中所描述的，将皂苷作为杀白细胞试剂是抑制白细胞的活性的替代性方法。图30显示添加的皂苷(x-轴值，以mg/mL计，在0至10mg/mL的范围内)对分析斜率的影响，对于EBS样本显示了0.05nA/秒的阈值。本研究显示具有0.5mg/mL的皂苷的样本显示显著更少的高于未处理样本(Prod)的阈值的斜率。图30也在高达10mg/mL的浓度时显示类似的结果。在其它实验中，已发现在约0.1至20mg/mL的范围内的皂苷浓度在减少白细胞活性中是有用的。还已发现皂苷对测定的精确性具有影响，该影响可通过重复的洗涤循环来减小。因此，在某些应用中，约0.5至1.0mg/mL更低但有效的皂苷浓度可以是优选的。

虽然如上所述的本发明通常涉及在利用全血样本的分析物测定中减少或消除来自白细胞的干扰，但其也适用于在白细胞可存在于其中的其它类型的生物样本例如脑脊髓液中进行的免疫测定。此外，其可适用于其中残留的白细胞可存在于其中(尽管期望通过离心或过滤除去它们)的样本例如血浆。其也适用于可能例如已利用缓冲液稀释的样本。此外，虽然本发明通常涉及通过将干试剂溶解于样本中来修正样本，但在其它实施方案中在分析过程中或在样本收集过程中以液体形式将试剂例如一种或多种白细胞试剂添加至样本中也是可行的。也很明显，本发明已在本文中根据电化学检测法例如安培计和电位计法进行了描述，虽然其同样地适用于其它检测法，特别地光学传感法(optical sensing approach)，例如基于发光、荧光和吸光度的方法。

虽然本发明已根据各种优选的实施方案进行了描述，但本领域技术人员将承认，可在不背离本发明的精神的情况下进行各种修改、替换、省略和改变。例如，虽然部分描述涉及非竞争性夹心免疫测定，但本发明的装置和方法类似地可用于竞争性免疫测定。此外，本发明的范围意欲仅受下列权利要求的范围限制。

Claims (62)

1.一种进行血液样本中的靶分析物的免疫测定的方法，包括：

使血液样本与杀白细胞试剂接触，其中所述试剂大体上抑制所述样本中白细胞的活性；和

对所述样本进行免疫测定以检测靶分析物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述杀白细胞试剂为代谢杀白细胞试剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述杀白细胞试剂为非离子性的。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性为吞噬作用。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为氧和葡萄糖消耗试剂。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为葡糖氧化酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为葡糖氧化酶和葡萄糖。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为葡糖氧化酶和葡萄糖，并且所述试剂与所述样本混合以提供高于约3IU/mL的葡糖氧化酶活性和高于约500mg/dL的葡萄糖浓度。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为葡糖氧化酶和电子受体。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括己糖激酶和腺苷-5’-三磷酸(ATP)的来源。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括己糖激酶、肌酸激酶、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括葡糖脱氢酶。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括葡糖脱氢酶、NAD、NADH氧化酶和电子受体。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为氧消耗试剂。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为选自连二亚硫酸酯、葡糖氧化酶和抗坏血酸氧化酶的氧消耗试剂。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为线粒体电子传递抑制剂。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为线粒体膜解偶联剂。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂选自氰化物、抗霉素、鱼藤酮、丙二酸酯、羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙、2，4-二硝基酚和寡霉素。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为两亲性试剂。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为两亲性试剂并且为皂苷。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为杀白细胞素。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为粘多糖。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为AHN-1抗体。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为脂皮质素-1。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定为通过使所述样本与免疫传感器接触而进行的夹心测定，所述免疫传感器包含固定的针对所述靶分析物的第一抗体和标记的针对所述靶分析物的第二抗体。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定为通过使所述样本与免疫传感器接触而进行的竞争性测定，所述免疫传感器包含固定的针对所述靶分析物的第一抗体和标记的靶分析物。

27.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样本与针对白细胞易受调理素作用的珠粒接触。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为葡糖氧化酶和葡萄糖，并且使所述样本与针对白细胞易受调理素作用的珠粒接触。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为全血样本。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本利用抗凝剂进行修正。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物选自TnI、TnT、BNP、NTproBNP、proBNP、HCG、TSH、NGAL、茶碱、地高辛和苯妥英。

32.一种用于进行全血样本中的靶分析物的免疫测定的试剂盒，包括：

杀白细胞试剂，其中所述试剂大体上抑制样本中的白细胞的活性，和

用于检测靶分析物的免疫测定试剂。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述杀白细胞试剂为代谢杀白细胞试剂。

34.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述杀白细胞试剂为非离子性的。

35.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述活性为吞噬作用。

36.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为氧和葡萄糖消耗试剂。

37.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为葡糖氧化酶。

38.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为葡糖氧化酶和葡萄糖。

39.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为葡糖氧化酶和葡萄糖，并且所述试剂与所述样本混合以提供高于约3IU/mL的葡糖氧化酶活性和高于约500mg/dL的葡萄糖浓度。

40.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为葡糖氧化酶和电子受体。

41.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂包括己糖激酶和腺苷-5’-三磷酸(ATP)的来源。

42.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂包括己糖激酶、肌酸激酶、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。

43.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂包括葡糖脱氢酶。

44.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂包括葡糖脱氢酶、NAD、NADH氧化酶和电子受体。

45.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为氧消耗试剂。

46.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为选自连二亚硫酸酯、葡糖氧化酶和抗坏血酸氧化酶的氧消耗试剂。

47.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为线粒体电子传递抑制剂。

48.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为线粒体膜解偶联剂。

49.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂选自氰化物、抗霉素、鱼藤酮、丙二酸酯、羰基氰化物对-[三氟甲氧基]-苯基-腙、2，4-二硝基酚和寡霉素。

50.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为两亲性试剂。

51.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为两亲性试剂并且为皂苷。

52.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为杀白细胞素。

53.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为粘多糖。

54.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为AHN-1抗体。

55.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为脂皮质素-1。

56.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫测定为夹心测定并且其中所述免疫测定试剂包括免疫传感器，所述免疫传感器包含固定的针对所述靶分析物的第一抗体和标记的针对所述靶分析物的第二抗体。

57.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫测定为竞争性测定并且其中所述免疫测定试剂包括免疫传感器，所述免疫传感器包含固定的针对所述靶分析物的第一抗体和标记的靶分析物。

58.根据权利要求32所述的试剂盒，还包括针对白细胞易受调素作用的珠粒。

59.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂为葡糖氧化酶，并且使所述样本与针对白细胞易受调素作用的珠粒接触。

60.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述样本为全血样本。

61.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述样本用抗凝剂进行修正。

62.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述分析物选自TnI、TnT、BNP、NTproBNP、proBNP、HCG、TSH、NGAL、地高辛、茶碱和苯妥英。

Images