CN101149384A

CN101149384A - 一种检测禽流感病毒抗原的装置及检测方法

Info

Publication number: CN101149384A
Application number: CNA2007100715451A
Authority: CN
Inventors: 赵广英; 吴淑春
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2027-09-30
Also published as: CN101149384B

Abstract

本发明公开了一种灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗原的装置。本发明装置包括免疫传感器、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连；免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。本发明还公开了一种使用该装置检测禽流感病毒抗原的方法。

Description

一种检测禽流感病毒抗原的装置及检测方法

技术领域

本发明涉及禽流感病毒抗原快速检测技术领域，特别是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗原的电化学传感器及检测方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)是源于禽类，能在极短的时间内造成大量禽畜死亡，并可致人类死亡的烈性传染病毒。近几年来，很多国家和地区相继爆发了高致病性禽流感，不但给相关产业造成巨大的经济损失，也严重威胁到人类健康与安全。

禽流感快速检测是疫病诊断，早期监控，防止疫情扩散，保证食品安全的最关键措施之一。

目前，禽流感病毒检测主要有以下方法：琼脂凝胶扩散试验(AGP)，免疫荧光技术(IFTr)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶免疫测定(EIA)技术，PCR及RT-PCR技术，核酸探针技术，RT-PCR-ELISA技术，荧光RT-PCR技术。

琼脂免疫扩散试验方法取材方便，操作简单，但检测时间长，敏感度低；免疫荧光技术和ELISA都需要特殊的仪器设备，检测过程复杂、费用高、检测时间长，并且易出现假阳性；PCR检测过程复杂、时间长，对操作人员专业技术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害。

因此，建立一种灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗原的技术成为疫情诊断、早期监控的迫切需要。

在病毒检测领域中，免疫传感器因其快速、简便、灵敏受到越来越广泛的应用。免疫传感器是在传感界面固定抗原或抗体，通过测量由抗原、抗体特异性结合引起的物理、化学信号的变化，对样品中抗原或抗体进行定性或定量判定。

抗原-抗体结合前后可导致多种信号的改变，如重量、光学、热学、电化学等。电化学分析具有能现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经处理，无需分离，所用仪器设备相对简单等优点，使得电化学免疫传感检测成为一种使用较为广泛的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗原的装置及检测方法。

本发明的装置是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗原的电化学检测装置，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低，适用于基层或现场检测禽流感病毒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种检测禽流感病毒抗原的装置，包括免疫传感器、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，其特征在于免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。

本发明装置的免疫传感器中，电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极以碳电极为支持电极，其上修饰有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。工作电极可以是多个，能同时检测多份样品。

酶标禽流感抗体可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶标记的H5N1型禽流感抗体或其它禽流感抗体；

包埋酶标禽流感抗体的膜材料可以是壳聚糖、醋酸纤维素、PVB、Nafion、明胶或琼脂糖的一种或它们的混合物。

本发明还包括一种检测禽流感病毒抗原的方法，包括以下步骤：

1)待测样本滴于本发明装置的免疫传感器工作电极表面，20℃孵育10分钟；

2)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇(Thionine，俗称劳氏紫)醋酸盐缓冲液，PH值为6.5；

3)设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电极间的电流值；

4)测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；

5)信息处理结果输出。

检测样本可以是死禽样本或活禽样本。死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织(气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等)；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。内脏样本应无菌取样。

本发明中检测方法原理：在电化学反应体系中，酶催化底物H₂O₂生成相应的酶促反应物H₂O，酶由还原态变为氧化态；此时氧化态的酶催化电子媒介体硫堇由还原态变为氧化态，而酶自身则由氧化态变为还原态；氧化态的电子媒介体在电极表面得到电子后又变为还原态，同时产生响应电流。

采用常用的循环伏安法(Cyclic voltammetry，CV)作为免疫传感器表征和定性判定的方法。当被检测物中含有禽流感病毒抗原时，抗原与包埋在工作电极上的酶标禽流感病毒抗体发生反应，生成抗原抗体复合物；当免疫传感器放置于电解池中时，抗原抗体复合物在空间上阻碍了硫堇向酶的活性中心靠近，导致酶的催化能力下降，使响应曲线中还原峰电流较免疫反应前显著降低。根据响应曲线峰值的变化即可判断待测物是否含有禽流感病毒抗原。

本发明中检测禽流感病毒抗原的免疫传感器，将免疫技术与电化学检测相结合，是一种电流型的酶免疫传感器。它将酶的化学放大功能与免疫传感器的特异性相结合，融合二者的优点，使其同时具备免疫反应的特异性和电化学分析的灵敏性，能准确地进行低含量物质的检测。

本发明的检测方法是一种新的快速检测禽流感病毒的方法，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低，适用于基层或现场检测禽流感病毒。

为进一步说明本发明的特点和效果，以下结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

图1是本发明装置的免疫传感器一种实施方式的正面示意图；

图2是本发明装置的免疫传感器在不同溶液中的电流响应曲线；

其中，1——橡胶树脂板；2——工作电极；3——辅助电极；4——参比电极。

具体实施方式

实施例1：本发明检测禽流感病毒抗原的装置，由免疫传感器、电解池和数据采集与处理系统组成。

免疫传感器包括工作电极2、参比电极4和辅助电极3，各电极采用丝网印刷方法印在橡胶树脂板1上，辅助电极3为石墨电极，参比电极4为Ag/AgCl电极，工作电极2以碳电极为支持电极，其上涂布有包埋标记辣根过氧化物酶的抗H5N1型禽流感病毒抗体(HRP-anti-AIV)的壳聚糖感应膜。

电解池包括检测底液、搅拌器和温控器，检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为6.5。

数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统。

免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，电化学工作站将电流信号传送至计算机。

免疫传感器的制备：

1)采用丝网印刷在橡胶树脂板1上印刷出如图1所示的参比电极4、辅助电极3和工作电极2的支持电极。辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极的支持电极为碳电极。工作电极为4个，两边对称排列；

2)将1％壳聚糖凝胶与标记辣根过氧化物酶的抗H5N1型禽流感病毒抗体溶液等体积充分混合；混合液4℃放置12小时；取3μL混合液滴涂于工作电极2表面，并于室温下放置5～6小时，使之干燥成膜；

3)将干燥后的传感器浸泡于4℃下的PBS溶液，用二次蒸馏水冲洗传感器表面，除去物理吸附的多余抗体；制得的传感器于PBS溶液(0.01mol/L pH 7.4)中在4℃下保存备用。

实施例2：检测禽流感病毒抗原的方法

1)样本采集和处理

无菌条件下取死禽肝脏，放入灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10分钟，取上清液作为样本。检测前将样品用0.3～0.5％福尔马林灭活。

采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。

2)将实施例1中所述的免疫传感器放入电解池，电解池的检测底液为含有0.4mmol/L H₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为6.5。

3)设定扫描速率为0.1V/s，对工作电极施加电压，测得辅助电极与工作电极间的电流值Ip1。

4)将待测样本滴于本发明免疫传感器的工作电极2表面，20℃下孵育10分钟，使样本中的抗原与免疫传感器工作电极2表面的抗体产生免疫反应。

5)将免疫传感器放入电解池，电解池的检测底液为含有0.4mmol/L H₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为6.5。

6)设定扫描速率为0.1V/s，对工作电极施加电压，检测辅助电极和工作电极间的电流值Ip2。

6)将上述测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；采用常用的循环伏安法作为免疫传感器表征和定性判定的方法。

7)处理信息结果输出。

为了更好的说明检测结果，样品检测前，先将同一免疫传感器分别于0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液，1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液，0.4mmol/L H₂O₂+1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液中检测响应电流，以比较免疫传感器在不同溶液中产生的响应电流变化。

如图2所示，为本发明装置的免疫传感器在不同溶液中的电流响应曲线图。

其中曲线a为免疫传感器在0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液中的电流响应曲线；可以看出免疫传感器无明显的电流响应，只显示出一个较小的背景电流；

曲线b为免疫传感器在1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液中的电流响应曲线；免疫传感器出现一对稳定的硫堇氧化还原峰。

曲线c为免疫传感器在0.4mmol/L H₂O₂+1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH

6.5醋酸缓冲溶液中的电流响应曲线；当醋酸硫堇溶液中加入底物H₂O₂后，免疫传感器还原峰电流显著增大，氧化峰电流明显减小，且还原峰电位略微负移。

曲线d为免疫传感器与检测样本反应后在0.4mmol/L H₂O₂+1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH 6.5醋酸缓冲溶液中的电流响应曲线。

涂布有包埋HRP-anti-AIV的壳聚糖膜的工作电极与含有AIV抗原的样本溶液温育后，电流响应曲线中还原峰电流显著降低，表明溶液中的AIV抗原与固定在工作电极表面的HRP-anti-AIV发生特异性的抗原抗体免疫反应，生成的AIV免疫复合物在空间上阻碍了硫堇向辣根过氧化物酶的活性中心靠近，导致辣根过氧化物酶的催化能力下降，从而使得响应曲线中还原峰电流显著降低。

以K＝(Ip1-Ip2)/Ip1×100％(既免疫反应前后催化电流的降低率)作为判断样品中是否含有AIV抗原的依据。当K≥25％时为阳性，表示被测样本中含有AIV抗原；当K＜25％时为阴性，表示被测样本中不含AIV抗原。

本实施例中，K＝(0.6609uA-0.3264uA)/0.6609uA×100％＝50.62％，＞25％，表明被测样本中含有AIV抗原。

当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

Claims

1.一种检测禽流感病毒抗原的装置，包括免疫传感器、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，其特征在于免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。

2.如权利要求1所述的检测禽流感病毒抗原的装置，其特征在于所述的禽流感抗体为H5N1型禽流感抗体。

3.如权利要求1所述的检测禽流感病毒抗原的装置，其特征在于所述的酶标禽流感抗体为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶标记的禽流感抗体。

4.如权利要求1所述的检测禽流感病毒抗原的装置，其特征在于所述的包埋酶标禽流感抗体的膜材料为壳聚糖、醋酸纤维素、PVB、Nafion、明胶或琼脂糖。

5.如权利要求1所述的检测禽流感病毒抗原的装置，其特征在于所述的工作电极为4～10个。

6.一种检测禽流感病毒抗原的方法，包括以下步骤：

1)待测样本滴于如权利要求1所述免疫传感器的工作电极表面，20℃孵育10分钟；

2)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为6.5；

4)测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；

5)信息处理结果输出。

7.如权利要求6所述的检测禽流感病毒抗原的方法，其特征在于数据采集与处理系统采用循环伏安法作为免疫电极表征和定性判定的方法。