CN104132984A - 单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极及其制备方法和应用，电极是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角处理后吸附硫堇，然后结合单壁碳纳米角-铂钯纳米粒，再孵育巨细胞病毒pp65抗体，最后用辣根过氧化物酶(HRP)封闭，制得的电极结合有壳聚糖修饰后的单壁碳纳米角，由于单壁碳纳米角具有大的比表面积和良好的生物相容性，氨基修饰后进一步有利于稳定铂、钯粒子，提高巨细胞病毒pp65抗体的结合量，增加其峰电流值，同时铂、钯纳米粒子及HRP能催化过氧化氢放大检测信号，从而提高检测低浓度巨细胞病毒抗原的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于诊断领域，具体涉及单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
背景技术
巨细胞病毒(Cytomegaovirus，CMV)是疱疹病毒家族，具有严格的种属特异性。在发达国家成人CMV的隐形感染率40％～90％，我国CMV的隐形感染率高达90％左右。CMV是导致胎儿先天性感染的最常见的病原体。流行病学调查结果显示，约0.5％～2.5％新生儿中感染过CMV。感染CMV的孕妇可通过胎盘、产道、哺乳方式垂直传播给胎儿或新生儿，也可通过亲密接触进行水平传播，最终导致胎儿畸形、新生儿智力低下或发育迟缓；CMV亦可通过输血和器官移植传播，是免疫功能低下的艾滋病患者、肿瘤患者死亡的主要原因，是导致器官移植失败的重要原因之一。多项研究表明，CMV感染还与动脉粥样硬化等多种疾病有关，所以CMV的检测显得尤为重要。CMV pp65抗原是CMV活动性感染的早期标志物，主要存在于人类肝细胞，血管内皮细胞，胆管内皮细胞，外周血白细胞中，可作为检测CMV活动性感染的指标。
现有的检测方法主要包括细胞培养、病毒学检测、免疫检测，核酸检测等，其中细胞培养是诊断CMV感染的金标准，但是这些方法均存在着操作繁琐，检测效率低，特异性差等缺点。例如，细胞培养耗费大，对技术人员要求高，临床应用受限；病毒学检查需从受检者的血、尿、唾液或组织等中分离并培养出CMV，操作过程费时费力；血清学CMV IgG、IgM抗体检测特异性差，对新生儿或严重免疫缺陷者可能存在假阴性，并且会受类风湿因子等干扰；分子生物学核酸检测则需专业人员和特殊仪器来完成，费用高，并且无法区分潜伏性感染。因此，人们急需一种灵敏度高，特异性好，快速和准确的检测CMV的电化学免疫传感器，这对优生优育，监控疾病进展及成功移植器官具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供单壁碳纳米角-铂钯纳米粒(Pt-PdNPsSWCNHs)和CMV pp65抗体修饰电极；本发明的目的之二在于提供上述Pt-PdNPsSWCNHs和CMVpp65抗体修饰电极的制备方法；本发明的目的之三在于提供含有Pt-PdNPsSWCNHs和CMVpp65抗体修饰电极的电化学传感器，本发明的目的之四在于提供利用上述电化学生物传感器检测CMV pp65抗原的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1.Pt-PdNPsSWCNHs和CMVpp65抗体修饰电极，所述电极是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜(Nafion，Nf)分散的SWCNHs处理后吸附硫堇(Thionine，Thi)，然后结合Pt-PdNPsSWCNHs，再用CMV pp65抗体孵育、HRP封闭非特异结合位点即可。
优选的，所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角(SWCNHs-Nf)由以下方法制备：将SWCNHs加入Nf中，超声搅拌过夜制得。
更优选的，所述Pt-PdNPsSWCNHs由以下方法制备：向壳聚糖(Chitosan，CS)溶液中加入SWCNHs，超声分散后离心，沉淀物用双蒸水洗涤后分散于双蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，搅拌，然后滴加硼氢化钠(NaBH4)，超声、离心、洗涤沉淀，将沉淀用双蒸水分散即可。
2.所述Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
a.将玻碳电极表面打磨，抛光，干燥，得预处理的电极；
b.将步骤a所得预处理的电极用SWCNHs-Nf修饰，23～26℃干燥，得SWCNHs-Nf修饰的电极；所述SWCNHs-Nf由将SWCNHs加入Nf中，超声搅拌过夜制得；
c.将b步骤所得SWCNHs-Nf修饰的电极上吸附Thi，然后双蒸水清洗；
d.将步骤c所得电极上吸附Pt-PdNPsSWCNHs，然后用双蒸水清洗，得Pt-PdNPsSWCNHs修饰的电极；所述Pt-PdNPsSWCNHs由如下方法制备：向CS溶液中加入SWCNHs，超声分散后离心，沉淀物用双蒸水洗涤后分散于双蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，搅拌，然后滴加NaBH4，超声、离心、洗涤沉淀，将沉淀用双蒸水分散即可；
e.将步骤d所得Pt-PdNPsSWCNHs修饰的电极上孵育CMV pp65抗体；然后用HRP封闭非特异性位点，制得Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极。
3.含有所述Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极的电化学生物传感器。
优选的，所述的电化学生物传感器包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液；所述工作电极为所述Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极；所述测试底液为含有0.1mol/L KCl、pH为5.5的浓度为0.1mol/LHAc-NaAc溶液。
4.利用所述电化学生物传感器检测CMV抗原的方法，包括如下步骤：将Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极与样品溶液共孵育；然后以Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极为工作电极、铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极电位，含有0.1mol/L KCl、pH 5.5，浓度为0.1mol/L HAc-NaAc溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行扫描测定，电位扫描范围为-0.5V-0.0V，根据电位-0.252V处峰电流和CMV pp65抗原标准曲线计算样品中CMV抗原的浓度。
本发明的有益效果在于：公开了Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极，通过在电极上结合SWCNHs，并将SWCNHs进行氨基化，再在表面固定铂、钯粒子，由于SWCNHs本身具有大的比表面积和和良好的生物相容性，氨基化的SWCNHs上拥有丰富的氨基有利于稳定铂、钯粒子，为CMV pp65抗体提供良好的生物学环境，最终使电极表面的CMV pp65抗体的固载量成倍增加，提高CMV pp65抗体的结合量，增加其峰电流值，同时铂、钯纳米粒子及HRP能催化过氧化氢(H2O2)放大检测信号，从而提高检测低浓度CMV pp65抗原的灵敏度，最低检测限为30pg/mL。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极的制作示意图。
图2为电极所修饰的纳米材料的扫描电镜图(A：SWCNHs-Nf；B：SWCNHs-CS；C：Pt-PdNPsSWCNHs)。
图3为电极制备过程的循环伏安法(CV)表征图(a：玻碳裸电极；b：SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极；c：吸附活性物质Thi后的SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极；d：Pt-PdNPsSWCNHs修饰玻碳电极；e：结合CMV pp65抗体的玻碳电极；f：HRP封闭后的玻碳电极；g：Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极检测CMV pp65抗原)。
图4为分别以HRP和牛血清白蛋白(Bull Serum Albumin，BSA)作为封闭剂检测不同浓度CMV pp65抗原的DPV曲线和标准曲线(A：HRP作为封闭剂检测不同浓度CMV pp65抗原的DPV曲线；B：BSA作为封闭剂检测不同浓度CMV pp65抗原的DPV曲线；a为HRP作为封闭剂的标准曲线；b为BSA作为封闭剂的标准曲线)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中使用的主要仪器与试剂：CHI660A型电化学工作站购自上海晨辉仪器有限公司；扫描电镜购自日本日立公司；CMV pp65抗原和CMV pp65抗体购自英国Abcam公司；SWCNHs购自深圳奈米港口有限公司；H2PtCl6·6H2O，K2PdCl4，Thi，Nf，CS，NaBH4，BSA购自美国Sigma公司。
实施例1
Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极的制备方法，制备原理如图1所示，包括如下步骤：
a.将玻碳电极表面打磨，抛光，干燥，得预处理的电极；
b.将步骤a所得预处理的电极滴加5μL浓度为0.5mg/mL的SWCNHs-Nf悬液，23～26℃干燥，得SWCNHs-Nf修饰的电极；其中SWCNHs-Nf悬液由1mg SWCNHs加入2mL质量分数为1％Nf分散剂，超声搅拌过夜后制得；
c.将b步骤所得SWCNHs-Nf修饰的电极上滴加20μL浓度为0.5mg/mL的Thi，吸附15min后用双蒸水清洗；
d.将步骤c所得电极上滴加20μL Pt-PdNPsSWCNHs悬液，吸附16h后用双蒸水清洗，得Pt-PdNPsSWCNHs修饰的电极；其中Pt-PdNPsSWCNHs悬液由如下方法制备：向2mL质量分数为0.1％的CS溶液中加入1mg的SWCNHs，超声分散4h后离心，双蒸水洗涤3次，沉淀物分散于1mL双蒸水中，再向其中加入1mL质量分数为0.5％的H2PtCl6和1mL质量分数为0.5％的K2PdCl4，搅拌24h，缓慢逐滴加10mL浓度为0.01mol/L的NaBH4，再继续超声1h，离心洗涤沉淀，最后将沉淀用2mL双蒸水分散，制得Pt-PdNPsSWCNHs悬液；
e.将步骤d所得Pt-PdNPsSWCNHs修饰的电极上滴加10μL浓度为30μg/mL的CMV pp65抗体，4℃过夜；然后向电极上滴加10μL质量分数为0.25％HRP，4℃孵育3h，封闭非特异性位点，制得Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极。
制得的Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极是由SWCNHs-Nf滴于干净电极表面，再吸附Thi，然后连接上自主合成的Pt-PdNPsSWCNHs，再用CMV pp65抗体孵育，最后用HRP封闭非特异性位点即可。
将制得的Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极用扫描电镜进行了表征，结果如图2中所示，A为SWCNHs-Nf，可以看出SWCNHs在Nf的作用下不规则的聚集起来，表面光滑但有模糊感；B为CS分散的单壁碳纳米角(SWCNHs-CS)，图中明显看出CS聚集了更多的SWCNHs，并且材料表面呈毛玻璃状，形成朦胧的表面，说明CS上的氨基成功的修饰在了SWCNHs上；C为Pt-PdNPsSWCNHs，可以看出CS分散的SWCNHs表面随机地分散着许多亮点结构，并在重叠聚集区形成强光区，说明Pt-PdNPsSWCNHs复合材料的合成是成功的，这种贯穿的网状结构将为电子提供快捷的传导通路，为固定抗体提供更大的比表面积。
实施例2
检测CMV pp65抗原的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液。其中所述工作电极为实施例1制得Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极，测试底液为含有0.1mol/L KCl浓度为0.1mol/LHAc-NaAc溶液(pH 5.5)。
Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极制备过程中电流的变化，用CV曲线表征。按上述条件分别测定裸玻碳电极、SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极、Thi吸附SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极、Pt-PdNPsSWCNHs结合Thi吸附SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极、CMV pp65抗体孵育Pt-PdNPsSWCNHs修饰后的玻碳电极、HRP封闭抗体孵育后的Pt-PdNPsSWCNHs修饰的玻碳电极、CMV pp65抗原结合Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极的电流变化，并根据峰电流变化绘制CV曲线(图3)。如图3所示，在检测底液中，裸玻碳电极无氧化还原峰(a)；SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极也没有氧化还原峰(b)；但吸附活性物质Thi后的SWCNHs-Nf修饰的玻碳电极出现了明显的氧化还原峰(c)，氧化峰峰值达60μA左右，明显较Nf膜修饰玻碳电极并吸附Thi后所得峰值增加(见图3左上角)；Pt-PdNPsSWCNHs修饰电极后，由于材料本身位阻和CS阻碍电子传递的原因，峰电流降低约20μA(d)；在电极结合CMV pp65抗体后，由于抗体蛋白质阻碍电子传递，峰电流进一步降低(e)；HRP孵育后，封闭了非特异性位点，同时也阻碍了电子传递，因此传感器峰电流值继续减低(f)；最后，制得的Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极在加入CMV pp65抗原孵育后，由于电极表面生成蛋白质大分子CMV pp65抗原和抗体的复合物，严重阻碍了电极表面的电子传输，所以传感器峰电流值降到了最低(g)。因此，图3表明了Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极制备是成功的。
利用检测CMV pp65抗原的电化学生物传感器检测CMV pp65抗原，具体方法为：将Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极与样品溶液共4℃孵育1h；采用CV进行测定，电位扫描范围为-0.2V－0.6V，电位扫描速度为50mV/s，根据CV曲线判断电极的修饰情况。采用DPV进行扫描测定，电位扫描范围为-0.5V-0.0V，根据电位-0.252V处峰电流和CMV pp65抗原标准曲线计算样品中CMV pp65抗原的浓度。
在上述检测条件下，检测不同浓度的CMV pp65抗原，结果如图4中A所示，其标准曲线如a所示。结果可以看出，CMV浓度在0.1ng/mL～100ng/mL的范围时，其浓度与峰电流呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝0.410x-65.697，相关系数为0.994，最低检测限为30pg/mL。
然后按照实施例1的方法制备Pt-PdNPsSWCNHs和CMV pp65抗体修饰电极，区别在于使用BSA作封闭剂，再以制得的电极构建检测CMV抗原的电化学生物传感器，检测不同浓度的CMV pp65抗原，结果如图4中B所示，其标准曲线如b所示。结果可以看出，CMV的浓度在0.5ng/mL～100ng/mL间，线性回归方程为：y＝0.331x-51.683，相关系数为0.993，最低检测限为100pg/mL。
上述结果表明使用封闭剂HRP的同时，其可与铂、钯纳米粒子共同催化H2O2放大检测信号，比用BSA封闭时，仅有铂钯纳米粒子催化H2O2获得的信号大，具有更宽的线性范围和更低的检出限。因此，以HRP作为封闭剂时效果更佳。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极，其特征在于：所述电极是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角处理后吸附硫堇，然后结合单壁碳纳米角-铂钯纳米粒，再用巨细胞病毒pp65抗体孵育、辣根过氧化物酶封闭非特异结合位点即可。
2.根据权利要求1所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极，其特征在于，所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角由以下方法制备：将单壁碳纳米角加入全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜中，超声搅拌过夜制得。
3.根据权利要求1所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极，其特征在于，所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒由以下方法制备：向壳聚糖溶液中加入单壁碳纳米角，超声分散后离心，沉淀物用双蒸水洗涤后分散于双蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，搅拌，然后滴加NaBH4，超声、离心、洗涤沉淀，将沉淀用双蒸水分散即可。
4.权利要求1-3任意项所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将玻碳电极表面打磨，抛光，干燥，得预处理的电极；
b.将步骤a所得预处理的电极用全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角修饰，23～26℃干燥，得全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角修饰的电极；所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角由单壁碳纳米角加入全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜中，超声搅拌过夜制得；
c.将b步骤所得全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的单壁碳纳米角修饰的电极上吸附硫堇，然后双蒸水清洗；
d.将步骤c所得电极上吸附单壁碳纳米角-铂钯纳米粒，然后用双蒸水清洗，得单壁碳纳米角-铂钯纳米粒修饰的电极；所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒由如下方法制备：向壳聚糖溶液中加入单壁碳纳米角，超声分散后离心，沉淀物用双蒸水洗涤后分散于双蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，搅拌，然后滴加NaBH4，超声、离心、洗涤沉淀，将沉淀用双蒸水分散即可；
e.将步骤d所得单壁碳纳米角-铂钯纳米粒修饰的电极上孵育巨细胞病毒pp65抗体；然后用辣根过氧化物酶封闭非特异性位点，制得单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极。
5.含有权利要求1-3任意项所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极的电化学生物传感器。
6.根据权利要求5所述的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液；所述工作电极为所述单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极；所述测试底液为含有0.1mol/LKCl、pH为5.5的浓度为0.1mol/L醋酸-醋酸钠溶液。
7.利用权利要求5或6所述电化学生物传感器检测巨细胞病毒抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：将单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极与样品溶液共孵育；然后以单壁碳纳米角-铂钯纳米粒和巨细胞病毒pp65抗体修饰电极为工作电极、铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，含有0.1mol/L KCl、pH为5.5的浓度为0.1mol/L醋酸-醋酸钠溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用差分脉冲伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.5V-0.0V，根据电位-0.252V处峰电流和巨细胞病毒抗原标准曲线计算样品中巨细胞病毒抗原的浓度。
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