CN110108531A - 一种排除医学检测中血细胞干扰的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种排除医学检测中血细胞干扰的方法。该排除医学检测中血细胞干扰的方法涉及处理全血样本的组合物，该处理全血样本的组合物包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂。每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g～10g的植物油及0.5g～10g的助溶剂。上述处理全血样本的组合物不影响检测结果且能够缩短获得检测结果时间。

Description

一种排除医学检测中血细胞干扰的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种排除医学检测中血细胞干扰的方法。

背景技术

医学检测的样本通常是来源于被检者的体液，尤以血液最多，然而血液中的血细胞会干扰医学检测结果。大多数的检测方法都需要对血液进行预处理以除去血细胞对检测的干扰。目前主要通过离心将血细胞去除红细胞或加入裂解液将红细胞裂解以减少血细胞对检测的干扰。通过离心将血细胞去除红细胞时一般需要将血液离心3000rpm，10分钟，增加了操作步骤，也增加了获得检测结果的时间，不利于追求快速、便捷、应用场景灵活的POCT(即时检测)产品。而以加入裂解液裂解红细胞的之后，大量的血细胞内容物溶解于血浆会严重干扰生物反应、示踪反应的进行。

发明内容

基于此，有必要提供一种便捷且干扰小的处理全血样本的组合物。

一种处理全血样本的组合物，包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂，每100mL的所述处理全血样本的组合物中含有0.5g～10g的所述植物油及0.5g～10g的所述助溶剂。

上述处理全血样本的组合物包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂。一方面通过植物油及助溶剂的配合使得植物油包裹血细胞，在不破坏血细胞的结构的条件下，防止血细胞内容物释放到检测液中，同时也阻断血细胞吸附生物大分子、消除生物大分子与待测物结合的空间位阻；另一方面，呼吸抑制剂阻断血细胞有氧呼吸的成分，防止血细胞有氧呼吸产生的电子及自由基破坏目标待测物的结构。上述处理全血样本的组合物的各组分协同作用，能够实现使用全血就可对血液完成医学检测，检测便捷，对后续的检测干扰小，检测结果可靠。

此外，还提供一种检测快速且结果可靠的试剂盒。该试剂盒包括上述处理全血样本的组合物。

此外，还提供一种排除医学检测中血细胞干扰方法。该方法包括将待测的全血样本与上述处理全血样本的组合物混合均匀，以使所述全血样本中的红细胞被所述处理全血样本的组合物中的植物油包裹的步骤。

附图说明

图1为实施例1的未处理组与血浆组的相对发光值的线性关系图；

图2为实施例1的处理组与血浆组的相对发光值线的线性关系图；

图3为实施例2的未处理组与血浆组的相对发光值的线性关系图；

图4为实施例2的处理组与血浆组的相对发光值线的线性关系图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种处理全血样本的组合物，该处理全血样本的组合物包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂。每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g～10g的植物油及0.5g～10g的助溶剂。

具体地，植物油选自大豆油、花生油、棕榈油、菜籽油、葵花籽油及橄榄油中的至少一种。优选地，植物油选自大豆油、花生油、棕榈油、菜籽油、葵花籽油及橄榄油中的一种。进一步地，植物油选自大豆油。具体地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有1g～8g的植物油。具体地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有1g～5g的植物油。进一步地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有1g、2g或3g的植物油。

具体地，呼吸抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素、氰化物、羰基氰化物-苯基-腙、寡霉素、丙二酸酯及2，4-二硝基酚中的至少一种。优选地，呼吸抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素、氰化物、羰基氰化物-苯基-腙、寡霉素、丙二酸酯及2，4-二硝基酚中的一种。优选地，抗霉素、寡霉素及2，4-二硝基酚中的一种。具体地，，每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g～5g的呼吸抑制剂。优选地，，每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g～3g的呼吸抑制剂。进一步地，，每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g、0.78g或1g的呼吸抑制剂。

具体地，助溶剂选自离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂及两性表面活性剂中的至少一种。助溶剂选自羧酸盐型阴离子表面活性剂、硫酸盐型阴离子表面活性剂、磺酸盐型阴离子表面活性剂、磷酸盐型阴离子表面活性剂、铵盐型阳离子表面活性剂、季铵盐型阳离子表面活性剂、多元醇型非离子表面活性剂、聚氧乙烯型非离子表面活性剂、聚氧乙烯-聚氧丙烯型非离子表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯型非离子表面活性剂、氨基酸型两性离子表面活性剂、甜菜碱型两性离子表面活性剂及磷脂型两性离子表面活性剂中的至少一种。进一步地，助溶剂选自硫酸盐型阴离子表面活性剂、磺酸盐型阴离子表面活性剂、多元醇型非离子表面活性剂、聚氧乙烯-聚氧丙烯型非离子表面活性剂及甜菜碱型表面活性剂中的一种。

具体地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有0.5g～10g的助溶剂。优选地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有1g～8g的助溶剂。进一步地，每100mL的处理全血样本的组合物中含有2g、3g或7g的助溶剂。

在其中一个实施例中，植物油与助溶剂的质量之比为1:1.5～3。植物油与呼吸抑制剂的质量之比为1:0.5～2。在此比例下，上述处理全血样本的组合物中的植物油、助溶剂及呼吸剂能够发挥更好的配合效果，使得处理全血之后的干扰小，检测结果可靠。

医学检测中血细胞的干扰主要来源于两个方面。第一，血细胞作为一个整体由于其表面含有糖类、蛋白质以及脂类，这些物质都会对目标待测物进行吸附，目标待测物被吸附后，可能导致其反应位点被阻挡，或者虽然反应位点还在，但大体积的血细胞阻挡了生物识别分子与待测物的结合。第二，血细胞的有氧呼吸会产生局部电子的改变，同时产生自由基。电子会影响生物识别分子与目标待测物表面的电荷排布甚至影响两者的空间构象从而使得两者的亲和力发生改变，最终反应为检测结果的不准确。自由基的产生会直接破坏生物分子的结构，使得生物识别分子或待测物的结构发生改变，最终也会影响测试结果的准确性。上述处理全血样本的组合物包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂。处理含有血细胞的全血样本时，上述处理全血样本的组合物中的植物油在助溶剂的作用下包裹在血细胞表面，形成物理屏障以阻隔血细胞与生物识别分子及目标待测物接触。呼吸抑制剂抑制血细胞呼吸，阻断细胞呼吸过程，抑制其产生电子及自由基。电子及自由基的减少使得目标待测物及生物识别分子的结构免遭破坏，保证其生物活性。上述处理全血样本的组合物中的各组分相互配合，使得血细胞不会干扰血液中目标待测物与生物识别分子的反应，血细胞仅改变样本固有体积，而这种改变有限，不足以影响测试结果。因此，测试全血样本所得结果与血清或血浆样本所得结果会有良好的相关性，检测结果可靠。

在其中一个是实施例中，上述处理全血样本的组合物还包括两性离子缓冲盐、金属离子及封闭蛋白中的至少一种。

具体地，上述处理全血样本的组合物还包括两性离子缓冲盐。两性离子缓冲盐选自三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)及2-吗啉乙磺酸中的至少一种。

具体地，上述处理全血样本的组合物还包括金属离子。

具体地，上述处理全血样本的组合物还包括封闭蛋白。封闭蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、脱脂奶粉及酪蛋白水解物中的至少一种。优选地，人血清白蛋白、卵清蛋白及明胶中的一种。具体地，处理全血样本的组合物中封闭蛋白的含量(w/v)为0.05％～5％。优选地，处理全血样本的组合物中封闭蛋白的含量(w/v)为0.5％～1％。

本发明一实施方式还提供一种排除医学检测中血细胞干扰方法。该方法包括以下步骤：

将待测样本与上述处理全血样本的组合物混合，得到处理后的待测样本。具体地，待测样本为血清、血浆或者全血。进一步地，待测样本与上述处理全血样本的组合物的体积比为100:1～1:100，优选地，待测样本与上述处理全血样本的组合物的体积比为50:1～5:50。

在经上述样本的前处理方法处理之后的待测样本中加入与检测相关的试剂就可以进行后续检测。

本发明一实施方式还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述处理全血样本的组合物。

进一步地，该试剂盒还包括反应试剂，反应试剂是基于目标检测物的特异性结合的对应设计，该特异性结合可以是酶与其催化的底物、抗原与抗体、受体与配体、互补的核酸、核酸适配子与蛋白质。优选的为抗原与抗体。具体地，目标检测物包括但不限于核酸、蛋白质、多肽、多糖、脂类以及微量元素。与目标检测物特异性结合的物质包括但不限于抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、核酸适配子。

在其中一个实施例中，反应试剂包括捕获抗体及酶标抗体中的至少一种。进一步地，捕获抗体为肌酸激酶同工酶抗体，酶标抗体为碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。

在另一个实施例中，该试剂盒包括上述处理全血样本的组合物及PCR反应液。具体地，PCR反应液包括PCR缓冲液、DNA提取液、DNA聚合酶及dNTPs中的至少一种。

上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

将待测样本与上述试剂盒中的处理全血样本的组合物和反应试剂混合后检测，得到检测结果。

进一步地，全血样本与上述处理全血样本的组合物的体积比为100:1～1:100，优选地，全血样本与上述处理全血样本的组合物的体积比为50:1～5:50。

目标检测物与上述试剂盒中能够与目标检测物特异性结合的物质结合之后，通过建立起目标检测物的量与示踪信号的关系，进而对目标检测物进行定量。示踪信号可以是吸光度、荧光强度、相对发光值、量子点个数、电流强度、电压变化、到达反应终点的时间等，优选的为荧光强度、相对发光值。

测试全血中目标检测物的浓度时，血细胞的体积会对样本起到扩容的作用，若以血清或血浆样本的测试值作为对照标准，全血样本的待测物浓度略低，在大多数的样本中，血细胞比容为40％～50％，因此将血细胞比容按45％计算，产生的偏差不会过大，如需更精确的测量，可以自行选择对血细胞容积进行校正，校正的待测物浓度近似等于测试结果×100/(100-血细胞容积％)。在加入了上述处理全血样本的组合物后，全血样本的测试结果与血清或血浆的测试结果具有良好的相关性，对于具体的测试项目，如果无法进行依据血细胞压积的浓度修正，可以通过两者的相关性进行校正，校正之后测试全血样本的浓度值等效于测试血清或血浆样本。

当然，在一些实施例中，上述试剂盒不包括反应试剂，此时，在待测样本与上述试剂盒中的上述处理全血样本的组合物混合后得到的混合物中加入与检测项目对应的试剂后进行检测即可，也即是该试剂盒是用于前处理的试剂盒。

上述试剂盒使用简便，能够降低红细胞对检测结果的影响，测试结果可靠。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

检测肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的化学发光免疫法试剂盒。

(1)制备捕获样本中CK-MB的捕获抗体，具体的制备过程为：将磁珠重悬30分钟，确保磁珠分散均匀，之后取1mL磁珠到新的离心管中。然后用磁铁吸附磁珠后，去掉上清，之后用MES(pH 6.0)缓冲液冲洗磁珠。重复3-4次。之后加入EDC使磁珠活化。然后活化的磁珠加入抗CK-MB的单克隆抗体，25℃孵育过夜。取出磁珠后，去掉上清，使用0.1％Tween 20的PBS清洗2遍。清洗完成后使用含有0.1％Tween 20和0.1％BSA的磁珠储存液保存。

(2)酶标抗体的制备，使用马来酰胺将抗CK-MB单克隆抗体与碱性磷酸酶(ALP)连接，得到可以识别CK-MB并提供示踪信号的酶标抗体。酶标抗体使用0.1M的Tris溶液保存，其中还含有0.9％(w/v)的NaCl、0.05％(w/v)的BSA。

(3)检测样本中的CK-MB。所使用的样本：含有CK-MB的人血浆样本以及来自于同一人同一时刻采集的同管全血样本。全血样本测试时，一部分添加处理全血样本的组合物，一部分添加同量的生理盐水作为对照。

含有CK-MB的血浆样本(即血浆样本组)的具体的测试方法为：将取血浆50μL加入到包被有抗体的磁珠中，之后加酶标抗体加入到该体系中形成磁珠、血浆以及标记抗体的混合物，37℃孵育5min。使用含0.1％Tween20的0.1M的Tris清洗液清洗磁珠，由于磁珠被强磁铁吸附，因此不会被清洗走，而CK-MB已被磁珠上的捕获抗体捕获同时与标记抗体形成了“三明治”结构，因此清洗只会将无法特异结合的杂质洗掉。清洗完成后，将复合物加入到底物(AMPPD)中，碱性磷酸酶催化底物产生光子，通过PMT(光电倍增管)读取相对发光强度，通过相对发光强度的大小，对CK-MB进行定量。

不经处理全血样本的组合物处理的全血样本(即未处理全血组)的具体的测试方法为：将50μL全血样本与生理盐水按5:1的比例混合，混匀之后的步骤与与含有CK-MB的血浆样本的测试方法一致。

加入处理全血样本的组合物的全血样本(即处理全血组)的具体的测试方法为：将50μL全血样本与处理全血样本的组合物按5:1的比例混合，混匀之后的测试步骤与不加全血处理液的全血样本测试方法一致。其中，以每100mL计，处理全血样本的组合物由1g大豆油、0.5g鱼藤酮、3gN-羧甲基-N,N-二甲基-十二烷基铵内盐(月桂基甜菜碱)、40g三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)及0.5g牛血清白蛋白组成。

血浆组、未处理全血组以及处理全血组的测试结果如表1所示，同时三者的关系如图1和图2所示。表1中的样本号对应于30个不同人。

表1

由表1及图1～图2可知，处理全血组的测试结果与血浆组的处理结果的相关性高。实施例1的处理全血样本的组合物能够降低血细胞对检测的干扰。

实施例2

制备检测C反应蛋白(CRP)的核酸适配子发光检测试剂盒。

(1)制备捕获样本中CRP的核酸适配子磁珠，具体的制备过程为：将磁珠重悬30分钟，确保磁珠分散均匀，之后加入1mL磁珠。然后用磁铁吸附磁珠后，去掉上清，之后用MES(pH 4.8)缓冲液冲洗磁珠。重复3-4次。之后将可以与CRP特异性结合的核酸适配子加入EDC中，使核酸适配子与EDC偶联。将核酸适配子及EDC混合物加入到磁珠中混匀，置于25℃过夜孵育。取出磁珠后，去掉上清，使用0.1％Tween 20的PBS清洗2遍。清洗完成后使用含有0.1％Tween20和0.1％BSA的磁珠储存液保存。

(2)酶标记物抗体的制备，使用马来酰胺将CRP单克隆抗体与碱性磷酸酶(ALP)连接。得到可以识别CRP并提供示踪信号的酶标抗体。酶标抗体使用0.1M的Tris溶液保存，其中还含有0.9％(w/v)的NaCl、0.05％(w/v)的BSA。

(3)检测样本中的CRP，所使用的样本为来自30个人的CRP血浆样本(对应于血浆组)以及来自于同一人同一时刻采集的同管全血样本。全血样本测试时一部分添加样处理全血样本的组合物(对应于处理全血组)，一部分添加同量的生理盐水作为对照(对应于未处理全血组)。具体处理方法及步骤与实施例1相同。

血浆组、未处理全血组以及处理全血组的测试结果如表2所示，同时三者的关系如图3和图4所示。表2中的样本号对应于30个不同人。

表2

由表2及图3～图4可知，处理全血组的测试结果与血浆组的处理结果的相关性高。实施例1的处理全血样本的组合物能够降低血细胞对检测的干扰。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种处理全血样本的组合物，其特征在于，包括植物油、呼吸抑制剂及助溶剂，每100mL的所述处理全血样本的组合物中含有0.5g～10g的所述植物油及0.5g～10g的所述助溶剂。

2.根据权利要求1所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，所述植物油选自大豆油、花生油、棕榈油、菜籽油、葵花籽油及橄榄油中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，所述呼吸抑制剂选自鱼藤酮、抗霉素、氰化物、羰基氰化物-苯基-腙、寡霉素、丙二酸酯及2，4-二硝基酚中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，所述助溶剂选自离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂及两性表面活性剂中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，每100mL的所述处理全血样本的组合物中含有0.5g～5g的所述呼吸抑制剂。

6.根据权利要求1～5任一项所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，还包括两性离子缓冲盐、金属离子及封闭蛋白中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，所述两性离子缓冲盐选自三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)及2-吗啉乙磺酸中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的处理全血样本的组合物，其特征在于，所述封闭蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、脱脂奶粉及酪蛋白水解物中的至少一种。

9.一种排除医学检测中血细胞干扰方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测样本与权利要求1～8任一项所述的处理全血样本的组合物混合，得到处理后的待测样本。

10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的处理全血样本的组合物。