JP2024510408A - エポキシ系樹脂に付着した生化学プローブ - Google Patents

Abstract

本発明は、生物学的および化学的アッセイを実施するための固体基材を製作するための方法、およびその方法により製作される固体基材を対象とする。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１７日に出願の米国特許仮出願第６３／２８８，０１８号および２０２１年３月４日に出願の米国特許仮出願第６３／１５５，４７２号の利益を主張するものであり、これらの文献の内容は全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府の支援による研究または開発に関する宣言
適用外。

コンパクトディスクで提出された資料の参照による組込み
適用外。

本発明は、生物学的および化学的アッセイを実施するための固体基材を製作するための方法、およびその方法により製作される固体基材を対象とする。特に、マルチプレックスバイオアッセイで使用するための固体基材を対象とする。

生物学的および化学的分析用のアレイは、官能化エポキシ樹脂などの樹脂材料を含む表面を有する固体基材にプローブ分子を付着させることにより作出されてもよい。アレイを使用することにより、核酸およびタンパク質などの多数の生体分子を非常に少ない試料体積で迅速にスクリーニングすることが可能になる。例えば、バーコード付きマイクロビーズと呼ばれる、識別可能な標識および／またはマーキングを有するマイクロスフェアまたはマイクロビーズとして公知である粒子は、疾患関連標的、毒素関連標的、および遺伝子関連標的などを識別するための並列マルチプレックス分析に使用されている。マイクロビーズは、それらの表面に、１つまたは複数の特定の標的分子に対する親和性および／または相互作用能力を有する１つまたは複数のプローブ分子にコンジュゲートされた樹脂コーティングを有する。各プローブ分子は、一意に識別可能なようにコード化された個別のビーズに付着している。アッセイでは、マイクロビーズを試料と接触させると、試料中の様々な標的分子は、対応するプローブ分子がコンジュゲートされているマイクロビーズに結合する。バーコードにより標的の識別が可能になる。

マイクロビーズアッセイは、現在、生物学的アッセイおよび診断における重要なツールである。マイクロビーズに基づく技術は、高度並列定量マルチパラメーターアッセイを実施するための洗練された汎用性の高い手法である。マイクロビーズに基づく技術は、試料中の核酸およびタンパク質を検出および定量化するための様々な技法の基礎を形成する。

プローブ分子を付着させるコーティング材料としては、エポキシ系樹脂が使用されている。しかしながら、プローブ分子をエポキシ系樹脂の表面に付着させるには、最初に樹脂の表面を官能化しなければならない追加ステップが必要である。米国特許第９，２５５，９２２号明細書には、プローブ分子を付着させたエポキシ系樹脂でコーティングされた、マイクロビーズまたはマイクロペレットなどの基材が開示されている。この特許には、エポキシ系樹脂は疎水性であるため、多数の生物学的応用に制限があり、プローブ分子の樹脂への効率的な付着を可能にする前に、エポキシ系樹脂を追加の官能性モノマーで修飾しなければならないことが教示されている。したがって、エポキシ系樹脂が形成された後（またはエポキシ系樹脂の形成中に）、生体分子プローブがエポキシ系樹脂の表面に効率的に付着できるように、エポキシ系樹脂を追加の官能性モノマーと接触させてエポキシ系樹脂を官能化する必要がある。エポキシ樹脂を官能性モノマーと接触させるこの追加のステップには、労力および時間がかかる。

当技術分野では、生体分子プローブを効率的に付着させることができるエポキシ系樹脂でコーティングされた基材を製作するための簡易な方法が必要とされている。本発明者らは、思いもよらぬことであったが、エポキシ系樹脂を最初に追加の官能性モノマーで官能化する必要なく、生体分子プローブを、エポキシ系樹脂でコーティングされた基材に効率的に付着させることができることを発見した。

本発明のこうしたおよび他の特徴ならびに利点は、本開示の残りの部分、特に以下の好ましい実施形態の詳細な記載から明らかになるであろう。以下の好ましい実施形態ではすべて、本発明の原理が例を用いて説明されている。

本出願におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する先行技術であると解釈されるべきではない。

本発明は、生物学的分析用の基材および生物学的分析用の基材を製作するための方法を対象とする。生物学的分析用の基材は、重合樹脂に直接結合された生体分子プローブを有するエポキシ系樹脂を含む。

生物学的分析用の基材は、
（ｉ）エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備すること、および
（ｉｉ）生体分子プローブがエポキシ系樹脂に直接結合するように、エポキシ系樹脂と生体分子プローブを接触させること
により調製される。

本発明は、試料中の分析物の存在をアッセイする方法をも対象とする。この方法は、エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブを有するエポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と試料を接触させることであって、生体分子プローブが、分析物に特異性をもって結合する、接触させること、を含む。

図１Ａおよび図１ＢのＸ軸にある「ＡＰ」、「Ａｐｈ」、および「Ａｐｌ」と表記されている３つのＡｎａｐｌａｓｍａ属由来ペプチドに特異的な抗体に関する、実施例６に記載のアッセイの、９６ウェルプレートの細胞縦列位置（つまり、１～１２）に対する、ウェル内のすべてのビーズの単一中央値結果として測定されたＢＭＢの蛍光強度（ＭＦＩ）としてのシグナル強度のプロットである。実施例６に記載のように、図１Ａは、標準読取り緩衝液でのシグナル強度対細胞縦列位置を示し、図１Ｂは、クエン酸塩読取り緩衝液でのシグナル強度対細胞縦列位置を示す。 同上。

本発明は、生物学的分析用の基材および生物学的分析用の基材を製作するための方法を対象とする。生物学的分析用の基材は、エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブを有するエポキシ系樹脂を含む。

「エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブ」および類似の語句は、本明細書で使用される場合、最初にエポキシ系樹脂を、エポキシ系樹脂と共有結合的に反応する別の試薬と接触させることなく、生体分子プローブを樹脂と単に接触させることにより、生体分子プローブを樹脂に付着させることを意味する。生体分子プローブは、エポキシ系樹脂に受動的に付着してもよく、エポキシ系樹脂に共有結合で付着してもよい。

生物学的分析用の基材は、
（ｉ）エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備すること、および
（ｉｉｉ）生体分子プローブがエポキシ系樹脂に直接結合するように、エポキシ系樹脂と生体分子プローブを接触させること
により調製される。

一実施形態では、基材はエポキシ系樹脂である。

一実施形態では、基材は、エポキシ系樹脂でコーティングされた固体支持体である。エポキシ系樹脂をコーティングすることができる例示的な固体支持体材料としては、これらに限定されないが、ガラス、ポリマー、ラテックス、元素金属、金属複合体、合金、ケイ素、炭素、およびそれらのハイブリッドを含む粒子、ビーズ、および表面が挙げられる。

一実施形態では、生体分子プローブをエポキシ系樹脂と接触させる前に、エポキシ系樹脂の部分を重合させる。

好適なエポキシ系樹脂としては、これらに限定されないが、ＥＰＯＮ ＳＵ－８、ＥＰＯＮ １００１Ｆ、１００２Ｆ、１００４Ｆ、１００７Ｆ、１００９Ｆ、２００２、および２００５（ＮＣ、ＦａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅのＨｅｘｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されている）が挙げられる。ＥＰＯＮ ＳＵ－８およびＥＰＯＮ １００２Ｆが好ましい樹脂である。

ＳＵ－８は、光硬化性エポキシ系樹脂である。ＳＵ－８は、（クロロメチル）オキシランと４，４－（１－メチルエチリデン）ビスフェノールとのホルムアルデヒドポリマーである（ＣＡＳ：２８９０６－９６－９）。ＳＵ－８は、約８個の平均エポキシド基官能価を有するポリマー固体エポキシノボラック樹脂である。ＳＵ－８エポキシ樹脂の構造は以下の通りである。

ＳＵ－８は、Ｈｅｘｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、ＥＰＯＮ ＳＵ－８という商品名で、ＳＵ－８および光酸発生剤を含む溶液として市販されている。

１００２Ｆは、光硬化性エポキシ樹脂（ＣＡＳ：２５０３６－２５－３）である。１００２Ｆは、２，２’－［（１－メチルエチリデン）ビス（４，１－フェニレンオキシメチレン）］ビス（オキシラン）との、フェノール、４，４’－（１－メチルエチリデン）ビス－ポリマーであり、Ｈｅｘｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、ＥＰＯＮ １００２Ｆという商品名で、１００２Ｆおよび光酸発生剤を含む溶液として市販されている。

好適な生体分子プローブとしては、これらに限定されないが、脂質、多糖、アミノ酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、抗体およびそれらの断片、ポリヌクレオチド（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む）、より短いオリゴヌクレオチド、アプタマー、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。好ましくは、生体分子プローブは、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、またはより短いオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、生体分子は抗体である。一実施形態では、生体分子プローブは、例えばローダミンなどの合成分子である。例示的な生体分子プローブとしては、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、Ｔ４、コルチゾール、プロゲステロン、および酵素（例えば、膵リパーゼなどのリパーゼ）が挙げられる。

理論に束縛されるものではないが、生体分子プローブは、生体分子のアミン基、チオール基、またはヒドロキシル基と樹脂のエポキシ基との反応により、エポキシ系樹脂に結合すると考えられる。また、生体分子プローブは、エポキシ系樹脂に受動的に結合してもよい。「受動的に結合する」という語句は、本明細書で使用される場合、ファンデルワールス（Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｌｌｓ）相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、または水素結合相互作用などの非共有結合相互作用による結合を意味する。

エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材は、これらに限定されないが、単独の薄膜または別の固体表面に接着された薄膜、マイクロビーズ、マイクロ粒子、マイクロペレット、マイクロウェハ、常磁性ビーズ、バーコードなどの識別特徴を含むマイクロ粒子、常磁性マイクロ粒子、バーコードを含む常磁性マイクロ粒子、およびニッケルバーコードを含むビーズであってもよい。

エポキシ系樹脂を生体分子と単に接触させることにより、生体分子プローブをエポキシ樹脂に直接結合させる。

一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を生体分子プローブの溶液に添加して接触混合物を準備することにより、生体分子プローブがエポキシ系樹脂と接触させられる。一実施形態では、生体分子プローブの溶液は水溶液である。一実施形態では、生体分子プローブの溶液は緩衝化水溶液である。一実施形態では、生体分子プローブの溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液である。

好ましい実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材が生体分子プローブの溶液に添加されて接触混合物を準備する前に、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材がＤＭＳＯで洗浄される。一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材が、生体分子プローブの溶液と接触させられて接触混合物を準備する直前に、ＤＭＳＯで洗浄される。思いもよらぬことであったが、エポキシ樹脂が生体分子プローブと接触させられる前にエポキシ系樹脂をＤＭＳＯと接触させることにより、エポキシ樹脂に結合する生体分子プローブの個数にばらつきが少なく、生体分子プローブに結合する試料中の分析物の存在を検出するために使用されるシグナルにばらつきが少ない生物学的分析用の基材がもたらされることを発見した。思いもよらぬことであったが、エポキシ樹脂が生体分子プローブと接触させられる前に、エポキシ系樹脂をＤＭＳＯと接触させることにより、より良好なシグナルを呈する生物学的分析用の基材がもたらされることを見出した。

この方法では、生体分子プローブをエポキシ系樹脂に直接結合させることにより、有利なことに、（ｉ）生体分子プローブをエポキシ系樹脂に結合させる前にエポキシ樹脂を別の分子と反応させることまたは（ｉｉ）重合前に別の分子をエポキシ樹脂に混合することにより、エポキシ系樹脂を官能化しなければならない追加のステップが回避される。この方法は、この追加のステップを回避することにより、有利なことに、より迅速であり、より安価であり、エラーまたはばらつきが潜在的に発生し得るステップが除外される。

生体分子プローブの溶液を使用して、生体分子プローブを、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と接触させる場合、溶液中の生体分子プローブの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約３．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１５～約２．５ｍｇ／ｍＬの範囲であり、例えば、約１．５ｍｇ／ｍＬである。

接触混合物中の、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材の濃度は、約５万～約５００万個基材／ｍＬ、好ましくは約１０万～約３００万個基材／ｍＬの範囲である。一実施形態では、生体分子プローブはペプチドであり、接触混合物中の、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材の濃度は、約１０万～約３００万個基材／ｍＬの範囲であり、例えば、約２００万個基材／ｍＬである。一実施形態では、生体分子プローブは抗体であり、接触混合物中の、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材の濃度は、約１０万～約１８０万個基材／ｍＬの範囲であり、例えば、約１００万個基材／ｍＬである。

生体分子プローブの溶液を、典型的には、生体分子プローブがエポキシ系樹脂に結合するのに十分な時間にわたって、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と接触させられる。典型的には、生体分子プローブの溶液は、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と、少なくとも約４時間、好ましくは少なくとも約８時間、より好ましくは少なくとも約１０時間接触させられる。一実施形態では、分子プローブは、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と約４時間～約１８時間接触させられる。

接触混合物（つまり、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材および生体分子プローブの溶液）は、生体分子プローブがエポキシ系樹脂に結合するのに十分な温度に維持される。一実施形態では、接触混合物は、約４℃～約６５℃、好ましくは約１５℃～約３０℃、より好ましくは約１８℃～２７℃の温度に維持される。一実施形態では、接触混合物を撹拌して、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材の表面が生体分子プローブの溶液と十分に接触することを保証する。

一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材および生体分子プローブの溶液を接触させて生体分子プローブをエポキシ系樹脂に結合させた後、生物学的プローブの溶液を除去し、得られた生体分子官能基化基材を、ｐＨが約７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の約１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＩＡ、ＡｎｋｅｎｙのＰｒｏｌｉａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから市販されている）、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、および０．０５％プロクリン９５０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）の混合物で洗浄する。好適なＰＢＳ溶液は、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、および約１４５ｍＭ塩化ナトリウム（ＯＨ、ＳａｌｏｎのＡｍｒｅｓｃｏから市販されている）を含む。一実施形態では、生体分子官能化基材を、少なくとも約２００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。一実施形態では、生体分子官能化基材を、約２００μＬ～約１，０００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。

好適な緩衝剤としては、これらに限定されないが、リン酸塩、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＥＰＰＳ、Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ－ＴＲＩＳプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＤＡ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、トリシン、ＴＥＳ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ＤＩＰＳＯ、無機緩衝剤、有機緩衝剤、酢酸系およびクエン酸系緩衝剤が挙げられる。

次いで、得られた洗浄生体分子官能化基材を、アッセイで使用するために、ｐＨが約７．４のＰＢＳ中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約０．０５％プロクリン９５０の溶液に添加することができる。

本方法の第１の態様では、生体分子プローブは、抗体、酵素（例えば、ストレプトアビジンおよびアビジン）、または抗体の一部（例えば、Ｆｃ断片およびＦＡＢ断片）などのタンパク質であり、生体分子プローブの溶液は水溶液である。本方法の第１の態様の一実施形態では、生体分子プローブの溶液は、約１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および約１４０ｍＭのグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ５．５に緩衝化された水溶液である。本方法の第１の態様の一実施形態では、生体分子プローブの溶液は、約１００ｍＭの３－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］プロパン－１－スルホン酸（ＥＰＰＳ）および１４０ｍＭのグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ８に緩衝化された水溶液である。

本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む少なくとも約２００μＬのＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄する。本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む約２００μＬ～約１，０００μＬのＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄する。

本方法の第１の態様の好ましい実施形態では、次いで、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、ＤＭＳＯでさらに洗浄する。本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、少なくとも約２００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約２００μＬ～約１，０００μＬのＤＭＳＯで少なくとも３回洗浄する。

本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材および生体分子プローブの溶液を接触させて生体分子プローブをエポキシ系樹脂に付着させた後、生物学的プローブの溶液を除去し、得られた生体分子官能基化基材を、ｐＨが約７．４のＰＢＳ中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および約０．０５％プロクリン９５０の混合物で洗浄する。一実施形態では、生体分子官能化基材を、少なくとも約２００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。一実施形態では、生体分子官能化基材を、約２００μＬ～約１，０００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。

次いで、得られた洗浄生体分子官能化基材を、アッセイで使用するために、ｐＨが約７．４のＰＢＳ中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約０．０５％プロクリン９５０の溶液に添加することができる。

本方法の第１の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、ＳＵ－８エポキシ系ネガ型フォトレジスト（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅから市販されている）でコーティングされたバーコード付き磁気ビーズなどのバーコード付き磁気ビーズである。

本方法の第２の態様では、生体分子プローブは、システイン残基を有するペプチドであり、生体分子プローブの溶液は、ＤＭＳＯ中の溶液である。本方法の第２の態様の一実施形態では、溶液は、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＭＳＯである。本方法の第２の態様の一実施形態では、ペプチド濃度は、約０．２ｍＭ～約１ｍＭペプチドの範囲であり、例えば約０．５ｍＭである。

本方法の第２の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する。本方法の第２の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む少なくとも約２００μＬのＤＭＳＯ溶液で少なくとも３回洗浄する。本方法の第２の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、生体分子プローブの溶液と接触させる前に、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む約２００μＬ～約１，０００μＬのＤＭＳＯ溶液で少なくとも３回洗浄する。

本方法の第２の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材および生体分子プローブの溶液を接触させて、生体分子プローブをエポキシ系樹脂に結合させた後、生物学的プローブの溶液を除去し、得られた生体分子官能化基材を、ｐＨが約７．４のＰＢＳ中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および約０．０５％プロクリン９５０の混合物で洗浄する。一実施形態では、生体分子官能化基材を、少なくとも約２００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。一実施形態では、生体分子官能化基材を、約２００μＬ～約１，０００μＬの洗浄溶液で少なくとも３回洗浄する。

次いで、得られた洗浄生体分子官能化基材を、アッセイで使用するために、ｐＨが約７．４のＰＢＳ中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約０．０５％プロクリン９５０の溶液に添加することができる。

本方法の第２の態様の一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材は、ＳＵ－８エポキシ系ネガ型フォトレジスト（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅから市販されている）でコーティングされたバーコード付き磁気ビーズなどのバーコード付き磁気ビーズである。

理論に束縛されるものではないが、本方法の第２の態様は、生体分子プローブのチオール基とエポキシ系樹脂のエポキシド基とを反応させることを含む。このシステイン残基は、ペプチド配列のいずれの場所に存在してもよい。システインは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーによりペプチドから離間されていてもよい。ＰＥＧは、ディスクリートＰＥＧ（ｄｉｓｃｒｅｅｔ ＰＥＧ）を使用することなどにより、規定の長さにすることができる。ｄＰＥＧ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｌａｉｎ Ｃｉｔｙ、ＯＨから市販されている）は、特に好適なＰＥＧである。ＰＥＧリンカーを用いてシステイン残基をタンパク質に連結する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｉ．Ｈａｍｌｅｙ、ＰＥＧ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１５巻：１５４３～５９頁、２０１４年を参照されたい。他のリンカーおよびスペーサーとしては、ベータ－アラニン、４－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、（２－アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５－アミノ吉草酸（Ａｖａ）、６－アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、トリオキサトリデカン－コハク酸（Ｔｔｄｓ）、およびペプチドが挙げられる。

一実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端アセチル化（Ａｃ）またはＣ末端アミド化によりＮ末端およびＣ末端がキャッピングされている。生体分子プローブが抗体である場合、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元試薬を使用して抗体を還元して、エポキシ系樹脂との結合のために抗体のヒンジ領域のチオール基を接近可能にすることにより、チオール基を介して抗体をエポキシ系樹脂に結合させることができる。

一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材は、ＳＵ－８樹脂およびトリフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネートなどの光酸発生剤をγ－ブチロラクトンまたはシクロペンタノンなどの溶媒中に含む溶液、例えば、ＥＰＯＮ ＳＵ－８（ＮＣ、ＦａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅのＨｅｘｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されている）で支持体をコーティングすることにより調製する。次いで、支持体を加熱して溶媒を除去し、支持体上に固体エポキシ系樹脂のコーティングを残す。固体エポキシ系樹脂の厚さは、数百ミクロン厚であってもよい。典型的には、固体エポキシ系樹脂の厚さは、約１ｎｍ～約３ｍｍの範囲である。次いで任意選択で、固体エポキシ系樹脂の部分をＵＶ光の照射により重合して、重合エポキシ系樹脂を得る。一実施形態では、重合エポキシ系樹脂上にパターンが残るように、ＵＶ光を照射する前に固体エポキシ系樹脂の上部にフォトマスクを配置する。一実施形態では、支持体を、固体エポキシ系樹脂から分離する。

一実施形態では、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材は、１００２Ｆ樹脂およびトリフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネートなどの光酸発生剤をγ－ブチロラクトンまたはシクロペンタノンなどの溶媒中に含む溶液、例えば、ＥＰＯＮ １００２Ｆ（ＮＣ、ＦａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅのＨｅｘｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されている）で支持体をコーティングすることにより調製する。次いで、支持体を加熱して溶媒を除去し、支持体上に固体エポキシ系樹脂のコーティングを残す。固体エポキシ系樹脂の厚さは、数百ミクロン厚であってもよい。典型的には、固体エポキシ系樹脂の厚さは、約１ｎｍ～約３ｍｍの範囲である。次いで任意選択で、固体エポキシ系樹脂の部分をＵＶ光の照射により重合して、重合エポキシ系樹脂を得る。一実施形態では、重合エポキシ系樹脂上にパターンが残るように、ＵＶ光を照射する前に固体エポキシ系樹脂の上部にフォトマスクを配置する。一実施形態では、支持体を、固体エポキシ系樹脂から分離する。

一実施形態では、試料は糞便試料である。一実施形態では、アッセイされる分子（つまり、分析物）は、例えば、回虫、鞭虫、鉤虫、条虫、またはイヌ糸状虫、または寄生虫Ｇｉａｒｄｉａなどの腸内寄生虫により生成されるタンパク質であり、生体分子プローブは、タンパク質に対する抗体である。一実施形態では、抗体は、糞便内抗原に特異的である。一実施形態では、生体分子プローブは、回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、イヌ糸状虫由来の抗原に特異的に結合する抗体、およびＧｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体からなる群から選択される。

鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体の例は、米国特許第９，２３９，３２６号明細書および第８，８９５，２９４号明細書に開示されている。回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体の例は、米国特許第８，０９７，２６１号明細書；第９，２１２，２２０号明細書；第９，１０３，８２３号明細書；第８，１０５，７９５号明細書；および第８，８９５，２９４号明細書に開示されている。鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体の例は、米国特許第８，３６７，８０８号明細書および第８，８９５，２９４号明細書に開示されている。条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体の例は、米国特許出願公開第２０２０／０１０２３７８号明細書に開示されている。Ｇｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体の例は、Ｈ．Ｓｔｉｂｂｓ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｏｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１１巻）：２５８２～２５８８頁、１９８９年１１月およびＨ．Ｓｔｉｂｂｓら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｇｅｒｂｉｌ ｆｅｃｅｓ ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１０巻）：２３４０～６頁、１９９０年１０月に開示されている。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は、感染性病原体により生成されるタンパク質に対する対象の免疫応答により生成される抗体であり、生体分子プローブは、その抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドである。Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、およびＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉを含むＥｈｒｌｉｃｈｉａ属の細菌に感染した動物の循環抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、米国特許第７，０８７，３７２号明細書；第７，４０７，７７０号明細書；第７，４４５，７８８号明細書；第７４４９，１９１号明細書；第７，８４２，４７３号明細書；第７，８８８，０５４号明細書；第８，９８０，２７４号明細書；第７，１８３，０６０号明細書；第７，７４４，８７２号明細書；第８，４０９，８１７号明細書；第９，８５０，２９５号明細書；第８，１５８，７５１号明細書、および第９，６０５，０３２号明細書に開示されている。Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｙｌｕｍおよびＡｎａｐｌａｓｍａ ｐｌａｔｙｓを含むＡｎａｐｌａｓｍａ属の細菌に感染した動物の循環抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、米国特許第６，９６４，８５５号明細書；第７，４３９，３２１号明細書；第８，３０３，９５９号明細書；第６，３０６，４０２号明細書；第６，２０４，２５２号明細書；第８，０９３，０８８号明細書、および第９，１２０，８５７号明細書に開示されている。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ属の細菌に感染した動物の循環抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、米国特許第６，７１９，９８３号明細書；第６，７４０，７４４号明細書；第６，４７５，４９２号明細書、および第６，６６０，２７４号明細書に開示されている。

一実施形態では、分析物は、ライム病を引き起こすＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより生成されるタンパク質に対する対象の応答から生じる抗体であり、生体分子プローブは、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより生成されるタンパク質またはタンパク質の一部である。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は代謝産物であり、生体分子プローブは、代謝産物に特異的に結合することが可能な抗体である。

一実施形態では、分析物は、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）である。ＳＤＭＡに特異的に結合する抗体は、米国特許第８，４８１，６９０号明細書に開示されている。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は、感染した対象の血液中に存在する病原体起源の抗原であり、生体分子プローブは、その抗原に対する抗体である。一実施形態では、分析物は、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）に由来する循環抗原に特異的に結合する抗体である。イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）に由来する循環抗原に特異的に結合する抗体は、米国特許第４，８３９，２７５号明細書に開示されている。

一実施形態では、生物学的アッセイ用の基材は、
（ｉ）シリコン／アルミニウムウェハを準備すること、
（ｉｉ）シリコン／アルミニウムウェハを、第１の溶媒に溶解した第１のエポキシ系樹脂の第１の溶液でコーティングして、第１のエポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハを準備すること、
（ｉｉｉ）第１のエポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハを加熱して、第１の溶媒の少なくとも部分を除去して、第１の固体エポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハを準備すること、
（ｉｖ）第１の固体エポキシ系樹脂コーティング上にニッケルバーコードを堆積させて、第１の固体エポキシ樹脂コーティングおよびニッケルバーコードを有するシリコン／アルミニウムウェハを準備すること、
（ｖ）ニッケルバーコードを、第２の溶媒に溶解した第２のエポキシ系樹脂の第２の溶液でコーティングして、第１のエポキシ系樹脂コーティングおよび第２のエポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハを準備すること、
（ｖｉ）第１の固体エポキシ系樹脂コーティングおよび第２のエポキシ系樹脂コーティングを有するシリコン／アルミニウムウェハを加熱して、第２の溶媒の少なくとも部分を除去して、第１の固体エポキシ系樹脂コーティングおよび第２の固体エポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハを準備することであり、
ニッケルバーコードは、第１の固体エポキシ系樹脂コーティングと第２の固体エポキシ系樹脂コーティングとの間に存在する、準備すること、
（ｖｉｉ）任意選択で、第１の固体エポキシ系樹脂コーティングおよび第２の固体エポキシ系樹脂コーティングの少なくとも部分を重合させて、第１の固体エポキシ系樹脂、ニッケルバーコード、および第２の固体エポキシ系樹脂コーティングで層化されたシリコン／アルミニウムウェハを準備し、第１の固体エポキシ系樹脂コーティングおよび第２の固体エポキシ系樹脂コーティングの少なくとも部分は重合されていること、
（ｖｉｉｉ）第１のエポキシ系樹脂コーティング、ニッケルバーコード、および第２のエポキシ系樹脂コーティングでコーティングされたシリコン／アルミニウムウェハからシリコン／アルミニウムウェハを分離して、バーコード付き磁気ビーズを準備すること、
（ｉｖ）生体分子がエポキシ系樹脂に直接結合するように、バーコード付き磁気ビーズを生体分子と接触させること
を含む方法により調製される。

一実施形態では、第１の溶媒に溶解した第１のエポキシ系樹脂の第１の溶液は、第２の溶媒に溶解した第２のエポキシ系樹脂の第２の溶液と同じである。

一実施形態では、シリコン／アルミニウムウェハを水酸化ナトリウムと接触させることにより、シリコン／アルミニウムウェハを、第１の固体エポキシ樹脂、ニッケルバーコード、および第２の固体エポキシ樹脂コーティングから分離する。

本発明は、試料中の分析物の存在をアッセイする方法をも対象とする。この方法は、エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブを有するエポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と試料を接触させることであって、生体分子プローブが、分析物に特異性をもって結合する、接触させること、を含む。

「分析物に特異性をもって結合する」、「特異的に結合する」、「特異性を有する」、「分析物に特異的な」という語句および類似の語句は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味、つまり、生体分子プローブが認識し、他の非特異的分子に結合するよりも高い親和性で分析物（または分析物のクラス）に結合することを意味する。例えば、抗原に対して生じ、他の非特異的分子よりも効率的にその抗原に結合する抗体は、その抗原に特異的に結合すると記述することができる。結合特異性は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロットアッセイなどの当技術分野で公知の方法を使用して試験することができる。

一実施形態では、試料は糞便試料である。一実施形態では、分析物は腸内寄生虫により生成されるタンパク質であり、生体分子プローブは腸内寄生虫により生成されるタンパク質に対する抗体である。一実施形態では、腸内寄生虫により生成されるタンパク質に対する抗体は、回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、イヌ糸状虫由来の抗原に特異的に結合する抗体、およびＧｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体からなる群から選択される。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は、感染性病原体により生成されるタンパク質に対する対象の免疫応答により生成される抗体であり、生体分子プローブは、その抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドである。

一実施形態では、分析物は、ライム病を引き起こすＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより生成されるタンパク質に対する対象の応答から生じる抗体であり、生体分子プローブは、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより生成されるタンパク質またはタンパク質の一部である。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は代謝産物であり、生体分子プローブは、代謝産物に特異的に結合することが可能な抗体である。一実施形態では、分析物は、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）である。

一実施形態では、試料は、対象からの血液試料であり、分析物は、感染した対象の血液中に存在する病原体起源の抗原であり、生体分子プローブは、その抗原に対する抗体である。一実施形態では、分析物は、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）に由来する循環抗原に特異的に結合する抗体である。

本発明は、本発明の幾つかの態様を説明することが意図されている実施例に開示されている特定の実施形態により範囲が限定されるものではなく、機能的に等価なあらゆる実施形態は本発明の範囲内にある。実際、当業者であれば、本明細書に図示および記載されているものに加えて、本発明に種々の改変があることは明らかであろう。またそのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。当業者の知識の範囲内であると考えられる現在公知であるかまたは後に開発されるすべての均等物の置換を含む本発明のそのような変形型、および配合の変更または実験設計の軽微な変更は、本明細書に組み込まれる本発明の範囲内に入るとみなされるべきである。

生体分子プローブとバーコード付き磁気ビーズとの受動的カップリング
バーコード付き磁気ビーズ（ＢＭＢ）は、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造される。モノクローナル抗体またはタンパク質などの生体分子プローブとＢＭＢとのカップリングは、以下の手順に従ってＢＭＢ表面に生体分子プローブを吸収させることにより達成した。

最終濃度が約０．１５～２．５ｍｇ／ｍＬ抗体（典型的には、約１．５ｍｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体の溶液を、約１００ｍＭ ＭＥＳ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）および約１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を含むｐＨが約５．５の水性緩衝液で、または約１００ｍＭ ＥＰＰＳ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）および約１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌを含むｐＨが約８の水性緩衝液で調製して、抗体コーティング溶液を得た。

十分な量のＢＭＢを、ＢＭＢ洗浄緩衝液（約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約１４５ｍＭ塩化ナトリウム（ＯＨ、ＳａｌｏｎのＡｍｒｅｓｃｏ ＬＬＣから市販されている）、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約ｐＨ７．４）に懸濁して、約１０万～１８０万個ＢＭＢ／ｍＬ（典型的には、抗体の場合は約１００万個／ｍＬ）の最終濃度を得た。ＢＭＢをＢＭＢ洗浄緩衝液で３回洗浄した。すべてのＢＭＢ洗浄（このステップおよびその後のステップの）は以下のように進めた。

まず、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にする。次いで、上清を注意深く吸引除去してから、ＢＭＢの元の懸濁物体積（約２００μＬ～約１，０００μＬ）とほぼ等しい体積の洗浄緩衝液にＢＭＢを再懸濁する。こうしたステップを合計３回繰り返して、ＢＭＢペレットを得る。

ＢＭＢを洗浄緩衝液で洗浄した後、元の懸濁物体積とほぼ等しい体積のＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）でＢＭＢを３回洗浄して、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢのペレットを得た。

コーティング反応：ＤＭＳＯ洗浄後、抗体コーティング溶液（最終濃度が約１．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢ（最終濃度が約１００万個ＢＭＢ／ｍＬ）と直ちに一緒にし、混合しながら室温（１８～２７℃）で４～１８時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、抗体カップリングＢＭＢを、アッセイ緩衝液（約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、および約１４５ｍＭ塩化ナトリウム（ＯＨ、ＳａｌｏｎのＡｍｒｅｓｃｏ ＬＬＣから市販されている）中の、約１％ＢＳＡ（ＩＡ、ＡｎｋｅｎｙのＰｒｏｌｉａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから市販されている）、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、および約０．０５％プロクリン９５０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、約ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

次いで、抗体カップリングＢＭＢを、アッセイで使用するための所望の最終濃度でアッセイ緩衝液に懸濁する。

チオール基を介した生体分子プローブとバーコード付き磁気ビーズとのカップリング
チオール基を含むモノクローナル抗体またはタンパク質などの生体分子プローブと、エポキシ系樹脂でコーティングされたバーコード付き磁気ビーズ（ＢＭＢ）とのカップリングは、以下の手順に従って生体分子プローブをＢＭＢ表面に吸収させることにより達成される。

約１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を含むＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）中の最終ペプチド濃度が約０．０２～約１ｍＭ（典型的には、約０．１ｍＭ）のペプチド溶液を調製して、ペプチドコーティング溶液を得た。この実施例に使用したペプチドは、アセチル化－Ｃｙｓ（ｄＰＥＧ１２）［ペプチド］－アミドであり、このペプチドは２５個アミノ酸残基のオリゴペプチドであり、ｄＰＥＧ１２はディスクリートＰＥＧ１２である。アセチル化－Ｃｙｓ（ｄＰＥＧ１２）［ペプチド］－アミドは、ＭＡ、ＧａｒｄｎｅｒのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅから特注合成物として提供された。

本方法での使用に好適なＢＭＢは、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造されたＢＭＢである。

約１０万～３００万個ＢＭＢ／ｍＬ（典型的には、約２００万個／ｍＬ）の最終濃度を下に記載のコーティング反応に提供するのに十分な量のＢＭＢを、約２００μＬ～約１，０００μＬの体積のＢＭＢ洗浄緩衝液（ＤＭＳＯ中約１％Ｔｗｅｅｎ－２０）に懸濁した。ＢＭＢを、下に記載のようにＤＭＳＯ中約１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。すべてのＢＭＢ洗浄（このステップおよびその後のステップの）は以下のように進めた。

まず、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にした。上清を注意深く吸引除去してから、ＢＭＢの元の懸濁物体積とほぼ等しい体積の洗浄緩衝液にＢＭＢを再懸濁した。こうしたステップを合計３回繰り返して、ＢＭＢペレットを得た。

ＢＭＢを洗浄緩衝液で洗浄したら直ぐに、洗浄ＢＭＢをペプチドコーティング溶液と一緒にし、混合しながら室温（１８～２７℃）で約４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、ペプチドカップリングＢＭＢを、一定体積のアッセイ緩衝液（約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、および約１４５ｍＭ塩化ナトリウム中の約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および約０．０５％プロクリン９５０、約ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

次いで、抗体カップリングＢＭＢを、アッセイで使用するための所望の最終濃度でアッセイ緩衝液に懸濁する。

還元ジスルフィド連結システインから生成されるチオール基を介した生体分子プローブとバーコード付き磁気ビーズとのカップリング
モノクローナル抗体などの巨大分子は、モノクローナル抗体を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元試薬と反応させて、ジスルフィド連結システイン側鎖がＢＭＢの表面への結合に接近可能になるようにジスルフィド連結システイン側鎖を還元することにより、チオール基を介してカップリングすることができる。

還元抗体をＢＭＢのエポキシ基に共有結合でカップリングするために、抗体を還元緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、７５ｍＭ塩化ナトリウム（ＯＨ、ＳａｌｏｎのＡｍｒｅｓｃｏ ＬＬＣから市販されている）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、および５ｍＭ ＤＴＴ（ＭＡ、ＷａｌｔｈａｍのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）、約ｐＨ約７．４）で約５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈することにより、還元抗体コーティング溶液を調製した。得られた溶液を１８～２７℃で約０．５時間インキュベートした。

還元後、還元抗体を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）、７５ｍＭ塩化ナトリウム（ＯＨ、ＳａｌｏｎのＡｍｒｅｓｃｏから市販されている）、および２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を含むｐＨが約７．４の溶液へと、Ｇ２５ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＡ、ＷａｌｔｈａｍのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を製造業者の説明書に従って使用して交換した。抗体溶液を約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、得られた溶液を、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢに直ちに添加した。

ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢを、まず、約１０～１８０万個ＢＭＢ／ｍＬ（典型的には、抗体の場合は約１００万個／ｍＬ）の最終濃度を下に記載のコーティング反応に提供するのに十分な量のＢＭＢを、約２００μＬ～約１，０００μＬの体積の洗浄緩衝液（約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約ｐＨ７．４）に懸濁することにより調製した。ＢＭＢを、下に記載のように洗浄緩衝液で３回洗浄した。

すべてのＢＭＢ洗浄（このステップおよびその後のステップ）は以下の通りに進めた：まず、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にする。次いで、上清を注意深く吸引除去してから、ＢＭＢの懸濁に使用した元の体積とほぼ等しい体積の洗浄緩衝液にＢＭＢを再懸濁する。こうしたステップを３回繰り返して、ＢＭＢペレットを得る。

ＢＭＢを洗浄緩衝液で洗浄した後、元の懸濁物体積とほぼ等しい体積のＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）でＢＭＢを３回洗浄して、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢのペレットを得た。次いで、ＢＭＢを元の懸濁物体積とほぼ等しい体積のＤＭＳＯに懸濁し、混合しながら１８～２７℃で約４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にした。次いで、上清を注意深く吸引除去して、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢペレットを得た。

本方法での使用に好適なＢＭＢは、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造されたＢＭＢである。

ＤＭＳＯ洗浄後、抗体コーティング溶液（最終濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＳＯで洗浄されたＢＭＢ（最終濃度が約１００万個ＢＭＢ／ｍＬ）と直ちに一緒にし、混合しながら室温（１８～２７℃）で約１８時間インキュベートした。

インキュベーションが完了した後、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にした。次いで、上清を注意深く吸引除去し、ＢＭＢを、元の懸濁物体積とほぼ等しい体積の洗浄緩衝液（約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｍＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－、約ｐＨ７．４）に再懸濁し、得られた溶液を１８～２７℃で約１５分間インキュベートした。

インキュベーションが完了した後、ＢＭＢを含むチューブを磁気スタンドに置き、１～１０分間にわたってＢＭＢが磁石に接着することを可能にした。次いで、上清を注意深く吸引除去し、ＢＭＢを、元の懸濁物体積とほぼ等しい体積のアッセイ緩衝液に再懸濁した。アッセイ緩衝液：ｐＨが７．４の約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、および約１４５ｎＭ塩化ナトリウム中の、約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および約０．０５％プロクリン９５０。得られた懸濁物を、混合しながら１８～２７℃で約３０分間インキュベートした。次いで、抗体カップリングＢＭＢを、元の懸濁物体積とほぼ等しい体積のアッセイ緩衝液で３回洗浄した。

次いで、抗体カップリングＢＭＢを、アッセイで使用するための最終所望濃度でアッセイ緩衝液に懸濁した。

ローダミンとバーコード付き磁気ビーズとのカップリング：
物質：

ＢＭＢのＤＭＳＯ洗浄：
磁気ラック上の１ｍＬ遠心分離チューブに、保管緩衝液に懸濁した０．５ｍＬのＢＭＢを添加して、１００，０００個ＢＭＢ／ｍＬの濃度を得た。

本方法での使用に好適なＢＭＢは、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造されたＢＭＢである。ＢＭＢを、塩化ナトリウム（０．８％）、塩化カリウム（０．０２％）、リン酸水素二ナトリウム（０．１４４％）、リン酸二水素カリウム（０．０２４％）、Ｔｗｅｅｎ－２０（０．０５％）、およびプロクリン－９５０（０．１％）を含む保管緩衝液中に準備する。

液体をピペットで遠心分離チューブの各々から除去し、次いで約０．５ｍＬのＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を各チューブに添加した。チューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁気ラックに戻し、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。次いで、約０．５ｍＬのＤＭＳＯを各チューブに添加し、チューブを激しくボルテックスし、室温で４時間ミキサー上に置いておいた。

ローダミン－リサミンによるコーティング：
４時間混合した後、チューブを取り出して磁石スタンドに置き、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去し、約０．５ｍＬの約１５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液、約ｐＨ９．０をチューブに添加した。次いで、ＥＰＰＳ緩衝液中にＢＭＢを含むチューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁石スタンドに戻し、ＥＰＰＳ緩衝液をピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。洗浄が完了した後、約０．５ｍＬのＥＰＰＳ緩衝液を各チューブに添加し、チューブをボルテックスした。次いで、約１０．０μＭローダミン－リサミン（ＤＭＳＯ中０．３ｍｇ／ｍＬ溶液９μＬ）またはスルホ－ローダミン（対照、ＤＭＳＯ中２．８ｍｇ／ｍＬ溶液１．２μＬ）をＥＰＰＳ緩衝液中のエポキシ系ＢＭＢに添加した。ＢＭＢの懸濁物を、室温で約２２時間にわたって逆さまに回転させ、光から保護した。この時間の後、コーティングされたＢＭＢを磁気スタンドに置き、溶媒をピペットで除去した。コーティングされたＢＭＢを、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約１．０ｍＬの溶液を用いて短時間ボルテックスして洗浄し、続いて溶媒を除去した。このプロセスを５回繰り返した。最後に、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約１．０ｍＬの溶液を、コーティングされたＢＭＢに添加して、約５０，０００個ＢＭＢ／ｍＬの最終濃度を得た。次いで、得られた懸濁物中の約５．０μＬのＢＭＢを、９６ウェルプレートのウェルに添加して、最終計数を約２５０個ＢＭＢ／ウェルにした。約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約２００μＬの溶液を各ウェルに添加して、アッセイで使用するためのＢＭＢの懸濁物を得た。

各ウェルの蛍光を、マイクロプレートリーダー（市販のリーダー、ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定した。

ローダミン－リサミンでコーティングされたエポキシＢＭＢは、マイクロプレートリーダーにおいて顕著な蛍光を示し、ローダミンプローブがエポキシ系ＢＭＢ表面に効率的にコーティングされたことを示した。反応性アミン官能基を有していないスルホ－ローダミン対照と共にインキュベートしたエポキシ系ＢＭＢは、観察可能な蛍光を一切示さなかった。これは、エポキシ系ＢＭＢ表面へのローダミンプローブの非特異的結合が非常に低いことを実証しており、ローダミン－リサミンが、第一級アミン官能基を介してエポキシ系表面と特異的に反応していることを示す。アミン官能化小分子は、エポキシ系ＢＭＢ表面に共有結合で結合させることが可能であると結論付けることができる。

アミン含有ペプチドとバーコード付き磁気ビーズとのカップリング：
物質：

ＢＭＢのＤＭＳＯ洗浄：
磁気ラック上の１ｍＬ遠心分離チューブに、保管緩衝液に懸濁した約０．２ｍＬのＢＭＢを添加して、１００，０００個ＢＭＢ／ｍＬの濃度を得た。

本方法での使用に好適なＢＭＢは、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造されたＢＭＢである。ＢＭＢは、塩化ナトリウム（０．８％）、塩化カリウム（０．０２％）、リン酸水素二ナトリウム（０．１４４％）、リン酸二水素カリウム（０．０２４％）、Ｔｗｅｅｎ－２０（０．０５％）、およびプロクリン－９５０（０．１％）を含む保管緩衝液中に準備する。

液体をピペットで遠心分離チューブの各々から除去し、次いで約０．２ｍＬのＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を各チューブに添加した。チューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁気ラックに戻し、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。次いで、約０．２ｍＬのＤＭＳＯを各チューブに添加し、チューブを激しくボルテックスし、室温で４時間ミキサー上に置いておいた。

４時間混合した後、チューブを取り出して磁石スタンドに置き、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去し、約０．２ｍＬの約１５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液、約ｐＨ９．０をチューブに添加した。次いで、ＥＰＰＳ緩衝液中にＢＭＢを含むチューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁石スタンドに戻し、ＥＰＰＳ緩衝液をピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。

ビオチン－ライムペプチドおよびライム－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５の両方の約０．１ｍＭ溶液を、１．０ｍＭストック溶液から調製した。各ペプチドは複数のリジン残基を有するが、システイン残基または他のチオール基を有しない。約２００μＬのビオチン－ライムペプチド溶液、ライム－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５溶液、またはＥＰＰＳ緩衝液のみを含む対照を、ＢＭＢを含むチューブに添加した。得られたＢＭＢ懸濁物を、室温で約２時間にわたって逆さまに回転させ、光から保護した。この時間の後、ＢＭＢを含むチューブを磁気ラックに置き、溶媒をピペットで除去した。次いで、ＢＭＢを、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約０．２ｍＬの溶液を用いて短時間ボルテックスして洗浄し、続いて溶媒を除去した。このプロセスを２回繰り返した。

約２００μＬのＳＡ－ＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリトリン）含有溶液（８μｇ／ｍＬ ＳＡ－ＰＥ、ＳＡ－ＰＥ（ＭＤ、ＰａｓａｄｅｎａのＭｏｓｓ Ｉｎｃ．から１ｍｇ／ｍＬ溶液として市販されている）をマルチプレックスアッセイ緩衝液：１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、１４５ｎＭ塩化ナトリウム、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、１％ウシ血清アルブミン、０．０５％プロクリン９５０で希釈することにより得た）をＢＭＢに添加し、ビーズを約１０分間インキュベートした。インキュベーション後、上清を除去し、ＢＭＢを、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約ｐＨ７．４の約０．２ｍＬの溶液を用いて短時間ボルテックスして洗浄し、続いて溶媒を除去した。このプロセスを５回繰り返した。最後に、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、約ｐＨ７．４の約０．４ｍＬの溶液を、コーティングされたＢＭＢに添加して、約５０，０００個ＢＭＢ／ｍＬの最終濃度を得た。５．０μＬの得られたＢＭＢ懸濁物を９６ウェルプレートのウェルに添加して、最終計数を約２５０個ＢＭＢ／ウェルとし、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約２００μＬの溶液を各ウェルに添加して、アッセイで使用するためのＢＭＢ懸濁物を得た。

各ウェルの蛍光を、マイクロプレートリーダー（市販のリーダー、ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定した。

ビオチン－ライムペプチドおよびライム－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５ペプチドでコーティングされたＢＭＢは両方とも、マイクロプレートリーダーにおいて顕著な蛍光を示し、ペプチドがＢＭＢ表面に効率的にコーティングされたことを示した。対照で観察された蛍光の欠如は、ＳＡ－ＰＥ分析物のＢＭＢ表面への非特異的結合が非常に低いことを実証しており、ビオチン－ライムペプチドおよびライム－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５ペプチドが、ペプチドのリジン残基に含まれる第一級アミン官能基を介してエポキシ表面と特異的に反応することを示す。リジン（アミン官能基）含有ペプチドを、エポキシＢＭＢ表面に共有結合で結合させることが可能であると結論付けることができる。

クエン酸緩衝液洗浄後のバーコード付き磁気ビーズを使用したアッセイ：
生体分子プローブとバーコード付き磁気ビーズとのカップリング
磁気ラック上の１ｍＬ遠心分離チューブに、保管緩衝液に懸濁した約０．２ｍＬ（体積は、約０．１ｍＬから約５００ｍＬまで変化させることができる）のＢＭＢを添加して、約１００，０００個ＢＭＢ／ｍＬの濃度を得た（濃度は、１００，０００個ＢＭＢ／ｍＬ～約３００万個ＢＭＢ／ｍＬの範囲であってもよい）。

本方法での使用に好適なＢＭＢは、エポキシ系ネガ型フォトレジストであるＳＵ－８（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）から製造されたＢＭＢである。ＢＭＢは、塩化ナトリウム（０．８％）、塩化カリウム（０．０２％）、リン酸水素二ナトリウム（０．１４４％）、リン酸二水素カリウム（０．０２４％）、Ｔｗｅｅｎ－２０（０．０５％）、およびプロクリン－９５０（０．１％）を含む保管緩衝液中に準備する。

液体をピペットで遠心分離チューブの各々から除去し、次いで約０．２ｍＬのＤＭＳＯ（ＭＯ、Ｓｔ． ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を各チューブに添加した。チューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁気ラックに戻し、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。一実施形態では、次いで、約０．２ｍＬのＤＭＳＯを各チューブに添加し、チューブを激しくボルテックスし、室温で４時間ミキサー上に置いておいた。この室温での４時間の混合は任意選択である。

混合後、チューブを取り出して磁石スタンドに置き、１分間静置し、ＤＭＳＯをピペットで除去し、約０．２ｍＬの約１５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液、約ｐＨ９．０をチューブに添加した。次いで、ＥＰＰＳ緩衝液中にＢＭＢを含むチューブを１０秒間激しくボルテックスし、磁石スタンドに戻し、ＥＰＰＳ緩衝液をピペットで除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。ＥＰＰＳで最終洗浄した後、ＢＭＢを、下のパート（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ記載のようにペプチドまたは抗体でコーティングし、各ペプチドおよび抗体を、異なるバーコードのＢＭＢと一緒にした。

（Ａ）ペプチドによるＢＭＢのコーティング
Ａｎａｐｌａｓｍａ属、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、またはＢｏｒｒｅｌｉａ属に対する患者抗体に特異的に結合可能なペプチド（生化学的プローブ）（例えば、上に記載のＡｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｙｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｌａｔｙｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、またはＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのタンパク質配列に由来するペプチド）は、Ｎ末端システインを有するがＰＥＧリンカーを有しないＢｏｒｒｅｌｉａ属由来のペプチドを除いて、上に記載のようにＰＥＧ１２リンカーを介して各ペプチドのＮ末端にシステインを連結させたものを合成した。約２００μＬの各ペプチドの約０．１ｍＭ溶液を、ＥＰＰＳ洗浄ＢＭＢを含むチューブに添加した。得られたＢＭＢ懸濁物を、室温で約２時間にわたって逆さまに回転させ、光から保護した。この時間の後、ＢＭＢを含むチューブを磁気ラックに置き、溶媒をピペットで除去した。次いで、ＢＭＢを、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約０．２ｍＬの溶液を用いて短時間ボルテックスして洗浄し、続いて溶媒を除去した。このプロセスを２回繰り返した。

（Ｂ）抗体によるＢＭＢのコーティング
感染動物の血液中を循環している、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）由来の抗原に特異的に結合可能な、およそ１０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体（生化学プローブ）約２００μＬ（抗体濃度は、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約１２．０ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい）を、上に記載のように、ＢＭＢを含むチューブに添加した。得られたＢＭＢ懸濁物を、室温で約２時間にわたって逆さまに回転させ、光から保護した。この時間の後、ＢＭＢを含むチューブを磁気ラックに置き、溶媒をピペットで除去した。次いで、ＢＭＢを、約１．８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、約８．４ｍＭリン酸一水素ナトリウム、約１４５ｎＭ塩化ナトリウム、および約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０の約０．２ｍＬの溶液を用いて短時間ボルテックスして洗浄し、続いて溶媒を除去した。このプロセスを２回繰り返した。

アッセイ：
上記の（Ａ）または（Ｂ）に記載の生体分子プローブでコーティングされたＢＭＢ（アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中１．０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、０．０５％プロクリン９５０）中６５，０００個ＢＭＢ／ｍＬ）を混合して、マルチプレックスＢＭＢ混合物を構築した。マルチプレックスＢＭＢ混合物をアッセイ緩衝液でさらに希釈して、５００個ＢＭＢ／ｍＬの各生体分子プローブの濃度を達成した。

約１００μＬのこの希釈マルチプレックスＢＭＢ混合物を、Ｉｎｔｅｇｒａ自動ピペット（ＮＨ、ＨｕｄｓｏｎのＩｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．から市販されている）を使用して、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（つまり、１生体分子プローブ当たり約５０個のビーズ）。ＢＭＢを、３００μＬのＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０に１０秒間浸漬し、４０５－ＴＳプレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴから市販されている）を用いて５回洗浄した。最終洗浄後、過剰な上清（およそ３０μＬ）をプレートに残した。

５０μＬの試料（血清または血漿、ニート）を、９６ウェルプレートの各ウェルのＢＭＢに添加した。次いで、プレートをプレートミキサー上に置き、１０００ｒｐｍで３０分間混合した。３０分間インキュベーションした後、ＢＭＢを、３００μＬのＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０に１０秒間浸漬して洗浄した。

ＰＢＳ中１．０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、０．０５％プロクリン９５０中の各ビオチン化ペプチド（２．０μｇ／ｍＬ、つまり、生体分子プローブとして使用したものと同じペプチド）またはビオチン化抗イヌ糸状虫抗体（１．０μｇ／ｍＬ）の５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、プレートをプレートミキサー上に置き、１５分間混合した。１５分間インキュベーションした後、ＢＭＢを、３００μＬのＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０に１０秒間浸漬して洗浄した。

５０μＬのＳＡ－ＰＥ、８．０μｇ／ｍＬ（ＭＯＳＳ Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤから市販されている。カタログ番号ＳＡＰＥＲＰ０１）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、プレートをプレートミキサー上に置き、１０分間混合した。１０分間インキュベーションした後、ＢＭＢを、３００μＬのＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０に１０秒間浸漬して洗浄した。

次いで、得られたＢＭＢを、２つの手順のいずれかで処理した。

第１の手順では、９６ウェルプレートの各ウェルに、
（ｉ）約２００μＬの緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＡから市販されている。カタログ番号４４－Ｄ０００４－５００）（標準読取り緩衝液）
を添加した。

第２の手順では、９６ウェルプレートの各ウェルに、
（ｉｉ）クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物（０．４８５Ｍ）、クエン酸（０．０１５Ｍ）、塩化ナトリウム（０．１Ｍ）、プロクリン９５０（０．５ｍＬ／Ｌ）を含むクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．１～６．３の溶液約２００μＬ（クエン酸塩読取り緩衝液）。
を添加した。

イオン強度は、ビーズの表面に形成される免疫複合体の安定性を可能にする重要な要因である。理論に束縛されるものではないが、安定化効果は、溶液を解離にとって不利なものにする高塩濃度によるものであると考えられる。クエン酸塩以外の高イオン強度の塩も有効であるが、最低濃度は約０．５Ｍであることが必要である。しかしながら、他の塩は、周囲温度より低い温度で溶液から析出するため、製造または輸送には理想的ではない。有利には、クエン酸塩緩衝液の混合物は、冷蔵条件で保管または輸送しても溶液中に溶解したままである。

各ウェルの蛍光を、ＢｉｏＣｏｄｅ（登録商標）２５００アナライザー（ＣＡ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ ＳｐｒｉｎｇｓのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＣｏｄｅ Ｃｏｒｐ．から市販されている）を使用して決定した。

９６ウェルプレート（つまり、１２縦列（１～１２）および８横列（Ａ～Ｈ）を有するプレート）の各ウェルにおける各試料の蛍光強度を決定した。図１は、標準読取り緩衝液を使用した場合（図１Ａ）およびクエン酸塩読取り緩衝液を使用した場合（図１Ｂ）に観察されたシグナル強度を示す。実験では、９６ウェルプレート（つまり、１２縦列（１～１２）および８横列（Ａ～Ｈ）を有するプレート）の各ウェルに、同一のＢＭＢ（つまり、上に記載のように、すべてがビーズに結合）を満たし、シグナルを縦列１（つまり、ウェル１Ａ～１Ｈ）から縦列１２（つまり、ウェル１２Ａ～１２Ｈ）まで読み取った。９６ウェルプレートのすべてのセル（つまり、セル１Ａ～１２Ｈ）の蛍光を読み取る時間は、およそ３７分間かかる。図１Ａから理解できるように、標準読取り緩衝液（クエン酸塩を含まない緩衝液）を使用する場合、つまり手順（ｉ）の場合、読取りサイクルを開始してから読取りサイクルを終了するまで（およそ３７分間）、シグナル強度が徐々に減少する。対照的に、図１Ｂから理解できるように、クエン酸塩読取り緩衝液を使用する場合、つまり手順（ｉｉ）の場合、読取りサイクルが開始してから読取りサイクルが終了するまで（約３７分間）、シグナル強度の低下は観察されなかった。このシグナル強度の減少は、図１Ａおよび図１ＢのＸ軸に「ＡＰ」、「Ａｐｈ」、および「Ａｐｌ」と表記されている３つのＡｎａｐｌａｓｍａ属由来ペプチドの各々に特異的な抗体のアッセイでは、標準読取り緩衝液などのクエン酸塩非含有緩衝液を使用した場合に読取りサイクル中に生じたが、クエン酸塩読取り緩衝液などのクエン酸塩含有緩衝液を使用した場合には生じなかった。

図１は、蛍光を読み取る前にＢＭＢをクエン酸塩緩衝液と接触させると、有利なことに、他の緩衝液と比較して時間の関数としての蛍光減少が回避されることを示している。

Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉに由来するペプチドに特異的な抗体のアッセイにおいて、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのアッセイにおいて（非表示）、時間の関数としてのシグナル強度に対する標準読取り緩衝液およびクエン酸塩読取り緩衝液の効果は同様であることが観察された。

引用されたすべての参考文献の開示は全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (62)

1. 生物学的分析用の基材を製作する方法であって、
   （ｉ）エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備すること、および
   （ｉｉ）前記生体分子プローブが前記エポキシ系樹脂に直接結合するように、前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と生体分子プローブを接触させること
   を含む方法。
2. 前記生体分子プローブは、脂質、多糖、アミノ酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、抗体およびそれらの断片、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ならびにポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記生体分子プローブは抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材は、薄膜、マイクロビーズ、マイクロ粒子、マイクロペレット、マイクロウェハ、常磁性ビーズ、バーコードを含むマイクロ粒子、常磁性マイクロ粒子、バーコードを含むマイクロ粒子、バーコードを含む常磁性マイクロ粒子、およびニッケルバーコードを含むビーズからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、前記生体分子プローブの溶液と接触させて接触混合物を準備することにより、前記生体分子プローブが前記エポキシ系樹脂と接触させられる、請求項１に記載の方法。
6. 前記溶液は水溶液である、請求項５に記載の方法。
7. 前記水溶液は、約１００ｍＭ ＭＥＳおよび約１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ５．５に緩衝化されている、請求項６に記載の方法。
8. 前記水溶液は、約１００ｍＭ ＥＰＰＳおよび約１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ８に緩衝化されている、請求項６に記載の方法。
9. 前記溶液はＤＭＳＯ溶液である、請求項５に記載の方法。
10. 前記ＤＭＳＯ溶液は、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記溶液中の前記生体分子プローブの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項５に記載の方法。
12. 前記接触混合物中の前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材の濃度は、約５万～約５００万個基材／ｍＬの範囲である、請求項５に記載の方法。
13. 前記生体分子プローブが、前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と少なくとも約４時間接触させられる、請求項１に記載の方法。
14. 前記生体分子プローブが、前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と約４時間～約１８時間接触させられる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記接触混合物は、約１５℃～約３０℃の温度に維持される、請求項５に記載の方法。
16. 前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材が、前記生体分子プローブと接触させられる前に、ＤＭＳＯで洗浄される、請求項１に記載の方法。
17. 前記ＤＭＳＯは、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１に記載の方法により調製された生物学的分析用の基材。
19. エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブを有する前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を含む生物学的分析用の基材。
20. 生物学的分析用の基材を製作する方法であって、
    （ｉ）（ａ）約１００ｍＭ ＭＥＳおよび約１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ５．５に緩衝化された水溶液、ならびに（ｂ）約１００ｍＭ ＥＰＰＳおよび１４０ｍＭグアニジン－ＨＣｌで約ｐＨ８に緩衝化された水溶液からなる群から選択される溶媒で生体分子プローブの溶液を準備することであり、
    前記生体分子プローブの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲である、準備すること、
    （ｉｉ）エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備すること、
    （ｉｉｉ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で洗浄して、エポキシ系樹脂を含む表面を有するＰＢＳで洗浄された基材を準備すること、
    （ｉｖ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有するＰＢＳで洗浄された基材をＤＭＳＯで洗浄して、エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材を準備すること、
    （ｖ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材を、前記生体分子プローブの前記溶液と一緒にすることであり、前記エポキシ系樹脂に前記生体分子プローブが直接結合される、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備し、前記エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材の濃度は、約５万～約５００万個基材／ｍＬの範囲である、一緒にすること、ならびに
    （ｖｉ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を洗浄することであり、前記生体分子プローブが約１％ＢＳＡ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および約０．０５％プロクリン９５０を含むｐＨが約７．４のＰＢＳを伴う前記エポキシ系樹脂に直接結合される、洗浄すること
    を含む方法。
21. 前記生体分子プローブは抗体である、請求項２０に記載の方法。
22. 生物学的分析用の基材を製作するための方法であって、
    （ｉ）約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＭＳＯで生体分子プローブの溶液を準備することであり、
    前記生体分子プローブの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲である、準備すること、
    （ｉｉ）エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備すること、
    （ｉｉｉ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を、約１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＭＳＯで洗浄して、エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材を準備すること、
    （ｉｖ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材を、前記生体分子プローブの前記溶液と一緒にすることであり、前記エポキシ系樹脂に前記生体分子プローブが直接結合される、エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を準備し、前記エポキシ系樹脂を含む表面を有するＤＭＳＯで洗浄された基材の濃度は、約５万～約５００万個基材／ｍＬの範囲である、一緒にすること、ならびに
    （ｖ）前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材を洗浄することであり、前記生体分子プローブが約１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．０５％プロクリン９５０を含むｐＨが約７．４のＰＢＳを伴う前記エポキシ系樹脂に直接結合される、洗浄すること
    を含む方法。
23. 前記生体分子プローブはシステイン残基を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記抗体は、回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、イヌ糸状虫由来の抗原に特異的に結合する抗体、およびＧｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
25. 前記抗体は、回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、イヌ糸状虫由来の抗原に特異的に結合する抗体、およびＧｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
26. 前記生体分子プローブは、感染性病原体により発現されるタンパク質、前記感染性病原体により発現される前記タンパク質の一部、感染性病原体により発現されるタンパク質に由来するペプチドもしくは組換えタンパク質、または前記感染性病原体により発現される前記タンパク質の変異体である、請求項２に記載の方法。
27. 前記生体分子プローブは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、Ａｎａｐｌａｓｍａ属、およびＢｏｒｒｅｌｉａ属からなる群から選択される属の細菌に対して対象により生成される抗体に特異的に結合することができる、請求項２８に記載の方法。
28. 前記生体分子プローブは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｙｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｌａｔｙｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからなる群から選択される細菌に対して前記対象により生成される抗体に特異的に結合することができる、請求項２９に記載の方法。
29. 前記生体分子プローブは、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓに対して対象により生成される抗体と特異的に結合することができる、請求項２８に記載の方法。
30. 前記生体分子プローブは、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓの抗原に特異的に結合することができる抗体である、請求項３に記載の方法。
31. 前記生体分子プローブは、代謝産物に対する抗体に特異的に結合することができる、請求項２８に記載の方法。
32. 前記代謝産物はＳＤＭＡである、請求項３３に記載の方法。
33. 試料中の分析物の存在をアッセイするための方法であって、エポキシ系樹脂に直接結合された生体分子プローブを有する前記エポキシ系樹脂を含む表面を有する基材と前記試料を接触させることであり、前記生体分子プローブは、前記分析物に特異性をもって結合する、接触させること、を含む、方法。
34. 前記試料は糞便試料である、請求項３５に記載の方法。
35. 前記分析物は、腸内寄生虫により発現される抗原であり、前記生体分子プローブは、前記腸内寄生虫により生成される前記抗原に対する抗体である、請求項３５に記載の方法。
36. 前記腸内寄生虫により生成される前記抗原に対する前記抗体は、回虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鞭虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、鉤虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、条虫由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体、イヌ糸状虫由来の抗原に特異的に結合する抗体、およびＧｉａｒｄｉａ由来の糞便内抗原に特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
37. 前記試料は、対象からの血液試料である、請求項３５に記載の方法。
38. 前記分析物は、感染性病原体により生成されるタンパク質に対する対象の免疫応答により生成される抗体であり、前記生体分子プローブは、前記感染性病原体により生成される前記タンパク質、前記タンパク質の一部、または前記感染性病原体により生成される前記タンパク質の変異体である、請求項３５に記載の方法。
39. 前記生体分子プローブは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、Ａｎａｐｌａｓｍａ属、およびＢｏｒｒｅｌｉａ属から選択される群からの細菌に対して前記対象により生成される抗体に特異的に結合することができる、請求項４０に記載の方法。
40. 前記生体分子プローブは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｙｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｌａｔｙｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉから選択される群からの細菌に対して前記対象により生成される抗体に特異的に結合することができる、請求項４１に記載の方法。
41. 前記生体分子プローブは、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓに対して前記対象により生成される抗体に特異的に結合することができる、請求項４０に記載の方法。
42. 前記生体分子プローブは、代謝産物に対する抗体に特異的に結合することができる、請求項４０に記載の方法。
43. 前記代謝産物はＳＤＭＡである、請求項４４に記載の方法。
44. 分析物は、病原体起源の抗原、前記抗原の断片、または前記病原体起源の抗原の変異体であり、前記生体分子プローブは、前記抗原に特異的な抗体である、請求項３９に記載の方法。
45. 前記病原体はＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓである、請求項４６に記載の方法。
46. 試料中の分析物の存在をアッセイする方法であって、
    （ａ）前記分析物と生化学プローブとの複合体を第１の緩衝溶液中で形成することであり、前記複合体がシグナルをもたらす、形成すること、
    （ｂ）前記第１の緩衝溶液を第２の緩衝溶液に置き換えること、および
    （ｃ）前記シグナルの強度を読み取ること
    を含む方法。
47. 前記第１の緩衝溶液は第１のイオン強度を有し、前記第２の緩衝溶液は第２のイオン強度を有し、前記第２のイオン強度は前記第１のイオン強度よりも高い、請求項４８に記載の方法。
48. 前記第２のイオン強度は、少なくとも０．４Ｍである、請求項４９に記載の方法。
49. 前記第２のイオン強度は、少なくとも０．５Ｍである、請求項４９に記載の方法。
50. 前記第２のイオン強度は、少なくとも０．６Ｍである、請求項４９に記載の方法。
51. 第２の緩衝液はクエン酸塩緩衝液である、請求項４８に記載の方法。
52. 前記クエン酸塩緩衝液は、少なくとも０．５Ｍのイオン強度を有する、請求項５３に記載の方法。
53. 前記クエン酸塩緩衝液は、クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物、クエン酸、塩化ナトリウム、プロクリン９５０を含み、約５．５～約７．０の範囲のｐＨを有する、請求項５３に記載の方法。
54. 前記ｐＨは、約ｐＨ６．０～約６．５の範囲である、請求項５５に記載の方法。
55. 前記ｐＨは、約ｐＨ６．１～約６．３の範囲である、請求項５６に記載の方法。
56. クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物の濃度は約０．４８５Ｍであり、クエン酸の濃度は約０．０１５Ｍであり、塩化ナトリウムの濃度は約０．１Ｍであり、プロクリン９５０の濃度は約０．５ｍＬ／Ｌである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記分析物は、Ａｎａｐｌａｓｍａ属、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、またはＢｏｒｒｅｌｉａ属のタンパク質配列に由来するペプチドである、請求項４８に記載の方法。
58. 前記ペプチドは、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｙｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｌａｔｙｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、またはＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのタンパク質配列に由来するペプチドである、請求項５７に記載の方法。
59. 前記分析物が、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）由来の抗原に特異的に結合することが可能な抗体である、請求項４８に記載の方法。
60. 生体分子プローブは、エポキシ系樹脂に結合されている、請求項４８に記載の方法。
61. 前記生化学プローブはポリペプチドまたはタンパク質であり、前記分析物は、前記生化学プローブに特異的に結合可能な抗体であり、前記試料は、患者から得られる、請求項４８に記載の方法。
62. 前記生化学プローブは抗体であり、前記分析物は、前記生化学プローブに特異的に結合可能な抗原であり、前記試料は、患者から得られる、請求項４８に記載の方法。