KR20230154223A - 에폭시-기반 수지에 부착된 생화학적 프로브 - Google Patents

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KR20230154223A
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알렉시에 보리스 슈베츠
대린 레이턴 램스델
미셸 엠. 스트라우브
예라밀리 브이.에스.엔. 무르티
필립 쉘던 스미스
앤 캐서린 피츠패트릭
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아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 생물학적 및 화학적 검정을 수행하기 위한 고체 기재의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고체 기재에 관한 것이다.

Description

에폭시-기반 수지에 부착된 생화학적 프로브
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 미국 가출원 번호 63/288,018호 및 미국 가출원 번호 63/155,472호의 이익을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본원에 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
[0002] 해당사항 없음.
컴팩트 디스크에 제출된 자료의 참조에 의한 통합
[0003] 해당사항 없음.
발명의 배경
[0004] 본 발명은 생물학적 및 화학적 검정을 수행하기 위한 고체 기재의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고체 기재에 관한 것이다. 특히, 다중 생물검정에 사용하기 위한 고체 기재에 관한 것이다.
[0005] 생물학적 및 화학적 분석을 위한 어레이는 작용성화된 에폭시 수지와 같은 수지 물질을 포함하는 표면을 갖는 고체 기재에 프로브 분자를 부착함으로써 생성된다. 어레이는 매우 작은 샘플 부피로, 많은 수의 생체분자, 예컨대, 핵산 및 단백질의 신속한 스크리닝을 가능하게 한다. 예를 들어, 바코딩된 마이크로비드(barcoded microbead)로 불리는 식별 가능한 라벨 및/또는 마킹을 갖는 마이크로구체 또는 마이크로비드로 알려진 입자는 질병-관련 표적, 독소-관련 표적, 유전자-관련 표적 등을 식별하기 위한 병렬 다중 분석에 사용되었다. 마이크로비드는 하나 이상의 특정 표적 분자에 대한 친화성 및/또는 상호작용하는 능력을 갖는 하나 이상의 프로브 분자에 컨쥬게이션된 수지 코팅을 이들의 표면에 갖는다. 각각의 프로브 분자는 고유하게 식별될 수 있도록 코딩된 별도의 비드에 부착된다. 검정에서, 마이크로비드는 샘플과 접촉되고, 샘플 내의 상이한 표적 분자는 이에 컨쥬게이션된 상응하는 프로브 분자를 갖는 마이크로비드에 결합된다. 바코드는 표적의 식별을 가능하게 한다.
[0006] 마이크로비드 검정은 이제 생물학 검정 및 진단에서 중요한 도구이다. 마이크로비드 기반 기술은 고도로 정량적 병렬 다중 파라미터 분석을 수행하기 위한 우아하고 다양한 접근 방식을 나타낸다. 이들은 샘플에서 핵산 및 단백질을 검출 및 정량하기 위한 다양한 기술의 기초를 형성한다.
[0007] 에폭시-기반 수지는 프로브 분자가 부착되는 코팅 물질로서 사용되어 왔다. 그러나, 프로브 분자를 에폭시-기반 수지의 표면에 부착시키는 것은 먼저 수지의 표면을 작용성화시켜야 하는 추가 단계를 필요로 한다. 미국 특허 번호 9,255,922호는 프로브 분자가 부착된 에폭시-기반 수지로 코팅된 마이크로비드 또는 마이크로 펠렛과 같은 기재를 개시한다. 상기 특허는 에폭시-기반 수지가 소수성이며, 이는 많은 생물학적 적용에 한계를 나타내므로, 프로브 분자가 수지에 효율적으로 부착될 수 있기 전에 에폭시-기반 수지는 추가의 작용성 모노머로 개질되어야 한다고 교시하고 있다. 따라서, 에폭시-기반 수지가 형성된 후(또는 에폭시-기반 수지가 형성되는 동안), 에폭시-기반 수지는, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지의 표면에 효율적으로 부착될 수 있도록 에폭시-기반 수지를 작용성화하기 위해 추가적인 기능성 모노머와 접촉해야 한다. 에폭시 수지를 작용성 모노머와 접촉시키는 이러한 추가 단계는 힘들고 시간 소모적이다.
[0008] 생체분자 프로브가 효율적으로 부착될 수 있는 에폭시-기반 수지로 코팅된 기재를 제조하기 위한 단순화된 방법이 당 분야에 필요하다. 본 발명자들은 예기치 않게 생체분자 프로브가 추가의 작용성 모노머로 에폭시-기반 수지를 먼저 작용성화시킬 필요 없이 에폭시-기반 수지로 코팅된 기재에 효율적으로 부착될 수 있음을 발견하였다.
[0009] 본 발명의 이러한 및 다른 특징 및 이점은 본 개시의 나머지 부분, 특히 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이며, 이들 모두는 예로서 본 발명의 원리를 예시한다.
[0010] 본 출원에서 임의의 참조의 인용은 이러한 참조가 본 출원에 대한 종래 기술인 것으로 해석되어서는 안 된다.
발명의 개요
[0011] 본 발명은 생물학적 분석을 위한 기재 및 생물학적 분석을 위한 기재의 제조 방법에 관한 것이다. 생물학적 분석을 위한 기재는 중합된 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함한다.
[0012] 생물학적 분석을 위한 기재는
(i) 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계; 및
(ii) 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지와 접촉시켜 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 직접 결합되도록 하는 단계에 의해 제조된다.
[0013] 본 발명은 또한 샘플 내 분석물의 존재 여부를 검정하는 방법에 관한 것이다. 방법은 샘플을 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며, 생체분자 프로브는 분석물에 특이적으로 결합한다.
[0014] 도 1은 실시예 6에 기재된 바와 같이, 도 1a 및 1b의 X 축에 명명된 바와 같이 "AP", "Aph", 및 "Ap1"으로 명명된 3개의 아나플라스마(Anaplasma) 유래된 펩티드에 특이적인 항체를 검정하기 위한 96 웰 플레이트의 세포 열(column) 위치(즉, 1 내지 12) 대 웰 (MFI)의 모든 비드의 단일 중앙값 결과로 측정된 BMB의 형광 강도와 같은 신호 강도의 플롯이다. 도 1a는 실시예 6에 기재된 바와 같이, 표준 판독 완충제에 대한 신호 강도 대 세포 열 위치를 도시하고, 도 1b는 시트레이트 판독 완충제에 대한 신호 강도 대 세포 열 위치를 도시한다.
발명의 상세한 설명
[0015] 본 발명은 생물학적 분석을 위한 기재 및 생물학적 분석을 위한 기재의 제조 방법에 관한 것이다. 생물학적 분석을 위한 기재는 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함한다.
[0016] 본원에서 사용되는 어구 "에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브" 및 유사한 어구는 생체분자 프로브가 먼저 에폭시-기반 수지를 에폭시-기반 수지와 공유적으로 반응하는 또 다른 시약과 접촉시키지 않고 단순히 생체분자 프로브를 수지와 접촉시킴으로써 수지에 부착됨을 의미한다. 생체분자 프로브는 에폭시-기반 수지에 수동적으로 부착되거나 또는 에폭시-기반 수지에 공유적으로 부착될 수 있다.
[0017] 생물학적 분석을 위한 기재는
(i) 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계; 및
(iii) 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지와 접촉시켜 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 직접 결합되도록 하는 단계에 의해 제조된다.
[0018] 한 구현예에서, 기재는 에폭시-기반 수지이다.
[0019] 한 구현예에서, 기재는 에폭시-기반 수지로 코팅된 고체 지지체이다. 에폭시-기반 수지가 코팅될 수 있는 예시적인 고체 지지체 물질은 유리, 폴리머, 라텍스, 원소 금속, 금속 복합체, 합금, 규소, 탄소, 및 이들의 하이브리드를 포함하는 입자, 비드 및 표면을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0020] 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지의 일부는 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지와 접촉시키기 전에 중합된다.
[0021] 적합한 에폭시-기반 수지는 EPON SU-8, EPON 1001F, 1002F, 1004F, 1007F, 1009F, 2002, 및 2005(Hexion Specialty Chemicals(Fayetteville, NC)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. EPON SU-8 및 EPON 1002F가 바람직한 수지이다.
[0022] SU-8은 광경화성 에폭시-기반 수지이다. SU-8은 (클로로메틸)옥시란 및 4,4-(1-메틸에틸리덴)비스페놀을 갖는 폴리머인 포름알데히드이다(CAS: 28906-96-9). SU-8은 약 8의 평균 에폭사이드 기 작용성을 갖는 폴리머성 고체 에폭시 노볼락 수지이다. SU-8 에폭시 수지의 구조는 하기와 같다:
[0023] SU-8은 SU-8 및 광산 발생제를 함유하는 용액으로서 상표명 EPON SU-8로 Hexion Specialty Chemicals로부터 상업적으로 입수 가능하다.
[0024] 1002F는 광경화성 에폭시 수지(CAS: 25036-25-3)이다. 1002F는 2,2'-[(1-메틸에틸리덴)비스(4,1-페닐렌옥시메틸렌)]비스(옥시란)을 갖는, 페놀, 4,4'-(1-메틸에틸리덴)비스-, 폴리머이고, 1002F 및 상품명 EPON 1002F의 광산 발생제를 함유하는 용액으로서 Hexion Specialty Chemicals로부터 상업적으로 입수 가능하다:
[0025] 적합한 생체분자 프로브는 지질, 다당류, 아미노산, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 항체 및 이들의 단편, 폴리뉴클레오티드(단일 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 포함), 더 짧은 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 생체분자 프로브는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 더 짧은 올리고뉴클레오티드이다. 한 구현예에서, 생체분자는 항체이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브는, 예를 들어, 로다민과 같은 합성 분자이다. 예시적인 생체분자 프로브는 SDMA, ADMA, T4, 코르티솔, 프로게스테론, 및 효소(예를 들어, 리파제, 예컨대, 췌장 리파제)를 포함한다.
[0026] 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 생체분자 프로브는 생체분자 상의 아민, 티올, 또는 하이드록실 기와 수지 상의 에폭시 기와의 반응에 의해 에폭시-기반 수지에 결합되는 것으로 여겨진다. 생체분자 프로브는 또한 에폭시-기반 수지에 수동적으로 결합될 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "수동적으로 결합된"은 반데르 발스(Vander Walls), 소수성, 친수성, 또는 수소 결합 상호작용과 같은 비공유 상호작용에 의한 결합을 의미한다.
[0027] 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 단독으로 또는 다른 고체 표면에 부착된 필름; 마이크로비드; 마이크로입자; 마이크로 펠렛; 마이크로웨이퍼; 상자성 비드; 바코드와 같은 식별 특징을 함유하는 마이크로입자; 상자성 마이크로입자; 바코드를 함유하는 상자성 마이크로입자; 및 니켈 바코드를 함유하는 비드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0028] 생체분자 프로브는 에폭시-기반 수지를 생체분자와 단순히 접촉시킴으로써 에폭시 수지에 직접 결합된다.
[0029] 한 구현예에서, 생체분자 프로브는, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 생체분자 프로브의 용액에 첨가함으로써 에폭시-기반 수지와 접촉되어 접촉 혼합물을 제공한다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브의 용액은 수용액이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브의 용액은 완충된 수용액이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브의 용액은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용액이다.
[0030] 바람직한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재가 생체분자 프로브의 용액에 첨가되기 전에 DMSO로 세척되어 접촉 혼합물을 제공한다. 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉하기 직전에 DMSO로 세척되어 접촉 혼합물을 제공한다. 에폭시 수지를 생체분자 프로브와 접촉시키기 전에 에폭시-기반 수지를 DMSO와 접촉시키는 것이 얼마나 많은 생체분자 프로브가 에폭시 수지에 결합되는지에 있어서 변동성을 적게 나타내고, 생체분자 프로브에 결합하는 샘플 내 분석물의 존재를 검출하는데 사용되는 신호에 있어서 변동성을 적게 나타내는 생물학적 분석을 위한 기재를 제공한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 에폭시 수지를 생체분자 프로브와 접촉시키기 전에 에폭시-기반 수지를 DMSO와 접촉시키는 것이 더 나은 신호를 나타내는 생물학적 분석을 위한 기재를 제공한다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
[0031] 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지에 직접 결합시킴으로써, 본 방법은 유리하게는 (i) 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합되기 전에 에폭시 수지를 다른 분자와 반응시킴으로써 또는 (ii) 중합 전에 또 다른 분자를 에폭시 수지에 혼합함으로써 에폭시-기반 수지를 작용성화시켜야 하는 추가 단계를 회피한다. 이러한 추가 단계를 회피함으로써, 본 방법은 유리하게는 더 빠르고, 덜 비싸고, 그리고 오류 또는 변동성이 잠재적으로 발생할 수 있는 단계를 제거한다.
[0032] 생체분자 프로브의 용액이 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉시키기 위해 사용될 때, 용액 중 생체분자 프로브의 농도는 약 0.05 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 바람직하게는 약 0.01 mg/mL 내지 약 3.0 mg/mL, 및 더욱 바람직하게는 약 0.15 내지 약 2.5 mg/mL의 범위, 예를 들어, 약 1.5 mg/mL이다.
[0033] 접촉 혼합물에서 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재의 농도는 약 5만 내지 약 500만 기재/mL, 바람직하게는 약 10만 내지 약 300만 기재/mL의 범위이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브는 펩티드이고, 접촉 혼합물에서 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재의 농도는 약 10만 내지 약 300만 기재/mL, 예를 들어, 약 200만 기재/mL의 범위이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브는 항체이고, 접촉 혼합물에서 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재의 농도는 약 10만 내지 약 180만 기재/mL, 예를 들어, 약 100만 기재/mL의 범위이다.
[0034] 생체분자 프로브의 용액은 전형적으로 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합하기에 충분한 시간 동안 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉된다. 전형적으로, 생체분자 프로브의 용액은 적어도 약 4시간, 바람직하게는 적어도 약 8시간, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10시간 동안 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉된다. 한 구현예에서, 분자 프로브는 약 4시간 내지 약 18시간 동안 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉된다.
[0035] 접촉 혼합물(즉, 생체분자 프로브의 용액 및 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재)은 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합하기에 충분한 온도로 유지된다. 한 구현예에서, 접촉 혼합물은 약 4℃ 내지 약 65℃, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 30℃, 및 더욱 바람직하게는 약 18℃ 내지 27℃의 온도에서 유지된다. 한 구현예에서, 접촉 혼합물은 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재의 표면이 생체분자 프로브의 용액과 충분히 접촉되도록 하기 위해 교반된다.
[0036] 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 생체분자 프로브의 용액은, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합되도록 접촉된 후, 생물학적 프로브의 용액이 제거되고, 생성된 생체분자 작용성화된 기재가 pH 약 7.4에서 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중 약 1% 소 혈청 알부민(BSA)(Proliant Biologicals(Ankany IA)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 0.05% Tween-20(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 약 0.05% Proclin 950(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)의 혼합물로 세척된다. 적합한 PBS 용액은 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 약 145 mM의 염화나트륨(Amresco(Salon, OH)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 포함한다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 적어도 약 200 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다.
[0037] 적합한 완충제는 포스페이트, TRIS, HEPES, MES, EPPS, Bis-TRIS, Bis-TRIS 프로판, PIPES, ADA, MOPS, MOPSO, ACES, BES, Tricine, TES, Gly-Gly, DIPSO, 무기 완충제, 유기 완충제, 아세트산 기반, 및 시트르산 기반 완충제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
[0038] 이후, 결과적인 세척된 생체분자 작용성화된 기재는, 검정에 사용하기 위해 pH 약 7.4에서 PBS 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 약 0.05% Proclin 950의 용액에 첨가될 수 있다.
[0039] 본 방법의 제1 양태에서, 생체분자 프로브는 단백질, 예컨대, 항체, 효소(예를 들어, 스트렙타비딘 및 아비딘), 또는 항체의 일부(예를 들어, Fc 및 FAB 단편)이고, 생체분자 프로브의 용액은 수용액이다. 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 생체분자 프로브의 용액은 pH 약 5.5에서 약 100 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 및 약 140 mM 구아니딘-HCl로 완충된 수용액이다. 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 생체분자 프로브의 용액은 약 pH 8의 수성에서, 약 100 mM의 3-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]프로판-1-설폰산(EPPS) 및 140 mM 구아니딘-HCl으로 완충된 수용액이다.
[0040] 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS의 용액으로 세척된다. 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 0.05% Tween-20을 함유하는 적어도 약 200 μL의 PBS의 용액으로 적어도 3회 세척된다. 본 방법의 제1 양태의 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 0.05% Tween-20을 함유하는 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 PBS의 용액으로 적어도 3회 세척된다.
[0041] 본 방법의 제1 양태의 바람직한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 이후 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 DMSO로 추가로 세척된다. 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 적어도 약 200 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다. 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 DMSO로 적어도 3회 세척된다.
[0042] 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재 및 생체분자 프로브의 용액은, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 부착되도록 접촉된 후, 생물학적 프로브의 용액이 제거되고, 생성된 생체분자 작용성화된 기재가 pH 약 7.4에서 PBS 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 및 약 0.05% Proclin 950의 혼합물로 세척된다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 적어도 약 200 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다.
[0043] 이후, 결과적인 세척된 생체분자 작용성화된 기재는, 검정에 사용하기 위해 pH 약 7.4에서 PBS 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 약 0.05% Proclin 950의 용액에 첨가될 수 있다.
[0044] 본 방법의 제1 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 바코딩된 자성 비드, 예를 들어, SU-8 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)로 코팅된 바코딩된 자성 비드이다.
[0045] 본 방법의 제2 양태에서, 생체분자 프로브는 시스테인 잔기를 갖는 펩티드이고, 생체분자 프로브의 용액은 DMSO 중의 용액이다. 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 용액은 약 1%의 Tween-20을 함유하는 DMSO이다. 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 펩티드 농도는 약 0.2 mM 내지 약 1 mM 펩티드의 범위, 예를 들어, 약 0.5 mM이다.
[0046] 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 1% Tween-20을 함유하는 DMSO의 용액으로 세척된다. 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 1% Tween-20을 함유하는 적어도 약 200 μL의 DMSO의 용액으로 적어도 3회 세척된다. 본 방법의 제2 양태의 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 생체분자 프로브의 용액과 접촉되기 전에 약 1% Tween-20을 함유하는 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 DMSO의 용액으로 적어도 3회 세척된다.
[0047] 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재 및 생체분자 프로브의 용액은, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합되도록 접촉된 후, 생물학적 프로브의 용액이 제거되고, 생성된 생체분자 작용성화된 기재가 pH 약 7.4에서 PBS 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 및 약 0.05% Proclin 950의 혼합물로 세척된다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 적어도 약 200 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다. 한 구현예에서, 생체분자 작용성화된 기재는 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 세척 용액으로 적어도 3회 세척된다.
[0048] 이후, 생성된 세척된 생체분자 작용성화된 기재는, 검정에 사용하기 위해 pH 약 7.4에서 PBS 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 약 0.05% Proclin 950의 용액에 첨가될 수 있다.
[0049] 본 방법의 제2 양태의 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 바코딩된 자성 비드, 예를 들어, SU-8 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)로 코팅된 바코딩된 자성 비드이다.
[0050] 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 본 방법의 제2 양태는 생체분자 프로브 상의 티올 기와 에폭시-기반 수지 상의 에폭사이드 기와의 반응을 포함한다. 이 시스테인 잔기는 펩티드 서열의 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 시스테인은 또한 PEG 링커와 같은 링커에 의해 펩티드로부터 이격될 수 있다. PEG는, 예컨대, 신중한 PEG의 사용을 통해 정의된 길이를 가질 수 있다. dPEG(Quanta Biodesign(Plain City, OH)로부터 상업적으로 입수 가능함)가 특히 적합한 PEG이다. 시스테인 잔기를 PEG 링커로 단백질에 링킹하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. (참조예: I. Hamley, PEG-Peptide Conjugates, Biomacromolecules, 15:1543-59, 2014). 다른 링커 및 스페이서는 베타-알라닌, 4-아미노부티르산(GABA), (2-아미노에톡시) 아세트산(AEA), 5-아미노발레르산(Ava), 6-아미노헥산산(Ahx), 트리옥사트리데칸-석시남산(Ttds) 및 펩티드를 포함한다.
[0051] 한 구현예에서, 펩티드는 N-말단 아세틸화(Ac) 또는 C-말단 아미드화를 통해 N 및 C 말단에서 캡핑된다. 생체분자 프로브가 항체인 경우, 항체는 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 또는 β-머캅토에탄올(BME)와 같은 환원제를 사용하여 항체를 환원시킴으로써 티올 기를 통해 에폭시-기반 수지에 결합되어 항체의 힌지 영역에서 티올 기를 에폭시-기반 수지에 결합하기 위해 접근 가능하게 할 수 있다.
[0052] 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 γ-부티로락톤 또는 사이클로펜타논, 예컨대, EPON SU-8(Hexion Specialty Chemicals(Fayetteville, NC)로부터 상업적으로 입수 가능함)과 같은 용매 중에서 SU-8 수지 및 광산 발생제, 예컨대, 트리페닐 설포늄 헥사플루오로안티모네이트를 함유하는 용액으로 지지체를 코팅함으로써 제조된다. 이후, 지지체는 가열되어 용매를 제거하고 지지체 상에 고체 에폭시-기반 수지의 코팅을 남긴다. 고체 에폭시-기반 수지의 두께는 수백 미크론의 두께일 수 있다. 전형적으로, 고체 에폭시-기반 수지의 두께는 약 1 nm 내지 약 3 mm의 범위이다. 선택적으로, 고체 에폭시-기반 수지의 일부는 이후 UV 광의 조사에 의해 중합되어 중합된 에폭시-기반 수지를 제공한다. 한 구현예에서, 포토마스크가 UV 광으로 조사되기 전에 고체 에폭시-기반 수지의 상부에 배치되어 중합된 에폭시-기반 수지 상에 패턴이 남도록 한다. 한 구현예에서, 지지체는 고체 에폭시-기반 수지로부터 분리된다
[0053] 한 구현예에서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재는 γ-부티로락톤 또는 사이클로펜타논, 예컨대, EPON 1002F(Hexion Specialty Chemicals(Fayetteville, NC)로부터 상업적으로 입수 가능함)과 같은 용매 중에서 1002F 수지 및 광산 발생제, 예컨대, 트리페닐 설포늄 헥사플루오로안티모네이트를 함유하는 용액으로 지지체를 코팅함으로써 제조된다. 이후, 지지체를 가열하여 용매를 제거하고 지지체 상에 고체 에폭시-기반 수지의 코팅을 남긴다. 고체 에폭시-기반 수지의 두께는 수백 미크론의 두께일 수 있다. 전형적으로, 고체 에폭시-기반 수지의 두께는 약 1 nm 내지 약 3 mm의 범위이다. 선택적으로, 고체 에폭시-기반 수지의 일부는 이후 UV 광의 조사에 의해 중합되어 중합된 에폭시-기반 수지를 제공한다. 한 구현예에서, 포토마스크가 UV 광으로 조사되기 전에 고체 에폭시-기반 수지의 상부에 배치되어 중합된 에폭시-기반 수지 상에 패턴이 남도록 한다. 한 구현예에서, 지지체는 고체 에폭시-기반 수지로부터 분리된다.
[0054] 한 구현예에서, 샘플은 대변 샘플이다. 한 구현예에서, (즉, 분석물)에 대해 검정되는 분자는, 예를 들어, 장내 기생충, 예컨대 이를테면, 회충, 편충, 십이지장충, 촌충, 또는 심장사상충, 또는 기생충 지아르디아(Giardia)에 의해 생성된 단백질이고, 생체분자 프로브는 단백질에 대한 항체이다. 한 구현예에서, 항체는 분변항원(coproantigen)에 특이적이다. 한 구현예에서, 생체분자 프로브는 회충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 십이지장충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 심장사상충으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 지아르디아로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0055] 구충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 미국 특허 번호 9,239,326호 및 8,895,294호에 개시되어 있다. 회충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 미국 특허 번호 8,097,261; 9,212,220; 9,103,823; 8,105,795; 및 8,895,294에 개시되어 있다. 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 미국 특허 번호 8,367,808호 및 8,895,294호에 개시되어 있다. 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 공개된 미국 특허 출원 번호 2020/0102378호에 개시되어 있다. 지아르디아로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 문헌[H. Stibbs, Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for Giardia lamblia antigen in human stool, J. Clin. Microbiol., (11):2582-2588, Nov. 1989 및 H. Stibbs et al., Identification of Giardia lamblia-specific antigens in infected human and gerbil feces by western immunoblotting, J. Clin. Microbiol., (10):2340-6, Oct. 1990]에 개시되어 있다.
[0056] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 감염원에 의해 생성된 단백질에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 생성된 항체이고, 생체분자 프로브는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 올리고펩티드이다. 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis), 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis) 및 에를리키아 에윙기(Ehrlichia ewingii)를 포함하는 에를리키아 속의 박테리아에 감염된 동물의 순환 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 올리고펩티드는 미국 특허 번호 7,087,372호; 7,407,770호; 7,445,788호; 7,449,191호; 7,842,473호; 7,888,054호; 8,980,274호; 7,183,060호; 7,744,872호; 8,409,817호; 9,850,295호; 8,158,751호, 및 9,605,032호에 개시되어 있다. 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophylum) 및 아나플라스마 플라티스(Anaplasma platys)를 포함하는 아나플라스마 속의 박테리아로 감염된 동물의 순환 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 올리고펩타이드는 미국 특허 번호 6,964,855호; 7,439,321호; 8,303,959호; 6,306,402호; 6,204,252호; 8,093,088호, 및 9,120,857호에 개시되어 있다. 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)를 포함하는 보렐리아 속의 박테리아로 감염된 동물의 순환 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 올리고펩타이드는 미국 특허 번호 6,719,983호; 6,740,744호; 6,475,492호, 및 6,660,274호에 개시되어 있다.
[0057] 한 구현예에서, 분석물은 라임병을 유발하는 보렐리아 부르그도르페리에 의해 생성된 단백질에 대한 대상체 반응으로부터 생성된 항체이고, 생체분자 프로브는 보렐리아 부르그도르페리에 의해 생성된 단백질, 또는 단백질의 일부이다.
[0058] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 대사산물이고, 생체분자 프로브는 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다.
[0059] 한 구현예에서, 분석물은 대칭 디메틸아르기닌(SDMA)이다. SDMA에 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 번호 8,481,690호에 개시되어 있다.
[0060] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 감염된 대상체의 혈액에 존재하는 병원체로부터 기원하는 항원이고, 생체분자 프로브는 항원에 대한 항체이다. 한 구현예에서, 분석물은 심장사상충(디로필라리아 임미티스(Dirofilaria immitis))으로부터의 순환 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 심장사상충(디로필라리아 임미티스)으로부터의 순환 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 번호 4,839,275호에 개시되어 있다.
[0061] 한 구현예에서, 생물학적 검정을 위한 기재는
(i) 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계;
(ii) 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제1 용매에 용해된 제1 에폭시-기반 수지의 제1 용액으로 코팅하여 제1 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계;
(iii) 제1 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 가열하여 제1 용매의 적어도 일부를 제거함으로써 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계;
(iv) 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅 상에 니켈 바코드를 침착시켜 제1 고체 에폭시 수지 코팅 및 니켈 바코드를 갖는 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계;
(v) 상기 니켈 바코드를 제2 용매에 용해된 제2 에폭시-기반 수지의 제2 용액으로 코팅하여 제1 에폭시-기반 수지 코팅 및 제2 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계;
(vi) 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅 및 제2 에폭시-기반 수지 코팅으로 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 가열하여 제2 용매의 적어도 일부를 제거함으로써 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅 및 제2 고체 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계
― 니켈 바코드는 상기 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅과 상기 제2 고체 에폭시-기반 수지 코팅 사이에 있음 ―;
(vii) 선택적으로, 상기 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅 및 상기 제2 고체 에폭시-기반 수지 코팅의 적어도 일부를 중합하여 상기 제1 고체 에폭시-기반 수지, 니켈 바코드, 및 제2 고체 에폭시-기반 수지 코팅로 적층된 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 제공하는 단계 ― 제1 고체 에폭시-기반 수지 코팅 및 상기 제2 고체 에폭시-기반 수지 코팅의 적어도 일부는 중합되었음 ―;
(viii) 제1 에폭시-기반 수지 코팅, 니켈 바코드, 및 제2 에폭시-기반 수지 코팅으로 코팅된 실리콘/알루미늄 웨이퍼로부터 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 분리하여 바코딩된 자성 비드를 제공하는 단계;
(iv) 생체분자가 에폭시-기반 수지에 직접 결합하도록 바코딩된 자성 비드를 생체분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
[0062] 한 구현예에서, 제1 용매에 용해된 제1 에폭시-기반 수지의 제1 용액은 제2 용매에 용해된 제2 에폭시-기반 수지의 제2 용액과 동일하다.
[0063] 한 구현예에서, 실리콘/알루미늄 웨이퍼는 실리콘/알루미늄 웨이퍼를 수산화나트륨과 접촉시킴으로써 제1 고체 에폭시 수지, 니켈 바코드, 및 제2 고체 에폭시 수지 코팅으로부터 분리된다.
[0064] 본 발명은 또한 샘플 내 분석물의 존재 여부를 검정하는 방법에 관한 것이다. 방법은 샘플을 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며, 생체분자 프로브는 분석물에 특이적으로 결합한다.
[0065] 본원에서 사용되는 어구 "분석물에 특이적으로 결합한다", "특이적으로 결합한다", "특이적으로", "분석물에 특이적인" 및 유사한 어구는 이들의 당 분야에서 인정되는 의미, 즉, 생체분자 프로브가 분석물(또는 분석물의 부류)을 인식하고 이에 다른 비특이적 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 결합한다는 의미를 갖는다. 예를 들어, 다른 비특이적 분자보다 더 효율적으로 항원에 결합하는 항원에 대해 제기된 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 기술될 수 있다. 결합 특이성은, 예컨대, 이를테면, 효소-링킹 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
[0066] 한 구현예에서, 샘플은 대변 샘플이다. 한 구현예에서, 분석물은 장내 기생충에 의해 생성된 단백질이고, 생체분자 프로브는 장내 기생충에 의해 생성된 단백질에 대한 항체이다. 한 구현예에서, 장내 기생충에 의해 생성된 단백질에 대한 항체는 회충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 십이지장충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 심장사상충으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 지아르디아로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0067] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 감염원에 의해 생성된 단백질에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 생성된 항체이고, 생체분자 프로브는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 올리고펩티드이다.
[0068] 한 구현예에서, 분석물은 라임병을 유발하는 보렐리아 부르그도르페리에 의해 생성된 단백질에 대한 대상체 반응으로부터 생성된 항체이고, 생체분자 프로브는 보렐리아 부르그도르페리에 의해 생성된 단백질, 또는 단백질의 일부이다.
[0069] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 대사산물이고, 생체분자 프로브는 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 한 구현예에서, 분석물은 대칭 디메틸아르기닌(SDMA)이다.
[0070] 한 구현예에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플이고, 분석물은 감염된 대상체의 혈액에 존재하는 병원체로부터 기원하는 항원이고, 생체분자 프로브는 항원에 대한 항체이다. 한 구현예에서, 분석물은 심장사상충(디로필라리아 임미티스)으로부터의 순환 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다.
실시예
[0071] 본 발명은 본 발명의 몇 가지 양태의 예시로서 의도된 실시예에 개시된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 구현예는 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 도시되고 기재된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 당업자에게 명백해질 것이며, 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 당업자의 범위 내에 있는, 현재 공지되어 있거나 나중에 개발될 모든 등가물의 치환, 및 포뮬레이션의 변화 또는 실험 설계의 사소한 변화를 포함하는 본 발명의 이러한 변형은 본원에 포함된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1: 바코딩된 자성 비드에 대한 생체분자 프로브의 수동 커플링
[0072] 바코딩된 자성 비드(BMB)는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된다. 모노클로날 항체 또는 단백질과 같은 생체분자 프로브를 BMB에 커플링시키는 것은 하기 절차에 따라 BMB 표면 상에 생체분자 프로브의 흡수를 통해 달성되었다.
[0073] 약 0.15 내지 2.5 mg/mL 항체(전형적으로 약 1.5 mg/mL)의 최종 농도의 모노클로날 항체의 용액을, pH 약 5.5에서 약 100 mM MES(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함) 및 약 140 mM의 구아니딘-HCl(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 함유하는 수성 완충제로, 또는 pH 약 8에서 약 100 mM EPPS(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함) 및 약 140 mM 구아니딘-HCl을 함유하는 수성 완충제로 제조하여 항체 코팅 용액을 제공하였다.
[0074] 충분한 양의 BMB를 BMB 세척 완충제(pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 145 mM 염화나트륨(Amresco LLC(Salon, OH)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 약 0.05% Tween-20(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함))에 현탁시켜 약 10만 내지 180만(전형적으로 항체에 대해 약 1백만/mL)의 최종 농도를 제공하였다. BMB를 BMB 세척 완충제로 3회 세척하였다. 모든 BMB 세척(이 단계 및 후속 단계에 대해)은 다음과 같이 진행하였다:
[0075] 먼저 BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB가 1 내지 10분 동안 자석에 부착되도록 하였다. 이후, BMB의 원래 현탁액 부피(약 200 μL 내지 약 1,000 μL)와 대략 동일한 세척 완충제의 부피에 BMB를 재현탁시키기 전에 상청액을 조심스럽게 흡인하였다. 이러한 단계를 총 3회 반복하여 BMB 펠렛을 제공하였다.
[0076] BMB를 세척 완충제로 세척한 후, BMB를 원래의 현탁액 부피와 거의 동일한 부피의 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)로 3회 세척하여 DMSO 세척된 BMB의 펠렛을 제공하였다.
[0077] 코팅 반응: DMSO 세척 후, 항체 코팅 용액(약 1.5 mg/mL 최종 농도)을 DMSO 세척된 BMB(약 1백만 BMB/mL 최종 농도)와 즉시 조합하고, 실온(18-27℃)에서 혼합하면서 4 내지 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 항체 커플링된 BMB를 검정 완충제(pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 약 145 mM의 염화나트륨(Amresco LLC(Salon, OH)로부터 상업적으로 입수 가능함) 중 약 1% BSA(Proliant biologicals(Ankany IA)로부터 상업적으로 입수 가능함), 약 0.05% Tween-20(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 약 0.05% Proclin 950(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함))로 3회 세척하였다.
[0078] 이후, 항체 커플링된 BMB를 검정에 사용하기 위해 요망되는 최종 농도로 검정 완충제에 현탁시켰다.
실시예 2: 티올 기를 통해 생체분자 프로브를 바코딩된 자성 비드에 커플링
[0079] 티올 기를 함유하는 모노클로날 항체 또는 단백질과 같은 생체분자 프로브를 에폭시-기반 수지로 코팅된 바코딩된 자성 비드(BMB)에 커플링시키는 것은 하기 절차에 따라 BMB 표면 상에 생체분자 프로브의 흡수를 통해 달성된다.
[0080] 약 0.02 내지 약 1 mM(전형적으로 약 0.1 mM)의 최종 펩티드 농도의, 약 1% Tween-20(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)을 함유하는 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함) 중의 펩티드의 용액을 제조하여 펩티드 코팅 용액을 제공하였다. 이 실시예에 사용된 펩티드는 아세틸화된-Cys(dPEG12)[펩티드]-아미드였으며, 펩티드는 25개 아미노산 잔기의 올리고펩티드이고 dPEG12는 개별 PEG12이다. 아세틸화된-Cys(dPEG12)[펩티드]-아미드는 New England Peptide of Gardner, MA로부터 맞춤 합성으로 제공되었다:
[0081] 본 방법에 사용하기에 적합한 BMB는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된 BMB이다.
[0082] 하기 기재된 코팅 반응에서 약 10만 내지 300만 BMB/mL(전형적으로 약 200만/mL)의 최종 농도를 제공하기에 충분한 양의 BMB를 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 부피의 BMB 세척 완충제(DMSO 중 약 1% Tween-20)에 현탁시켰다. BMB를 하기 기재된 바와 같이 DMSO 중 약 1% Tween-20으로 3회 세척하였다. 모든 BMB 세척(이 단계 및 후속 단계에 대해)은 다음과 같이 진행하였다:
[0083] BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB를 1 내지 10분 동안 자석에 부착시켰다. BMB의 원래 현탁액 부피와 대략 동일한 부피의 세척 완충제에 BMB를 재현탁시키기 전에 상청액을 조심스럽게 흡인하였다. 이들 단계를 총 3회 반복하여 BMB 펠렛을 제공하였다.
[0084] BMB를 세척 완충제로 세척한 직후, 세척된 BMB를 펩티드 코팅 용액과 조합하고 혼합하면서 실온(18 내지 27℃)에서 약 4시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션 후, 펩티드-커플링된 BMB를 일정 부피의 검정 완충제(pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 및 약 145 mM 염화나트륨 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 및 약 0.05% Proclin 950)로 3회 세척하였다.
[0085] 이후, 펩티드 커플링된 BMB를 검정에 사용하기 위해 요망되는 최종 농도로 검정 완충제에 현탁시켰다.
실시예 3: 환원된 디설파이드-링킹된 시스테인으로부터 생성된 티올 기를 통해 생체분자 프로브를 바코딩된 자성 비드에 대한 커플링
[0086] 모노클로날 항체와 같은 거대분자는 모노클로날 항체를 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 또는 2-머캅토에탄올(BME)과 같은 환원제와 반응시킴으로써 티올 기를 통해 커플링되어 디설파이드-링킹된 시스테인 측쇄를 환원시켜 BMB의 표면에 결합하기 위해 접근 가능하게 할 수 있다.
[0087] BMB 상의 에폭시 기에 대한 환원된 항체의 공유 커플링을 위해, 환원 완충제(pH 약 7.4에서, 50 mM 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 75 mM 염화나트륨(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 2 mM EDTA(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 5 mM DTT(Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)로부터 상업적으로 입수 가능함))로 항체를 약 5 mg/mL의 농도로 희석함으로써 환원된 항체 코팅 용액을 제조하였다. 생성된 용액을 18 내지 27℃에서 약 0.5 시간 동안 인큐베이션하였다.
[0088] 환원 후, 환원된 항체를 제조업체의 지침에 따라 G25 Zeba Spin 탈염 컬럼(Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)으로부터 상업적으로 입수 가능함)을 사용하여 pH 약 7.4에서, 50 mM 소듐 포스페이트(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함), 75 mM 염화나트륨(Amresco(Salon, OH)로부터 상업적으로 입수 가능함), 및 2 mM EDTA(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 함유하는 용액으로 교환하였다. 항체 용액을 약 0.5 mg/mL의 농도로 조정하고, 생성된 용액을 DMSO 세척된 BMB에 즉시 첨가하였다.
[0089] 먼저 하기 기재된 코팅 반응에서 약 10만 내지 180만 BMB/mL(전형적으로 항체에 대해 약 1백만/mL)의 최종 농도를 제공하기에 충분한 양의 BMB를 약 200 μL 내지 약 1,000 μL의 부피의 세척 완충제(pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM 소듐, 및 약 0.05% Tween-20)에 현탁시킴으로써 DMSO 세척된 BMB를 제조하였다. BMB를 하기 기재된 바와 같이 세척 완충제로 3회 세척하였다.
[0090] 모든 BMB 세척(이 단계 및 후속 단계에 대해)은 다음과 같이 진행하였다: 먼저 BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB가 1 내지 10분 동안 자석에 부착되도록 하였다. 이후, 상청액을 조심스럽게 흡인하고 BMB를 현탁시키는데 사용된 원래 부피와 대략 동일한 부피의 세척 완충제에 BMB를 재현탁시켰다. 이러한 단계를 3회 반복하여 BMB 펠렛을 제공하였다.
[0091] BMB를 세척 완충제로 세척한 후, BMB를 원래의 현탁액 부피와 거의 동일한 부피의 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)로 3회 세척하여 DMSO 세척된 BMB를 제공하였다. 이후, BMB를 원래의 현탁액 부피와 대략 동일한 부피의 DMSO에 현탁시키고, 혼합하면서 18 내지 27℃에서 약 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB를 1 내지 10분 동안 자석에 부착시켰다. 이후, 상청액을 조심스럽게 흡인하여 DMSO 세척된 BMB 펠렛을 제공하였다.
[0092] 본 방법에 사용하기에 적합한 BMB는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된 BMB이다.
[0093] DMSO 세척 후, 항체 코팅 용액(약 0.5 mg/mL 최종 농도)을 DMSO 세척된 BMB(약 1백만 BMB/mL 최종 농도)와 즉시 조합하고, 실온(18 내지 27℃)에서 혼합하면서 18 시간 동안 인큐베이션하였다.
[0094] 인큐베이션이 완료된 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB를 1 내지 10분 동안 자석에 부착시켰다. 이후, 상청액을 조심스럽게 흡인하고, BMB를 원래의 현탁액 부피와 대략 동일한 일정 부피의 세척 완충제(pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 mM 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-)에 재현탁시키고, 생성된 용액을 18 내지 27℃에서 약 15분 동안 인큐베이션하였다.
[0095] 인큐베이션이 완료된 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 배치하고 BMB를 1 내지 10분 동안 자석에 부착시켰다. 이후, 상청액을 조심스럽게 흡인하고, BMB를 원래의 현탁액 부피와 대략 동일한 부피의 검정 완충제에 재현탁시켰다. 검정 완충제: pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 및 약 145 nM 염화나트륨 중 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 및 약 0.05% Proclin 950. 생성된 현탁액을 혼합하면서 18 내지 27℃에서 약 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 항체 커플링된 BMB를 원래의 현탁액 부피와 대략 동일한 부피의 검정 완충제로 3회 세척하였다.
[0096] 이후, 항체 커플링된 BMB를 검정에 사용하기 위해 최종 요망되는 농도로 검정 완충제에 현탁시켰다.
실시예 4: 바코딩된 자성 비드에 대한 로다민의 커플링:
[0097] 물질:
[0098] BMB의 DMSO 세척:
[0099] 자기 랙 상의 1 mL 원심분리기 튜브에 저장 완충제에 현탁된 0.5 mL의 BMB를 첨가하여 100,000 BMB/mL의 농도를 제공하였다.
[00100] 본 방법에 사용하기에 적합한 BMB는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된 BMB이다. BMB는 염화나트륨(0.8%), 염화칼륨(0.02%), 디소듐 하이드로겐 포스페이트(0.144%), 포타슘 디하이드로겐 포스페이트(0.024%), Tween-20(0.05%), 및 ProClin-950(0.1 %)을 함유하는 저장 완충제에 제공된다.
[00101] 액체를 피펫으로 각각의 원심분리기 튜브로부터 제거한 후, 약 0.5 mL의 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 다시 자기 랙에 배치하고, 1분 동안 방치하고, DMSO를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다. 이후, 약 0.5 mL의 DMSO를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 격렬하게 볼텍싱하고, 실온에서 4시간 동안 믹서에 배치하였다.
[00102] 로다민-리사민으로의 코팅:
[00103] 4시간 동안 혼합한 후, 튜브를 제거하여 자기 스탠드에 배치하고, 1분 동안 방치시키고, DMSO를 피펫으로 제거하고, pH 약 9.0에서 약 0.5 mL의 약 150 mM EPPS 완충제를 튜브에 첨가하였다. 이후, EPPS 완충제 중 BMB를 함유하는 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 자기 스탠드에 다시 배치하고, EPPS 완충제를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다. 세척이 완료된 후, 약 0.5 mL의 EPPS 완충제를 각 튜브에 첨가하고 튜브를 볼텍싱하였다. 이후, 약 10.0 μM 로다민-리사민(DMSO 중 0.3 mg/mL 용액 9 μL) 또는 설포-로다민(대조군, DMSO 중 2.8 mg/mL 용액 1.2 μL)을 EPPS 완충제 중의 에폭시-기반 BMB에 첨가하였다. BMB의 현탁액을 빛으로부터 보호된 실온에서 약 22시간 동안 끝까지 회전시켰다. 이 시간 후, 코팅된 BMB를 자기 스탠드에 배치하고 용매를 피펫으로 제거하였다. 코팅된 BMB를 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 1.0 mL의 용액으로 짧은 볼텍싱으로 세척한 후, 용매를 제거하였다. 이 과정을 5회 반복하였다. 마지막으로, 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 1.0 mL의 용액을 코팅된 BMB에 첨가하여 약 50,000 BMBs/mL의 최종 농도를 제공하였다. 이후, 생성된 현탁액 중 약 5.0 μL의 BMB를 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하여 약 250 BMB/웰의 최종 카운트를 제공하였다. 약 200 μL의 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 용액을 각 웰에 첨가하여 검정에 사용하기 위한 BMB의 현탁액을 제공하였다.
[00104] 각 웰의 형광을 마이크로플레이트 리더(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)의 상업적 리더)를 사용하여 결정하였다.
[00105] 로다민-리사민으로 코팅된 에폭시 BMB는 마이크로플레이트 리더에서 상당한 형광을 나타내었고, 이는 로다민 프로브가 에폭시-기반 BMB 표면 상에 효율적으로 코팅되었음을 나타낸다. 반응성 아민 작용성을 갖지 않는 설포-로다민 대조군과 함께 인큐베이션된 에폭시-기반 BMB는 관찰 가능한 형광을 나타내지 않았다. 이는 에폭시-기반 BMB 표면에 대한 로다민 프로브의 비특이적 결합이 매우 낮다는 것을 입증하고, 로다민-리사민이 1차 아민 작용기를 통해 구체적으로 에폭시-기반 표면과 반응하고 있음을 나타낸다. 아민-작용성화된 소분자는 에폭시-기반 BMB 표면에 공유 결합할 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 5: 바코딩된 자성 비드에 대한 아민-함유 펩티드의 커플링:
[00106] 물질:
[00107] BMB의 DMSO 세척:
[00108] 자기 랙 상의 1 mL 원심분리기 튜브에 저장 완충제에 현탁된 약 0.2 mL의 BMB를 첨가하여 100,000 BMB/mL의 농도를 제공하였다.
[00109] 본 방법에 사용하기에 적합한 BMB는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된 BMB이다. BMB는 염화나트륨(0.8%), 염화칼륨(0.02%), 디소듐 하이드로겐 포스페이트(0.144%), 포타슘 디하이드로겐 포스페이트(0.024%), Tween-20(0.05%), 및 ProClin-950(0.1 %)을 함유하는 저장 완충제에 제공된다.
[00110] 액체를 피펫으로 각각의 원심분리기 튜브로부터 제거한 후, 약 0.2 mL의 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 다시 자기 랙에 배치하고, 1분 동안 방치하고, DMSO를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다. 이후, 약 0.2 mL의 DMSO를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 격렬하게 볼텍싱하고, 실온에서 4시간 동안 믹서에 배치하였다.
[00111] 4시간 동안 혼합한 후, 튜브를 제거하여 자기 스탠드에 배치하고, 1분 동안 방치하고, DMSO를 피펫으로 제거하고, pH 약 9.0에서 약 0.2 mL의 약 150 mM EPPS 완충제를 튜브에 첨가하였다. 이후, EPPS 완충제 중 BMB를 함유하는 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 자기 스탠드에 다시 배치하고, EPPS 완충제를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다.
[00112] 비오틴-라임 펩티드 및 Lyme-Alexafluor555 둘 모두의 약 0.1 mM 용액을 1.0 mM 스톡 용액으로부터 제조하였다. 각각의 펩티드는 다수의 리신 잔기를 갖지만, 시스테인 잔기 또는 다른 티올 기는 없다. 약 200 μL의 비오틴-라임 펩티드 용액, Lyme-Alexafluor555 용액, 또는 EPPS 완충제만을 함유하는 대조군을 BMB를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 생성된 BMB의 현탁액을 빛으로부터 보호된 실온에서 약 2시간 동안 끝까지 회전시켰다. 이 시간 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 랙에 배치하고 용매를 피펫으로 제거하였다. 이후, BMB를 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 0.2 mL의 용액으로 짧은 볼텍싱으로 세척한 후, 용매를 제거하였다. 이 과정을 2회 반복하였다.
[00113] 약 200 μL의 SA-PE(스트렙타비딘 피코에리트린)-함유 용액(SA-PE(Moss Inc.(Pasadena, MD)로부터 1 mg/mL 용액으로 상업적으로 입수 가능함)을 다중 검정 완충제: 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 145 nM 염화나트륨, 0.05% Tween-20, 1% 소 혈청 알부민, 0.05% ProClin 950로 희석함으로써 수득된, 8 μg/mL SA-PE)을 BMB에 첨가하고, 비드를 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상청액을 제거하고, BMB를 pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 0.2 mL의 용액으로 짧은 볼텍싱으로 세척한 후, 용매를 제거하였다. 이 과정을 5회 반복하였다. 마지막으로, pH 약 7.4에서, 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 0.4 mL의 용액을 코팅된 BMB에 첨가하여 약 50,000 BMBs/mL의 최종 농도를 제공하였다. 5.0 μL의 생성된 BMB 현탁액을 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하여 약 250 BMB/웰의 최종 카운트를 제공하고, 약 1.8 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 200 μL의 용액을 각 웰에 첨가하여 검정에 사용하기 위한 BMB의 현탁액을 제공하였다.
[00114] 각 웰의 형광을 마이크로플레이트 리더(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)의 상업적 리더)를 사용하여 결정하였다.
[00115] 비오틴-라임 펩티드 및 라임-알렉사플루오르555 펩티드로 코팅된 BMB는 둘 모두 마이크로플레이트 리더에서 유의한 형광을 나타내어 펩티드가 BMB 표면 상에 효율적으로 코팅되었음을 나타낸다. 대조군에서 관찰된 형광의 결여는 BMB 표면에 대한 SA-PE 분석물의 비특이적 결합이 매우 낮다는 것을 입증하고, 비오틴-라임 펩티드 및 라임-Alexafluor555 펩티드가 펩티드의 리신 잔기에 함유된 일차 아민 작용성을 통해 에폭시 표면과 특이적으로 반응한다는 것을 나타낸다. 리신(아민 작용성) 함유 펩티드는 에폭시 BMB 표면에 공유 결합할 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 6: 바코딩된 자성 비드를 사용한 검정 후 시트레이트 완충제 세척:
바코딩된 자성 비드에 대한 생체분자 프로브의 커플링:
[00116] 자기 랙 상의 1 mL 원심분리 튜브에 저장 완충제에 현탁된 약 0.2 mL(부피는 약 0.1 mL 내지 약 500 mL로 다양할 수 있음)을 첨가하여 약 100,000 BMB/mL의 농도(농도는 약 100,000 BMB/mL 내지 약 300만 BMB/mL)의 범위일 수 있음)를 제공하였다.
[00117] 본 방법에 사용하기에 적합한 BMB는 에폭시-기반 네거티브 포토레지스트(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)인 SU-8로부터 제조된 BMB이다. BMB는 염화나트륨(0.8%), 염화칼륨(0.02%), 디소듐 하이드로겐 포스페이트(0.144%), 포타슘 디하이드로겐 포스페이트(0.024%), Tween-20(0.05%), 및 ProClin-950(0.1 %)을 함유하는 저장 완충제에 제공된다.
[00118] 액체를 피펫으로 각각의 원심분리기 튜브로부터 제거한 후, 약 0.2 mL의 DMSO(Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 다시 자기 랙에 배치하고, 1분 동안 방치하고, DMSO를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다. 한 구현예에서, 이후 약 0.2 mL의 DMSO를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 격렬하게 볼텍싱하고, 실온에서 4시간 동안 믹서에 배치하였다. 실온에서 이러한 4시간 혼합은 선택적이다.
[00119] 혼합 후, 튜브를 제거하여 자기 스탠드에 배치하고, 1분 동안 방치하고, DMSO를 피펫으로 제거하고, pH 약 9.0에서 약 0.2 mL의 약 150 mM EPPS 완충제를 튜브에 첨가하였다. 이후, EPPS 완충제 중 BMB를 함유하는 튜브를 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하고, 자기 스탠드에 다시 배치하고, EPPS 완충제를 피펫으로 제거하였다. 이러한 세척 절차를 2회 더 반복하였다. EPPS로 최종 세척한 후, 각각의 펩티드 및 항체가 별개의 바코드의 BMB와 조합되도록, BMB를 하기 (A) 및 (B)에 각각 기술된 바와 같이 펩티드 또는 항체로 코팅하였다.
(A) 펩티드에 의한 BMB의 코팅
[00120] 아나플라스마, 에를리키아 또는 보렐리아에 대한 환자 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드(생화학적 프로브)(예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 아나플라스마 파고사이토필룸, 아나플라스마 플라티스, 에를리키아 카니스, 에를리키아 에윙기, 또는 보렐리아 부르그도르페리의 단백질 서열로부터 유래된 펩티드)를 N-말단 시스테인을 갖지만 PEG 링커를 갖지 않는 보렐리아로부터 유래된 펩티드를 제외하고, 상기 기재된 바와 같이 PEG12 링커를 통해 각각의 펩티드의 N-말단에 링킹된 시스테인으로 합성하였다. 약 200 μL의 각 펩티드의 약 0.1 mM 용액을 EPPS-세척된 BMB를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 생성된 BMB의 현탁액을 빛으로부터 보호된 실온에서 약 2시간 동안 끝까지 회전시켰다. 이 시간 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 랙에 배치하고 용매를 피펫으로 제거하였다. 이후, BMB를 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 0.2 mL의 용액으로 짧은 볼텍싱으로 세척한 후, 용매를 제거하였다. 이 과정을 2회 반복하였다.
(B) 항체에 의한 BMB의 코팅
[00121] 감염된 동물의 혈액에서 순환하는, 상기 기재된 바와 같은, 심장사상충(디로필라리아 임미티스)으로부터의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 약 10 mg/mL의 농도(항체 농도는 약 1.5 mg/mL 내지 약 12.0 mg/mL의 범위일 수 있음)의 약 200 μL의 항체(생화학적 프로브)를 BMB를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 생성된 BMB의 현탁액을 빛으로부터 보호된 실온에서 약 2시간 동안 끝까지 회전시켰다. 이 시간 후, BMB를 함유하는 튜브를 자기 랙에 배치하고 용매를 피펫으로 제거하였다. 이후, BMB를 약 1.8 mM의 일염기성 소듐 포스페이트, 약 8.4 mM의 이염기성 소듐 포스페이트, 약 145 nM의 염화나트륨, 및 약 0.05% Tween-20의 약 0.2 mL의 용액으로 짧은 볼텍싱으로 세척한 후, 용매를 제거하였다. 이 과정을 2회 반복하였다.
검정:
[00122] (A) 또는 (B)에서 상기 기재된 생체분자 프로브로 코팅된 BMB(검정 완충제 중 65,000 BMB/mL(PBS 중 1.0% BSA, 0.05% Tween, 0.05% Proclin 950))를 혼합하여 다중 BMB 혼합물을 형성하였다. 다중 BMB 혼합물을 검정 완충제로 추가로 희석하여 각각의 생체분자 프로브의 500 BMB/mL의 농도를 달성하였다.
[00123] 약 100 μL의 이러한 희석된 다중 BMB 혼합물을 인테그라 자동 피펫(Integra Biosciences Corp.(Hudson, NH)로부터 상업적으로 입수 가능함)을 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰(즉, 생체분자 프로브 당 약 50개 비드)에 첨가하였다. BMB를 405-TS 플레이트 워셔(BioTek®, Winooski, VT로부터 상업적으로 입수 가능함)에서 300 μL의 PBS 중 0.05% Tween-20으로 10초 침지로 5회 세척하였다. 최종 세척 후, 과량의 상청액(약 30 μL)이 최종 세척 후 플레이트에 남았다.
[00124] 50 μL의 샘플(혈청 또는 혈장, 순수)을 96 웰 플레이트 상의 각 웰의 BMB에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 플레이트 믹서에 배치하고 1000 rpm에서 30분 동안 혼합하였다. 30분 인큐베이션 후, BMB를 300 μL의 PBS 중 0.05% Tween-20으로 10초 침지로 세척하였다.
[00125] PBS 중 1.0% BSA, 0.05% Tween, 0.05% Proclin 950 중의 50 μL의 각각의 비오티닐화된 펩티드(2.0 μg/mL, 즉, 생체분자 프로브로서 사용된 동일한 펩티드) 또는 비오티닐화된 항-심장사상충 항체(1.0 μg/mL)를 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 플레이트 믹서에 배치하고 15분 동안 혼합하였다. 15분 인큐베이션 후, BMB를 300 μL의 PBS 중 0.05% Tween-20으로 10초 침지로 세척하였다.
[00126] 50 μL의 SA-PE, 8.0 μg/mL(MOSS Inc., Pasadena, MD 카탈로그 번호 SAPERP01로부터 상업적으로 입수 가능함)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 플레이트 믹서에 배치하고 10분 동안 혼합하였다. 10분 인큐베이션 후, BMB를 300 μL의 PBS 중 0.05% Tween-20으로 10초 침지로 세척하였다.
[00127] 생성된 BMB를 2개의 절차 중 하나로 처리하였다.
[00128] 첫 번째 절차에서, 96 웰 플레이트의 각 웰에
(i) 약 200 μL의 완충제(Applied BioCode Inc., Santa Fe Springs, CA, 카달로그 번호 44-D0004-500으로부터 상업적으로 입수 가능함)(표준 판독 완충제)를 첨가하였다.
[00129] 두 번째 절차에서, 96 웰 플레이트의 각 웰에
(ii) 삼염기성 소듐 시트레이트 이수화물(0.485 M), 시트르산(0.015 M), 염화나트륨(0.1 M), Proclin 950(0.5 mL/L), pH 6.1 내지 6.3을 함유하는, 약 200 μL의 시트레이트 완충제의 용액(시트레이트 판독 완충제)를 첨가하였다.
[00130] 이온 강도는 비드의 표면에 형성된 면역복합체의 안정성을 가능하게 하는 중요한 인자이다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 안정화 효과는 용액을 해리에 바람직하지 않게 만드는 높은 염 농도 때문인 것으로 여겨진다. 시트레이트 염 이외의 염이 또한 높은 이온 강도에서 작용하지만, 이들은 최소 농도가 약 0.5M이어야 한다. 그러나, 다른 염은 주위 온도보다 낮은 온도에서 용액에서 빠져 나오기 때문에 제조성 또는 선적에 이상적이지 않다. 유리하게는, 시트레이트 완충제의 혼합물은 냉장 조건에서 저장되거나 운송될 때 용액에 남아 있다.
[00131] BioCode® 2500 분석기(Applied BioCode Corp.(Santa Fe Springs, CA)로부터 상업적으로 입수 가능함)를 사용하여 각 웰의 형광을 결정하였다.
[00132] 96-웰 플레이트(즉, 12개의 열(1 내지 12) 및 8개의 행(A 내지 H)을 갖는 플레이트)의 각 웰에서 각 샘플의 형광 강도를 결정하였다. 도 1은 표준 판독 완충제 함유(도 1a)를 사용하고, 시트레이트 판독 완충제(도 1b)를 사용하여 관찰된 신호 강도를 예시한다. 실험에서, 96-웰 플레이트(즉, 12개의 열(1 내지 12) 및 8개의 행(AH)를 갖는 플레이트)의 각각의 웰을 동일한 BMB(즉, 상기 기재된 바와 같이, 비드에 결합된 모든 것)로 채우고, 1열(즉, 웰 1A 내지 1H)에서 12열(즉, 웰 12A 내지 12H)로 신호를 판독하였다. 96 웰 플레이트의 모든 세포(즉, 세포 1A 내지 12H)에서 형광을 판독하는 시간은 대략 37분이 걸린다. 도 1a에서 볼 수 있는 바와 같이, 표준 판독 완충제(이는 시트레이트를 함유하지 않는 완충제임)가 사용될 때, 즉, 절차 (i)의 경우, 판독 사이클의 시작부터 판독 사이클의 끝까지(대략 37분) 신호 강도가 점진적으로 감소한다. 대조적으로, 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, 시트레이트 판독 완충제가 사용될 때, 즉, 절차 (ii)의 경우, 판독 사이클의 시작부터 판독 사이클의 끝까지(약 37) 신호 강도의 감소는 관찰되지 않았다. 시트레이트 판독 완충제와 같은 시트레이트 함유 완충제를 사용할 때가 아닌, 시트레이트 비함유 완충제, 예컨대, 표준 판독 완충제를 사용할 때 판독 주기 동안 신호 강도의 이러한 감소는, 도 1a 및 도 1b의 X 축에서 "AP", "Aph", 및 "Ap1"으로 명명된 3개의 아나플라스마 유래된 펩티드 각각에 대한 항체 특이적 검정에서 발생하였다.
[00133] 도 1은 형광을 판독하기 전에 BMB를 시트레이트 완충제와 접촉시키는 것이 유리하게는 다른 완충제와 비교하여 시간의 함수로서 형광의 감소를 피한다는 것을 보여준다.
[00134] 시간의 함수로서 신호 강도에 대한 표준 및 시트레이트 판독 완충제의 유사한 효과가 에를리키아 카니스, 에를리키아 에윙기로부터 유래된 펩티드에 특이적인 항체에 대한 검정 및 보렐리아 부르그도르페리에 대한 검정(도시되지 않음)에서 관찰되었다.
[00135] 인용된 모든 참고문헌의 전체 개시내용은 본원에 참조로서 포함된다.

Claims (62)

  1. 생물학적 분석을 위한 기재를 제조하는 방법으로서,
    (i) 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계; 및
    (ii) 생체분자 프로브를 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉시켜 상기 생체분자 프로브가 상기 에폭시-기반 수지에 직접 결합되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생체분자 프로브가 지질, 다당류, 아미노산, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 항체 및 이들의 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 생체분자 프로브가 항체인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재가 필름, 마이크로비드; 마이크로입자; 마이크로 펠렛; 마이크로 웨이퍼; 상자성 비드; 바코드를 함유하는 마이크로입자; 상자성 마이크로입자; 바코드를 함유하는 마이크로입자; 바코드를 함유하는 상자성 마이크로입자; 및 니켈 바코드를 함유하는 비드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 생체분자 프로브가, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 상기 생체분자 프로브의 용액과 접촉시킴으로써 상기 에폭시-기반 수지와 접촉되어 접촉 혼합물을 제공하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 용액이 수용액인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 수용액이 pH 약 5.5에서 약 100 mM MES 및 약 140 mM 구아니딘-HCl로 완충되는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 수용액이 pH 약 8에서 약 100 mM EPPS 및 140 mM 구아니딘-HCl로 완충되는, 방법.
  9. 제5항에 있어서, 용액이 DMSO 용액인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, DMSO 용액이 약 1%의 Tween-20을 함유하는, 방법.
  11. 제5항에 있어서, 용액 중 생체분자 프로브의 농도가 약 0.05 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 범위인, 방법.
  12. 제5항에 있어서, 접촉 혼합물에서 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재의 농도가 약 5만 내지 약 500만 기재/mL의 범위인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 적어도 약 4시간 동안 접촉되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 약 4시간 내지 약 18시간 동안 접촉되는, 방법.
  15. 제5항에 있어서, 접촉 혼합물이 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 유지되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재가 생체분자 프로브와 접촉되기 전에 DMSO로 세척되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, DMSO가 약 1%의 Tween-20을 함유하는, 방법.
  18. 제1항의 방법에 의해 제조된 생물학적 분석을 위한 기재.
  19. 생물학적 분석을 위한 기재로서, 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 포함하는, 기재.
  20. 생물학적 분석을 위한 기재를 제조하는 방법으로서,
    (i) (a) pH 약 5.5에서, 약 100 mM MES 및 약 140 mM 구아니딘-HCl로 완충된 수용액 및 (b) pH 약 8에서, 약 100 mM EPPS 및 140 mM 구아니딘-HCl로 완충된 수용액으로 구성된 군으로부터 선택된 용매 중의 생체분자 프로브의 용액을 제공하는 단계
    ― 상기 생체분자 프로브의 농도는 약 0.05 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 범위임 ―;
    (ii) 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계;
    (iii) 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 0.05% Tween-20을 함유하는 포스페이트 완충된 염수(PBS) 용액으로 세척하여 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 PBS 세척된 기재를 제공하는 단계;
    (iv) 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 PBS 세척된 기재를 DMSO로 세척하여 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재를 제공하는 단계;
    (v) 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재를 상기 생체분자 프로브의 용액과 조합하여 상기 생체분자 프로브가 상기 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계 ― 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재의 농도는 약 5만 내지 약 500만 기재/mL의 범위임 ―; 및
    (vi) 상기 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 pH 약 7.4에서 약 1% BSA, 약 0.05% Tween-20, 및 약 0.05% Proclin 950을 함유하는 PBS로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 생체분자 프로브가 항체인, 방법.
  22. 생물학적 분석을 위한 기재를 제조하는 방법으로서,
    (i) 약 1% Tween-20을 함유하는 DMSO 중 생체분자 프로브의 용액을 제공하는 단계
    ― 상기 생체분자 프로브의 농도는 약 0.05 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 범위임 ―;
    (ii) 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계;
    (iii) 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 약 1% Tween-20을 함유하는 DMSO로 세척하여 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재를 제공하는 단계;
    (iv) 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재를 상기 생체분자 프로브의 용액과 조합하여 상기 생체분자 프로브가 상기 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계 ― 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 DMSO 세척된 기재의 농도는 약 5만 내지 약 500만 기재/mL의 범위임 ―; 및
    (v) 상기 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 상기 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재를 pH 약 7.4에서 약 1% BSA, 0.05% Tween-20, 및 0.05% Proclin 950을 함유하는 PBS로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 생체분자 프로브가 시스테인 잔기를 함유하는, 방법.
  24. 제3항에 있어서, 항체가 회충으로부터의 분변항원(coproantigen)에 특이적으로 결합하는 항체, 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 십이지장충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 심장사상충으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 지아르디아(Giardia)로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제21항에 있어서, 항체가 회충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 십이지장충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 심장사상충으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 지아르디아로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제2항에 있어서, 생체분자 프로브가 감염원에 의해 발현된 단백질, 상기 감염원에 의해 발현된 상기 단백질의 일부, 감염원에 의해 발현된 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 재조합 단백질, 또는 상기 감염원에 의해 발현된 상기 단백질의 변이체인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 생체분자 프로브가 에를리키아(Ehrlichia), 아나플라스마(Anaplasma), 및 보렐리아(Borrelia)로 구성된 군으로부터 선택된 속으로부터의 박테리아에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 생체분자 프로브가 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis), 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 에를리키아 에윙기(Ehrlichia ewingii), 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophylum), 아나플라스마 플라티스(Anaplasma platys), 및 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 생체분자 프로브가 디로필라리아 임미티스(Dirofilaria immitis)에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  30. 제3항에 있어서, 생체분자 프로브가 디로필라리아 임미티스의 항원에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  31. 제26항에 있어서, 생체분자 프로브가 대사산물에 대해 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 대사산물이 SDMA인, 방법.
  33. 샘플 내 분석물의 존재 여부를 검정하기 위한 방법으로서, 상기 샘플을 에폭시-기반 수지에 직접 결합된 생체분자 프로브를 갖는 에폭시-기반 수지를 포함하는 표면을 갖는 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 생체분자 프로브는 분석물과 특이적으로 결합하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 샘플이 대변 샘플인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 분석물이 장내 기생충에 의해 발현되는 항원이고, 생체분자 프로브가 상기 장내 기생충에 의해 생성된 항원에 대한 항체인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 장내 기생충에 의해 생성된 항원에 대한 항체가 회충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 편충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 십이지장충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 촌충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체, 심장사상충으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 지아르디아로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 샘플이 대상체로부터의 혈액 샘플인, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 분석물이 감염원에 의해 생성된 단백질에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 생성된 항체이고, 생체분자 프로브가 상기 단백질, 상기 감염원에 의해 생성된 단백질의 일부, 또는 상기 감염원에 의해 생성된 단백질의 변이체인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 생체분자 프로브가 에를리키아, 아나플라스마, 및 보렐리아로부터 선택된 군으로부터의 박테리아에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 생체분자 프로브가 에를리키아 카니스, 에를리키아 샤펜시스, 에를리키아 에윙기, 아나플라스마 파고사이토필룸, 아나플라스마 플라티스, 및 보렐리아 부르그도르페리로부터 선택된 군으로부터의 박테리아에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  41. 제38항에 있어서, 생체분자 프로브가 디로필라리아 임미티스에 대해 대상체에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  42. 제38항에 있어서, 생체분자 프로브가 대사산물에 대해 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대사산물이 SDMA인, 방법.
  44. 제37항에 있어서, 분석물이 병원체로부터 유래된 항원, 항원의 단편, 또는 병원체로부터 유래된 항원의 변이체이고, 생체분자 프로브가 항원에 특이적인 항체인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 병원체가 디로필라리아 임미티스인, 방법.
  46. 샘플 중 분석물의 존재 여부를 검정하는 방법으로서,
    (a) 제1 완충 용액에서 분석물과 생화학적 프로브 사이에 복합체를 형성하는 단계 ― 상기 복합체는 신호를 제공함 ―;
    (b) 상기 제1 완충 용액을 제2 완충 용액으로 대체하는 단계; 및
    (c) 상기 신호의 강도를 판독하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 제1 완충 용액이 제1 이온 강도를 갖고, 제2 완충 용액이 제2 이온 강도를 갖고, 상기 제2 이온 강도가 상기 제1 이온 강도보다 높은, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 제2 이온 강도가 적어도 0.4 M인, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 제2 이온 강도가 적어도 0.5 M인, 방법.
  50. 제47항에 있어서, 제2 이온 강도가 적어도 0.6 M인, 방법.
  51. 제46항에 있어서, 제2 완충제가 시트레이트 완충제인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 시트레이트 완충제가 적어도 0.5 M의 이온 강도를 갖는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 시트레이트 완충제가 삼염기성 소듐 시트레이트 이수화물, 시트르산, 염화나트륨, Proclin 950을 포함하고, 약 5.5 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, pH가 약 pH 6.0 내지 약 6.5의 범위인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, pH가 약 pH 6.1 내지 약 6.3의 범위인, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 삼염기성 소듐 시트레이트 이수화물의 농도가 약 0.485 M이고, 시트르산의 농도가 약 0.015 M이고, 염화나트륨의 농도가 약 0.1 M이고, Proclin 950의 농도가 약 0.5 mL/L인, 방법.
  57. 제46항에 있어서, 분석물이 아나플라스마, 에를리키아 또는 보렐리아의 단백질 서열로부터 유래된 펩티드인, 방법.
  58. 제55항에 있어서, 펩티드가 아나플라스마 파고사이토필룸, 아나플라스마 플라티스, 에를리키아 카니스, 에를리키아 에윙기, 또는 보렐리아 부르그도르페리의 단백질 서열로부터 유래된 펩티드인, 방법.
  59. 제46항에 있어서, 분석물이 심장사상충(디로필라리아 임미티스)으로부터의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인, 방법.
  60. 제46항에 있어서, 생체분자 프로브가 에폭시-기반 수지에 결합되는, 방법.
  61. 제46항에 있어서, 생화학적 프로브가 폴리펩티드 또는 단백질이고, 분석물이 상기 생화학적 프로브에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이고, 샘플이 환자로부터 수득되는, 방법.
  62. 제46항에 있어서, 생화학적 프로브가 항체이고, 분석물이 상기 생화학적 프로브에 특이적으로 결합할 수 있는 항원이고, 샘플이 환자로부터 수득되는, 방법.
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