JP2005147718A

JP2005147718A - マイクロビーズアレイ作製法

Info

Publication number: JP2005147718A
Application number: JP2003381765A
Authority: JP
Inventors: Yoshishige Harada; 慶恵原田; Yasuhiro Takaya; 康尋貴家
Original assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Current assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2005-06-09

Abstract

【課題】核酸-タンパク質分子間相互作用やタンパク質-タンパク質分子間相互作用等のタンパク質の機能解析を効率化、自動化するためのマイクロビーズアレイ作製方法の提供。
【解決手段】マイクロビーズを光ピンセットで捕捉し、当該マイクロビーズを基板上に固定化することを特徴とする、高密度集積化マイクロビーズアレイの製造方法、前記方法により作製されたマイクロビーズアレイ、及び、標識された被験物質とマイクロビーズアレイとを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを特徴とする、相互作用物質の分析方法を提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、光ピンセットを使ってガラス基板上の任意の位置に１個１個のマイクロビーズを固定する方法に関するものである。特に本発明は、核酸-タンパク質分子間相互作用やタンパク質-タンパク質分子間相互作用等のタンパク質の機能解析を効率化、自動化するためのマイクロビーズアレイ作製方法に関する。

近年、ゲノムプロジェクトの進展とともに、遺伝子の発現解析や遺伝子産物であるタンパク質の機能解析に関する注目が高まり、網羅的な遺伝子発現解析、タンパク質発現解析、さらにタンパク質相互作用解析が非常に重要になりつつある。遺伝子の網羅的発現解析法として、DNAプローブ断片を基板上に整列・固定したマイクロアレイを作製し、検体との間でハイブリダイゼーションを起こさせて、特定のDNAだけを基板上にトラップして検出するDNAチップが使われるようになっている（非特許文献１）。

タンパク質の機能解析法としては、1989年にin vivoでタンパク質の相互作用を調べることができる酵母のTwo-Hybridシステムが開発された。このシステムの内容は、遺伝子の転写因子を2つに分けて、それぞれにリガンドと調べたいタンパク質を結合させるというものである。そして、これらが相互作用し、完全な転写因子ができたときに、遺伝子が転写され、その産物によって細胞の色の変化がおこる。つまり、細胞の色の変化からリガンドとタンパク質の相互作用の有無を知ることができる方法である。しかし、この方法は、莫大な時間と労力を必要とし、網羅的な解析には向かない。

一方、タンパク質の発現解析や、機能解析でもDNAチップに相当するプロテインチップが用いられ始めている。例えば、BIACORE社の装置を用いた方法は、ガラスに金の薄膜を蒸着したセンサーチップ表面に既知のリガンドを固定し、そこに細胞抽出液を流し、リガンドへの細胞抽出液中に含まれるタンパク質の結合による屈折率の変化を表面プラズモン共鳴で解析するものである。この方法は、結合の特異性、結合解離の速度定数等をタンパク質を標識することなく調べることができる上に、酵母のTwo-Hybridシステムに比べると解析時間や労力も格段に改善され、非常に便利なシステムである。また、別のタンパク質分子間相互作解析システムとして、BIACORE社と同じようなプロテインチップと飛行時間型質量分析計を組み合わせたタンパク質解析システム、数百種類の抗体を並べた抗体アレイなどが知られており、抗体との結合の有無を、短時間に比較的安価に調べることができるようになった。研究室レベルでも様々なprotein kinaseや低分子のリガンドを結合させたチップを使った研究も紹介されている。このように、プロテインチップを使った方法は、少量の試料で、迅速、高感度に結合を見ることができる点で優れている。

しかしながら、BIACORE社のシステムは、一度に多検体を扱うことが困難であるため、網羅的解析には向かない。また、測定中試料溶液を流し続けなければならないので、多量の試料を必要とする。一方、上記タンパク質解析システムや抗体アレイシステム、あるいはDNAチップを用いたシステムでは、相互作用をアナライザーで検出するためには、サンプル添加後、相互作用しなかった分子を除くための洗浄過程を必要とするので、結合速度、解離速度など動的相互作用の情報を得ることが困難である。

そこで、少量の試料で、一度に多検体の生体分子間の動的相互作用を迅速かつ高感度に解析できる新しいシステムの開発が、遺伝子の発現やタンパク質機能を網羅的に研究するために必要とされている。
Kozal, M. J. et al.,Nature Medicine 2, 753-759 (1996)

本発明は、生体分子間の動的相互作用を少量の生体分子試料を用いて網羅的に迅速かつ高感度に解析する新しいシステムのための、高密度集積化マイクロビーズアレイ作製技術を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、低背景光蛍光顕微鏡システム、光ピンセット及び光反応性架橋試薬を用いてマイクロビーズを基板上に固定化することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）マイクロビーズを光ピンセットで捕捉し、基板上に固定することを特徴とする高密度集積化マイクロビーズアレイの製造方法。

マイクロビーズの集積密度は、例えば150個 / 7500μｍ²(2×10⁶個 / cｍ²)〜3000個 /7500μｍ²(4×10⁷個 / cｍ²)である。

本発明の方法において、基板上へのマイクロビーズの固定は光反応性架橋試薬を用いることができ、例えば共有結合により固定することが可能である。

上記マイクロビーズの表面には、被験物質の相互作用相手を結合させることができる。
（２）光ピンセットで捕捉されたビーズが基板に固定された高密度集積化マイクロビーズアレイ。

本発明のアレイにおいて、マイクロビーズの基板上への固定は光反応性架橋試薬を用いることができ、例えば共有結合により固定することが可能である。

上記マイクロビーズの表面には、被験物質の相互作用相手を結合させることができる。
（３）被験物質と相互作用する物質の分析方法であって、標識された被験物質と前記アレイとを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを特徴とする前記方法。
（４）被験物質と相互作用する物質のスクリーニング方法であって、標識された被験物質と前記アレイとを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを特徴とする前記方法。
（５）前記アレイを含む、被験物質と相互作用する物質の分析又はスクリーニング用キット。

本発明により、マイクロビーズを基板上に高密度に順番に並べたアレイを作製することができる。

本発明の方法により、タンパク質、DNA等のプローブアレイを作製し、低背景光蛍光顕微鏡システムと組み合わせることで、わずかな試料量で複数の生体分子の動的相互作用を一度に実時間観察できる。試料が少量で解析できることから、in vitro翻訳系で調製した試料の量で十分である。実施例2及び3で示すように、in vitro翻訳系の溶液中に蛍光標識ピューロマイシンを加えておくことで、蛍光標識も非常に簡単に行うことができる。in vitro転写・翻訳系を使えば、解析したいタンパク質をコードしたDNAを溶液に加え、反応を始めてからわずか数時間後には、相互作用解析が終了する。したがって、本発明は、cDNAライブラリーの機能解析等を短時間で簡単に行うための有効な手段となる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、マイクロビーズを、光ピンセットにより基板上に高密度に集積固定することにより、生体分子等の分析に適したマイクロビーズアレイを作製することを特徴とする。また、抗体などの生体分子を結合させたマイクロビーズを基板に固定したアレイを作製し、使用することで、これと相互作用する物質（抗原）のスクリーニング等を行うことができる。その際、基板に固定したビーズのみが検出シグナルを発するように、本発明においては低背景光蛍光顕微鏡システムを使用することが可能である。

分子間相互作用を分析する際に、BIACORE社のシステム以外の市販のチップを使ったシステムでは、動的相互作用の情報を得ることができない。その理由は、相互作用を検出するために、結合しなかった試料を除かなければならないからである。試料の相互作用の有無を試料に結合させた蛍光色素を指標として検出するシステムの場合、チップ上のリガンドに結合しなかった試料を除かなければ、アナライザーでの解析時に、チップ上のスポットに結合した試料も結合していない試料も励起されて蛍光を発するために、蛍光標識した試料が結合したスポットと結合しなかったスポットの区別がつかない。チップ上のスポットに結合した試料だけを選択的に励起することができれば、結合しなかった分子を除去する必要がなくなり、動的な結合・解離を直接解析することができる。

本発明者は、ガラス表面のごく近傍を局所励起することで、ガラスに吸着した個々の蛍光色素分子をイメージングすることができる、全反射照明（エバネッセント照明）を組み込んだ低背景光蛍光顕微鏡システムを使って、遊離の蛍光標識分子が存在した状態であっても、チップ上のスポットに結合した蛍光標識分子を可視化することでハイスループットに対応した分子間相互作用解析システムを構築することを考えた。

低背景光蛍光顕微鏡の場合、60倍、あるいは100倍の対物レンズを使用しなければならない。これらの対物レンズを使用すると、その視野は、直径100マイクロメートル程度である。ハイスループットに対応するためには、視野内に相互作用を調べる生体分子試料をアレイ化しなければならない。現在、市販されているDNAチップや抗体チップなどは、スポットの径が大きすぎるために使用することはできない。そこで、顕微鏡の視野内に生体分子を配列させるため、光ピンセット技術と架橋試薬によるアレイ化を考案した。

光ピンセット法を使うと顕微鏡下で直径数マイクロメートル程度のプラスチックビーズを操作することができる。すなわち、あらかじめ生体分子を付けたプラスチックビーズを光ピンセットで捕捉し、基板上の任意の位置に移動させ、その位置で架橋剤を用いて固定するという操作を繰り返すことによって、ビーズを規則正しく並べ、高密度に集積させたプローブアレイを作製することができる。
１．光ピンセット
「光ピンセット」とは、レーザー光を対物レンズで集光させ、数μm程度の微小粒子を光でトラップすることを意味する。光は波としての性質と粒子としての性質を持っている。光の粒子すなわち光子が物体に衝突すると物体は光子から力を受ける。媒質と異なる屈折率をもつ物体を光が通過する時、光は屈折する。粒子である光子は運動量を持っているので、屈折によって物体に力が及ぼされることになる。

高倍率で、開口数の大きい対物レンズでレーザーを集光し、その焦点を微小粒子の少し上の位置に結ばせた状態を考える。図１で光線Aは微小粒子に入射した際に屈折され、屈折された光線Aの運動量変化によって、粒子には運動量を保存するように力が粒子表面に対して垂直方向に作用（F_A1）する。また、微小粒子内を通過し再度媒質内に出射するときにも、表面に垂直方向に力F_A2が作用し、両者の合力として、力F_Aが生じる。光線Aと同様に、光線Bから生じた合力がF_Bとなる。結果、粒子全体には上向きの力Fが作用することになる。この力Fが重力よりも大きくなると、微小粒子の浮揚が起こる。レーザー光による力と重力とが釣り合った位置で安定となり、微小粒子は捕捉されることとなる。レーザーの焦点が微小粒子よりも下にある場合や光軸の中心が粒子の中心とずれている場合も、光の微小粒子に対する力は、焦点方向に作用し、結果的として粒子は捕捉される。

微小粒子を目的の位置に移動させるに際し、水平方向（X-Y方向）の移動は顕微鏡のステージを水平移動させることにより、垂直方向への移動はレーザー光の力を調節することにより、それぞれ行うことができる。

生体分子を扱う場合、レーザーのエネルギー吸収によるダメージを防ぐために、生体分子がわずかなエネルギーしか吸収せず、ダメージを与えることなく捕捉することができる近赤外の波長のレーザーを使う。本発明において使用されるレーザーとしては、Nd:YAGレーザー、Nd:YLFレーザー、Ti:sapphire レーザーなどが挙げられる。レーザーの波長は650〜1100nm、出力は5mW〜10Wである。
２．架橋工程
本発明において、ビーズを基板に固定するための架橋工程は、 (a)ガラス表面のアミノ化、(b)架橋剤の固定、及び(c)ビーズの固定の３つの工程からなる（図２、図３）。

(a) カバーガラスのアミノ化
まず、アミノシランを用いて常法にしたがってガラス（カバーガラス等）の表面をアミノ化する（図２）。すなわち、エタノールに5%(v/v)γ-アミノプロピルトリエトキシシラン、2.9% (v/v)水、1mN HClを加え、一晩重合させたアミノシラン液に、洗浄したガラス（カバーガラス等）を浸したのち風乾させ、乾燥後純水で洗浄し再び乾燥させる。

アミノシランとしては、特に限定されるものではなく、例えばγ-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-(2-アミノエチルアミノプロピル)トリメトキシシランなどが挙げられる。

(b) 架橋剤の固定
アミノ基反応性残基と光反応性残基を持つ架橋剤のアミノ基反応性残基をガラス表面のアミノ基と反応させ、架橋剤（光反応性のもの）を固定する。光反応性架橋剤としては、例えばsulfo-SANPAH（Sulfosuccinimidyl 6-[4'-azido-2'-nitrophenylamino]hexanate）（図３）、sulfo-SADP（Sulfosuccinimidyl [4-azidophenyldithio]propionate）、sulfo-NHS-LC-ASA（Sulfosuccinimidyl [4-azidosalicylamido]hexanate）、sulfo-HSAB (N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate)、SAND（Sulfosuccinimidyl 2-[m-azido-o-nitrobenzamide]ethyl-1,3'-dinitropropionate）などが挙げられる。

(c) ビーズの固定
ビーズの固定化は、アミノ基反応性残基と光反応性残基を持つ架橋剤を使う。ビーズを光ピンセットで捕捉し、固定したい場所に移動した後、架橋剤で処理した基板に押しつける（ステージを上下して押しつける）。

本発明において使用される基板は、ビーズを固定化できる限り限定されるものではなく、ガラス基板、シリコン製基板、アクリル製基板、金属性基板などが挙げられる。また、ビーズは、ポリスチレン、ポリエチレン、ガラス、シリコン製の材質ものを使用することができ、ビーズの大きさは、直径が0.2〜3μｍ、好ましくは0.3〜2μｍ、さらに好ましくは0.5〜1μｍ程度である。

次に、ビーズの直径程度に絞った架橋剤の光分解波長の光をビーズに照射し、ビーズをガラスに固定する（図2）。光反応性架橋剤には光分解波長が270nm付近のものと、320〜350nmのものがあるが、光照射によって生体分子の機能を損なわないようにするためには、光分解波長が320〜350nmの紫外線を使用することが好ましい。

ビーズの固定化の作業は、光ピンセットの動きをコンピューターで制御し、光照射やチャンバーへのビーズ懸濁液の注入、チャンバーの緩衝液による洗浄等を光ピンセットの動きと連動させて行うことで全自動化が可能である。

(d) 高密度集積
本発明において、「高密度に集積」とは、顕微鏡の視野内に収まるように150個 / 7500μｍ²(2×10⁶個 / cｍ²)〜3000個 /7500μｍ²(4×10⁷個 / cｍ²)の密度で多数のビーズを基板に配列させることを意味する。顕微鏡の視野内は、直径が100 μm程度であり、視野の面積は7500μｍ²（ただし、円周率πは便宜上３として計算した）である。この面積の視野内に150〜3000個、好ましくは150〜600個のビーズ（密度：2×10⁶個 / cｍ²〜4×10⁷個 / cｍ²、好ましくは2×10⁶個 / cｍ²〜8×10⁶個 / cｍ²）を配列させる。但し、顕微鏡の視野全体にビーズを配列させる必要はなく、視野内のさらに一区画（例えば50μ四方の領域内）に、密度が2×10⁶個 / cｍ²〜4×10⁷個 / cｍ²となるようにビーズを配列させてもよい。例えば、2500μｍ²(50μ四方の領域の面積)に50〜1000個、好ましくは50〜200個配列させることが可能である。

以上の方法により、顕微鏡の視野内に最大数千個のビーズがアレイ化され、ビーズが高密度に集積化されたアレイを得ることができる。

本発明のアレイは、後述する分子間相互作用を分析したりスクリーニングするためのキットとして使用することもできる。キットには、緩衝液、架橋剤、マイクロビーズ、抗体、オリゴDNA、蛍光色素などを１種、又は複数組み合わせて含めることができる。
３．分子間相互作用分析
本発明においては、上記の通り作製されたマイクロビーズアレイを用いて分子間の相互作用、すなわち被験物質とその相手との間の相互作用を分析することが可能である。例えば、タンパク質、核酸、低分子物質などをマイクロビーズアレイに結合させてアレイを作製し、これに上記結合相手を接触させて相互作用を分析する。「相互作用」とは、被験物質とその相手（例えばタンパク質又は核酸と標的分子）との間に生じる共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、又は静電力による結合を意味する。相互作用の具体例としては、抗原と抗体との結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドとの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子との間の結合及び解離、酵素と基質との間の結合及び解離、核酸と核酸との結合及び解離（例えばDNAとDNAとの反応）、核酸とそれに結合するタンパク質との間の結合及び解離、糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離などが挙げられる。

タンパク質の発現は、当業者に周知の手法により行うことができるが、微量発現で済む点で、いわゆるin vitro翻訳系が好ましい。in vitro翻訳系としては、大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽などの翻訳系を使用することができる。

標識は、蛍光標識、放射標識のいずれを採用してもよい。蛍光標識物質としては、例えばAlexa系、Cy2、Cy3、Cy5、FITC、ローダミン、テキサスレッド、BODIPY、Quantum dot等が挙げられる。放射標識物質としては、³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、ポジトロン放出核等が挙げられる。また、タンパク質については、GFP等の蛍光タンパク質との融合タンパク質を採用してもよい。

また、本発明においては、相互作用する物質の一方をビーズに結合させてアレイを作製し、これに相互作用する物質の他方を反応させて、上記一方の物質に結合する物質をスクリーニングすることも可能である。本発明は、そのようなスクリーニング方法も提供する。

スクリーニングに供される被験物質としては、例えばタンパク質、核酸、ペプチド、ポリペプチド、合成化合物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。これらの被験物質を標識して、所定のマイクロビーズアレイと反応させることにより、スクリーニングをおこなう。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、cDNAライブラリーなどが挙げられる。また上記ライブラリーをあらかじめマイクロビーズに固定してマイクロビーズライブラリーとしておき、ライブラリーアレイを作製し、未知被験試料を標識して、アレイと反応させ、結合するものを探り出すか、あるいは、未知被験物質の機能を予測する。一例としては、上記標識物質で標識した抗原を含む緩衝液を、様々な抗体が結合したビーズを含むアレイに供試し、抗原抗体反応を起こす。時間の経過とともに抗原はビーズ上の抗体と結合するため、これを顕微鏡下でリアルタイムに観察することが可能であり、一度の解析で複数の抗体の結合能を評価することができる。また、本発明は、Gタンパク質共役レセプター（GPCR）などのタンパク質をビーズに結合させてアレイを作製し、当該GPCRに結合するリガンドのスクリーニングやビーズに結合してあるタンパク質に様々な変異を導入しておくことで、そのタンパク質の機能解析を行うことが可能である。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１は、直径0.29μmから2.6μmのマイクロビーズをガラス基板上に並べたアレイの作製例である。
（１）カバーガラスのアミノシラン化
カバーガラス（24×32mm, マツナミガラス）は、1/2飽和KOH中に2時間以上浸した後、純水で十分に洗浄し、さらに10mN HClに浸し、直ちに純水で洗浄後、乾燥させた。このガラスを、エタノールに5%(v/v)γ-アミノプロピルトリエトキシシラン、2.9% (v/v)水、1mN HClを加え、一晩重合させたアミノシラン液に浸したのち乾燥させた。最後に純水で洗浄し乾燥させた。
（２）ガラスのsulfo-SANPAH処理
（１）でアミノシラン化したカバーガラスともう一枚のカバーガラス（18×18mm）を両面テープ（NW-25, ニチバン）をスペーサーにして挟み、チャンバーを作製した。最終濃度が0.1mg/ml となるように0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2) に溶解した光架橋剤sulfo-SANPAH（PIERCE, 図3）20μlを流し込み、室温で20分間湿潤チャンバー内で反応させた後、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で十分に洗浄した。すべての操作は、安全光の下で行った。
（３）マイクロビーズのアレイ化
ビーズのガラスへの非特異的な吸着を防ぐために、sulfo-SANPAH処理チャンバーに1mg/ml αカゼイン（dephosphorylated, SIGMA）を含むリン酸塩緩衝液 20μlを流し込み、室温10分間湿潤チャンバー内でブロッキングをおこなった。リン酸塩緩衝液で数回洗浄した後、顕微鏡にセットした。1mg/mlαカゼインを含むリン酸塩緩衝液に懸濁した直径0.29μmのマイクロビーズ〔P0002910CN P(S/V/COOH) , Bangs〕を流し込み、浮遊しているビーズ1つを光ピンセット〔IRレーザー（IRCL-1000-1064, 500mW, CrystaLaser）、対物レンズ出口で約17mW〕で捉え、sulfo-SANPAH処理面に押しつけ、UV光（水銀ランプ、300-360のバンドパスフィルター）を局所照射（約1.5μW, 2秒間）してビーズを固定した(図2)。この操作を繰り返し３つのビーズを並べた後、リン酸塩緩衝液でビーズがなくなるまで洗浄し、次に直径0.44μmのビーズ〔P0004402CN P(S/V/COOH) , Bangs〕を同様に流し込み、上記操作を繰り返した。さらに、直径0.73μm 〔P0002910CN P(S/V/COOH),Bangs〕、直径0.95μm〔PC03N P(S/MA), Bangs〕、2.6μm〔PC05N(S/V/COOH), Bangs〕のビーズについても繰り返し操作をおこない、アレイ化した（図４）。

ここで示したのは、すべて表面がカルボキシル基修飾されたビーズであるが、アミノ基修飾のビーズも同様に固定された。また、カルボキシル基修飾ビーズにタンパク質やオリゴヌクレオチドを固定したものも同様に固定され、アレイ化できた。

ガラスへのビーズの非特異的な吸着を防ぐために、ここで示した例では1mg/mlαカゼインを使用したが、非特異的な吸着を防ぐのには、0.5mg/ml以上の濃度のαカゼインが有効であった。

抗原-抗体反応の実時間解析
抗原としてGlutathione S-transferase (GST)を用いた。GSTを蛍光色素Cy3で標識した。蛍光標識によるタンパク質の機能への影響を少なくするために、低濃度のピューロマイシンが翻訳終了後の完全長タンパク質のC末端に結合する性質を利用した。GSTはin vitro翻訳で調製し、翻訳反応時に溶液にCy3標識ピューロマイシンを加えておくことで、C末端にCy3-ピューロマイシンを取り込ませ標識した。Cy3-ピューロマイシンは、ピューロマイシンにデオキシシトシンリンカーと5'-アミノ基を介してCy3を結合させ調製した。GSTをコードするDNAをT7プロモーターおよびΩ配列の下流に終結コドンを削った状態で組み込み、これを鋳型にT7RNAポリメラーゼにより転写し、RNAを合成した。

精製したRNA 3μgを用いて翻訳反応をおこなった。翻訳反応は、麦芽抽出液（PROTEIOS, TOYOBO）を用い25μlのスケール、26℃、4時間でおこない、Cy3-ピューロマイシンの最終濃度は20μMとした。反応終了後遊離のCy3-ピューロマイシンを除くため、Sephadex G-50のスピンカラムでゲル濾過後、一部をSDS-PAGEで分離し、蛍光イメージャー（モレキュラーイメージャーFX, BIO-RAD）で検出し、蛍光強度からCy3標識されたタンパク質の濃度を見積もった。

抗GST抗体結合ビーズは、まずProteinAビーズを作製後、ProteinAが抗体と特異的に結合する性質を利用して作製した。Protein Aを水溶性カルボジイミド(EDC, PIERCE)で架橋した直径0.95μmのカルボキシル基修飾マイクロビーズ〔PC03N P(S/MA), Bangs〕約1% (w/v)の懸濁液20μlと抗Glutathione-S-transferase(GST)抗体溶液（0.2mg/ml, Rabbit polyclonal, SANTA CRUZ）10μlをリン酸塩緩衝液100μl中に加え混合し、室温で1時間反応させた。0.05％の界面活性剤Tween 20を含むリン酸塩緩衝液で4回洗浄し、さらにリン酸塩緩衝液で2回洗浄した。この抗GST抗体結合ビーズを、sulfo-SANPAH処理チャンバーに流し込み、本発明によりアレイ化した。

1mg/mlαカゼインを含むリン酸塩緩衝液をチャンバーに加え、室温で15分間ブロッキングした後、リン酸塩緩衝液で洗浄後、1mg/ml αカゼインを含むリン酸塩緩衝液に溶かした各濃度のCy3-標識 GST 20μlを流し込み、観察をおこなった。蛍光観察は2倍波Nd-YAGレーザー(532nm約0.2mW)を励起光に用い、対物レンズ式のエバネッセント照明でおこなった。光路の途中にメカニカルシャッターを置き、5秒毎にシャッターを開け（シャッタースピード1/8秒）、できるだけ蛍光色素が退色しないようにした。蛍光像はイメージインテンシファイア(VIDEO SCOPE)とEBCCDカメラ (浜松ホトニクス)で捉え、ビデオに録画した。顕微鏡観察は30℃でおこなった。画像はMetaview（Roper）で解析し、ビーズの蛍光強度の変化を計測した。

Cy3標識抗体を流し込むと、抗原が固定されたビーズの蛍光強度が経時的に増加していく様子が観察された（図５、図は50秒毎の写真）。また、加えたGST抗体の濃度依存的に結合量が増加した（図６）。得られたデーターのフィッティングから、各濃度の最終蛍光強度を見積もり、抗原濃度に対してそれらの値をプロットして得られた解離定数はおよそ0.54nMであり、これまでに他の方法で求められている抗原と抗体の解離定数とほぼ同じ値であった（図７）。

本発明の方法を使うことによって、洗浄操作なしでわずか20μlの試料で結合過程の観察が可能になり、実時間観察から結合の速さや解離定数を求めることができることが明らかとなった。

DNA-タンパク質間相互作用の実時間観察
転写調節因子NFκB (p50) と、その標的DNAであるκB配列およびそれらに変異を加えた配列との相互作用を、本発明のマイクロビーズアレイを使って解析した。解析に用いたκB配列およびその変異配列DNAは表1に示すトップストランドおよびボトムストランド合成オリゴヌクレオチドをアニーリングして作製した（表１）。

オリゴヌクレオチドを緩衝液(10mM Tris-HCl , 1mM MgCl2, 50mM KCl, pH7.9)に最終濃度10μMになるように溶解し、25μlずつ混合した。混合物を90℃で熱変性した後、室温までゆっくりと冷却しアニーリングした。直径0.95μmのカルボキシル基修飾マイクロビーズ〔PC03N P(S/MA), Bangs〕にストレプトアビジンを水溶性カルボジイミド(EDC, PIERCE)で架橋して作製したストレプトアビジンビーズに、クランプオリゴ
（5'-ビオチン- T₁₀₈-GCCCCGTCCC-3'（配列番号１７））を結合させたビーズ約1% w/v 懸濁液の10μlをアニーリング後の溶液に加え、30℃で2時間反応させた。この反応でκB配列およびその変異配列DNAの１本鎖部分とクランプオリゴがアニーリングし、DNAが固定される。最後に緩衝液で十分に洗浄し、κB配列および変位配列DNA結合ビーズを得た。κB配列および変位配列DNA結合ビーズを順にsulfo-SANPAH処理チャンバーに流し込み、本発明によりアレイ化した（図８）。

1mg/ml αカゼインを含む結合緩衝液(50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 0.5mM DTT, pH7.5) で室温15分間ブロッキングした後、結合緩衝液で洗浄した。次に、実施例2のCy3標識GSTと同じ手順で作製した2nM Cy3-標識 NFκB (p50) 溶液（1mg/ml αカゼイン, 結合緩衝液）20μlを流し込み、観察をおこなった。15分間の結合反応を観察終了後、100μlの結合緩衝液で洗い、解離反応過程をさらに10分間観察した。顕微鏡の観察条件は、実施例2のGST-抗GST抗体反応の解析と同様におこなった。

Cy3標識NFκB (p50)添加後、それぞれのDNA結合ビーズにCy3標識NFκB (p50)が時間とともに結合していく様子、Cy3標識NFκB (p50)除去後、徐々にビーズから解離していく様子が観察できた（図９、それぞれのビーズの位置は、図８で示したビーズの位置に対応する）。各々のビーズの蛍光強度の時間変化を図10に示す。κB配列と複数の異なる変異配列DNAへのCy3標識NFκB (p50)の結合の速さ、結合量、また、解離の速さの違いが一度の観察で解析できることが示された。

光ピンセットの原理を示す図。光ピンセットと光照射によるビーズの基板への固定化の概念図。ビーズの固定化に用いた光反応性架橋剤を示す図。ガラス基板上に固定された各種直径のマイクロビーズを示す図。抗原-抗体反応の実時間解析図。抗GST抗体ビーズへのCy3標識GST結合による蛍光強度の時間変化を示す図。最大蛍光強度と添加Cy3標識GST濃度との関係を示す図。解析に用いたκB配列およびその変異配列を示す図。 Cy3標識転写調節因子NFκB (p50) と、標的DNAκB配列およびその変異配列の相互作用の観察結果を示す図。 κB配列およびその変異配列とNFκB (p50)の結合と解離を示す図。

配列番号１：合成オリゴヌクレオチド
配列番号２：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号４：合成オリゴヌクレオチド
配列番号５：合成オリゴヌクレオチド
配列番号６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号７：合成オリゴヌクレオチド
配列番号８：合成オリゴヌクレオチド
配列番号９：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１０：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１１：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１２：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１４：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１５：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１７：合成オリゴヌクレオチド

Claims

マイクロビーズを光ピンセットで捕捉し、基板上に固定することを特徴とする高密度集積化マイクロビーズアレイの製造方法。
マイクロビーズの集積密度が、2×10⁶個 / cｍ²〜4×10⁷個 / cｍ²である請求項１記載の方法。
基板上への固定が光反応性架橋試薬を用いたものである請求項１又は２に記載の方法。
基板上への固定が共有結合によるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
マイクロビーズが、その表面に被験物質の相互作用相手が結合したものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
光ピンセットで捕捉されたビーズが基板に固定された高密度集積化マイクロビーズアレイ。
マイクロビーズの集積密度が、2×10⁶個 / cｍ²〜4×10⁷個 / cｍ²である請求項６記載のアレイ。
基板上への固定が光反応性架橋試薬を用いたものである請求項６又は７記載のアレイ。
基板上への固定が共有結合によるものである請求項６〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
マイクロビーズが、その表面に被験物質の相互作用相手が結合したものである請求項６〜９のいずれか１項に記載のアレイ。
被験物質と相互作用する物質の分析方法であって、標識された被験物質と請求項１０記載のアレイとを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを特徴とする前記方法。
被験物質と相互作用する物質のスクリーニング方法であって、標識された被験物質と請求項１０記載のアレイとを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを特徴とする前記方法。
請求項１０記載のアレイを含む、被験物質と相互作用する物質の分析又はスクリーニング用キット。