JP2017513474A - 細胞伸長および分化における使用のためのヒドロゲル組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
配列表の紙コピーおよびサイズが11,615バイト(MICROSOFT WINDOWS(登録商標)EXPLORER内で測定)である「P150263US01_ST25.txt」と称するファイルを含む配列表のコンピューターに読み込み可能な形式は、本明細書において提供され、参照することによって本明細書に援用される。配列表は、配列番号:1-48からなる。
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月10日出願の米国仮出願第61/978,032号に対する優先権を主張する。上記出願の開示の全体を参照することにより本出願に含める。
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、本発明は、米国政府の支援を受け、国立衛生研究所によって与えられた契約番号HL093282のもとで行われた。米国政府は本発明に関して権利を有する。
本開示は、一般に、生体材料組成物および生体材料組成物の使用方法に関する。さらに詳しくは、本開示は、ヒドロゲル組成物ならびにヒドロゲル組成物を用いて細胞伸長および細胞分化を促進する方法に関する。
他に特記しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本命最初に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。
本開示は、ヒドロゲル組成物の製造方法および得られる組成物の使用に関する。ヒドロゲルアレイを製造するために用いられる場合、製造方法は、一般に、基質にヒドロゲル前駆体溶液を接触させること(ここで、基質は疎水性領域と親水性領域を含む);ヒドロゲル前駆体溶液が基質と表面修飾基質との間に位置するように、表面修飾基質をヒドロゲル前駆体溶液上に置くこと;ヒドロゲル前駆体溶液を重合させること;および基質から表面修飾基質を分離して、ヒドロゲルアレイを得ること;を含む(図1A-1B参照)。このように、ポリマーヒドロゲル前駆体溶液を基質と表面修飾基質との間で重合させ、得られるヒドロゲルを表面修飾基質がヒドロゲルアレイを含むように表面修飾基質とともに移す。1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルを含まないバックグラウンドによって囲まれるヒドロゲルスポットのアレイを含むように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。もう1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルバックグラウンド内にヒドロゲルを含まないスポット(またはプール)のアレイが形成されるように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。
材料および方法
PEG-ノルボルネン合成
末端ヒドロキシル基(-OH)を有し、分子量20 kDaである8-アームポリ(エチレングリコール)(PEG)をJenKem Technology USA(テキサス州、アレン)から購入した。無水ピリジン、4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、5-ノルボルネン-2-カルボン酸、ジエチルエーテル、および0.03 % v/v テトラメチルシラン(TMS)を含む重水素化クロロホルム(CDCl3、99.8%)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、無水ジクロロメタン(DCM)をACROS Organics(ベルギー、ヘール)から購入した。3.5K分子量カットオフのスネークスキン(SNAKESKIN)透析チューブをThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。
これらの実験に用いたヒドロゲルアレイは、シラン化ガラス基質に固定されたヒドロゲルスポットから構成された。ヒドロゲルスポットは、金の、異なる湿潤性をもつことにより、エラストマーステンシルによってパターンが定義される領域を有するようにパターニングされた表面を用いて形成された。ヒドロゲルアレイの製造方法を、以下にさらに記載する。
ガラスカバースリップおよび塩酸(HCl)溶液をThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。トルエン、メタノール、エタノール、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(3-MPTS)およびジチオスレイトール(DTT)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。低圧プラズマシステムをDiener Electronic(ドイツ、エブハウゼン)から購入した。
シリコンウェハーをWRS Materials(カリフォルニア州、サンノゼ)から購入した。SU-8 100フォトレジストをMicroChem(マサチューセッツ州、ニュートン)から購入した。Sylgard 184シリコンエラストマーキットをDow Corning Corporation(ミシガン州、ミッドランド)から購入した。
金コートテストスライド(25 mm x 75 mm x 1 mmのガラス上の50 Åのチタン金属薄膜上に1,000 Åの金)をEvaporated Metal Films(ニューヨーク州、イサカ)から購入した。過フッ素化アルカンチオール(HS-(CH2)11-O-(CH2)2-(CF2)5-CF3)をProChimia Surfaces(ポーランド、ソポト)から購入した。既述されたように、ヒドロキシル末端アルカンチオール(HS-C11-(O-CH2-CH2)3-OH)を合成した(Prime and Whitesides J. Am. Chem. Soc. 1993、115:10714-10721)。
上述のように、PEG-NBを官能化した。二官能性PEGジチオール(PEG-DT)架橋剤(3.4 kDa)をLaysan Bio(アラバマ州、アラブ)から購入した。IRGACURE 2959光開始剤をCiba/BASF(ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン)から購入した。システイン末端ペプチドをGenScript USA(ニュージャージー州、ピスカタウェイ、NJ)から購入した。オムニキュアシリーズ1000 UVスポット硬化ランプ(波長365 nm)、ライトガイドおよびコリメートアダプタをLumen Dynamics Group(カナダ、オンタリオ)から購入した。上記と同じ手順を用い、所望のヒドロゲルスポット高さに対応する厚さ寸法をもつPDMSスペーサーを製造した。
パターニングされたアルカンチオレート自己組織化単分子膜(SAM)で、金基質を修飾して、周囲の疎水性領域によって分離される単離された親水性領域を提供した (図1A-1Bに示す)。図2A(図1Aにも)に示すように、金コートスライド上の疎水性および親水性SAM形成を、接触角測定によって確認した。図2Bは、疎水性パターニング前のステップにおける金基質 100;フッ素SAMを有する基質 110;エッチング後の基質 120;および親水性パターニング後の基質 130;のパターニング中の端面図を提供する。
上述のように(図1A-1B参照)、金基質上のパターニングされた疎水性/親水性自己組織化単分子膜を用いて、アレイにおける各ヒドロゲルスポットの形状を定義し、含量を限定するように、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルアレイを形成した。UV開始チオール-エン架橋は、同時にヒドロゲルを重合させ、ヒドロゲルスポットをガラス上に固定して、ヒドロゲルアレイをもたらした。図9に示すように、ヒドロゲルアレイを、64ウェルマイクロアレイアドオン(オーランド州、ベンドのGrace Bio-Labsから市販)に適合する寸法で製造することができた。
Claims (20)
- 細胞伸長を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを含む)を製造すること;
細胞をヒドロゲル組成物に接触させること;および
細胞を培養すること;を含む方法。 - ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、8-アーム,20 kDaのノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールを含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、循環血管新生細胞である、請求項1に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号:2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD(配列番号:35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)から選ばれる少なくとも1 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項3に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、約2 kPa〜約12 kPaのせん断弾性率を有する、請求項3に記載の方法。
- 細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、約1.8 kPa〜約33 kPaのせん断弾性率を有する、請求項6に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号:2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD(配列番号:35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項6に記載の方法。
- 細胞が、ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞から選ばれるヒト多能性幹細胞である、請求項6に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号:2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD(配列番号:35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項9に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、約3 kPa〜約16 kPaのせん断弾性率を有する、請求項9に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、固定化低分子量ヘパリンをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 細胞分化を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを包含する)を製造すること;
細胞をヒドロゲル組成物に接触させること;および
細胞を培養すること;を含む方法。 - ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、8-アーム,20 kDaのノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールを含む、請求項13に記載の方法。
- 細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項13に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、約1.8 kPa〜約33 kPaのせん断弾性率を有する、請求項15に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号:2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD(配列番号:35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項15に記載の方法。
- 細胞が、ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞から選ばれるヒト多能性幹細胞である、請求項13に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号:2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD(配列番号:35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項18に記載の方法。
- ヒドロゲル組成物が、約3 kPa〜約16 kPaのせん断弾性率を有する、請求項18に記載の方法。
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