KR101311325B1 - 합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포외기질이나 성장 인자에서 유래한 펩티드와 같은 다양한 생체활성 펩티드로 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합 접착 단백질로부터 만들어진 3차원 미세환경 구조물을 제공한다. 합성 3차원 미세환경은 다양한 세포 내에서 세포의 부착, 성장, 분화 및 형태형성과 같은 세포의 거동을 조절하도록 맞추어질 수 있다. 본 발명은 홍합 접착 단백질에 매트릭스잠재 부위를 제공함으로써 변조가능한 3차원 미세환경 구조물을 제공한다. 또한, 본 발명은 특정 세포의 거동을 조절할 수 있는 미세환경을 만들기 위하여 최적 조합의 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 스크리닝하기 위한 장치 및 방법을 제공한다.

Description

합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물{Synthetically Designed 3D Microenvironment Structure}
본 발명은 합성 디자인된 3차원 미세환경(microenvironment) 구조물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이나 성장 인자에서 유래한 펩티드와 같은 다양한 생체활성(bioactive) 펩티드로 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합 접착 단백질로부터 만들어진 3차원 미세환경 구조물에 관한 것이다.
생화학적 신호와 물리적 신호에 의해 정의되는 세포의 미세환경은 세포 부착, 성장, 분화 및 세포 특이적 기능의 발현을 포함하는 세포의 광범위한 거동을 결정하는 요소이다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 세포는 일반적으로 세포를 둘러싼 미세환경과 상호작용하여 생존 및 생물학적 기능을 발휘하거나, 또는 세포의 분화방향을 결정하는 것이 잘 알려져 있다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4).
조직 내의 대부분의 세포들은 모든 방향에서 세포의 기능을 인도하는데 결정적인 역할을 하는 세포외기질 단백질 복합체 세트에 의해 둘러싸여 있다. 세포는 인테그린(integrin) 수용체와 같은 세포 표면 수용체를 통해 세포외기질에 결합하며, 그 결합은 세포의 기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 생화학적 신호로 작용한다. 또한, 세포외기질은 조직 내에서 생화학적 및 기계적 자극의 변조기(modulator)로 작용한다. 예를 들면, 세포외기질 단백질은 성장 인자를 격리 및 분비하고, 영양분의 공급 속도를 조절할 뿐만 아니라, 세포의 형태를 조절하고, 기계적 신호를 세포의 표면에 전달할 수 있다. 세포외기질의 기계적 컴플라이언스(compliance) 또한 세포의 기능을 조절하는 중요한 요소이다. 따라서, 세포가 성장, 분화, 이동, 자살(apoptosis), 또는 다른 특정 기능을 수행하는 등의 세포의 궁극적인 운명은 이러한 세포외기질 미세환경의 결정자(effector)간의 분자적 수준의 상호작용에 대한 조절된 반응이라고 볼 수 있다(비특허문헌 5).
세포 부착 리간드를 생체소재에 결합시켜 합성 3차원 미세환경을 만들기 위한 많은 시도가 있어 왔다. 생물 유래 또는 합성 소재들은 그 소재 및 그 소재가 유도하는 세포의 거동을 조절하기 위한 세포외기질 미세환경용 소재로서 활용 가능성이 탐색되어 왔다. 한 예로는 RGD 펩티드 모티프(motif)를 갖는 가교결합이 가능한 히알루론산, 알기네이트, 폴리에틸렌글리콜계 히드로겔(hydrogel)이 폴리머 골격(backbone)에 이식된 것이다(비특허문헌 6, 비특허문헌 7 및 특허문헌 1).
복잡한 구조적인 조성, 순도, 면역원성과 병원체의 전달을 포함하는 자연형 세포외기질 단백질과 관련된 복합성으로 인하여, 합성 생체소재는 자연형 세포외기질과 세포외기질에 결합된 성장 인자의 조절적 특징을 모방하기 위해 2차원 또는 3차원 세포외기질의 미세환경 모방체용 소재로 적극 개발되어 왔다(비특허문헌 8 및 비특허문헌 9).
세포외기질과 성장 인자가 일으키는 신호 환경은 세포의 운명을 조절하는 중요한 메커니즘이다. 이러한 미세환경적 자극은 복합적인 신호전달 경로를 통해 처리된다. 이러한 신호전달 경로간의 상호작용은 세포의 운명을 결정하는데 결정적이다(비특허문헌 10). 예를 들면, 섬유아세포가 근섬유아세포로 증식 및 분화하는 것과 증가된 콜라겐 합성은 정상적인 상처 회복에서의 핵심적인 사건이며, 섬유아세포의 증식과 분화는 복합적인 신호전달 경로에 의해 조절된다(비특허문헌 11). 그러나, 종래의 기술은 물리적 또는 생화학적 신호의 결여로 인해 적어도 서로 다른 2가지 세포표면 수용체를 동시에 활성화시켜 복합적인 신호전달 경로를 유도하는 미세환경을 생성하지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 복합적인 수용체리간드 상호작용을 제공함으로써 자연형 세포외기질 미세환경을 모방하는 합성 3차원 미세환경 구조물을 개발하였다. 본 발명의 합성 3차원 미세환경 구조물은 세포외기질 유래 펩티드와 결합된 매트릭스잠재 부위(matricryptic site)를 포함할 수 있으며, 세포에서 분비되는 콜라겐 분해 효소 등에 의해 매트릭스가 분해되면 세포는 세포외기질 유래 펩티드와 결합하여 특정한 생화학적 신호를 유도할 수 있으므로 생화학적 및 물리적 신호를 시공간적으로 조정할 수 있게 된다. 본 발명의 합성 3차원 미세환경 구조물은 내피세포의 튜브 형성 시험에서 입증된 바와 같이 세포의 부착, 이동, 성장, 증식 또는 세포의 형태형성(morphogenesis)과 같은 세포의 거동을 조절하거나 규명하는데 사용될 수 있다.
미국 공개특허 공보 제2006-0134050호
Discher DE, et al., Science, 26;324(5935):1673-7, 2009 Hynes RO, Trends Cell Biol., 9(12):M33-7, 1999 Song X, et al., Science, 296:1855-1857, 2002 Li L, et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21:605-631, 2005; Lutolf MP, et al., Nat. Biotechnol., 23(1):47-55, 2005 Woerly et al., J. Neural Transplant. Plasticity, 5:245-255, 1995 Imen et al., Biomaterials, 27:3451-3458, 2006 Lutolf MP, et al., Nat. Biotechnol., 23(1):47-55, 2005 Ogiwara K, et al., Biotechnol Lett., 27(20):1633-7, 2005 Flaim CJ, et al., Stem Cells Dev., 17(1):29-39, 2008 Grotendorst GR, et al., FASEB J., 18(3):469-79, 2004
본 발명은 세포 부착, 이동, 성장 또는 분화와 같은 세포 거동을 조절하는 적어다 하나 이상의 ECM 유래 펩티드 모티프를 제공하는 생체소재 조성물을 포함하는 3차원 미세환경 구조물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 자연형 세포외기질 미세환경의 모방체로서 생화학적 또는 기계적 신호가 시공간적으로 조절되는 합성 3차원 미세환경 구조물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 부착, 이동, 성장 또는 분화와 같은 세포의 거동을 정밀하게 조절하는 적어도 하나 이상의 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 제공하는 가교결합이 가능한 생체소재 조성물을 포함하는 합성 3차원 미세환경 구조물을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 적어도 하나 이상의 세포외기질 유래 펩티드 모티프로 기능화된 생체소재와 가교결합제를 포함하는 합성 3차원 미세환경 구조물을 즉석으로(in situ) 만들기 위한 가교결합이 가능한 생체소재 조성물을 제공하며, 상기 가교결합제는 광범위한 pH 조건에서 공유결합, 이온결합, 수소결합 및 반 데르 발스 상호작용을 통한 화학적인 방법이나, 분자의 꼬임이나 얽힘을 통한 물리적인 방법, 혹은 화학적 및 물리적 방법을 동시에 사용하여 가교 반응을 매개할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 적어도 하나 이상의 세포외기질 유래 펩티드 모티프로 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합 접착 단백질과 가교결합제를 포함하는 합성 3차원 미세환경 구조물을 만들기 위한 가교결합이 가능한 생체소재 조성물을 제공하며, 상기 가교결합제는 광범위한 pH 조건하에 가교반응을 통해 화학적 가교결합을 매개할 수 있다.
임의의 적합한 홍합 접착 단백질이 본 발명의 생체소재로 사용될 수 있다. 3차원 미세환경 구조물을 생성하는 생체소재 조성물은 기본적으로 2가지 성분을 포함한다. 첫 번째 성분은 MAPTrix™ ECM과 같은 생체활성 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질이다. 두 번째 성분은 가교결합제이다. 두 성분은 모두 시판되는 소재이거나 합성 혹은 자연형 공급원으로부터 얻을 수 있다. 시판되는 홍합 접착단백질의 예로는 미국 사우스캐롤리나주 노스 오구스타 소재 콜로디스 바이오사이언스사에 의해 시판되고 있는 MAPTrix™ ECM이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 선택적인 세 번째 성분은 기계적 물성이 우수한 맞춤형 3차원 미세환경 구조물과 같이 물리기계적 물성을 향상시키기 위해 상기 조성물에 첨가될 수 있는 생체적합성 폴리머(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 폴리비닐알코올)이다.
MAPTrix™ ECM은 콜로디스 바이오사이언스사가 개발한 소재로서, 홍합 접착 단백질에 기반한 세포외기질 모방체 소재이다. 상기 소재는 세포외기질에서 유래한 다양한 펩티드를 유전자 재조합적으로 기능화한 홍합 접착 단백질로서, 자연적으로 존재하는 세포외기질의 생체활성을 모방한 것이며, 자연형 혹은 재조합 세포외기질 단백질과 비교할 때 1차 세포배양에서 자연형 세포외기질 단백질과 유사한 생체활성을 가짐이 실험적으로 증명된 바 있다. 이렇게 미리 디자인된 세포외기질 모방체인 MAPTrix™ ECM은 합성 3차원 세포외기질 미세환경 구조물의 제조시 큰 장점을 갖는다. 예를 들면, 세포 특이적 또는 사용자 정의에 따라 조정되는 합성 3차원 미세환경 구조물을 제공하여, 생화학적 신호의 측면에서 자연형 미세환경이 제공하는 생화학적 신호와 유사하도록 정밀하게 모방할 수 있다.
상기 MAPTrix™ ECM은 생체활성 펩티드와 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합접착 단백질이다. 본 발명에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 그 자체로 사용하거나, 서열번호 10, 11, 12 또는 13으로 기재되는 foot protein 5(FP-5) 또는 서열번호 5, 6, 7 또는 8로 기재되는 foot protein(FP-3), 서열번호 14로 기재되는 foot protein 6(FP-6) 의 탄소 말단이나 아민 말단 혹은 양쪽 모두에 해당하는 제1 펩티드와 홍합 접착 단백질 FP-1(서열번호 1), FP-2(서열번호 4), FP-4(서열번호 9) 및 각 단백질의 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 펩티드가 융합된 융합 단백질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 펩티드는 서열번호 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 FP-5이고, 상기 제2 펩티드는 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 FP-1이다.
본 발명에 있어서, 생체활성 펩티드는 자연형 세포외기질의 미세환경 구조를 모방하기 위해 필요하다. 또한, 예를 들면, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 또는 물질 P 등의 성장 인자와 같은 추가적인 성분이 포함되어 세포 및 조직 배양, 의료용 장치 및 치료, 또는 다른 연관되는 적용분야에 있어서 세포외기질 유사체의 유리한 효과를 추가로 향상시킬 수 있다.
상기 생체활성 펩티드는 유전자 재조합 기술로 홍합 접착 단백질의 탄소 말단이나, 아민 말단, 혹은 양쪽 모두에 부가될 수 있다. 융합된 홍합 접착 단백질은 탄소 말단, 아민 말단은 물론 융합 단백질 사이에 부가될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 FP-151의 경우 FP-1과 FP-5 사이에 세포외기질 또는 성장인자 유래 펩티드를 부가할 수 있다. 또 생체활성 펩티드는 양 말단이나 융합 단백질 사이에 서로 다른 세포외기질 유래 펩티드나 성장인자 유래 펩티드가 될 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 유래 펩티드 GFPGER(서열번호 22)은 탄소 말단이나 FP-1과 FP-5사이에, 라미닌 유래 펩티드 IKVAV(서열번호 37)은 아민 말단에 부가될 수 있다.
생체활성 펩티드는 세포외기질 단백질로부터 유래되어 자연형 세포외기질의 생화학적 또는 생물리학적 신호를 모방하는 자연형 또는 합성 펩티드이다. 상기 세포외기질 단백질은 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin) 등과 같은 섬유형 단백질일 수 있다. 세포외기질 단백질은 인테그린과 같은 세포 표면 수용체의 활성에 영향을 미칠 수 있고, 인테그린은 다시 다가의(polyvalent) 세포외기질 단백질과 결합한 후 초점 접착 복합체(focal adhesion complex) 내에서 키나아제(kinase) 및 어뎁터(adaptor) 단백질과의 동시-클러스터링(co-clustering)에 의해 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴, 라미닌 또는 비트로넥틴 유래의 RGD-함유 펩티드 단편(segment)은 인테그린의 활성을 조절할 수 있다.
함께 3차원 미세환경 구조물을 생성하여 복합적인 신호전달을 유도하는 세포외기질 단백질 유래의 적합한 조합의 펩티드 모티프는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 헤파린-결합 도메인, 엔탁틴(entactin), 피브리노겐(fibrinogen), 캐드헤린(cadherin) 또는 디스트로글리칸(dystroglycan)으로부터 선택된다. 예를 들면, 인테그린 α1β1을 활성화시키는 GFPGER(서열번호 22) 모티프를 함유하는 콜라겐 타입 I 유래의 MAPTrix™ ECM과 인테그린 αvβ3을 활성화시키는 IKVAV(서열번호 37 모티프를 함유하는 라미닌 유래의 MAPTrix™ ECM의 혼합물은 2가지 상이한 인테그린 αvβ3 - α1β1을 동시에 활성화시켜 내피세포의 튜브 형성을 유도할 수 있다.
바람직하게는, 펩티드 모티프의 적합한 조합은 식 A-B를 가지며, 상기 A는 인테그린 αvβ3, αvβ5, 신데칸(syndecan), 캐드헤린 또는 헤파린(heparin)을 활성화시키는 펩티드 모티프이고, 상기 B는 인테그린 α1β1, α3β1, α5β1, α6β1 또는 α7β1을 활성화시키는 펩티드 모티프이다. 상기에서, 신데칸은 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3 및 신데칸-4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 인테그린 αvβ3, αvβ5, 신데칸, 캐드헤린 또는 헤파린을 활성화시키기 위한 적합한 펩티드 모티프(A)는 IDAPS(서열번호 60), IKVAV(서열번호 37), RQVFQVAYIIIKA(서열번호 36), KAFDITYVRLKF(서열번호 47), MNYYSNS(서열번호 31), RGDV(서열번호 63), WQPPRARI(서열번호 57), RKRLQVQLSIRT(서열번호 40), KNSFMALYLSKG(서열번호 41), SPPRRARVT(서열번호 56), KNNQKSEPLIGRKKT(서열번호 58), GDLGRPGRKGRPGPP(서열번호 98), ATETTITISWRTKTE(서열번호 99), TLFLAHGRLVFM(서열번호 100), KGHRGF(서열번호 21), FRHRNRKGY(서열번호 101), KRSR(서열번호 102), FHRRIKA(서열번호 103), HAV(서열번호 104), ADTPPV(서열번호 105), DQNDN(서열번호 106)로부터 선택된다. 인테그린 α1β1, α3β1, α5β1, α6β1, α7β1 또는 αβ1을 활성화시키기 위한 다른 적합한 펩티드 모티프(B)는 표 1에 나타낸 군으로부터 선택된다.
생체활성 펩티드 모티프 및 그 수용체
수용체 펩티드 모티프 ECM 타입
a1β1 또는 a2β1 GLPGER(서열번호 20)
KGHRGF(서열번호 21)
GFPGER(서열번호 22)
DEGA(서열번호 23)
GTPGPQGIAGQRGVV(서열번호 24)
GLSGER(서열번호 25)
GASGER(서열번호 26)
GAPGER(서열번호 27)
TAGSCLRKFSTM(서열번호 28)
GEFYFDLRLKGDK(서열번호 29)
TAIPSCPEGTVPLYS(서열번호 30)
MNYYSNS(서열번호 31)
ISRCQVCMKKRH(서열번호 32)
GLKGEN(서열번호 33)
GLPGEN(서열번호 34)
GLPGEA(서열번호 35)		 콜라겐
a3β1 또는 a6β1 RQVFQVAYIIIKA(서열번호 36)
IKVAV(서열번호 37)
NRWHSIYITRFG(서열번호 38)
TWYKIAFQRNRK(서열번호 39)
RKRLQVQLSIRT(서열번호 40)
KNSFMALYLSKG(서열번호 41)
DYATLQLQEGRLHFMFDLG(서열번호 42)
GIIFFL(서열번호 43)
YIGSR(서열번호 44)
RYVVLPR(서열번호 45)
PDSGR(서열번호 46)
KAFDITYVRLKF(서열번호 47)
RNIAEIIKDI(서열번호 48)		 라미닌
a4β1 또는 a5β1 KLDAPT(서열번호 49)
PHSRN(서열번호 50)
RGD(서열번호 51)
GRGDSP(서열번호 52)
PHSRNSGSGSGSGSGRGDSP(서열번호 53)
YRVRVTPKEKTGPMKE(서열번호 54)
EDGIHEL(서열번호 55)
SPPRRARVT(서열번호 56)
WQPPRARI(서열번호 57)
KNNQKSEPLIGRKKT(서열번호 58)
EILDVPST(서열번호 59)
IDAPS(서열번호 60)
REDV(서열번호 61)
LEDV(서열번호 62)		 피브로넥틴
본 발명의 한 구현예에서, 인테그린 αv(α) 서브타입과 인테그린 β 서브타입의 활성을 동시에 복합적으로 조절할 수 있는 합성 미세환경 구조물이 제공된다. 본 발명에서 사용되는 홍합 접착 단백질은 하나 이상의 생체활성 홍합 접착 단백질을 포함하는데, 상기 홍합 접착 단백질은 주로 콜라겐 타입 I에서 유래하여 α1β1을 표적화하는 GFPGER(서열번호 22) 서열과 같은 펩티드 및 라미닌으로부터 유래하여 αvβ3 을 표적화하는 IKVAV(서열번호 37) 서열과 같은 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질로 이루어지는 기능화된 홍합 접착 단백질의 조합이다.
본 발명의 한 구현예에서, 인테그린 α 혹은 인테그린 α의 서브타입과 인테그린 β의 활성 모두를 복합적으로 조절할 수 있는 합성 미세환경 구조물이 제공된다. 본 발명에서 사용되는 홍합 접착 단백질은 하나 이상의 생체활성 홍합접착 단백질을 포함하는데, 상기 홍합 접착 단백질은 주로 콜라겐 타입 I에서 유래하여 α1β1을 표적화하는 GFPGER(서열번호 22) 서열과 같은 펩티드 및 피브로넥틴으로부터 유래하여 α5β1을 표적화하는 GRGDSP(서열번호 52) 서열과 같은 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질로 이루어지는 생체-기능화된 홍합 접착 단백질의 조합이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-1과 FP-5의 융합 단백질인 FP-151로서, 상기 단백질은 피브로넥틴 유래 펩티드인 GRGDSP(서열번호 52) 펩티드로 유전자 재조합적으로 기능화되어 피브로넥틴 풍부(rich) 세포외기질 모방체인 히드로겔을 형성한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 화학적으로 가교결합이 가능한 제제는 자연형 또는 합성 기원의 임의의 생체적합성 폴리머일 수 있다. 바람직하게는, 가교결합제는 적절한 기능기를 가져서 홍합 접착 단백질과 직접적으로 또는 링커(linker)를 통해 공유결합적으로 결합될 수 있는 합성 폴리머이다. 이러한 조건을 충족하는 임의의 폴리머가 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 폴리머의 선택, 이러한 폴리머의 확보 또는 제조는 본 기술분야에서 공지된 임의의 방식으로 실행될 수 있다(참고문헌: The Biomedical Engineering Handbook, ed. Bronzino, Section 4, ed. Park). 이러한 가교결합이 가능한 폴리머로서 바람직한 것은 폴리알킬렌 옥사이드, 특히 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리펩티드, 폴리라이신과 같은 폴리아미노산, 폴리알릴아민(PAM), 폴리아크릴레이트, 폴리에스테르, 폴리포스파젠, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 올리옥사머, 폴리우론산 및 이들의 그래프트(graft) 폴리머를 포함하는 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 폴리머는 일반적으로 최소 1,000으로부터 수백만 달톤(Da)까지의 다양한 범위의 분자량을 갖도록 선택될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 폴리머는 분자량이 5,000 내지 5만 달톤이거나, 폴리머 자체의 분자골격이 분해가능한 것일 수 있다. 분해가능한 폴리머 골격을 갖는 폴리머는, 예를 들면, 폴리글리콜산 및 폴리젖산을 포함하는 폴리(a-히드록시산)의 지방족 폴리에스테르와 같이 골격 내에 에스테르기를 함유하는 폴리머와 같은 그 내부에 가수분해가능한 기를 갖는 골격을 갖는 폴리머를 포함한다. 분자 골격 자체가 분해가능할 때는 이러한 분해성을 제공하기 위해 반드시 저분자량의 폴리머일 필요는 없다.
본 발명의 한 구현예에서, 즉석에서 형성될 수 있는 시공간적으로 조절될 수 있는 3차원 세포외기질 모방체 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 다중-팔의(multiple-arm) 폴리에틸렌글리콜과 자연형 세포외기질의 3차원 세포외기질 미세환경을 모방한 홍합 접착 단백질을 포함한다. 다중-팔의 폴리에틸렌글리콜은 4개, 6개, 8개 혹은 10개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜 또는 그 혼합물로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직한 다중-팔의 폴리에틸렌글리콜은 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜이다.
다른 바람직한 구현예에서, 바람직한 화합물은 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-숙신산(PEG-SG), 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-글루타르산, 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-숙시미딜 숙시네이트, 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-글루타레이트, 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-아크릴레이트, 또는 4개 내지 8개의 팔을 갖는 폴리에틸렌글리콜-프로피온 알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
8개의 팔을 갖는 PEG-SG, 4개의 팔을 갖는 PEG-SG, 또는 8개의 팔을 갖는 PEG-SG와 4개의 팔을 갖는 PEG-SG의 혼합물과 세포외기질 유래 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함하는 조성물로부터 본 발명의 히드로겔 기반의 3차원 미세환경 구조물이 용이하게 형성될 수 있다. 폴리에틸렌글리콜과 홍합 접착 단백질로부터 히드로겔의 형성에 관한 상세한 내용은 PCT/KR2011/001831 (Adhesive extracellular matrix mimic)에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명의 일부를 구성하고 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 내피세포의 형태형성을 위한 합성 3차원 미세환경 구조물이 제공되며, 상기 미세환경 구조물은 신생혈관을 일으키는 인테그린 매개 복합 신호를 제공한다.
인테그린은 세포 표면 접착 분자의 수퍼패밀리이며, 18개의 서로 다른 α 사슬(α1-α11, αv, αIIb, αL, αM, αX, αD, αE)과 8개의 서로 다른 β 사슬(β1-β8)이 비-공유결합적으로 헤테로다이머를 형성한다. 인테그린은 세포와 세포, 세포와 매트릭스간 상호작용을 매개하는데 중요한 역할을 하고, 세포 성장, 생존, 분화 및 이동과 같은 세포의 주요 기능에 참여한다.
내피세포는 광범위한 인테그린 서브유닛을 발현한다. 혈관 내피세포는 αvβ3, αvβ5, α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α6β4 을 포함하는 다양한 인테그린의 서브세트(subset)를 발현하며, 상기 인테그린들은 다양한 리간드와 결합한다.
인테그린 α1β1, α3β1 및 α5β1은 무활동성 혈관에서 낮은 수준으로 발현되지만, 신생혈관 형성 시에는 적어도 인테그린 α5β1의 발현량이 상향조절된다(Kairbaan M, et al., Cell Tissue Res (2003) 314:131-144). 또한, 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α2β1은 무활동성 혈관에서 거의 검출되지 않지만, 스프라우트(sprout)에서는 그 발현량이 크게 증가한다(Max et al., Eur J Cancer (1997) 33:208-208).
본 발명의 한 구현예에서, 내피세포가 내피세포 튜브 형성과 같은 형태형성을 하기 위해 활용하는 β1 인테그린을 함유하는 헤테로다이머를 조절하는 합성 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
내피세포에서, αv와 같은 몇 종의 인테그린에 의해 매개되는 세포-매트릭스 상호작용은 세포의 형태형성의 중요한 조절자이다(Stupack DG, et al., Curr Top Dev Biol. 2004, 64:207-38 WickstrSA, et al., Adv Cancer Res. 2005;94:197-229). 상기 αv 인테그린 서비유닛은 4개의 서로 다른 β 서브유닛인 β3, β5, β6 및 β8과 선택적으로 짝을 이루고, 10여개 이상의 다른 α 서브유닛은 β1과 짝을 이룬다. β1 인테그린은 신생혈관 생성시 내피세포의 부착, 이동과 생존에 필요하다(Carlson TR, et al., Development. 2008; 135(12):2193-202). 상기 β1 서브유닛은 적어도 10개의 서로 다른 α 서브유닛과 결합하여 최대의 인테그린 서브패밀리를 구성한다. β1 인테그린 서브패밀리의 구성원들은 주로 피브로넥틴, 콜라겐 및 라미닌과 같은 세포외기질 성분들과 결합하지만, 일부 β1 인테그린 서브유닛은 세포-세포 접착에 직접 참여하기도 한다(Hynes, 1992; Haas and Plow, 1994).
한 구현예에서, 세포의 형태형성을 위한 합성 3차원 미세환경 구조물이 제공된다. 상기 합성 미세환경 구조물은 내피세포가 형태형성을 위해 활용하게 될 β1 인테그린을 함유하는 헤테로다이머를 조절하는 MAPTrix™ ECM 조성물을 포함한다. 본 발명에 적합한 MAPTrix™ ECM 조성물은 둘 이상의 서로 다른 생체활성 펩티드 모티프를 제공하며, 상기 펩티드 모티프 중 하나는 αv를 함유하는 인테그린을 조절하고, 다른 하나는 β1을 함유하는 인테그린을 조절한다. 바람직하게는, β1 인테그린을 함유하는 헤테로다이머는 α2β1 또는 α5β1로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 MAPTrix™ ECM 조성물은 αvβ3과 α2β1 인테그린을 동시에 조절한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 MAPTrix™ ECM 조성물은 αvβ3과 α5β1 인테그린을 동시에 조절한다.
또한, 본 발명은 인테그린과 상호작용으로 상승 효과를 유도할 수 있는 성장인자 모방체가 포함되어 세포의 성장, 증식 또는 분화를 보다 정밀하게 조절할 수 있는 합성 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
폴리펩티드인 성장인자(growth factor)는 세포 증식 및 분화의 조절제로 성장인자는 발생, 재생 및 상처 회복을 포함하는 여러 가지 생리적 과정의 조절에 관여하고 있다.
섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)는 세포증식을 자극하는 유사분열촉진 반응을 유도할 뿐 아니라, 대다수의 세포 유형을 자극하여 비유사분열촉진 방식으로 반응하도록 할 수 있다. 이들 활성은 상처부위로의 세포이동 촉진(화학주성), 새로운 혈관 형성의 개시(신생 혈관형성), 신경 재생의 조절(향신경성), 및 특정 세포 단백질 발현, 세포 생존의 자극 또는 억제를 포함한다(Ornitz and Itoh, Fibroblast growth factors, Genome Biology 2001 2(3), 3005.1-3005.12).
산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자를 포함하여 현재까지 섬유아세포 성장인자는 23종이 알려져 있으며, 각 성장 인자는 활성 부위로 카노핀(canofin), 헥사핀(hexafin), 데카핀(decafin) 모티프가 있음이 알려져 있다(Li S, et al., Fibroblast growth factor-derived peptides: functional agonists of the fibroblast growth factor receptor. J Neurochem. 2008 Feb;104(3):667-82., Li S, et al., Agonists of fibroblast growth factor receptor induce neurite outgrowth and survival of cerebellar granule neurons. Dev Neurobiol. 2009. 69(13):837-54., Shizhong Li, et al., Neuritogenic and Neuroprotective Properties of Peptide Agonists of the Fibroblast Growth Factor Receptor. Int J Mol Sci. 2010; 11(6): 2291-2305).
산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor)에서 유래한 서열번호 91, 92, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)에서 유래한 서열번호 93, 94, 95, 96 및 97로 기재된 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질은 섬유아세포 성장인자 모방체로 자연형 또는 재조합 섬유아세포 성장인자와 비슷한 활성을 가진다.
본 발명의 구현예에서 내피세포의 튜브형성이 촉진되도록 서열번호 93으로 기능화된 홍합 접착단백질이 포함되어 섬유아세포 성장인자와 인테그린간 상호작용으로 상승효과를 가져와 내피세포의 튜브 형성을 촉진하는 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
또한 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid)가 추가로 포함된 3차원 미세환경 구조물이 제공된다. 히알루론산은 세포외기질을 구성하는 주요 물질의 하나로 글루코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 주요 구성성분으로서 세포간 간격 유지, 세포 성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여할 뿐만 아니라, 세포의 분열과 분화, 이동 등에도 관여한다(J. Necas, et al., Hyaluronic acid (hyaluronan): a review. Veterinarni Medicina, 53, 2008 (8): 397-411).
그러나, 홍합 접착 단백질은 양으로 하전된 아미노산인 라이신(lysine)이 풍부한 관계로 음으로 하전된 히알루론산과 정전기적 상호작용으로 응집체(aggregate)를 형성하여 침전하기 때문에 히드로겔을 형성하기 어렵다.
본 발명의 구현예에서, 홍합 접착 단백질의 라이신을 페길화(pegylation)하여 라이신의 아민기와 히알루론산의 카르복실산(carboxylic acid)간의 과도한 정전기 상호작용을 억제하면 히드로겔을 형성할 수 있다.
단백질의 페길화는 단백질 치료제와 같은 생체 물질의 전달 효율을 높이는 방법으로 잘 알려져 있는 확립된 기술로, 예를 들면, 로버트 등이 정리한 문헌에 제시된 방법들을 본 발명에 활용할 수 있다(Roberts MJ, Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv Drug Deliv Rev. 2002. 54(4):459-76. 및 Bailon P, Won CY., PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Drug Deliv. 2009. 6(1):1-16).
본 발명의 구현에 사용되는 히알루론산은 1,000 달톤에서 3백만 달톤(Da)의 분자량을 가지는 등 기본적으로 제한되지 않는다. 바람직하게는 분자량이 3,000 달톤에서 100만 달톤, 더욱 바람직하게는 분자량이 1만 달톤에서 50만 달톤의 히알루론산 중에서 선택될 수 있다.
자연 상태에서 세포외기질의 특수한 형태인 기저막(basement membrane)은 4가지 주요성분인 라미닌과 콜라겐 IV, 엔탁틴(entactin) 및 페레칸(perlecan)으로 전체의 약 98%를 이루고 있으며 히알루론산과 같은 헤파란(heparan)이나 콜라겐 분해효소와 같은 기타 성분들은 약 2%를 차지하고 있다(Valerie S. LeBleu et al., Structure and Function of Basement Membranes. Exp Biol Med 2007 232(9). 1121-1129).
본 발명의 구현예에서 히알루론산의 중량비는 기본적으로 제한되지 않으나 생체 기저막과 유사한 수준에서 3차원 미세환경 구조물에 첨가될 수 있다. 바람직하게는 히알루론산의 중량비는 구조물의 총 중량의 0.1%에서 40%, 더욱 바람직하게는 0.5%에서 2%의 비율로 3차원 미세환경 구조물에 첨가될 수 있다.
본 발명은 3차원 구조물의 구조(architecture)가 조절되는 3차원 미세환경 구조물을 제공한다. 지지체 구조(scaffold architecture)나 형태(morphology)가 세포의 부착이나 퍼짐(spread)에 상당한 영향을 미치는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 마이크로미터 수준의 구조에서 세포는 평평한 표면에서 배양되는것처럼 거동하지만, 나노수준의 구조물에서는 세포와 상호작용하는 표면적이 크게 증가하므로 세포 수용체와 상호작용하는 부착 사이트(binding site) 역시 크게 증가하여 세포의 형태나 활성에 상당한 영향을 미친다(M. M. Stevens and J. H. George, Exploring and engineering the cell-surface interface, Science, Vol.310 (2005) 1135-8).
지지체 혹은 구조물의 공극도(porosity)와 공극 구조(pore architecture)는 세포의 기능은 물론 생존에도 중요한 영향을 미치므로, 합성 3차원 구조물을 설계하는데 있어 매우 중요한 요소에 해당한다(Annabi N. et al., Controlling the Porosity and Microarchitecture of Hydrogels for Tissue Engineering. Tissue Eng Part B Rev. 2010. 16(4):371-83).
히드로겔의 공극은 단백질과 PEG의 분자량, 농도, 산성도, 겔화 온도(gelation temperature), 겔화 시간(gelation time) 등에 영향을 받는다.
본 발명의 구현예에서 홍합 단백질의 농도 및 다중-팔의 폴리에틸렌글리콜의 분자량과 농도 조절을 통해 공극도와 공극 구조가 조절되는3차원 미세환경 구조물을 제공한다. 공극 크기는 0.1 마이크로미터에서 1,000 마이크로미터까지 조절된 3차원 미세환경 구조물이 제공된다. 바람직하게는 0.1 마이크로미터에서 100마이크로미터의 공극을 가진 3차원 미세환경 구조물이다.
또한, 본 발명은 MAP-ECM-X-NH2 또는 MAP-ECM1-X-ECM2-Y-NH2의 식 중 하나를 갖는 매트릭스잠재 부위를 포함하는 조절적인 3차원 미세환경 구조물을 제공한다. 이때, 상기 MAP은 재조합 홍합 접착 단백질로서, FP1, FP2, FP3, FP4, FP5, FP6 혹은 이들 홍합 접착 단백질로 만들어진 서열번호 15의 FP-151과 같은 융합 홍합 접착 단백질로부터 선택되고, 상기 ECM은 세포외기질 혹은 성장 인자로부터 유래하는 펩티드 모티프이며, 상기 X 및 Y는 효소에 의한 분해속도가 비슷하거나 다를 수 있는 효소 민감성 펩티드 모티프이다.
상기 식에 존재하는 말단 아민기는 다중-팔의 폴리에틸렌글리콜과 가교결합을 하여 도 1에 개시된 것과 같은 매트릭스잠재 부위를 갖는 히드로겔을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 매트릭스잠재 부위는 세포외기질 단백질 내에 존재하는 생물학적으로 활성인 서열로서, 용액에 녹아있는 형태에서는 노출되지 않지만 단백질의 구조나 형태 변화가 일어나면 외부에 노출될 수 있다. 상기 서열은 결합 조직 내에서 신호 부위의 독특한 보존성을 나타내며, 세포외기질의 리모델링이 일어나는 곳에서 다양한 조건에 따라 외부에 노출되어 활성화된다. 매트릭스잠재 부위의 발현을 촉진하는 메커니즘은 단백질의 폴리머화, 단백질 분해 및 기계적 힘을 포함한다(Davis GE, et al,. Regulation of tissue injury responses by the exposure of matricryptic sites within extracellular matrix molecules. Am J Pathol. 2000; 156: 1489-1498).
생체내 세포의 미세환경은 화학적 및 물리적 신호의 시공간적 패턴에 의해 정의되며, 세포의 거동은 시간과 공간에 따라 변화하는 세포외 미세환경 내에 있는 화학적 및 물리적 큐에 의해 정밀하게 조절된다(Richter C, et al., Spatially controlled cell adhesion on three-dimensional substrates. Biomed Microdevices. 2010 Oct;12(5):787-95). 따라서, 동적인 부분, 즉 외부 자극에 따른 세포와 기질간 상호작용을 변조할 수 있는 능력이 도입되면, 세포 배양이나 조직공학적 응용을 위한 표면 설계에서 더 많은 기회의 문이 열리게 된다.
본 발명자들의 접근법은 매트릭스잠재 부위를 홍합 접착 단백질 내에 포함시키는 것이다. 매트릭스잠재 부위는 MAP-ECM-X-NH2 또는 MAP-ECM1-X-ECM2-Y-NH2의 식을 갖는 세포외기질 유래 펩티드 내에 포함되는 적어도 하나 이상의 효소 민감성 펩티드를 포함한다. 상기 매트릭스잠재 부위를 함유하는 세포외기질 모방체 홍합 접착 단백질을 Dynamic MAPTrix™ ECM이라 칭하며, Dynamic MAPTrix™ ECM을 포함하는 히드로겔-형성 조성물은 효소 민감성 부위를 포함하는 3차원 미세환경 구조물을 용이하게 형성할 수 있다. 히드로겔의 분해는, 예를 들면, 세포가 분비하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease, MMP)나 엘라스타아제(elastase)와 같은 효소에 의해 수행될 수 있다. 히드로겔의 분해가 시작되면, 세포는 세포외기질 펩티드에 노출되어 세포의 거동을 조절하는 신호들이 촉발하게 된다.
적합한 효소 민감성 펩티드 모티프는 콜라겐분해효소, 엘라스타아제, 인자 Ⅷa, 매트릭스 메탈로프로티나아제 혹은 트롬빈으로부터 유래된다. 바람직하게는, 콜라겐분해효소인 MMP로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 GPQGIAGQ(서열번호 65), GPQGIASQ(서열번호 66), GPQGIFGQ(서열번호 67, GPQGIWGQ(서열번호 68), GPVGIAGQ(서열번호 69), GPQGVAGQ(서열번호 70) 또는 GPQGRAGQ(서열번호 71)의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 콜라겐분해효소로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 LGPA(서열번호 72) 또는 APGL(서열번호 73)의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 인자 Ⅷa로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 NQEQVSP(서열번호 74)의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 엘라스타아제로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 AAAAAAAA(서열번호 75)의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 플라스민으로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 YKNR(서열번호 76), NNRDNT(서열번호 77), YNRVSED(서열번호 78), LIKMKP(서열번호 79) 또는 VRN(서열번호 80)의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 트롬빈으로부터 유래되는 효소 민감성 펩티드 절편은 GLVPRG(서열번호 81)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 한 구현예에서, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 민감성 펩티드 모티프가 AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-IKVAV-GPQGIAGQ(서열번호 82), AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-GFPGER-GPQGIAGQ(서열번호 83), AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-GRGDSP-GPQGIAGQ(서열번호 84) 또는 AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-GRGDSP-IKVAV-GPQGIAGQ(서열번호 85)의 아미노산 서열을 갖는 라미닌, 콜라겐 및 피브로넥틴 유래 펩티드 모티프에 포함되어 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함하는 효소분해가 가능한 조성물로 이루어진 변조가능한 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
본 발명의 한 구현예에서, 효소 분해 속도가 다른 2개의 매트릭스 메탈로프로테나아제(MMP) 민감성 펩티드 모티프가 AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-IKVAV-GPQGIAGQ-GFPGER-GPQGIWGQ(서열번호 86) 또는 AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-IKVAV-GPQGIAGQ-GRGDSP-GPQGIWGQ(서열번호 87)의 아미노산 서열을 갖는 라미닌 또는 콜라겐 타입 I 유래 펩티드 모티프에 포함되어 유전자 재조합적으로 기능화된 서열번호 2로 기재된 FP-1 혹은 서열번호 15로 기재된 FP-151의 홍합 접착 단백질을 포함하는 효소 분해가 가능한 조성물로 이루어진 변조가능한 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 효소 분해 속도가 다른 2개의 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 민감성 펩티드 모티프가 서열번호 3의 FP-1 및 서열번호 10의 FP-5 사이에 포함된 IKVAV-GPQGIAGQ-GFPGER-GPQGIWGQ(서열번호 86) 또는 AKPSYPPTYKAKPSYPPTYK-IKVAV-GPQGIAGQ-GRGDSP-GPQGIWGQ(서열번호 87)의 아미노산 서열을 갖는 피브로넥틴, 라미닌 또는 콜라겐 타입 I 유래 펩티드 모티프에 포함되어 유전자 재조합적으로 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함하는 효소분해가 가능한 조성물로 구성된 변조가능한 3차원 미세환경 구조물이 제공된다.
본 발명은 특정한 세포 거동을 조절하는 복합 신호를 유도하는 최적의 합성 미세환경을 스크리닝하거나 설계할 수 있는 펩티드 모티프 조합을 확인하는 대용량 스크리닝(high throughput screening, HTS)에 사용될 수 있다. 재생의학과 신약 탐색 분야에서 줄기세포의 적절한 분화 환경을 스크리닝하는 것은 특히 중요한 이슈(issue)에 해당한다. 본 발명은 줄기세포의 분화 환경을 합성 모방체로 대체하기 위해 필수적인 미세환경 구조물의 최적화에 필요한 도구를 제공한다.
홍합 접착 단백질로 구성된 히드로겔은 대용량 스크리닝을 위한 히드로겔 어레이 형태로 사용될 수 있다. 상기 히드로겔 어레이는 2개 이상의 마이크로로케이션(microlocation)의 조합이다. 바람직하게는, 상기 어레이는 행렬로 위치를 배정할 수 있는 마이크로로케이션을 포함한다. 본 발명에 따라 제조되는 홍합 접착 단백질로 이루어지는 히드로겔 및/또는 히드로겔 어레이의 두께와 치수는 사용자의 필요에 따라 변경될 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 가교결합이 가능한 MAPTrix™ 조성물을 얻는 단계;
(b) 상기 가교결합이 가능한 MAPTrix™ 조성물을 고형 지지체 상에 패턴으로 위치시키는 단계; 및
(c) 상기 MAPTrix™ 조성물을 가교결합시켜 MAPTrix™ 히드로겔 어레이를 얻는 단계를 포함하는 MAPTrix™ 히드로겔 어레이 장치를 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서, MAPTrix™ 히드로겔 어레이가 제공된다. 상기 어레이는 12×8 웰의 이동가능한 스트립으로 이루어지는 96 웰 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 스트립 내의 각각의 웰(총 7 웰)은 상이한 MAPTrix™ 조성물로 미리 코팅되어 상이한 3차원 미세환경을 생성하며, 재구성된 기저막이 코팅된 하나의 웰이 양성대조군으로 사용된다(도 1 참조). 관심있는 세포를 각각의 웰에 분주한 후 상이한 3차원 미세환경에서 배양할 수 있다. 상기 MAPTrix™ 히드로겔을 이용한 실험을 분석함으로써 원하는 세포 거동을 유도하는 합성 3차원 미세환경 구조물이 동정 및 디자인될 수 있다.
본 발명의 합성 3차원 미세환경 구조물은 다양한 세포 내에서 세포의 부착, 성장, 분화 및 형태형성과 같은 세포의 거동을 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 기술된 특징들과 또 다른 특징 및 장점들은 예시적인 목적으로 제공되는 하기 구현예들과 도면들을 함께 고려할 때 분명할 것이다.
도 1은 변조가능한 3차원 미세환경 구조물을 개략적으로 나타낸 것으로서, (A)는 MAP-ECM-X-NH2로부터 형성된 히드로겔, (B)는 MAP-ECM-X-NH2 및 MAP-ECM-Y-NH2의 혼합물로부터 형성된 히드로겔, (C)는 MAP-ECM-X-ECM-Y-NH2로부터 형성된 히드로겔이며, 상기 ECM은 세포외기질 유래 펩티드, X 및 Y는 서로 다른 또는 유사한 효소 분해 속도를 갖는 효소 민감성 모티프이다.
도 2는 αvβ3 결합 펩티드 모티프인 라미닌 α1 사슬 유래의 IKVAV(서열번호 37)을 기준으로 다양한 세포외기질 조성과 각 조성의 농도별로 48 웰 플레이트(도 2의 (A)) 및 96 웰 플레이트(도 2의 (B))에 어레이(array)한 포맷(format)을 나타낸 것이다.
도 3은 페길화(PEGylation)된 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액과 페길화되지 않은 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액에 히알루론산을 혼합하기 전(도 3의 (A)) 및 혼합한 후(도 3의 (B))의 형태를 보여주는 사진이다.도 4는 MAPTrix™ 피브로넥틴이 낮은 농도(15 mg/㎖, 도 4의 (A)) 및 높은 농도(20 mg/㎖, 도 4의 (B))에서의 공극의 크기를 보여주는 전자현미경 사진이다.
도 5는 효소 민감성 모티프를 함유하는 MAP이 Type Ⅳ 박테리아 콜라겐분해효소에 의해 분해되었음을 SDS PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다. MAP은 재조합 홍합 접착 단백질이고, E-MAP은 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9와 같은 다양한 콜라겐분해효소에 민감한 매트릭스 메탈로프로티나아제 민감성 모티프인 GPQGIAGQ를 함유하는 홍합 접착 단백질이다.
도 6은 내피세포의 튜브 형성을 유도하는 최적의 인테그린-매개성 복합 신호를 스크리닝 하기 위해 설계된 MAPTrix™ ECM 분석의 개요도를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 단일한 세포외기질 유래 펩티드가 제공되는 홍합단백질(MAPTrix™ ECM으로 칭함)이 코팅된 플레이트(도 7a) 또는 튜브형성을 유도하는 것으로 알려진 신데칸-인테그린 복합신호가 코팅된 플레이트(도 7b)에서의 HUVEC 세포의 배양 결과를 보여주는 사진이다. 인테그린 αvβ3 및 α5β1 결합 모티프를 함유하는 MAPTrix™ ECM은 내피세포의 튜브 형성에 보다 친화적인 환경을 제공함을 알 수 있다. 반면에, α2β1 및 α4β1 인테그린 결합 모티프를 함유하는 MAPTrix™ ECM은 내피세포의 튜브 형성에 보다 덜 친화적인 환경을 제공한다.
도 8은 재구성된 기저막인 GelTrx(Invitrogen)에서 배양될 때의 6시간(도 8의 (A)) 및 12시간(도 8의 (B)) 후의 내피세포의 튜브 형성 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 세포외기질 유래 펩티드 모티프가 복합적으로 존재할 경우 내피세포의 튜브형성에 미치는 영향을 보여주고 있는 사진이다. 인테그린αvβ3/α2β1을 동시에 결합하는 모티프를 함유하는 MAPTrix™ ECM이 내피세포 튜브 형성에 최적의 환경을 제공한다. 인테그린 αvβ3/α5β1을 동시에 결합하는 모티프를 함유하는 MAPTrix™ ECM은 내피세포 튜브 형성에 보통의 환경을 제공한다.
도 10은 MAPTrix™ HyGel로부터 만들어진 합성 내피세포 미세환경이 내피세포의 튜브 형성에 미치는 시간적 효과를 보여주는 사진이다.
도 11은 히드로겔로 구성된 3차원 미세환경 구조물의 공극도가 튜브형성에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, 4-arm과 8-arm 혼합물로 구성된 폴리에틸렌글리콜은 내피세포의 튜브형성을 유도하지만, 8-arm 폴리에틸렌글리콜을 단독으로 사용하면 내피세포의 튜브형성이 제대로 일어나지 않음을 보여주는 사진이다.
도 12a 및 도 12b는 히드로겔의 구조(architecture)가 튜브형성에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, αvβ3/α2β1 복합신호를 유도하는 히드로겔을 열처리(annealing)하면 히드로겔의 구조가 보다 치밀해지는 3차원 미세환경 구조물을 얻을 수 있음과(도 12a), 상기 구조물에서 내피세포를 배양하면 공극도가 충분한 구조물과 달리 내피세포의 튜브형성이 일어나지 않음(도 12b)을 보여주는 사진이다. 공극도가 충분한 환경에서 αvβ3/α2β1 신호비가 50/50 및 75/25인 경우 내피세포의 튜브가 형성되었으나 공극도가 낮은 나노섬유상 구조물에서는 튜브가 전형 형성되지 않았다.
도 13은 섬유아세포 성장인자 모방체의 활성을 비교한 것으로서, 섬유아세포 성장인자 모방체의 농도를 50배에서 100배로 첨가할 때 재조합 또는 자연형 섬유아세포 성장인자와 비슷한 활성도를 가짐을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 14는 섬유아세포 성장인자에 의한 내피세포의 튜브형성 효과를 나타낸 것으로서, 섬유아세포 성장인자 모방체나 자연형 섬유아세포 성장인자가 첨가된 경우 내피세포의 스프라우트가 상당히 형성되었으나(도 14의 (A)), 성장인자가 없는 음성대조군의 스프라우트는 매우 짧게 형성되었음(도 14의 (B))을 보여주는 사진이다.
도 15는 인간 진피 섬유아세포가 효소 민감성 모티프의 농도가 상이한 MAPTrix™ HyGel에서 배양될 때의 세포 형태를 보여주는 사진이다. 효소 민감성 모티프가 포함된 홍합 단백질 대비 일반 홍합 단백질 비율(75:25 내지 50:50)인 경우 재구성된 기저막에서 배양된 진피 섬유아세포와 유사한 세포 형태를 보여준다.
도 16은 효소 민감성 모티프가 포함된 합성 3차원 히드로겔(Dynamic MAPTrix™ HyGel)에서 배양된 인간 진피 섬유아세포의 형태에 미치는 혈청의 영향을 보여주는 사진이다.
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 제공되며, 본 발명은 예시의 목적으로만 제공되는 하기 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 기능적으로 동일한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위에 포함되는 것이 자명하다.
실시예 1. 생화학적으로 정의된 3차원 미세환경을 제공하는 MAPTrix™ HyGel의 제조
MAPTrix™ HyGel 겔 용액을 다음과 같이 준비하였다: 자연형 세포외기질과 같이 복합 신호를 유도할 수 있는 MAPTrix™ ECM 의 3차원 미세환경 구조물을 만들기 위하여 세포외기질 모방체의 조성비를 표2에 제시된 조성비로 준비하여 20 ㎎/㎖의 농도로 PBS 버퍼 용액(pH 7.4)에 용해시켰다. 상기 세포외기질 조성물은 αvβ3 결합 펩티드 모티프인 라미닌 α1 사슬 유래의 IKVAV(서열번호 37)을 기준으로 αvβ3 - α2β1, αvβ3 - α3β1, αvβ3 - α5β1, αvβ3 - 신데칸 복합 신호를 유도할 수 있도록 준비하였다. 가교화제로 20 ㎎/㎖의 4-Arm 및 8-Arm PEG-SG(1:1(v/v))와 혼합된 PBS 버퍼 용액(pH 7.4)에 용해시켰다. 상기 MAPTrix™ ECM 용액과 가교화제 용액을 각각 1:1(v/v)로 구성된 MAPTrix™ HyGel 용액을 48 웰 플레이트(BD Biosciences)에 분주한 후, 37℃에서 2시간동안 방치하여 겔을 형성하였다.
도 2에 표현한 바와 같이 αvβ3 결합 펩티드 모티프인 라미닌 α1 사슬 유래의 IKVAV(서열번호 37)을 기준으로 다양한 세포외기질 조성과 각 조성의 농도별로 48 웰 플레이트에 어레이하여 세포외기질 개별 조성과 각 조성의 농도비가 세포의 거동에 미치는 영향을 동시에 확인할 수 있도록 준비하였다. 각 행(row)에는 αvβ3 - α2β1, αvβ3 - α3β1, αvβ3 - α5β1, αvβ3 - 신데칸 복합 신호를 유도하는 조성물로 구성되었으며, 각 열(column)은 해당 조성물이 서로 다른 농도로 구성되어 각 인테그린 결합 펩티드 모티프의 농도가 세포거동에 미치는 영향을 정량화할 수 있도록 디자인되었다. 기본 포맷으로 콜라겐 타입 I 유래의 α1β1 또는 α2β1 결합 펩티드 모티프인 GFPGER(서열번호 22), DGEA(서열번호 23), 라미닌 α1 사슬 유래의 NRWHSIYITRFG(서열번호 38), 라미닌 β1 사슬 유래의 YIGSR(서열번호 44), 피브로넥틴 도메인 3 유래의 α4β1 결합 펩티드 모티프인 REDV(서열번호 61), 피브로넥틴 도메인 3 유래의 α5β1 결합 펩티드 모티프인 GRGDSP(서열번호 52), 신데칸 결합 펩티드 모티프인 피브로넥틴 유래 SPPRRARVT(서열번호 56)와 라미닌 α1 사슬 유래의 RKRLQVQLSIRT(서열번호 40) 서열을 포함하는 다양한 ECM-유래 펩티드의 복합 제공에 의해 내피세포의 세포외기질을 모방하는 생화학적 미세환경을 생성하였다.
MAPTrix™ ECM의 조성(중량%)
αvβ3/GFPGER αvβ3/YIGSR αvβ3/REDV αvβ3/GRGDSP αvβ3/
SPPRRARVT		 αvβ3/
RKRLQVQLSIRT
100/0 100/0 100/0 100/0 100/0 100/0
75/25 75/25 75/25 75/25 75/25 75/25
50/50 50/50 50/50 50/50 50/50 50/50
25/75 25/75 25/75 25/75 25/75 25/75
0/100 0/100 0/100 0/100 0/100 0/100
αvβ3 결합 모티프: IKVAV(서열번호 37), KAFDITYVRLKF(서열번호 47)
실시예 2. 히알루론산이 포함된 3차원 미세환경 구조물
MAPTrix™ 피브로넥틴 모방체(GRGDSP, 서열번호 52)로 기능화된 홍합 단백질) 200 mg을 3차 증류수에 0.5 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 마그네틱 교반기(600rpm)로 30분동안 교반하여 MAPTrix™ 피브로넥틴을 완전히 용해한 후 4-arm 및 8-arm 폴리에틸렌글리콜 각각 20 mg을 3차 증류수 5 mL에 녹인 후 2개의 MAPTrix™ 피브로넥틴 모방체 용액에 각각 4- 및 8-arm 폴리에틸렌글리콜 용액을 한방울씩 첨가하여 홍합 접착 단백질의 라이신 아민기와 균일하게 반응이 일어나도록 하였다. 반응 온도는 실온이며, 반응 시간은 5시간 동안 충분하고 완전히 반응되도록 하였다. 반응이 종료되면 4-arm, 8-arm 폴리에틸렌글리콜로 각각 페길화(PEGylation)된 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액을 영하 80℃에서 4시간 동결한 후 영하 100℃에서 72시간 동결건조하였다.
MAPTrix™ 피브로넥틴 및 페길화 MAPTrix™ 피브로넥틴 각각 10 mg을 PBS 버퍼 용액(pH 7.4) 1 mL에 용해시켜 히드로겔이 형성되는 표준 농도로 만들었다. 히알루론산(분자량 10만 달톤)을 0.5 mg/mL 농도로 준비하여 상기 준비된 MAPTrix™ 피브로넥틴 및 페길화 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액에 0.5 mL 첨가하였다. 이때 히알루론산 중량비는 페길화 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액과 혼합된 히알루론산 용액은 비교적 투명한 반면, MAPTrix™ 피브로넥틴 용액은 콜로이드성으로 불투명한 결과를 얻었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 페길화된 용액에 히알루론산 용액을 첨가해도 비교적 혼합이 이루어지는 반면, MAPTrix™ 피브로넥틴 용액은 히알루론산과 정전기적 상호작용으로 응집체를 이루어 완전히 불투명한 콜로이드성 용액을 형성했으며, 30분 이상 방치한 경우 상기 응집체는 침전되므로 히알루론산이 균일하게 분포된 히드로겔을 형성하기 어렵게 된다. 페길화된 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액에 실시예 1과 같은 절차에 따라 4-arm/8arm 폴리에틸렌글리콜 혼합물을 가교화제로 첨가하여 반응시키면 히드로겔을 형성함을 확인했으며, 따라서 히알루론산이 포함된 3차원 미세환경 구조물을 얻을 수 있었다.
상기와 같은 절차로 6-arm 및 8-arm 폴리에틸렌글리콜로 페길화된 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액에 히알루론산을 첨가한 결과, 상기와 동일한 비교적 투명한 용액이 만들어졌고, 상기 페길화된 MAPTrix™ ECM 용액으로부터 히드로겔을 형성시킬 수 있었다.
실시예 3. 공극도와 공극의 크기가 조절된 3차원 미세환경 구조물
공극 크기가 조절되는 3차원 미세환경 구조물은 다음과 같이 제조하였다. MAPTrix™ 피브로넥틴을 3차 증류수에 농도 15 및 20 ㎎/㎖로 용해하고, 상기 준비된 MAPTrix™ 피브로넥틴 용액에 15 mg/㎖ 농도의 4-arm PEG-SG를 첨가하여 MAPTrix™ HyGel 용액을 만들었다. 상기 제조된 MAPTrix™ HyGel 용액을 1.5 ㎖ e-tube에 넣고, 37℃에서 2시간 동안 가교반응 시켰다. 히드로겔이 완성된 후 상온에서 24시간 동안 방치한 후 영하 80℃에서 4시간 동결하였으며, 히드로겔 구조물의 상태를 그대로 관찰하기 위하여 영하 100℃에서 72시간 동결건조하였다. 동결건조가 완료된 샘플을 액체질소에 넣고 히드로겔 샘플의 중간 부분을 절단하였으며, 그 절단된 단면을 주사현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, MAPTrix™ 피브로넥틴이 낮은 농도(15 mg/㎖)에서 공극 크기가 5-10 마이크로미터 사이로 비교적 균일한 반면, MAPTrix™ 피브로넥틴가 높은 농도(20 mg/㎖)에서 공극이 크며 10-50 마이크로미터로 공극도가 비교적 불균일함을 알 수 있었다.
실시예 4. 효소에 의해 소화되는 MAPTrix ™ HyGel 의 생성
MMP 민감성 모티프인 GPQGIAGQ 서열(서열번호 65)에 결합된 라미닌 유래 펩티드 IKVAV 서열(서열번호 37)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 홍합 접착 단백질에 추가하였다(FP1-FP-5-효소 민감성 모티프-FP1). 상기 홍합 접착 단백질과 MMP 민감성 IKVAV의 융합 단백질을 다이내믹 MAPTrix™(Dynamic MAPTrix™) 라미닌으로 명명하였다.
5 ㎎의 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌을 10 ㎖ PBS(1×) 내에 용해시키고, 타입 Ⅳ 박테리아 콜라게나아제를 상기 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌 용액 내에 첨가시켰다. MAPTrix™ 라미닌 : 콜라게나아제의 비는 25 : 1이었다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후, SDS-PAGE에 의해 소화를 모니터링하였다. 소화된 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌 유래의 다양한 절편들의 외관상(apparent) 분자량은 29, 18 및 12 kDa 였다. 상기 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌 및 FP1-FP5의 분자량은 각각 24 kDa 및 16 kDa 였다. SDS-PAGE 겔 상의 각각의 절편의 외관상 분자량은 홍합 접착 단백질의 높은 pI 값(9.89)으로 인해 예측된 분자량보다 더 컸다(예를 들면, 24 kDa와 비교하여 ∼29 kDa). 상기 절편의 분자량으로부터, 본 발명자들은 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌이 효소에 의해 소화가능한 것임을 확인하였다(도 5 참조).
실시예 5. 내피세포의 세포 배양에 적합한 3차원 미세환경 구조물 탐색
혈관생성에 적합한 복합 신호 환경을 탐색하기 위하여 실시예 1에서 제조된 MAPTrix™ ECM Array를 사용하여 내피세포의 튜브형성을 유도하는 생화학적 신호 환경을 제공하는 3차원 미세환경 구조물을 탐색하였다. 내피세포의 부착 상태나 스프라우트 또는 튜브 형성 등 세포의 표현형(phenotype)을 광학 현미경으로 관찰하였으며, 대표적으로 몇가지 생화학적 신호 환경에 따른 세포의 거동을 관찰한 사진을 도 6에 나타내었다.
도 6에서 생화학적 신호를 제공하는 3차원 구조물이 유도하는 복합 신호의 종류와 강도에 따라 세포의 표현형이 달라짐을 알 수 있었다. 도 6에서 관찰된 것과 같이, αv 신호 강도가 높은 3차원 미세환경 구조물에서는 세포의 접착과 생존률이 높음을 알 수 있으며, 도 7a에서 관찰된 것과 같이, 단일 MAPTrix™ ECM 성분으로된 미세환경 구조물이 내피세포의 튜브형성에 미치는 영향을 분석한 결과, αvβ3 및 α5β1 단일 신호만으로도 내피세포의 튜브형성을 유도가 가능함을 알 수 있었다.
실시예 6. 미세환경이 튜브 형성에 미치는 분석
인테그린 조합에 의한 복합 신호가 내피세포의 튜브형성에 미치는 영향을 파악하기 위하여, 내피세포에서 발현도가 가장 높은 인테그린을 기준으로 실시예 1에서 같은 절차로 αvβ3 - α2β1, αvβ3 - α4β1, αvβ3 - α5β1 및 α2β1 - α5β1 신호를 유도하는 3차원 미세환경 구조물을 제조하였다. 상기 구조물에서 유도된 복합 신호가 내피세포의 튜브형성 여부에 미치는 영향을 분석하기 위하여 다음과 같이 내피세포를 배양하였다.
10% 우태아혈청(FBS)과 내피세포 성장 보충물(ECGS, 30 ㎍/㎖; BD Biosciences)이 보충된 내피세포 성장 배지(M199 배지)를 사용하여 HUVEC 세포를 접종하였다.
HUVEC 세포를 무혈청 M199 배지 내에서 400 g에서 1분 동안 원심분리하여 세척한 후, 세척된 HUVEC 세포를 무혈청 M199 배지 내에 재부유시켰다. 실시예 1에서 제조된 각각의 MAPTrix™ 히드로겔 상에 100 ng/㎖의 VEGF와 함께 5×104 세포/웰의 밀도로 상기 HUVEC 세포를 접종한 후, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로 자연형 기저막을 추출하여 재구성한 GelTrex(Invitrogen사 판매)를 사용하였다. HUVEC의 형태형성을 관찰하였고, 6시간마다 위상차현미경을 이용하여 사진촬영을 하였다.
그 결과, 각각의 미세환경이 HUVEC 세포의 형태형성에 미치는 효과는 도 9(MAPTrix™ ECM에 의한 복합 인테그린 결합 모티프를 제공하는 미세환경)에서 보는 바와 같이, 실시예 5의 단일 인테그린 결합 모티프를 제공하는 미세환경에서 배양된 내피세포의 형태(도 7a)와 매우 상이하였다. 그러나 튜브형성을 유도하는 것으로 알려진 신데칸-인테그린 복합신호와 단일 인테그린 신호 환경에서 내피세포의 형태는 큰 차이가 없었다(도 7b). 다만, 신데칸-α5β1 복합신호를 유도하는 경우, 스프라우트가 생성되어 튜브형성의 가능성을 보여주고 있다. αvβ3 또는 α5β1 인테그린 결합 모티프를 제공하는 MAPTrix™ 조성물은 내피세포 튜브 형성을 위한 양호한 환경을 제공하였지만, α2β1 및 α4β1 인테그린 결합 모티프를 제공하는 MAPTrix™ 조성물은 내피세포 튜브 형성을 위한 덜 양호한 환경을 제공하였다(도 7a 및 도 7b). αvβ3/α2β1 인테그린 결합 모티프의 조합을 제공하는 MAPTrix™ 조성물은 내피세포 튜브 형성을 위한 최적의 환경을 제공하였다. 그러나, αvβ3/α5β1 인테그린 결합 모티프의 조합을 제공하는 MAPTrix™ 조성물은 내피세포 튜브 형성을 위한 보통의 환경을 제공하였다(도 9). 도 10은 αvβ3/α2β1 인테그린 결합 모티프의 조합을 제공하는 MAPTrix™ 조성물에서 배양된 내피세포가 튜브를 형성하는 형태형성 과정을 나타낸 것으로 도 9에 나타낸 바와 같이, αvβ3/α2β1 인테그린 결합 모티프의 조합을 제공하는 MAPTrix™ 조성물은 형태형성 분석에서 자연형 내피세포 기저막과 유사한 미세환경을 보여주었다. 약 6시간만에 튜브형성이 되는 양성 대조군과 달리 αvβ3/α2β1 환경에서는 튜브 형성이 약 24간 전후로 완료되어, 상기 αvβ3/α2β1 환경은 내피세포의 튜브형성을 상당히 지연시킴을 알 수 있었다.
실시예 7. 히드로겔의 공극도가 튜브형성에 미치는 영향 검정
히드로겔로 구성된 3차원 미세환경 구조물에서 공극도가 내피세포의 튜브형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 서로 다른 가교화제인 4-arm/8-arm 혼합물과 8-arm 단일 폴리에틸렌글리콜로 히드로겔을 형성했으며, 실시예 6에서 같은 절차로 내피세포를 배양하여 동일한 복합 신호를 유도하는 3차원 미세환경 구조물의 형태와 공극이 내피세포에 미치는 영향을 분석하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 동일한 αvβ3/α2β1 복합 신호를 유도하더라도 3차원 구조물의 표면 구조(morphology)나 공극도가 다를 경우 내피세포의 튜브형성에 영향을 미침을 알 수 있었다. 4-arm와 8-arm 혼합물로 구성된 폴리에틸렌글리콜은 내피세포의 튜브형성을 유도하지만, 8-arm 폴리에틸렌글리콜을 단독으로 사용하면 내피세포의 튜브형성이 제대로 일어나지 않음을 알 수 있었다.
실시예 8. 히드로겔의 구조( architecture )가 튜브형성에 미치는 영향 검정
실시예 6에서 제조된 αvβ3/α2β1 복합신호를 유도하는 히드로겔을 열처리(annealing)하면 히드로겔의 구조가 보다 치밀해지는 3차원 미세환경 구조물을 얻을 수 있다(도 12a 참조).
일반적으로 물질을 열처리하면 공극도가 감소하면서 조직이 치밀해지는데, 도 12a와 같이 히드로겔은 나노수준의 섬유상을 형성하면서 공극도가 크게 낮아짐을 알 수 있다. 이러한 구조물에서 내피세포를 배양한 결과, 공극도가 충분한 구조물과 달리 내피세포의 튜브형성이 일어나지 않음을 알 수 있었다(도 12b).
실시예 9. 섬유아세포 성장인자 모방체의 활성 효과
진피 섬유 아세포를 무혈청 배지에 2일간 배양 후 무혈청 배지를 새로 교환하였고 추가로 1일간 배양시켰다. 서열번호 93으로 기능화된 홍합 단백질 기반 섬유아세포 성장인자 모방체를 세포배양액에 첨가한 후 5분간 섬유아세포 성장인자 모방체에 의한 진피 섬유아세포를 처리한 후 세포 용해물(lysates)로 처리하고 pFGFR1 및 pERK 항체를 이용한 면역블롯하였다. FGFR1 및 ERK의 인산화 레벨을 면역블롯으로 측정하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 대조군에는 재조합 섬유아세포 성장인자를 첨가하여 섬유아세포 성장인자 모방체의 활성과 비교하였다.
그 결과, 섬유아세포 성장인자 모방체의 농도를 50배에서 100배로 첨가할 때 재조합 또는 자연형 섬유아세포 성장인자와 비슷한 활성도를 가짐을 알 수 있었다(도 13).
실시예 10. 섬유아세포 성장인자에 의한 내피세포의 튜브형성 효과
실시예 6에서 내피세포의 튜브 형성이 어려운 신호인 α4β1 인테그린 결합 모티프의 조합을 제공하는 MAPTrix™ 조성물에 실시예 9에서 사용된 섬유아세포 성장인자 모방체를 1umM 농도로 첨가한 후 내피세포의 튜브형성 시험을 진행하였다. 자연형 섬유아세포 성장인자가 첨가된 군을 양성대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포 성장인자 모방체나 자연형 섬유아세포 성장인자가 첨가된 경우 내피세포의 스프라우트가 상당히 형성되었으나, 성장인자가 없는 음성대조군의 스프라우트는 매우 짧음을 알 수 있었다. 스프라우트 형성은 내피세포가 튜브로 형태가 변환되기 위해 거쳐야 할 과정으로 내피세포의 튜브형성의 척도가 된다.
실시예 11. 다이내믹 MAPTrix ™ 라미닌으로부터 형성된 히드로겔에서의 섬유아세포 배양
효소 민감성 MAPTrix™ HyGel 겔 용액을 다음과 같이 제조하였다: 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌 및 MAPTrix™ 라미닌을 PBS 버퍼 용액(pH 7.4) 내에서 각각 최종 농도 20 ㎎/㎖로 용해시키고, 10 ㎎/㎖ 4-Arm 및 8-Arm PEG-SG(1:1(v/v))과 함께 혼합시켰다. 다이내믹 MAPTrix™ 라미닌 대 MAPTrix™ 라미닌의 비는 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 및 0:100 이었다. 제조된 MAPTrix™ HyGel 용액을 48 웰 플레이트(BD Biosciences)에 넣고, 37℃에서 2시간 동안 두었다. 재구성된 기저막인 GelTrex(Invitrogen)를 양성대조군으로 사용하였다.
10% 우태아혈청(FBS)과 세포 성장 배지(DMEM 배지)를 사용하여 Hs27 진피 섬유아세포를 분주하였다. Hs27 진피 섬유아세포를 무혈청 DMEM 배지 내에서 400 g에서 1분 동안 원심분리하여 세척하였고, 세척된 Hs27 진피 섬유아세포를 무혈청 DMEM 배지 내에 재부유시켰다. 상기 세포를 3×104 세포/웰의 밀도로 각각의 다이내믹 MAPTrix™ 히드로겔 위에 분주하고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. Hs27 진피 섬유아세포의 형태형성을 모니터링하고, 위상차현미경으로 사진촬영을 하였다.
섬유아세포는 다이내믹 Dynamic MAPTrix™ 라미닌 대 MAPTrix™ 라미닌의 비가 75:25 및 50:50일 때 GelTrex 상에 배양된 섬유아세포와 유사하게 튜브 모양의 구조를 형성하였다(도 15). FBS(10%)를 상기 MAPTrix™ HyGel에 첨가하여 복합 신호를 생성하면, 상기 세포의 형태는 GelTrex 상의 세포와 더욱 유사하였다(도 16).
상기에서 살펴본 바와 같이, 복합 신호와 함께 기질의 역학적 특성(즉, 효소에 의한 조절된 분해)은 세포의 거동에 현저한 영향을 미친다는 것을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 홍합 접착 단백질 및 가교결합제를 포함하는 생체소재 조성물을 포함하는 3차원 미세환경 구조물로서,
    상기 홍합 접착 단백질은 그 구조 내에 세포 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 하나 이상의 매트릭스잠재(matricryptic) 펩티드 모티프를 포함하는 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 포함하고,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 캐드헤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3차원 미세환경 구조물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 포함하는 홍합 접착 단백질은 MAP-ECM1-X-NH2, MAP-ECM2-Y-NH2 및 MAP-ECM3-X-ECM4-Y-NH2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구조를 갖는 3차원 미세환경 구조물:
    상기에서, MAP는 홍합 접착 단백질이고, ECM1, ECM2, ECM3 및 ECM4는 서로 독립적으로 세포 거동을 조절하는 하나 이상의 매트릭스잠재 펩티드 모티프를 포함하는 세포외기질 유래 펩티드 모티프이며, X 및 Y는 서로 독립적으로 효소에 의한 분해속도가 동일하거나 상이한 효소 민감성 펩티드 모티프이다.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 가교결합제는 8개의 팔을 갖는 PEG-SG, 4개의 팔을 갖는 PEG-SG, 및 8개의 팔을 갖는 PEG-SG와 4개의 팔을 갖는 PEG-SG의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 3차원 미세환경 구조물.
  4. 삭제
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프는 인테그린, 신데칸, 캐드헤린 또는 디스트로글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 상이한 세포 표면 수용체를 동시에 활성화시키는 조합을 포함하는 3차원 미세환경 구조물.
  6. 삭제
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 인테그린은 α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, αvβ3, α6β4 및 αvβ5로 이루어진 군으로부터 선택되는 3차원 미세환경 구조물.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 신데칸은 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3 및 신데칸-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 3차원 미세환경 구조물.
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 한 세포 표면 수용체는 인테그린들로부터 선택되고, 다른 한 세포 표면 수용체는 신데칸, 캐드헤린 및 디스트로글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3차원 미세환경 구조물.
  10. 삭제
  11. 홍합 접착 단백질 및 가교결합제를 포함하는 생체소재 조성물을 포함하며, 세포 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 하나 이상의 세포 표면 수용체의 활성을 조절할 수 있는 표면으로서,
    상기 홍합 접착 단백질은 그 구조 내에 세포 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 매트릭스잠재 펩티드 모티프를 포함하는 하나 이상의 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 포함하고,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 캐드헤린으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 세포 표면 수용체는 인테그린, 신데칸, 캐드헤린 및 디스트로글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표면.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 포함하는 홍합 접착 단백질은 MAP-ECM1-X-NH2, MAP-ECM2-Y-NH2 및 MAP-ECM3-X-ECM4-Y-NH2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구조를 갖는 표면:
    상기에서, MAP는 홍합 접착 단백질이고, ECM1, ECM2, ECM3 및 ECM4는 서로 독립적으로 세포 거동을 조절하는 하나 이상의 매트릭스잠재 펩티드 모티프를 포함하는 세포외기질 유래 펩티드 모티프이며, X 및 Y는 서로 독립적으로 효소에 의한 분해속도가 동일하거나 상이한 효소 민감성 펩티드 모티프이다.
  13. 청구항 12에 있어서,
    단백질의 구조나 형태 변화에 의해 세포외기질 유래 펩티드 모티프 내의 매트릭스잠재 펩티드 모티프가 세포에 노출되면서 세포 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 시공간적으로 조절이 가능한 표면.
  14. 청구항 12에 있어서,
    단백질의 구조나 형태 변화에 의해 세포의 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 세포외기질 유래 펩티드 모티프 내의 매트릭스잠재 펩티드 모티프가 세포에 노출될 수 있는 홍합 접착 단백질로 구성된 표면.
  15. 그 구조 내에 세포 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 매트릭스잠재 펩티드 모티프를 포함하는 하나 이상의 세포외기질 유래 펩티드 모티프를 포함하는 홍합 접착 단백질로서,
    상기 세포외기질 유래 펩티드 모티프는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 캐드헤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 홍합 접착 단백질.
  16. 청구항 15에 있어서,
    단백질의 구조나 형태 변화에 의해 세포의 부착, 이동, 성장 및 분화로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 거동을 조절하는 세포외기질 유래 펩티드 모티프 내의 매트릭스잠재 펩티드 모티프가 세포에 노출될 수 있는 홍합 접착 단백질.
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