KR102486925B1 - 세포배양기재 및 이의 제조방법 - Google Patents

세포배양기재 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102486925B1
KR102486925B1 KR1020200184987A KR20200184987A KR102486925B1 KR 102486925 B1 KR102486925 B1 KR 102486925B1 KR 1020200184987 A KR1020200184987 A KR 1020200184987A KR 20200184987 A KR20200184987 A KR 20200184987A KR 102486925 B1 KR102486925 B1 KR 102486925B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell culture
tyr
lys
gly
pro
Prior art date
Application number
KR1020200184987A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210084328A (ko
Inventor
김형택
서동식
구희관
Original Assignee
주식회사 아모라이프사이언스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 아모라이프사이언스 filed Critical 주식회사 아모라이프사이언스
Publication of KR20210084328A publication Critical patent/KR20210084328A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102486925B1 publication Critical patent/KR102486925B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

세포배양기재가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 섬유들이 집적된 섬유웹, 및 상기 섬유웹의 일 표면에 위치하는 섬유들 중 적어도 일부 섬유들 사이를 연결하는 코팅막을 포함하는 세포배양 코팅층을 구비하고, 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질를 통해 구현된다. 이에 의하면, 세포배양에 도움을 주는 단백질과 같은 물질을 함유함에도 불구하고 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 세포배양기재에 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있음에 따라서 줄기세포 등 각종 세포배양에 널리 응용될 수 있다.

Description

세포배양기재 및 이의 제조방법{Cell cultivation substrate and method for manufacturing thereof}
본 발명은 세포배양기재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
포유류 세포의 배양은 생명 과학 및 보건 과학에서 많은 공정들 중 하나이다. 고정-의존성 세포를 수반하는 포유류 세포 배양 및 분석을 위한 세포배양기재는 흔히 예를 들어 고분자 중합체 또는 유리로 만들어진 웰-플레이트와 같은 용기나 필름과 같은 플레이트가 많이 사용되는데, 세포가 용기나 플레이트 표면에 부착되게 하는 추가의 표면 처리가 요구된다. 이와 같은 표면 처리는 예를 들어 흡착, 그래프팅 또는 플라스마 중합 기술에 의해 표면 상에 흡착층을 형성시키거나 적절한 표면형상을 구현하는 것을 포함할 수 있다. 또는 상기 표면 처리는 용기나 플레이트 표면 그 자체에 화학적 개질을 통한 것일 수 있으며, 예를 들어 대기 코로나, 무선 주파수 진공 플라스마(radio frequency vacuum plasma), DC 글로우 방전(glow discharge), 및 마이크로파 플라스마 처리(microwave plasma treatments)등을 통해 수행될 수 있다.
한편, 줄기세포 예를 들어 성인 줄기세포(adult stem cells, ASCs), 전분화능줄기세포(Pluriopotent stem cell)을 포함한 각종 줄기세포 및 체세포들을 배양 및 분화, 교차분화, 리프로그래밍 하는 현재의 방법은 복잡한 배양 환경들, 예를 들어 세포외 기질 단백질이나, 세포의 증식에 도움을 주는 다른 여러 단백질을 이용한 코팅층을 고형 기재 표면 상에 형성시켜 세포외 기질과 같은 유사한 미세환경을 형성시켜 줄기 세포를 배양하는 것이 일반적이다.
한편, 상기 코팅층은 상술한 각종 단백질들을 포함한 용액을 단순히 용기나 플레이트와 같은 세포부착 표면에 처리한 뒤 건조시켜 형성시키는데, 코팅층 내 단백질의 활성 안정성은 매우 낮아서 코팅층을 형성시킨 뒤 상온에서 몇 시간 내 활성을 쉽게 잃어버리는 문제가 있어서 미리 코팅층이 형성된 세포배양기재를 제조해 두기 어렵고, 제조하더라도 이를 저온에서 보관해야 하며, 저온 보관 시에도 보관일수가 30일 이내로 매우 짧은 문제가 있다. 또한, 이와 같은 열악한 저장안정성으로 인해 세포 로딩 작업 직전에 세포부착 표면에 코팅층을 형성시키는 것이 일반적이며, 이로 인해 세포배양 작업상 불편함과, 세포배양 전 준비시간이 연장되는 문제가 있다.
공개특허공보 제10-2016-0036681호
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수하고, 그럼에도 불구하고 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있는 세포배양기재 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있는 세포배양기재 및 이의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
나아가 본 발명은 위와 같은 우수한 특성을 달성할 수 있도록 하는 세포배양 코팅조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 섬유들이 집적된 섬유웹, 및 상기 섬유웹의 일 표면에 위치하는 섬유들 중 적어도 일부 섬유들 사이를 연결하는 코팅막을 포함하는 세포배양 코팅층을 구비하고, 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질로 형성된 세포배양기재를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 기능성 펩타이드는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 섬유웹은 폴리스티렌(PS), 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
또한, 상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질일 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 RGD 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드일 수 있다
또한, 상기 섬유웹의 일면에 대향하는 타면에 배치된 지지체를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 섬유웹은 평균직경이 200 ~ 1000㎚이며, 두께가 2 ~ 20㎛이고, 평량이 3 ~ 20g/㎡일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계, 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 섬유웹 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하는 세포배양기재 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 또는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있다.
또한, 상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제는 1: 0.1 ~ 10 중량비로 활성용액에 포함되며, 상기 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드 커플링제가 1: 1~100 중량부로 혼합될 수 있다.
또한, 본 발명은 피코팅 기재인 섬유웹 표면의 적어도 일부 기공을 폐색하는 코팅막을 형성하는 세포배양 코팅조성물로서, 상기 세포배양 코팅조성물은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질, 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양 코팅조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대하여 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
본 발명에 의한 세포배양기재는 세포배양에 도움을 주는 단백질과 같은 물질을 함유함에도 불구하고 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 세포배양기재에 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있음에 따라서 줄기세포 등 각종 세포배양에 널리 응용될 수 있다
도 1 내지 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양기재의 표면 SEM 사진,
도 3 내지 도 4는 본 발명의 비교예에 따른 세포배양기재의 표면 SEM 사진 및 세포배양결과에 대한 사진,
도 5 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 배양한 후 2종(Nanog, Sox2)의 마커의 발현정도를 촬영한 사진,
도 8은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 동일한 조건에서 13번 계대배양한 후 계대1과 계대13에서의 배양세포를 세포염색법으로 염색하여 배양여부를 촬영한 사진,
도 9는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 배양한 후 시간 별 배양세포수를 흡광도를 통해 세포 성장을 측정한 그래프,
도 10은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 계대배양한 후 계대3과 계대9에서의 Oct4마커를 발현하는 배양세포를 촬영한 사진,
도 11 및 도 12는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 배양한 후 유세포분석기를 이용하여 Oct4 마커가 발현하는 세포의 발현정도를 평가한 그래프,
도 13 내지 도 15는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 대해 각각 1 ~ 3개월 동안 가속화실험을 수행 후 유도만능줄기세포를 배양한 사진, 그리고
도 16 내지 도 18은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 세포배양기재에 대해 각각 1 ~ 3개월 동안 가속화실험을 수행 후 유도만능줄기세포를 배양한 사진이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 섬유들이 집적된 섬유웹 및 세포배양 코팅층을 구비한다.
상기 섬유웹은 파종된 세포가 안착하여 증식할 수 있는 지지체로서 후술하는 세포배양 코팅층에 대한 피코팅면을 제공한다. 상기 섬유웹은 섬유들이 집적된 3차원 네트워크 구조를 가지며, 구체적으로 각각의 섬유가 독립적으로 폴딩 및/또는 섬유길이방향의 정함이 없이 각각이 배열되고, 이들이 적층됨을 통해 구조적으로 더욱 복잡하고, 다양한 3차원 네트워크 구조를 형성할 수 있다. 이와 같이 복잡, 다양하게 형성된 내부 구조는 세포의 증식에 필요한 영양분을 포함하는 배양용액의 유로로 기능하여 섬유웹 내부에 위치한 세포까지 용이하게 영양분을 공급시킬 수 있고, 세포사멸을 방지하며, 세포증식을 향상시킬 수 있다.
이때, 1가닥 섬유 내의 서로 다른 표면 간 및/또는 서로 다른 섬유의 표면 간에는 접착 또는 융착이 발생할 수 있고, 이를 통해 3차원네트워크 구조가 구조적으로 보다 안정화 될 수 있다.
또한, 섬유들이 랜덤하게 배열되고 축적되어 형성된 섬유웹의 표면은 표면 모폴로지에 의해 세포의 입체적 배양을 유도할 수 있다. 표면 모폴로지의 일 예로써, 섬유웹 표면은 평평하지 않고, 울퉁불퉁한 표면이 형성될 수 있고, 표면 거칠기가 클 수 있다. 섬유웹의 표면 형상이 울퉁불퉁하다는 것은 예시적으로 다수개의 오목부 및/또는 볼록부를 포함한 것으로써, 세포의 입체적 성장효과 이외에 세포가 볼록부 간 사이 공간 또는 오목부의 홈에 보다 용이하고 견고하게 안착될 수 있어서 세포배양시트에 안착된 뒤 탈리되는 세포의 수를 현저히 감소시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 섬유웹을 형성하는 섬유는 세포배양에 사용되는 통상적인 재질의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 일예로서 상기 섬유는 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리카보네이트와 같은 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 등의 불소계 화합물, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 다만, 세포증식 및 회수성을 모두 고려하여 섬유는 불소계 화합물을 포함할 수 있고, 이 중에서도 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)를 포함할 수 있다. 섬유가 PVDF인 경우 세포 회수 특성이 우수할 뿐만 아니라, 배양된 세포가 파종 시 세포 직경 보다 작게 구현하기에 유리할 수 있다.
상기 섬유웹은 스펀본드, 멜트블로운 등의 공지된 방법으로 웹 형상으로 구현된 것이거나, 전기방사를 통해 구현된 것일 수 있다. 또한, 상기 섬유웹은 평균직경이 10㎚ ~ 1.5㎛인 섬유들로 형성되며, 평량이 1 ~ 20g/㎡일 수 있다. 만일 섬유의 평균직경이 10㎚ 미만일 경우 기계적 강도가 열위하고, 섬유웹의 제조가 어려울 수 있다. 만일 섬유의 평균직경이 1.5㎛를 초과하는 경우 섬유웹의 밀도(평량)가 작아지고, 열압착시 섬유웹의 표면이 부분적으로 용융된 것과 같이 형성될 우려가 있다. 또한, 섬유웹 모폴로지가 세포배양에 유리한 토폴로지를 구현하기 어려워 세포배양 효율이 감소할 우려가 있다. 또한, 만일 평량이 1 g/㎡ 미만일 경우 섬유웹 제조 시 핸들링이 용이하지 않은 우려가 있고, 평량이 20g/㎡를 초과하는 경우 압착롤에서 섬유웹이 용융될 수 있고, 섬유웹이 후술하는 별도의 지지체인 필름과 합지되어 세포배양시트를 구현하는 경우에 필름에 부착되기 어려울 수 있다. 또한, 섬유 직경과 섬유웹 평량 조건을 만족하지 못하는 경우 세포배양에 적합한 표면 모폴로지의 구현이 어려울 수 있고, 본 발명이 목적하는 수준의 세포배양 효율 등을 달성하기 어려울 수 있다. 한편, 섬유웹 표면이 세포배양, 특히 줄기세포의 배양에 유리한 모폴로지를 구현하기 위해서 바람직하게는 섬유웹은 섬유 평균직경이 200 ~ 1000㎚이며, 두께가 2 ~ 10㎛이고, 평량이 3 ~ 7g/㎡일 수 있고, 이를 통해 세포배양효율이 향상됨과 더불어 배양된 세포가 파종 시보다 작은 직경을 갖도록 배양할 수 있어서 보다 젊고, 상태가 우수한 세포를 배양시키기에 유리하다. 특히 두께가 2㎛ 미만일 경우 세포 증식 속도가 매우 저하될 수 있는 우려가 있다. 또한, 두께가 10㎛를 초과할 경우 세포의 현미경 관찰이 어려울 수 있어서 증식되는 세포 관찰이 용이하지 않을 수 있다.
다음으로 상술한 섬유웹 상에 구비되는 세포배양 코팅층에 대해 설명한다.
상기 세포배양 코팅층은 배양될 세포가 파종된 뒤 안착 및 증식을 향상시킬 수 있는 세포부착 표면을 제공하는 층이다. 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 포함하여 형성된다.
도 1을 참고하여 설명하면, 상기 세포배양 코팅층은 섬유웹 표면에 위치하는 섬유들 중 일부 섬유간 사이의 공간을 연결하는 코팅막을 포함한다. 상기 코팅막은 섬유웹 표면에 군데군데 랜덤하게 형성되는데, 섬유 간 사이를 연결하는 코팅막과 섬유웹 표면에 위치하는 섬유들로 인해 형성되는 모폴로지는 세포배양에 보다 유리한 환경을 만들 수 있다. 또한, 상기 코팅막이 섬유웹 일 표면을 전부 덮지 않음에 따라서 배가 내부로 유입 및 유출이 가능하고, 이를 통해 섬유웹 표면에 안착한 세포에 3차원으로 배지를 공급할 수 있어서 세포배양에 상승된 효과를 얻기에 유리하다.
또한, 상기 세포배양 코팅층은 코팅막뿐만 아니라 섬유웹을 형성하는 섬유들 일부 또는 전부의 외부면 적어도 일부 표면 상에 형성된 피복층을 포함할 수 있다. 더불어 상기 코팅막은 섬유웹 표면에 위치하는 섬유들뿐만 아니라, 섬유웹 내부에 위치하는 섬유나, 섬유웹 타면에 위치하는 섬유들 중 일부 섬유 간 사이 공간을 연결하도록 형성될 수도 있다.
세포배양용 융합단백질을 통해 형성되고 섬유 간 사이 공간을 연결하는 코팅막을 포함한 세포배양 코팅층은 세포배양 효율에 있어서 매우 우수한 동시에 상온에서도 수 년 이상 보관하는 경우에도 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양용 융합단백질이 분해, 변성됨에 따라 야기되는 기능성 펩타이드의 활성 감소가 방지 또는 최소화됨에 따라서 저장안정성이 매우 향상되는 이점이 있다. 또한, 상기 세포배양 코팅층은 폴리머 계열의 접착성분, 예를 들어 아크릴계 접착성분을 사용하지 않고 기능성 펩타이드를 세포배양기재 표면에 도입함에 따라서 세포독성이 없고, 세포를 보다 생체친화적으로 배양시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 통해 형성되는데, 상기 기능성 펩타이드는 세포배양에 도움을 줄 수 있는 기능을 갖는 물질로서, 구체적으로는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 수행하는 물질일 수 있다. 상기 기능성 펩타이드는 이러한 기능을 수행하는 공지된 펩타이드의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 이에 대한 비제한적인 예로서, 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor , KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin , GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포외 기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.
일예로 상기 기능성 펩타이드는 아미노산 서열 내 RGD 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드일 수 있다 또한, 상기 기능성 펩타이드는 비트로넥틴 폴리펩타이드, 콜라겐 폴리펩타이드, 라미닌 폴리펩타이드, 피브로넥틱 폴리펩타이드 또는, 이들의 변이체일 수 있다.
한편, 상기 기능성 펩타이드는 일예로 아미노산 개수가 a ~ b인 펩타이드 일 수 있으며, 이를 통해 장시간 상온에서 코팅층에 함유된 상태로 보관되는 경우에도 분해, 변성 등이 최소화 또는 방지되기에 보다 유리할 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 홍합 접착단백질에 결합되는데, 구체적으로 홍합 접착단백질의 카르복시 말단, 아미노 말단 또는 카르복시 말단과 아미노 말단 양단에 결합될 수 있다. 이때 상기 결합은 공유결합이며, 구체적으로 아미노 결합일 수 있다. 한편, 기능성 펩타이드와 홍합 접착단백질은 공지된 방법을 통해 결합시킬 수 있고, 일예로 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법를 통해 제조할 수 있다. 한편, 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드 간에 직접 공유결합으로 결합될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며 가교제와 같은 소정의 물질을 매개하여 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드 간 간접적으로 결합될 수 있음을 밝혀둔다.
기능성 펩타이드를 홍합 접착단백질에 결합시키는 이유는 홍합 접착단백질이 기능성 펩타이드를 섬유웹의 섬유 표면에 부착특성이 좋게 고정시키기에 유리하며, 상술한 것과 같이 폴리머 기반의 접착성분에 대비해 배양세포에 가할 수 있는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하기 때문이다. 또한, 파종된 세포와의 부착특성이 좋아서 파종된 세포가 세포부착 표면에 안착된 후 탈리를 최소화할 수 있는 이점이 있다.
상기 홍합 접착단백질은 홍합에서 유래한 접착단백질로서, 홍합 접착단백질로 통칭되는 공지의 접착단백질의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질일 수 있고, 일예로 서열번호 13번으로 표시되는 홍합 접착단백질일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 상기 섬유웹의 일면에 대향하는 타면에 배치된 지지체를 더 포함할 수 있다. 상기 지지체는 섬유웹의 기계적 강도를 보완하는 부재의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 일예로 상기 지지체는 직물, 편물, 부직포 또는 필름일 수 있다. 또한, 지지체의 재질은 세포배양에 영향이 없는 재질이 바람직하며, 일예로 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리이미드 등의 재질일 수 있다. 한편, 상기 지지체와 섬유웹은 지지체의 일부분 및/또는 섬유웹의 일부분이 용융에 의한 열융착 또는 별도의 접착제를 통해 상호 간에 부착될 수 있다. 이때, 접착제는 세포배양에 영향을 최소화할 수 있는 실리콘 재질의 접착제를 사용할 수 있다.
상술한 세포배양 코팅층이 구비된 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계, 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 섬유웹 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 (1) 단계로서 카보디이미드 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계를 수행한다.
상기 활성용액은 카보디이미드계 커플링제와 반응제를 포함하며, 용매를 더 포함할 수 있다. 활성용액은 세포배양용 융합 단백질을 섬유웹 표면에 도입시키는 물질로서, 단순히 세포배양용 융합 단백질을 통상의 방법으로 섬유웹 표면에 처리한 경우에 대비해 세포배양 코팅층과 세포배양기재 표면 간의 부착력을 향상시키며, 섬유 간 사이 공간을 연결하는 코팅막을 형성할 수 있게 하는 이점이 있다.
상기 카보디이미드계 커플링제는 융합 단백질들이 서로 결합되도록 하는 커플링제의 경우 제한 없이 사용될 수 있으며, 일예로 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)일 수 있다.
또한, 상기 반응제는 카보디이미드계 커플링제와 커플링된 상태의 융합단백질이 수화되는 것을 방지하여 융합 단백질들이 서로 결합되는 효율을 증가시키기 위해 구비되는 것으로서, 일예로 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있다. 한편, 반응제로 종래에 알려진 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 경우 본 발명이 목적하는 효과를 발현하는데 있어서 용이하지 않을 수 있다.
상기 활성용액은 상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제를 1 :0.1 ~ 10 중량비로 포함할 수 있다. 만일 이들이 적절한 비율로 포함되지 못할 경우 본 발명이 목적하는 효과를 달성하기 어렵고, 구현된 세포배양코팅층에서 세포의 부착성이 현저히 저하될 우려가 있다.
또한, 상기 활성용액은 반응성 향상을 위하여 아세트산나트륨을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 아세트산 나트륨은 카보디이미드 커플링제 100 중량부에 대해서 1 ~ 100 중량부로 포함될 수 있다.
또한, 상기 활성용액은 용매를 더 포함할 수 있는데, 상기 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 일예로 물일 수 있다.
상기 활성용액은 제조하는 방법이 특별히 한정되는 것은 아니나, 일예로 아세트산 나트륨 용액을 카보디이미드계 커플링제 용액과 반응제 용액에 각각 투입하여 혼합하여 2 종의 용액을 제조한 뒤, 2종의 용액을 적절한 비율로 혼합한 뒤 20 ~ 50분간 반응을 유도하고, 이후 28 ~ 35℃ 항온 배양기에서 다시 25 ~ 40분간 반응시켜 최종 활성용액이 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (2) 단계로서, 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계를 수행한다.
이때, 상기 세포배양용 융합단백질과 활성용액은, 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드 커플링제가 1 ~ 100 중량부 포함되도록 함량을 조절하여 혼합될 수 있다. 만일 카보디이미드계 커플링제가 1 중량부 미만일 경우 세포의 부착이 되지 않거나 분화가 될 수 있고, 100 중량부를 초과할 경우 세포가 부착 후 탈리될 수 있어서 세포를 안정적으로 배양하기 어려울 수 있다.
또한, 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질은 혼합 후 0 초과 ~ 2시간 동안 반응을 유도한 뒤 최종 세포배양용 코팅조성물로 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (3) 단계로서, 세포배양 코팅조성물을 섬유웹 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 수행한다.
준비된 세포배양 코팅조성물을 섬유웹 표면에 처리하는 방법은 통상적인 코팅방법에 의할 수 있고, 일예로 파이펫 에이드를 이용한 분주나, 함침에 의할 수 있다. 세포배양 코팅조성물을 표면에 처리한 뒤 25 ~ 32℃ 항온배양기에서 30분 ~ 2시간 동안 반응을 유도해 세포배양 코팅층을 형성시킬 수 있다.
이후 세척공정을 더 거칠 수 있고, 일예로 3차 증류수를 통해 3 ~ 6분씩 총 2 ~ 5회 세척공정을 반복수행할 수 있다. 세척공정을 거친 후에는 공기 중에서 자연건조시킬 수 있으며, 이를 통해 세포배양기재를 제조할 수 있다.
한편, 최종 제조된 세포배양기재에서 세포배양 코팅층은 건조공정을 거침에 따라서 수분율이 5% 미만일 수 있는데, 이러한 특징은 본 발명에 따른 융합단백질을 사용함에 따라서 발현되는 효과이다. 즉, 세포배양에 도움을 주는 상용화된 물질들은 섬유웹에 처리한 뒤 장기간 저장되지 못함에 따라서 통상적으로 섬유웹에 처리된 후 수일 내 사용할 수밖에 없고, 이로 인해 코팅 후 건조공정을 거치지 않는 것이 일반적이다. 이에 반해 본 발명에 따른 세포배양기재는 수년 간 상온에서 장기보관이 가능하고, 결과적으로 세포배양 코팅층 내 잔존하는 용매나, 세척공정에 따른 세척수는 모두 증발함에 따라서 매우 적은 수분율을 발현할 수 있다.
하기 표 1은 상술한 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 아미노산 서열
1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
4 Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys
5 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe
6 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
7 Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His
8 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser
9 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
10 Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser
11 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
12 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg Ser Gly Tyr
13 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Ly
15 Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
16 Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala
17 Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro
18 Arg Gly Asp
19 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser Pro
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예1>
멸균처리된 평균직경이 260㎚인 PVDF 섬유로 형성되며, 평량이 4.5g/㎡, 두께가 5㎛인 섬유웹을 준비했다. 이후 하기의 준비예에서 제조된 세포배양 코팅조성물을 파이펫 에이드를 이용해 섬유웹 표면에 분주한 뒤 30℃ 항온 배양기에서 한 시간 반응하여 섬유웹 표면에 세포배양 코팅층을 형성시켰다. 이후 3차 증류수를 이용하여 5분씩 3회 세척한 뒤, 클린벤치 내에서 플레이트 뚜껑을 열어둔 채로 공기 중에서 건조시켜 세포배양기재를 제조하였다.
* 준비예 - 세포배양 코팅조성물 제조
세포배양용 융합단백질은 서열번호 13인 홍합 접착단백질의 카르복시 말단에 서열번호 19의 기능성 펩타이드를 아미노 말단에 결합시킨 것을 준비하였다. 이때, 융합단백질은 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법으로 제조하였다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 Sulfo-NHS 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 Sulfo-NHS을 제조했다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 Sulfo-NHS 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 Sulfo-NHS을 제조했다.
세포배양 코팅조성물을 제조하기 위해서 코니칼 튜브에 EDC 용액을 투입한 뒤, Sulfo-NHS 용액을 넣고 교반하면서 준비된 활성용액에 세포배양용 융합단백질을 투입한 뒤 교반시켜 세포배양 코팅조성물을 제조하였다. 이때, 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 EDC가 1 중량부 포함되도록 하고, EDC와 Sulfo-NHS는 1:2 중량비가 되도록 혼합하였으며, 코팅조성물에 포함된 NaOAc는 EDC 100 중량부에 대해서 100 중량부가 되도록 포함시켰다. 이때, 세포배양 코팅조성물에서 세포배양용 융합단백질의 농도는 0.05㎎/㎖이었다.
<실시예2>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 섬유웹을 평균직경이 500㎚인 PVDF 섬유로 형성되며, 평량이 5.8g/㎡, 두께가 3㎛인 섬유웹을 사용하여 세포배양기재를 제조하였다.
<비교예1>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양 코팅조성물로 코팅시키지 않은 섬유웹을 세포배양기재로 사용하였다.
<비교예2>
실시예2와 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양 코팅조성물로 코팅시키지 않은 섬유웹을 세포배양기재로 사용하였다.
<실험예 1>
실시예1 ~ 2 및 비교예1 ~ 2에 따른 세포배양기재의 표면에 대한 SEM 사진을 촬영하여 이를 도 1 ~ 3에 나타내었다.
촬영결과 실시예1 ~ 2에는 세포배양코팅층이 표면에 위치하는 섬유들 중 일부 섬유들 사이를 연결하는 코팅막을 포함하는 것을 관찰할 수 있다.
<비교예 3 ~ 4>
비교예1에 따른 세포배양기재에 세포배양용 코팅조성물로 시판 중인 Matrigel, Vitronectin-XFTM을 해당 코팅조성물 제조사의 프로토콜에 의거하여 코팅시켜서 세포배양기재를 제조하였다.
<실험예 2>
실시예1, 비교예 3 및 4에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)조건에서 배양 후 DAPI, NANOG, SOX2, Merge 마커의 발현여부를 관찰으며, 그 결과를 도 5(실시예1), 도 6(비교예3), 도 7(비교예4)에 나타내었다.
도 5 내지 도 7을 통해 확인할 수 있듯이 실시예1에 따른 세포배양기재는 시판 중인 Matrigel, Vitronectin-XFTM에 대비하여 세포배양성능이 유사하고, NANOG, SOX2 등의 미분화 마커가 잘 발현된 것을 알 수 있다.
<실험예 3>
실시예1 및 비교예3에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)조건에서 배양 후 배양된 세포의 계대1(P1)과 계대13(P13)의 모폴로지를 세포염색법으로 세포배양여부를 확인하여 도 8에 나타내었다. 또한, 시간별 증식률을 흡광도 분석을 통해 확인했고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 계대3(P3) 및 계대9(P9)에 대한 OCT4 마커의 발현을 면역세포화학법(Immunocytochemistry)확인하여 평가한 사진을 각각 도 10에 나타내었다. 또한, 유도만능줄기세포를 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)조건에서 5일간 배양 후 Oct4 마커에 대한 발현정도를 평가해 그 결과를 도11(실시예1) 및 도 12(비교예3)에 나타내었다.
도 8을 확인할 수 있듯이, 실시예1에 따른 세포배양기재는 시판 중인 세포배양 코팅조성물을 사용한 세포배양기재인 비교예3과 대비해 계대1과 계대13에서 알 수 있듯이 장기 배양 했을 때에도 모폴로지에 있어 차이가 없는 것을 알 수 있다.
또한, 도 9를 통해 확인할 수 있듯이, 실시예1에 대한 더블링타임이 29.2시간, 비교예3에 대한 더블링타임이 29.0시간으로 세포배양효율에 있어서도 유사한 성능을 발현하는 것을 알 수 있다.
또한, 도 10을 통해 확인할 수 있듯이, 실시예1에 따른 세포배양기재는 시판 중인 세포배양 코팅조성물을 사용한 세포배양기재인 비교예3과 대비해 장기 배양했을 때에도 계대3과 계대9에서 Oct4 발현이 잘되었고, 세포배양 성능이 유사함을 알 수 있다.
또한, 도 11 및 도 12에서 알 수 있듯이, 오히려 실시예1에 따른 세포배양기재를 통해서 배양된 경우 세포 특이적 마커인 Oct4의 발현이 더 우수한 것을 알 수 있다.
<비교예 5>
비교예3과 동일하게 실시하여 제조하되, 비교예2의 섬유웹으로 변경하여 세포배양기재를 제조했다.
<비교예 6>
비교예4와 동일하게 실시하여 제조하되, 비교예2의 섬유웹으로 변경하여 세포배양기재를 제조했다.
<실험예4>
실시예1, 실시예2, 비교예 3 ~ 6에 따른 세포배양기재를 아래의 방법으로 의료기기 유효기간 설정 및 안정성 평가에 따른 가이드라인에 따라 가속노화 시험을 시킨 뒤 유도만능줄기세포를 배양시켜서 세포배양기재의 저장안정성을 평가했다.
구체적으로 세포배양기재를 실시간노화를 단축된 시간 내에서 재현하기 위해 상승된 온도(60℃)에서 세포배양기재를 0개월, 1개월, 2개월, 3개월 보관하여 각각의 세포배양기재의 노화기간을 0년, 1년, 2년, 3년이 되도록 준비했다.
실시예 및 비교예 별 각각 준비된 3개의 유도만능줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)를 이용하여 5일간 배양 후 세포염색법으로 염색하여 세포배양여부를 확인하였으며, 광학현미경으로 촬영하여, 세포배양 결과 사진을 도 13(실시예1), 도 14(비교예3), 도 15(비교예4), 도 16(실시예2), 도 17(비교예5), 도 18(비교예6)에 나타내었다.
도 13 내지 도 18을 통해 확인할 수 있듯이,
실시예1 및 실시예2에 따른 세포배양기재의 경우 노화기간이 1년, 2년, 3년이 되도록 가속화 시킨 경우에도 모두 세포배양이 가능하며, 배양 성능도 우수한 것을 알 수 있다. 그러나 비교예3 ~ 비교예6에 따른 세포배양기재의 경우 모두 노화기간이 1년 ~ 3년이 되도록 가속화 시킨 시편에서 세포가 배양되지 않았으며, 이를 통해서 실시예1에 따른 세포배양기재의 저장안정성 및 세포배양성능이 매우 우수한 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
<110> amolifescience <120> Cell cultivation substrate and method for manufacturing thereof <130> 1068681 <150> KR 10-2019-0177073 <151> 2019-12-27 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys 20 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 4 Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys 35 <210> 5 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 5 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Glu Phe Glu Phe 50 <210> 6 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 6 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 7 Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His 1 5 10 15 Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His 20 25 30 Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val 35 40 45 Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His 50 55 60 <210> 8 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 8 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 9 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 9 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 10 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 10 Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr 20 25 30 Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr 35 40 45 Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys 50 55 60 His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 65 70 <210> 11 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 11 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 12 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 12 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg 35 40 45 Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys 50 55 60 Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg 85 90 95 Ser Gly Tyr <210> 13 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 13 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 130 135 140 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 165 170 175 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 180 185 190 Tyr Lys <210> 14 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 15 Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro 1 5 10 15 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 16 Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 17 Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro 1 5 10 15 <210> 18 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 18 Arg Gly Asp 1 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial protein <400> 19 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg 1 5 10 15 Gly Asp Ser Pro 20

Claims (12)

  1. 섬유들이 집적된 섬유웹; 및
    세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질로 형성되며, 상기 섬유웹의 일 표면에 위치하는 섬유들 중 적어도 일부 섬유들 사이를 연결하는 코팅막을 포함하는 세포배양 코팅층;을 구비하는 세포배양기재.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹은 폴리스티렌(PS), 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질인 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 RGD 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹의 일면에 대향하는 타면에 배치된 지지체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹은 평균직경이 200 ~ 1000㎚이며, 두께가 2 ~ 20㎛이고, 평량이 3 ~ 20g/㎡인 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  9. (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계;
    (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계; 및
    (3) 세포배양 코팅조성물을 섬유웹 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계;를 포함하는 세포배양기재 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)인 것을 특징으로 하는 세포배양기재 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제는 1: 0.1 ~ 10 중량비로 활성용액에 포함되며,
    상기 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1: 1 ~ 100 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 세포배양기재 제조방법.
  12. 피코팅 기재인 섬유웹 표면의 적어도 일부 기공을 폐색하는 코팅막을 형성하는 세포배양 코팅조성물로서, 상기 세포배양 코팅조성물은 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질, 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양 코팅조성물.
KR1020200184987A 2019-12-27 2020-12-28 세포배양기재 및 이의 제조방법 KR102486925B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190177073 2019-12-27
KR1020190177073 2019-12-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210084328A KR20210084328A (ko) 2021-07-07
KR102486925B1 true KR102486925B1 (ko) 2023-01-10

Family

ID=76574547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200184987A KR102486925B1 (ko) 2019-12-27 2020-12-28 세포배양기재 및 이의 제조방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230056844A1 (ko)
EP (1) EP4083178A4 (ko)
JP (1) JP2023508478A (ko)
KR (1) KR102486925B1 (ko)
CN (1) CN115151631A (ko)
WO (1) WO2021133143A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230109115A (ko) * 2022-01-11 2023-07-19 주식회사 아모라이프사이언스 세포배양지지체 및 이의 제조방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058842A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Andrea Liebmann-Vinson Methods of surface modification of a flexible substrate to enhance cell adhesion
KR101311325B1 (ko) * 2012-09-13 2013-09-30 이상재 합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물
KR101856575B1 (ko) * 2016-05-25 2018-06-19 주식회사 아모그린텍 세포배양 지지체용 원사 및 이를 포함하는 원단

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008150101A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Postech Academy-Industry Foundation Chimeric polypeptide including a mussel adheisve protein and extracellular matrix
US9499593B2 (en) * 2011-05-11 2016-11-22 Children's Medical Center Corporation Modified biotin-binding protein, fusion proteins thereof and applications
KR101384746B1 (ko) * 2011-08-24 2014-04-14 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질을 이용한 다양한 기능성 생체분자의 표면 고정화
KR101665941B1 (ko) 2014-09-25 2016-10-17 한국생산기술연구원 패트리접시의 표면처리방법 및 이 방법으로 제조된 패트리접시
US20160355780A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Amogreentech Co., Ltd. Defined three dimensional microenvironment for cell culture
JP6758616B2 (ja) * 2016-02-23 2020-09-23 国立大学法人 新潟大学 細胞培養方法及び培養組織
US11629321B2 (en) * 2016-05-31 2023-04-18 Amolifescience Co., Ltd. Scaffold for cell culture or tissue engineering
CN110249043B (zh) * 2016-12-07 2024-01-23 阿莫生命科学有限公司 用于控制细胞行为的三维微环境结构、用于控制细胞行为的三维表面以及用于制造阵列和三维微环境结构的方法
CN111065727B (zh) * 2017-07-13 2023-09-12 阿莫生命科学有限公司 细胞培养容器

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058842A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Andrea Liebmann-Vinson Methods of surface modification of a flexible substrate to enhance cell adhesion
KR101311325B1 (ko) * 2012-09-13 2013-09-30 이상재 합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물
JP2015528493A (ja) 2012-09-13 2015-09-28 コロディス バイオサイエンス，カンパニー リミテッドＫｏｌｌｏｄｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 合成的にデザインされた細胞外微小環境
KR101856575B1 (ko) * 2016-05-25 2018-06-19 주식회사 아모그린텍 세포배양 지지체용 원사 및 이를 포함하는 원단

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210084328A (ko) 2021-07-07
EP4083178A4 (en) 2024-04-24
CN115151631A (zh) 2022-10-04
WO2021133143A1 (ko) 2021-07-01
EP4083178A1 (en) 2022-11-02
US20230056844A1 (en) 2023-02-23
JP2023508478A (ja) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10478524B2 (en) Tissue-engineered silk organs
Tang et al. Recent development of temperature-responsive surfaces and their application for cell sheet engineering
US9211266B2 (en) Cell construct for cell transplantation and cell aggregate for cell transplantation
KR102119514B1 (ko) 세포배양용 또는 조직공학용 지지체
US11946031B2 (en) Yarn for cell culture scaffold and fabric comprising the same
KR102486926B1 (ko) 세포배양기재 및 이의 제조방법
KR102486925B1 (ko) 세포배양기재 및 이의 제조방법
WO2015190430A1 (ja) 細胞構造体及び細胞構造体の製造方法
Fu et al. Pro‐angiogenic decellularized vessel matrix gel modified by silk fibroin for rapid vascularization of tissue engineering scaffold
Mishan et al. Potential of a novel scaffold composed of human platelet lysate and fibrin for human corneal endothelial cells
Salerno et al. Advanced membrane systems for tissue engineering
KR20200056344A (ko) 대용량 배양기용 세포배양시트 집합체 및 이를 포함하는 대용량 배양기
KR102463360B1 (ko) 세포배양시트 및 이를 포함하는 대용량 세포 배양기
KR102511304B1 (ko) 세포배양 지지체용 혼섬사 제조방법, 이를 통해 구현된 세포배양 지지체용 혼섬사 및 이를 포함하는 원단
KR102308484B1 (ko) 3d 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체 및 이의 제조방법
KR102591579B1 (ko) 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단
Ryma Exploiting the Thermoresponsive Properties of Poly (2-oxazoline) s for Biofabrication
Chen et al. Emerging Strategies for Optimizing Cell‐Derived Decellularized Extracellular Matrix Scaffolds in Tissue Engineering
Zhan et al. Modulation of neo-endothelialization of vascular graft materials by silk fibroin
Hu et al. In vitro evaluation of the growth and migration of schwann cells on electrospun silk fibroin nanofibers
KR20230109115A (ko) 세포배양지지체 및 이의 제조방법
Krishnamoorthi Engineering 3D scaffolds with iPSCs towards regeneration of cardiac tissues
JP2018174929A (ja) 哺乳動物細胞の培養のための培養液添加剤
US20100310630A1 (en) Coated surface for cell culture

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant