KR20230109115A - 세포배양지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
세포배양지지체가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양지지체는 지지체, 및 상기 지지체 표면의 적어도 일부를 피복하며, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 구비한 세포배양 코팅층을 포함한다. 이에 의하면, 각종 세포의 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있고, 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 융합 폴리펩타이드가 형성한 세포배양 코팅층의 표면이 매끄러움에 따라서 세포배양 지지체 상에서 세포관찰이나 형광분석 시 발생할 수 있는 이미징 방해가 방지됨에 따라서 여러 세포 배양에 응용될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양 지지체는 특히 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식 및 분화에 우수한 효과를 발현할 수 있다.
Description
본 발명은 세포배양지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
포유류 세포의 배양은 생명 과학 및 보건 과학에서 많은 공정들 중 하나이다. 고정-의존성 세포를 수반하는 포유류 세포 배양 및 분석을 위한 세포배양지지체는 흔히 예를 들어 고분자 중합체 또는 유리로 만들어진 웰-플레이트와 같은 용기나 필름과 같은 플레이트가 많이 사용되는데, 세포가 용기나 플레이트 표면에 부착되게 하는 추가의 표면 처리가 요구된다. 이와 같은 표면 처리는 예를 들어 흡착, 그래프팅 또는 플라스마 중합 기술에 의해 표면 상에 흡착층을 형성시키거나 적절한 표면형상을 구현하는 것을 포함할 수 있다. 또는 상기 표면 처리는 용기나 플레이트 표면 그 자체에 화학적 개질을 통한 것일 수 있으며, 예를 들어 대기 코로나, 무선 주파수 진공 플라스마(radio frequency vacuum plasma), DC 글로우 방전(glow discharge), 및 마이크로파 플라스마 처리(microwave plasma treatments)등을 통해 수행될 수 있다.
한편, 신경계 세포는 크게 두 종류로 구분할 수 있는데, 뇌와 척수를 구성하는 중추신경계 세포와, 운동신경, 감각신경, 자율신경 등을 구성하는 말초신경계 세포로 나눠진다. 중추신경계(뇌와 척수)를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경전구세포(neural stem cell 또는 neural progenitor cell: NPC)를 분화시켜 만들 수 있으며, 반면에 말초신경계를 구성하는 말초신경세포(운동신경, 자율신경, 및 감각신경)과 슈반세포(Schwann cell)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경능선세포(Neural crest stem cell: NCSC)로부터 유래된다. 따라서 중추신경계 세포와 말초신경계 세포는 만능 줄기 세포로부터 서로 다른 분화경로를 따라, 각각 신경전구세포와 신경능선세포를 거쳐 만들어지게 되며, 이러한 서로 다른 경로는 주변 환경과 세포 내 신호전달 체계에 따라 좌우되는 것으로 알려져 있다.
중추 신경계 질환은 크게 뇌 질환과 척수 질환으로 나뉘는데 뇌의 기능 이상으로 발생하는 질환으로는 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등이 있다. 척수손상은 갑작스런 부상에 의해 야기되며 척수의 기능이 손상되면 운동 조절 능력 상실, 감각 상실, 방광 조절 능력 상실 등의 문제들이 발생하며 평생 동안 고통 가운데 살게 된다. 이 밖에 많은 중추신경계 질환에 의해 고통 받고 있는 사람들은 전 세계적으로 고령화가 진행되면서 급속히 증가하고 있으며 따라서 환자와 가족들의 삶의 질 저하와 사회에 큰 사회적/경제적 부담을 주기 때문에 이들을 치료하기 위한 노력들이 시급한 실정이다.
이에 최근에는 중추 신경계 질환들에 대한 가장 근본적인 치료법으로 여겨지는 세포 대체 치료법(cell replacement therapy)을 개발하기 위해, 신경줄기세포나 중추 신경계 세포들의 모세포인 신경전구세포(neural progenitor cell: NPC)를 증식하거나 이들 세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대한 연구가 활발하다.
관련된 연구 중 하나는 세포외 기질 단백질이나, 세포의 증식에 도움을 주는 다른 여러 단백질을 이용한 코팅층을 고형 지지체 표면 상에 형성시켜 세포외 기질과 같은 유사한 미세환경을 형성시켜 신경줄기세포나 신경전구세포를 배양 분화시키는 것이 일반적이다.
그러나 현재까지 상용화된 세포외 기질 단백질이나, 세포의 증식에 도움을 주는 다른 여러 단백질을 이용한 코팅층이 구비된 배양용 지지체는 섬유아세포 등의 배양에는 유익하나 신경줄기세포나 신경전구세포를 배양 분화시키기에 효과가 충분하지 못한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 세포의 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있는 세포배양지지체 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수하고, 그럼에도 불구하고 세포 배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있는 세포배양지지체 및 이의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양에 도움을 주도록 부가된 물질로 인하여 배양된 세포를 세포배양 지지체 상에서 관찰 또는 형광 분석 시 이미징 방해 등을 초래하는 것을 방지하고, 세포배양 지지체로부터 탈리되어 배양된 세포와 함께 수득되는 것을 방지할 수 있는 세포배양지지체 및 이의 제조방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
나아가 본 발명은 위와 같은 우수한 특성을 달성할 수 있도록 하는 세포 배양용 코팅조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 지지체, 및 상기 지지체 표면의 적어도 일부를 피복하며, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 구비한 세포배양 코팅층을 포함하는 세포배양지지체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 지지체는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 비다공성 지지체이거나 또는 폴리스티렌(PS), 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 다공성 지지체일 수 있다.
또한, 상기 세포배양용 펩타이드는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 부착용 펩타이드는 홍합접착단백질 유래일 수 있다.
또한, 상기 부착용 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 것일 수 있다.
또한, 상기 세포배양용 펩타이드는 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 것일 수 있다.
또한, 상기 융합 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 28 또는 서열번호 29인 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 융합 폴리펩타이드는 알갱이를 형성하지 않을 수 있다.
또한, 신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양용도일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 융합 폴리펩타이드를 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 지지체 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하는 세포배양지지체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있다.
또한, 상기 카보디이미드 커플링제와 반응제는 1: 0.1 ~ 10 중량비로 활성용액에 포함되며, 상기 세포배양 코팅조성물은 융합 폴리펩타이드 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부로 혼합될 수 있다.
또한, 본 발명은 지지체 표면에 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양용 코팅조성물로서, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양용 코팅조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대하여 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 "펩타이드"란 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 일 예로 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.
본 발명의 "융합 폴리펩타이드"는 이의 유도체를 포함하는 의미로 상기 펩타이드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L-또는 D-아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다.
본 발명에 의한 세포배양 지지체는 각종 세포의 증식, 분화 등 배양에 도움을 주는 융합 폴리펩타이드로 형성된 세포배양 코팅층을 구비함에 따라서 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있다. 또한, 세포의 증식, 분화 등 배양에 도움을 주는 물질이 쉽게 변성되며 저장안정성이 불안정한 폴리펩타이드 임에도 불구하고 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 폴리펩타이드의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 이러한 융합 폴리펩타이드가 형성한 세포배양 코팅층의 표면이 매끄러움에 따라서 세포배양 지지체 상에서 세포관찰이나 형광분석 시 발생할 수 있는 이미징 방해의 우려가 방지될 수 있다. 더불어 융합 폴리펩타이드가 세포배양 코팅층으로부터 탈리되어 배양된 세포에 혼입되고 이로 인한 배양된 세포를 이용한 각종 실험, 생체이식 시 발생될 수 있는 부작용을 방지됨에 따라서 여러 세포 배양에 응용될 수 있으며, 특히 본 발명의 일 실시예에 의하면, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식이나 분화에 도움을 주는 세포배양용 펩타이드가 부착용 펩타이드에 결합된 융합 폴리펩타이드가 본 발명에 따른 제조방법으로 형성한 세포배양 코팅층은 종래의 세포배양용 코팅층에 대비해 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식 촉진 및 분화성 향상에 상승작용이 있음에 따라서 신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양 용도에 적합할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 각각 실시예 1 및 비교예 1에 따른 세포배양지지체 표면의 광학현미경 사진,
도 2a 내지 도 2c는 각각 실시예 2 및 비교예 2 내지 3에 따른 세포배양지지체에 전분화줄기세포를 배양 후 신경 로제트(Neural rosette)를 생성한 결과에 대한 광학현미경 사진, 그리고
도 3은 실시예 2에 따른 세포배양 지지체를 통해서 신경전구세포를 선별한 결과에 대한 광학현미경 사진이다.
도 2a 내지 도 2c는 각각 실시예 2 및 비교예 2 내지 3에 따른 세포배양지지체에 전분화줄기세포를 배양 후 신경 로제트(Neural rosette)를 생성한 결과에 대한 광학현미경 사진, 그리고
도 3은 실시예 2에 따른 세포배양 지지체를 통해서 신경전구세포를 선별한 결과에 대한 광학현미경 사진이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양지지체는 지지체 및 상기 지지체 표면의 적어도 일부를 피복하는 세포배양 코팅층을 구비하며, 상기 세포배양 코팅층은 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 구비한다.
상기 지지체는 배양되는 세포를 물리적으로 지지하기 위한 부재로서, 세포배양 시 통상적으로 사용되는 지지체의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 지지체는 전부가 비다공성의 지지체거나, 일부가 또는 전 영역이 다공성인 지지체일 수 있다. 일예로서 상기 지지체는 통상적으로 웰플레이트라고 불리는 용기 형태이거나 또는 필름과 같은 판상인 플레이트와 같은 비다공성 부재일 수 있다. 또한, 부직포 또는 섬유웹으로 통칭되는 섬유들이 3차원 네트워크 구조를 형성한 것이거나 고분자매트릭스에 다수의 기공이 형성된 다공성 부재일 수 있다. 또한, 이들 비다공성 부재나 다공성 부재가 적층되거나 단층을 이루되 일부가 비다공성 부재로 형성되고 나머지 영역이 다공성 부재로 형성된 것일 수도 있다.
또한, 상기 지지체는 통상적인 세포배양 시 사용되는 지지체의 재질의 경우 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 예로 비다공성 지지체는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 것일 수 있다. 또한, 일 예로 다공성 지지체는 폴리스티렌(PS), 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 것일 수 있다.
또한, 상기 지지체에서 세포배양 코팅층이 형성될 표면은 플라즈마 처리와 같은 젖음성을 개선하기 위한 공지된 표면개질 처리가 된 것일 수 있다. 다만, 상기 지지체의 표면은 세포배양 코팅층을 이루는 융합 폴리펩타이드와 펩타이드 결합을 유도하기 위한 작용기를 구비하는 개질은 하지 않을 수 있고, 이에 따라서 지지체 표면과 세포배양층 간에는 세포배양 코팅조성물에 카보디이미드계 커플링제 및 N-하이드록시석신이미드를 함유하는 반응제를 포함하는 활성용액 혼합되어 있음에도 지지체 표면과 융합 폴리펩타이드 간에 펩타이드 결합이 형성되지 않을 수 있다.
다음으로 상술한 지지체의 표면 상에 구비되는 세포배양 코팅층에 대해 설명한다.
상기 세포배양 코팅층은 배양될 세포가 파종된 뒤 안착 및 증식하는 세포부착 표면을 제공하는 층으로서 융합 폴리펩타이드를 통해 형성된다.
상기 융합 폴리펩타이드는 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함한다. 상기 세포배양용 펩타이드는 세포, 특히 신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양에 도움을 줄 수 있는 기능을 갖는 물질로서, 구체적으로는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 수행하는 물질일 수 있다. 상기 세포배양용 펩타이드는 이러한 기능을 수행하는 공지된 펩타이드의 경우 제한없이 사용될 수 있다. 이에 대한 비제한적인 예로서, 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor , KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin , GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포외 기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 세포배양용 펩타이드는 비트로넥틴 폴리펩타이드, 콜라겐 폴리펩타이드, 라미닌 폴리펩타이드, 피브로넥틱 폴리펩타이드 또는, 이들의 변이체일 수 있다.
바람직하게는 상기 세포배양용 펩타이드는 아미노산 서열 내 RGD 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기능성 펩타이드는 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결되거나 선택된 1종의 아미노산 서열이 2회 이상 반복된 펩타이드일 수 있으며, 이를 통해 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식을 촉진하고, 전분화줄기세포에서 신경 로제트를 생성하는 분화효율 증진에 상승작용을 발현할 수 있음에 따라서 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식 및 분화에 더욱 적합한 세포배양 코팅층 구현이 가능할 수 있다. 한편, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식 및 분화에 적합한 효과는 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 해당 펩타이드가 부착용 펩타이드와 결합되어 형성한 융합 펩타이드만의 효과로 보기는 어려우며, 상기 융합 펩타이드가 후술하는 제조방법을 통해서 지지체 상에 세포배양 코팅층을 형성함에 따라 발생하는 상승효과로 볼 것이다.
한편, 상기 세포배양용 펩타이드는 일예로 아미노산 개수가 3 ~ 100개, 보다 바람직하게는 3 ~ 50개, 일예로 3 ~ 30개인 펩타이드 일 수 있으며, 이를 통해 장시간 상온에서 코팅층에 함유된 상태로 보관되는 경우에도 분해, 변성 등이 최소화 또는 방지되기에 보다 유리할 수 있다.
또한, 상기 세포배양용 펩타이드는 부착용 펩타이드에 결합될 수 있으며, 구체적으로 부착용 펩타이드의 카르복시 말단, 아미노 말단 또는 카르복시 말단과 아미노 말단 양단에 결합될 수 있다. 이때 상기 결합은 공유결합이며, 구체적으로 아미노결합일 수 있다. 일 예로 서열번호 28인 융합 폴리펩타이드는 서열번호 15인 부착용 펩타이드 양쪽으로 각각 서열번호 24 및 서열번호 25인 세포배양용 펩타이드가 결합된 것이다. 또한, 일 예로 서열번호 29인 융합 폴리펩타이드는 서열번호 13인 부착용 펩타이드 N-말단에 히스티딘 태그가 구비되며, C-말단에 서열번호 16인 세포배양용 펩타이드가 결합된 것이다. 이러한 서열번호 28 및 서열번호 29인 융합 폴리펩타이드는 다른 융합 폴리펩타이드에 대비해 신경줄기세포 및 신경전구세포의 배양, 증식 및 분화에 우수한 효과를 가질 수 있다.
또한, 세포배양용 펩타이드와 부착용 펩타이드는 공지된 방법을 통해 결합시킬 수 있고, 일예로 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법을 통해 제조할 수 있다. 또한, 부착용 펩타이드와 세포배양용 펩타이드 간에 직접 공유결합으로 결합될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 링커를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 링커는 펩타이드 링커로써 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 또는 가교제와 같은 소정의 물질을 매개하여 부착용 펩타이드와 세포배양용 펩타이드 간을 간접적으로 연결시킬 수 있음을 밝혀둔다.
상술한 것과 같이 세포배양용 펩타이드를 부착용 펩타이드에 결합시키는 이유는 부착용 펩타이드가 세포배양용 펩타이드를 지지체 표면에 부착특성이 좋게 고정시키기에 유리하며, 폴리머 기반의 접착성분에 대비해 배양세포에 가할 수 있는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하기 때문이다. 또한, 파종된 세포와의 부착특성이 좋아서 파종된 세포가 세포부착 표면에 안착된 후 탈리를 최소화할 수 있는 이점이 있다.
상기 부착용 펩타이드는 홍합 접착단백질 유래의 펩타이드일 수 있으며, 홍합 접착단백질로 통칭되는 공지의 접착단백질 또는 이의 변이체의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 부착용 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결되거나, 또는 상기 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열이 2회 이상 반복된 것일 수 있다.
한편, 상술한 융합 폴리펩타이드로 형성시킨 세포배양 코팅층은 홍합 접착단백질 유래의 부착용 펩타이드 및 후술하는 세포배양 코팅층 형성방법에 기인해 상기 세포배양용 융합 폴리펩타이드가 형성된 알갱이들이 집합된 형태를 가질 수 있다. 또는 지지체가 다공성 부재의 경우 다공성 부재 표면에 노출된 섬유 사이의 공간을 막으로 연결한 형태로 구현될 수도 한다. 이러한 형태를 가지는 세포배양 코팅층의 경우 세포배양 효율에 있어서 매우 우수한 동시에 상온에서도 수 년 이상 보관하는 경우에도 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양용 융합 폴리펩타이드가 분해, 변성됨에 따라서 야기되는 세포배양용 펩타이드의 활성 감소가 방지 또는 최소화됨에 따라서 저장안정성이 매우 향상되는 이점이 있다.
그러나 융합 폴리펩타이드가 알갱이나 막형태로 코팅되어 형성한 세포배양 코팅층의 표면은 세포배양 지지체 상에서 배양된 세포를 관찰 시 또는 형광염색을 통한 분석 시 관찰 및 분석을 방해할 우려가 있다. 또한, 융합 폴리펩타이드가 형성한 알갱이나 막 형태의 코팅부분이 세포배양 코팅층에서 탈리되어 배양된 세포를 세포배양 지지체에서 분리시킬 때 불순물로서 함께 배양된 세포에 포함될 우려가 있다. 이에 본 발명에 따른 일 실시예에 의하면 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 활성용액의 조성에 기인한 반응속도 차이를 조절해 융합 펩타이드가 알갱이나 다공성 부재 표면에 막을 형성하는 정도를 제어하거나 형성되지 않고, 매끄러운 표면을 갖는 세포배양 코팅층이 형성되도록 할 수 있다. 이에 대한 일 예로써 활성용액의 조성을 통한 융합 폴리펩타이드와의 반응속도를 제어하기 위하여 후술하는 것과 같이 활성용액에 구비되는 반응제를 N-하이드록시석신이미드를 함유하도록 하고, 바람직하게는 반응제에 N-하이드록시설포석신이미드를 포함하지 않도록 함으로써 구현되는 세포배양 코팅층이 알갱이들이 집합된 형태, 또는 다공성의 지지체인 경우 섬유 표면의 기공을 막는 코팅막 형태가 아닌 지지체의 표면을 매끄럽게 피복하도록 코팅할 수 있다. 또는, 다른 일 예로서 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 통한 활성용액과의 반응속도를 제어를 통해서 매끄러운 표면을 갖는 세포배양 코팅층을 구현할 수 있다. 이에 대한 구체적인 예로써, 부착용 펩타이드를 서열번호 2 또는 서열번호 15인 것을 사용해서 구현한 융합 펩타이드(Ex. 서열번호 28)의 경우 활성용액의 반응제로써 N-하이드록시설포석신이미드를 사용하는 경우에도 융합펩타이드가 알갱이를 형성하지 않고 매끄러운 표면을 갖는 세포배양 코팅층을 구현할 수 있다.
또한, 상기 융합 폴리펩타이드는 배양 후 지지체로부터 분리해 수득한 세포에 융합 폴리펩타이드 함유여부를 확인하거나 융합 폴리펩타이드를 수득된 세포로부터 분리시키기 위해서 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그를 더 포함할 수 있다. 상기 히스티딘 태그는 3 ~ 10개의 히스티딘이 연결된 아미노산 서열을 가지며, 일 예로 6개의 히스티딘이 연결된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포배양 코팅층은 알갱이가 형성되지 않고 매끄러운 표면을 가지며, 이러한 표면형상을 갖도록 세포배양 코팅조성물에는 상술한 것과 같이 반응제로써 N-하이드록시석신이미드를 함유함에 따라서 최종 구현된 세포배양 코팅층에서 N-하이드록시석신이미드가 검출될 수 있다. N-하이드록시석신이미드는 세포배양 코팅층의 제조 후 다수의 세척과정을 통해 세척되나, 극미량이 세포배양 코팅층에 잔존할 수 있으며, 이에 따라서 최종 구현된 세포배양 코팅층에서 검출될 수 있다. 상기 N-하이드록시석신이미드의 검출은 N-하이드록시석신이미드를 검출할 수 있는 공지의 방법과 조건을 통해서 수행할 수 있고, 일 예로 1H-NMR, 13C-NMR, 15N-NMR, 질량스펙트럼(MS spectrum), 라만스펙트럼, FTIR 등을 통해 공지된 N-하이드록시석신이미드의 측정값과, 세포배양 코팅층에서의 측정값의 대비를 통해서 N-하이드록시석신이미드 유무에 대한 검출이 가능하다. 구체적으로 세포배양 코팅층은 아래와 같은 검출방법에 따를 때 해당 위치에서 피크값을 가질 경우 N-하이드록시석신이미드가 존재한다고 판별할 수 있다. 일 예로 일 예로 1H고체-상태 NMR 스펙트럼에서 TMS 대비 2.7ppm ± 0.05ppm 및/또는 2.56ppm ± 0.05ppm 에서 피크를 가질 수 있고, 13C고체-상태 NMR 스펙트럼에서 TMS 대비 25.5ppm ± 0.05ppm 에서 피크를 가질 수 있고/거나 15N 고체 - 상태 NMR 스펙트럼에서 TMS 대비 -167ppm ± 0.05ppm 에서 피크를 가질 수 있다. 또한, 질량스펙트럼(MS spectrum)에서 28 m/z, 55 m/z, 115 m/z에서 피크를 가질 수 있다. 또한, 라만스펙트럼에서 725㎝-1± 5.0㎝-1에서 피크값을 가질 수 있다.
상술한 세포배양 코팅층이 지지체 표면에 구비된 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양지지체는 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 N-하이드록시석신이미드를 함유하는 반응제를 포함하는 활성용액과, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 융합 폴리펩타이드를 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계, 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 지지체 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 (1) 단계로서 카보디이미드계 커플링제 및 N-하이드록시석신이미드를 함유하는 반응제를 포함하는 활성용액과 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 각각 준비하는 단계를 수행한다.
상기 활성용액은 카보디이미드계 커플링제와 N-하이드록시석신이미드를 함유하는 반응제를 포함하며, 용매를 더 포함할 수 있다. 활성용액은 융합 폴리펩타이드를 지지체 표면에 도입시키는 물질로서, 단순히 융합 폴리펩타이드를 통상의 방법으로 지지체 표면에 처리한 경우에 대비해 세포배양 코팅층과 지지체 표면 간의 부착력을 향상시키며, 융합 폴리펩타이드가 지지체에 도입된 상태에서 외부 균의 감염의 우려가 적고 온도의 변화에도 안정적으로 장기간 보관이 가능하며 세포배양 시 배양된 세포의 크기, 분화수준 등의 편차가 적게 배양되도록 하는 이점이 있다. 한편, 활성용액 융합 폴리펩타이드를 지지체 표면에 도입시키는 역할을 하나 이때 도입은 상술한 것과 같이 융합 폴리펩타이드와 지지체 표면에 구비된 카르복시기 및/또는 아민기와의 펩타이드 결합을 유도하여 도입시키는 것을 의미하지는 않는다.
상기 카보디이미드계 커플링제는 융합 폴리펩타이드들이 서로 결합되도록 하는 커플링제의 경우 제한 없이 사용될 수 있으며, 일 예로 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)일 수 있다.
또한, 상기 반응제는 카보디이미드계 커플링제와 커플링된 상태의 융합단백질이 수화되는 것을 방지하여 융합 폴리펩타이드들이 서로 결합되는 효율을 증가시키기 위해 구비되는 것으로서, N-하이드록시석신이미드를 포함한다. 다만, 반응제는 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열로 인하여 활성용액과의 반응속도에 미치는 영향을 적게 하기 위하여 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)를 포함하지 않을 수 있고, N-하이드록시설포석신이미드를 반응제에 포함시킴에 따라서 발생하는 세포배양 코팅층 형성양태, 즉 알갱이 형성 또는 다공성 부재인 지지체 표면에 코팅막을 형성하는 것을 방지해 지지체 표면에 매끄러운 표면을 갖는 세포배양 코팅층을 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 고려하지 않고 형성시키기에 보다 유리할 수 있다.
상기 활성용액은 상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제를 1 :0.1 ~ 10 중량비로 포함할 수 있다. 만일 이들이 적절한 비율로 포함되지 못할 경우 본 발명이 목적하는 효과를 달성하기 어렵고, 구현된 세포배양코팅층에서 세포의 부착성이 현저히 저하될 우려가 있다.
또한, 상기 활성용액은 반응성 향상을 위하여 아세트산나트륨을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 아세트산 나트륨은 카보디이미드계 커플링제 100 중량부에 대해서 1 ~ 100 중량부로 포함될 수 있다.
또한, 상기 활성용액은 용매를 더 포함할 수 있는데, 상기 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 일예로 물일 수 있다.
상기 활성용액은 제조하는 방법이 특별히 한정되는 것은 아니나, 일예로 아세트산 나트륨 용액을 카보디이미드계 커플링제 용액과 반응제 용액에 각각 투입하여 혼합하여 2 종의 용액을 제조한 뒤, 2종의 용액을 적절한 비율로 혼합한 뒤 30 ~ 60분간 반응을 유도하고, 이후 28 ~ 35℃ 항온 배양기에서 다시 25 ~ 40분간 반응시켜 최종 활성용액이 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (2) 단계로서, 준비된 활성용액과 융합 폴리펩타이드를 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계를 수행한다.
이때, 상기 융합 폴리펩타이드와 활성용액은, 세포배양용 융합 폴리펩타이드 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부 포함되도록 함량을 조절하여 혼합될 수 있다. 만일 카보디이미드계 커플링제가 1 중량부 미만일 경우 세포의 부착이 되지 않거나 분화가 될 수 있고, 100 중량부를 초과할 경우 세포가 부착 후 탈리될 수 있어서 세포를 안정적으로 배양하기 어려울 수 있다.
또한, 준비된 활성용액과 융합 폴리펩타이드는 혼합 후 0 초과 ~ 2시간 동안 반응을 유도한 뒤 최종 세포배양용 코팅조성물로 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (3) 단계로서, 세포배양 코팅조성물을 지지체 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 수행한다.
준비된 세포배양 코팅조성물을 지지체 표면에 처리하는 방법은 통상적인 코팅방법에 의할 수 있고, 일예로 웰플레이트와 같은 지지체일 경우 파이펫 에이드를 이용해 분주할 수 있다. 세포배양 코팅조성물을 표면에 처리한 뒤 4 ~ 60℃ 항온배양기에서 0분 초과 ~ 2시간 동안 반응을 유도해 세포배양 코팅층을 형성시킬 수 있다.
이후 세척공정을 더 거칠 수 있고, 일예로 3차 증류수를 통해 0초과 ~ 30분씩 총 2 ~ 5회 세척공정을 반복수행할 수 있다. 세척공정을 거친 후에는 공기 중에서 자연건조시킬 수 있으며, 이를 통해 세포배양지지체를 제조할 수 있다.
하기 표 1은 상술한 부착용 펩타이드와 세포배양용 펩타이드에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
| 서열번호 | 아미노산 서열 |
| 1 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 2 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 3 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 4 | Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys |
| 5 | Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe |
| 6 | Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr |
| 7 | Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His |
| 8 | Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser |
| 9 | Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser |
| 10 | Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser |
| 11 | Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser |
| 12 | Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg Ser Gly Tyr |
| 13 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 14 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 15 | Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys |
| 16 | Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro |
| 17 | Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala |
| 18 | Ser Glu Thr Gln Arg Gly Asp Val Phe Val Pro Met |
| 19 | Pro Met Gln Lys Met Arg Gly Asp Val Phe Ser Pro |
| 20 | Glu Ala Pro Arg Gly Asp Val Tyr Gln Gly |
| 21 | Ser Glu Cys Thr Gln Arg Gly Asp Val Phe Cys Val Pro Met |
| 22 | Pro Met Gln Cys Lys Met Arg Gly Asp Val Phe Cys Ser Pro |
| 23 | Glu Cys Ala Pro Arg Gly Asp Val Tyr Cys Gln Gly |
| 24 | Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro |
| 25 | Gly Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro |
| 26 | Gly Arg Gly Asp Ser Pro |
| 27 | Lys Ser Ser Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser Pro |
| 28 | Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro |
| 29 | His His His His His His Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro |
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예1>
기재로 멸균된 폴리스티렌 재질의 6웰 플레이트를 준비했다. 이때, 6웰 플레이트는 플라즈마 처리가 되지 않은 것을 준비했다. 이후 하기의 준비예에서 제조된 세포배양 코팅조성물을 각 웰당 2㎖씩 파이펫 에이드를 이용해 분주한 뒤 항온 배양기에서 반응하여 기재 표면에 세포배양 코팅층을 형성시켰다. 이후 3차 증류수를 이용하여 10분씩 3회 세척한 뒤, 클린벤치 내에서 플레이트 뚜껑을 열어둔 채로 공기 중에서 건조시켜 도 1a와 같은 매끄러운 표면을 가지는 세포배양 코팅층이 형성된 세포 배양 지지체를 제조하였다.
* 준비예 - 세포배양 코팅조성물 제조
융합 폴리펩타이드는 서열번호 29인 아미노산 서열을 갖는 것을 준비하였다. 이때, 융합 폴리펩타이드는 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법으로 제조하였다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 반응제로써 N-하이드록시석신이미드 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 N-하이드록시석신이미드(이하, 'NHS'라고 함) 용액을 제조했다.
세포배양 코팅조성물을 제조하기 위해서 코니칼 튜브에 EDC 용액을 투입한 뒤, NHS 용액을 넣고 교반하면서 준비된 활성용액에 세포배양용 융합 폴리펩타이드를 0.1mg 투입한 뒤 교반시켜 세포배양 코팅조성물을 제조하였다. 이때, 세포배양 코팅조성물은 융합 폴리펩타이드 100 중량부에 대해서 EDC가 1 중량부 포함되도록 하고, EDC와 NHS는 1:2 중량비가 되도록 혼합하였으며, 코팅조성물에 포함된 NaOAc는 EDC 100 중량부에 대해서 100 중량부가 되도록 포함시켰다. 이때, 세포배양 코팅조성물에서 세포배양용 융합단백질의 농도는 0.05㎎/㎖이었다.
<비교예 1>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양 코팅조성물에서 활성용액 내 반응제의 종류를 N-하이드록시석신이미드 대신에 N-하이드록시설포석신이미드로 변경해 도 1b와 같은 세포배양용 융합 폴리펩타이드가 알갱이를 형성해 알갱이들이 집합되어 형성된 세포배양 코팅층을 구비한 세포배양 지지체를 제조했다.
<실험예 1>
실시예1 및 비교예1에 따른 세포배양 지지체에 배아줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 mTeSR 배양액을 이용하여 7일간 배양 후 배양된 결과를 광학현미경으로 촬영하였다. 이후 촬영된 사진을 통해 배양된 세포의 모양 관찰 평가항목에 대해서 관련 기술분야 연구원 10인이 동일하게 평가했고, 평가 시 세포 관찰의 용이성 여부에 대해 연구원 10인의 의견을 수렴하였다.
의견 수렴 결과 세포 관찰 용이성과 관련하여 연구원 10인 중 8명은 비교예 1에 따른 세포배양 지지체에 대비해 실시예 1에 따른 세포배양 지지체가 배양된 세포를 관찰하는데 더 용이했다고 평가했으며, 2명은 유사하다고 평가했다.
이러한 평과 결과를 통해서 배양된 세포를 관찰하는데 있어서 세포배양 코팅층 표면의 조도가 영향을 미칠 수 있고, 비교예 1에 대비해 실시예 1에 따른 세포배양 지지체가 세포 관찰에 더 유리함을 알 수 있다.
<실시예 2>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 융합 폴리펩타이드를 서열번호 28인 것으로 변경하여 세포배양 지지체를 제조했다.
<비교예 2>
실시예 2와 동일하게 실시하여 제조하되, 서열번호 28인 융합 폴리펩타이드 대신에 서열번호 28인 융합 폴리펩타이드에 포함된 세포배양용 펩타이드에 해당하는 서열번호 25인 세포배양용 펩타이드를 사용해 세포배양 지지체를 제조했다.
<비교예 3>
기재로 멸균된 폴리스티렌 재질의 6웰 플레이트에 세포배양용 코팅조성물로 시판 중인 Matrigel을 해당 코팅조성물 제조사의 프로토콜에 의거하여 코팅시켜서 세포배양 지지체를 제조하였다.
<실험예 2>
실시예2 및 비교예2 ~ 3에 따른 세포배양 지지체에 대해서 아래의 물성을 평가하였다.
1. 전분화줄기세포의 분화효율 평가
인간배아줄기세포를 low attachment plate에 파종한 뒤, EB 배양액(DMEM/F12, kSR,NEAA, b-ME, SB431542, Dorsomorphin, 0.5% penicillin-streptomycin)에서 7일간 배양하여 EB (Embryoid body)를 수득하였다. 수득한 EB를 세포배양 지지체에 파종하여 N2 배양액(DMEM/F12, N2, insulin, bFGF) 에서 2~3일 주기로 배양액을 교환해 5일 주기로 계대 후 분화결과를 광학현미경을 통해 관찰했고, 그 결과를 각각 도 2a(실시예2), 도 2b(비교예2), 도 2c(비교예3)에 나타내었다.
도 2a에서 확인 할 수 있듯이 실시예 2에 따른 세포배양 지지체는 서열번호 28인 융합 폴리펩타이드로 형성된 세포배양 코팅층을 포함함에 따라서 신경 로제트(neural rosette) 형성성이 우수했으며, 상용품인 세포배양 코팅물질로 코팅된 세포배양 코팅층을 구비한 비교예3(도 2c)에 대비해 신경 로제트 형성이 크게 우수한 것을 알 수 있다.
한편, 도 2b인 비교예 2의 세포배양 지지체는 실시예2에서 사용된 융합 폴리펩타이드에 구비된 동일한 세포배양용 펩타이드를 사용했음에도 불구하고 부착용 펩파이드가 융합되지 못함에 따라서 실시예 2에 대비해서는 신경 로제트 형성이 적은 것을 알 수 있다.
2. 신경전구세포 선별
실시예 2에 따른 세포배양지지체에 신경 로제트를 파종한 뒤 N2 배양액(DMEM/F12, N2, insulin, bFGF) 에서 2~3일 주기로 배양액을 교환하며, 6~7일 주기로 계대하며, 신경전구세포를 선별하였고, 이에 대한 광학현미경 사진을 도 3에 나타내었다.
도 3을 통해 확인할 수 있듯이, 실시예 2에 따른 세포지지체를 통해서 신경 로제트에서 신경전구세포로의 전환을 확인할 수 있었다.
<비교예4>
기재로 멸균된 폴리스티렌 재질의 6웰 플레이트에 세포배양용 코팅조성물로 시판 중인 Vitronectin-XFTM를 해당 코팅조성물 제조사의 프로토콜에 의거하여 코팅시켜서 세포배양 지지체를 제조하였다.
<실험예 3>
실시예 2 및 비교예 3 ~ 4에 따른 세포배양 지지체에 대하여 아래의 방법으로 대한민국 식품의약품안전처 고시 제2014-178호(2014.10.31, 개정)에 따른 의료기기 유효기간 설정 및 안정성 평가 기준에 의거한 가이드라인에 따라 가속노화 시험을 시킨 뒤 신경줄기세포를 배양시켜서 저장안정성을 평가했다.
구체적으로 세포배양 지지체에 대한 실시간노화를 단축된 시간 내에서 재현하기 위해 상승된 온도(60℃)에서 세포배양기재를 0개월 및 3개월 보관하여 각각의 세포배양 지지체의 노화기간을 각각 0년, 및 3년이 되도록 준비했다.
실시예 및 비교예 별 각각 준비된 세포배양 지지체에 배아줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 mTeSR 배양액을 이용하여 6일간 배양 후 광학현미경으로 촬영하여 세포배양여부를 관찰했으며, 배양된 세포 수를 카운팅 한 뒤 실시예 1의 0개월 카운팅 결과를 100%로 기준해 나머지 실험결과를 상대적인 백분율로 하기 표 2에 나타내었다.
| 가속화 시편 별 배양세포수(%) | ||
| 0개월 | 3개월 | |
| 실시예2 | 100 | 104.6 |
| 비교예3 | 98.1 | 0 |
| 비교예4 | 95.5 | 12.4 |
표 2를 통해 확인할 수 있듯이,
실시예 2에 따른 세포배양 지지체의 경우 기재의 경우 노화기간이 3년이 되도록 가속화 시킨 경우에도 노화시키지 않은 경우에 대비해 세포배양 효율이 저하되지 않았음을 알 수 있다. 그러나 비교예 3 및 비교예 4의 경우 노화기간이 3년인 경우 0년에 대비해 세포배양 성능이 크게 저하되거나 발현되지 않아 저장안정성이 좋지 않음을 예상할 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
Claims (15)
- 지지체; 및
상기 지지체 표면의 적어도 일부를 피복하며, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 구비한 세포배양 코팅층;을 포함하는 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 지지체는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 비다공성 지지체 또는
폴리스티렌(PS), 폴리에스테르, 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 다공성 지지체인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 세포배양용 펩타이드는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 가지는 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 부착용 펩타이드는 홍합접착단백질 유래인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 부착용 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 것인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 세포배양용 펩타이드는 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 것인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 융합 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그를 더 포함하는 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 융합 펩타이드는 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 융합 폴리펩타이드는 알갱이를 형성하지 않고 세포배양 코팅층을 형성하는 것을 특징으로 하는 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양용도인 세포배양지지체. - 제1항에 있어서,
상기 지지체와 상기 융합 폴리펩타이드 간에는 펩타이드 결합이 형성되지 않는 것을 특징으로 하는 세포배양지지체. - (1) 카보디이미드계 커플링제 및 N-하이드록시석신이미드를 함유하는 반응제를 포함하는 활성용액과 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 준비하는 단계;
(2) 준비된 활성용액과 융합 폴리펩타이드를 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계; 및
(3) 세포배양 코팅조성물을 지지체 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계;를 포함하는 세포배양지지체 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시설포석신이미드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포배양지지체 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 카보디이미드 커플링제와 반응제는 1: 0.1 ~ 10 중량비로 활성용액에 포함되며,
상기 세포배양 코팅조성물은 융합 폴리펩타이드 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 세포배양지지체 제조방법. - 지지체 표면에 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양용 코팅조성물로서, 세포배양용 펩타이드 및 부착용 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 카보디이미드계 커플링제 및 N-하이드록시석신이미드를 함유한 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포 배양용 코팅조성물.
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