KR102463360B1 - 세포배양시트 및 이를 포함하는 대용량 세포 배양기 - Google Patents

세포배양시트 및 이를 포함하는 대용량 세포 배양기 Download PDF

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Abstract

세포배양시트가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양시트는 평균직경이 1.5㎛ 이하인 지지섬유들이 축적되어 형성된 3차원 네트워크 구조이며, 평량이 1 ~ 15g/㎡인 섬유웹 및 및 적어도 상기 섬유웹의 일 표면 상에 노출되는 지지섬유에 피복되며, 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 코팅층을 포함하여 구현된다. 이에 의하면, 높은 비표면적 및 세포에 적합한 표면 모폴로지로 인해서 세포 부착성을 향상시키며, 부착된 세포를 안정적으로 지지하고, 높은 배양효율로 세포를 집적도 높게 배양할 수 있는 동시에, 세포들이 얇은 막을 형성하는 등의 뭉침 없이 배양 및 회수할 수 있다. 또한, 통상적인 배양을 통해 배양된 세포에 대비해 크기가 작은 세포가 수득 됨에 따라서 더욱 젊고, 건강하며 형질 변화가 없는 세포를 배양, 증식시키는데 매우 유리하다. 더불어 줄기세포를 특정한 목적세포로 분화시키는 분화 및 증식에 있어서 탁월한 효과를 갖는다.

Description

세포배양시트 및 이를 포함하는 대용량 세포 배양기{Cell culture sheet for mass culture apparatus and mass culture apparatus comprising the same}
본 발명은 세포배양시트에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 세포의 대량생산에 적합한 세포배양시트 및 이를 포함하는 대용량 세포 배양기에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
질병의 치료를 위해 배양된 세포를 인체에 이식하기 위해서는 타겟하는 세포의 수가 실험실 수준을 넘어서는 양으로 배양되는 것이 요구된다. 이에 세포를 실험실 수준을 넘어서 대용량으로 배양할 수 있는 배양장치나 시스템의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
그러나 세포는 3차원으로 증식되기 어려워서 2차원 증식을 통해 세포를 수득해야 하는 어려움이 있다. 또한, 2차원 증식을 통해 많은 양의 세포를 배양하기 위해서는 세포배양시트의 면적을 증가시켜야 하나, 한정된 부피를 갖는 세포배양장치나 시스템을 고려할 때 세포배양시트의 면적을 계속 늘리는 것에도 한계가 있다.
또한, 배양되는 세포의 종류에 따라서 배양방법이 달라질 수 있고, 어떤 세포의 경우 이산화탄소의 농도가 적절히 유지되도록 배지를 순환시켜 배양되는데, 배지의 순환과정에서 발생하는 유체 흐름은 세포배양시트에 접종(seeding)된 세포들을 탈리시킬 수 있으므로 세포배양시트와 배양되는 세포간 부착력이 약한 경우 세포배양 효율이 현저히 감소할 수 있는 문제가 있다.
한편, 세포와 세포배양시트 간 부착력을 좋게 할 경우 세포배양은 잘 이루어지나, 배양과정 뒤 배양된 세포를 회수 시, 회수가 잘 되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 세포가 시트에서 쉽게 탈리되지 않을 경우 더 높은 수준의 물리적 외력이나, 화학적 처리가 요구되는데, 이 과정에서 배양된 세포에 손상이 발생할 수 있다.
더불어 배양된 세포는 세포들이 낱개로 분리되어 회수되어야 하는데, 세포배양시트에 따라서 배양된 세포들이 콜라겐 등의 각종 물질로 결합된 얇은 막 상태를 형성하며 배양되며, 회수 시에도 얇은 막으로 회수되는데, 회수된 세포덩어리인 얇은 막을 통해서 낱개의 세포들로 분리 시키는 것은 용이하지 않으며, 얇은 막 상태의 세포덩어리는 연구용으로도 사용하기 곤란한 문제가 있다.
이에 따라서 이러한 문제점들을 해결하고, 대용량의 세포 배양 시스템이나 세포배양장치에 적합한 세포배양시트에 대한 개발이 시급한 실정이다.
공개특허공보 제10-2009-0056667호
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 세포배양시트 상에 배양되는 세포를 집적도 높게 배양할 수 있는 동시에, 세포들이 얇은 막을 형성하는 등의 뭉침 없이 배양 및 회수될 수 있는 세포배양시트를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 지지할 수 있음에 따라서 배지의 순환흐름과 같은 외력이 존재하고, 이로 인해 세포배양시트의 흔들림이 있는 배양 환경 하에서도 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있는 세포배양시트를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 대용량배양기 내에서 배양된 세포를 통상적인 배양을 통해 배양된 세포에 대비해 더욱 젊고, 건강하며, 형질 변화가 없도록 배양시킬 수 있는 세포배양시트를 제공하는데 다른 목적이 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 세포배양시트를 이용해 목적하는 세포, 특히 줄기세포를 대량으로 안정적으로 배양하고, 회수할 수 있는 대용량 세포 배양기를 제공하는데 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 평균직경이 1.5㎛ 이하인 지지섬유들이 축적되어 형성된 3차원 네트워크 구조이며, 평량이 1 ~ 15g/㎡인 섬유웹, 및 적어도 상기 섬유웹의 일 표면 상에 노출되는 지지섬유에 피복되며, 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 코팅층을 포함하는 세포배양시트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포배양시트는 면적이 100㎠ 이상일 수 있다.
또한, 상기 세포배양시트는 줄기세포 배양 용도일 수 있다. 이때, 상기 줄기세포는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC), 인간 심장 줄기세포(hCSC), 간엽 줄기세포(MSC), 쥐 배아줄기세포(mESCs) 및 골모세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 하기의 배양조건1로 배양 후 회수된 세포 수는 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 9배 이상일 수 있다.
[배양조건1]
낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 60장의 세포배양시트를 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 4일간 배양한다.
또한, 하기의 배양조건2로 배양 후 회수된 세포 수는 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 25배 이상일 수 있다.
[배양조건2]
낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 100장의 세포배양시트를 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 5일간 배양하되, 세포를 파종 한 뒤 24시간 경과 후 배지를 줄기세포를 포함하지 않은 동일한 배지로 1회 교체하여 배양한다.
또한, 상기 지지섬유는 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)를 포함할 수 있다.
또한, 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 1.0㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 3.0일 수 있다.
또한, 상기 세포배양시트는 줄기세포 배양 용도이고, 지지섬유 평균직경이 200 ~ 600㎚이며, 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 0.6㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 2.3일 수 있다.
또한, 상기 세포배양시트는 줄기세포 배양 용도이고, 상기 세포배양시트는 지지섬유 평균직경이 500 ~ 600㎚이며, 상기 섬유웹은 평량이 3 ~ 12g/㎡이고, 공기투과도가 4.5 ~ 8.0cfm 일 수 있다.
또한, 상기 섬유웹 일면에 고정된 지지필름을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 지지필름과 섬유웹 사이에 실리콘계 접착층을 더 포함할 수 있다.
또한, 배양조건1 또는 배양조건2에서 배양 후 회수된 줄기세포의 평균직경은 파종된 줄기세포의 평균직경보다 15% 이상 작은 수 있다. 일예로 상기 배양 후 회수된 줄기세포의 평균직경은 18㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 기능성 코팅층은 기능성 펩티드와 접착 단백질 간의 융합단백질을 포함할 수 있다.
*
또한, 본 발명은 하우징, 및 상기 하우징 내부에 다수 장 구비되어 일방향을 따라 소정의 간격을 두고 다단으로 배열되는 본 발명에 따른 세포배양시트를 포함하는 대용량 세포 배양기를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 대용량 세포 배양기, 상기 대용량 세포 배양기 일 측으로 세포 배양 시 필요한 배지를 공급하는 배지공급장치, 및 상기 배지를 순환시키기 위한 펌프를 구비하는 대용량 세포 배양시스템을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대하여 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 "모티프"는 세포의 부착, 이동, 분화 등에 중요한 역할을 하는 세포외 기질내 단백질, 당단백질 등에 포함되어 세포막의 표면 또는 막을 관통하도록 구비되는 수용체와 구조적/기능적으로 상호작용을 할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로써, 세포내에서 분리하거나 유전자 클로닝(Gene cloning) 기법을 이용하여 인공적으로 생산된 것을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 세포배양시트는 세포배양에 적합한 표면 모폴로지가 구현됨에 따라서 파종 세포를 우수한 효율로 증식시킬 수 있는 동시에, 증식되는 세포들이 얇은 막을 형성하는 등의 뭉침 발생이 방지됨에 따라서 증식된 세포의 회수율이 우수하다. 또한, 세포 크기, 종류를 고려해 알맞게 구현된 세포배양시트 표면 모폴로지는 세포 부착성을 향상시키며, 부착된 세포를 안정적으로 지지할 수 있음에 따라서 배지의 순환흐름과 같은 외력이 존재하고, 이로 인해 세포배양시트의 흔들림이 있는 배양 환경 하에서도 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있다. 나아가 통상적인 배양 세포에 대비해 파종 시 세포 크기에 대비해 크기가 작은 세포가 수득되며, 배지가 순환되는 대용량배양기에 채용되었을 때 더욱 크기가 작은 세포가 수득 됨에 따라서 더욱 젊고, 건강하며 형질 변화가 없는 세포를 증식시키는데 매우 유리하다. 나아가, 줄기세포를 지방세포, 골세포 등으로 분화시키는데 있어서도 우수한 분화로 목적하는 세포로 분화시키는데 유리하다. 이로 인해 본 발명의 세포 배양시트는 목적하는 세포, 특히 줄기세포를 대량으로 안정적으로 배양하고, 회수할 수 있으며, 나아가 목적하는 특정 세포로 분화시키기 위한 대용량 배양기 등에 널리 응용될 수 있다.
도 1은 배양조건 1에 따라서 세포배양시트의 세포배양효율을 평가하기 위해서 예시된 세포배양시트 적층체의 사시도,
도 2는 세포배양시트의 세포배양효율을 평가하기 위해 사용되는 일 예시의 하우징 및 하우징에 장착된 세포배양시트를 보여주는 사진,
도 3 및 도 4는 각각 실시예1 및 비교예2에 따른 세포배양시트를 이용한 줄기세포 배양 후 줄기세포들이 뭉쳐서 필름막을 형성하는지 유무를 관찰한 사진,
도 5 및 도 6은 각각 실시예1 및 비교예2에 따른 세포배양시트를 이용해서 줄기세포를 뼈 세포로 분화시킨 결과에 대한 사진, 그리고
도 7 및 도 8은 각각 실시예1 및 비교예2에 따른 세포배양시트를 이용해서 줄기세포를 지방 세포로 분화시킨 결과에 대한 사진, 그리고
도 9 및 도 10은 각각 실시예1, 실시예4에 따른 섬유웹 표면의 AFM 사진이며, 사진 상에 섬유 간 연결된 기능성 코팅층인 막이 형성됨을 확인할 수 있다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 부가한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양시트는 평균직경이 1.5㎛ 이하인 지지섬유들이 축적되어 형성된 3차원 네트워크 구조이며, 평량이 1 ~ 15g/㎡인 섬유웹과 적어도 상기 섬유웹의 일 표면 상에 노출되는 지지섬유에 피복되며, 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 코팅층을 포함하여 구현된다.
상기 섬유웹은 지지섬유들이 축적되어 3차원 네트워크 구조를 형성되며, 구체적으로 각각의 지지섬유가 독립적으로 폴딩 및/또는 섬유길이방향의 정함이 없이 각각이 배열되고, 이들이 적층됨을 통해 구조적으로 더욱 복잡하고, 다양한 3차원 네트워크 구조를 형성할 수 있다. 이와 같이 복잡, 다양하게 형성된 내부 구조는 세포의 증식에 필요한 영양분을 포함하는 배양용액의 유로로 기능하여 섬유웹 표면과 접하는 세포 부착면으로도 용이하게 영양분을 공급시킬 수 있고, 세포사멸을 방지하며, 세포증식을 향상시킬 수 있다.
이때, 1가닥 지지섬유 내의 서로 다른 표면 간 및/또는 서로 다른 지지섬유의 표면 간에는 접착 또는 융착이 발생할 수 있고, 이를 통해 3차원네트워크 구조가 구조적으로 보다 안정화 될 수 있다.
또한, 지지섬유들이 랜덤하게 배열되고 축적되어 형성된 섬유웹의 표면은 표면 모폴로지에 의해 세포의 입체적 배양을 유도할 수 있다. 표면 모폴로지의 일 예로써, 섬유웹 표면은 평평하지 않고, 울퉁불퉁한 표면이 형성될 수 있고, 표면 거칠기가 클 수 있다. 섬유웹의 표면 형상이 울퉁불퉁하다는 것은 예시적으로 다수개의 오목부 및/또는 볼록부를 포함한 것으로써, 세포의 입체적 성장효과 이외에 세포가 볼록부 간 사이 공간 또는 오목부의 홈에 보다 용이하고 견고하게 안착될 수 있어서 세포배양시트에 안착된 뒤 탈리되는 세포의 수를 감소시킬 수 있는 이점이 있다.
위와 같은 기능성 코팅층이 형성된 섬유웹 표면의 모폴로지는 기능성 코팅층이 형성되기 전 섬유웹을 구성하는 섬유의 직경분포, 섬유의 배열, 방사 후 열 압착 유무 및 정도, 열 압착 시 온도, 섬유웹의 평량, 두께 등에 따라서 매우 다양한 형태로 나타나며, 기능성 코팅층의 형성정도에 따라서도 달라질 수 있다. 결국 표면 모폴로지는 기능성 코팅층이 형성된 섬유웹 내 섬유 직경, 섬유웹의 공기투과도, 기능성 코팅층이 형성된 섬유웹 표면의 표면조도, 공경, 기공도 등의 인자들을 통해 정의될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 위와 같은 인자들의 변경에 따른 표면 모폴로지의 다양한 변화가 세포 배양에 미치는 영향을 연구하던 중, 기능성 코팅층이 구비된 섬유웹 표면의 모폴로지에 따라서 세포의 증식에 있어서 예상하지 못한 수준의 개선된 효과를 발현하며, 세포배양시트에서 배양된 세포들이 얇은 막을 형성하는 것을 방지해 증식된 세포들의 분리, 회수성을 향상시키고, 특히 파종 되는 세포가 줄기세포인 경우 세포 형질의 변형 없이 파종 시 세포 크기에 대비해 배양, 증식 후 세포 크기가 더 작은 세포를 수득할 수 있게 하며, 줄기세포가 지방세포, 골세포 및 연골세포 등으로 분화 시 효율을 개선할 수 있다. 한편, 파종 시 세포 크기에 대비해 배양, 증식 후 세포 크기가 더 작다는 것은 노화가 최소화되어 배양된 세포가 매우 젊고, 세포 상태가 우수할 수 있다. 이러한 특징은 배양조건 1이나 2와 같이 배지가 교환되지 않는 배양조건에서도 발현되지만 배양조건 3과 같이 배지가 파종 후 1회 교환되거나, 소정의 교환 주기 또는 연속하여 교환되는 조건의 다른 배양조건에서 더욱 현저하게 발현될 수 있다. 일 예로, 파종 시 세포 직경 대비 15% 이상, 더욱 크게는 30% 가량 작은 직경을 갖는 세포가 배양될 수 있고, 일예로 파종 세포가 줄기세포의 경우 18㎛ 이하의 세포가 수득될 수 있다. 이러한 특징은 세포배양시트 표면 모폴로지에 의한 영향으로 예상된다.
한편, 상술한 우수한 세포배양효율을 갖는 본 발명의 세포배양시트에 구비되는 섬유웹은 세포배양에 적합한 표면 모폴로지를 구현시키기 위해서 섬유웹을 구성하는 지지섬유의 평균직경이 1.5㎛ 이하 일 수 있다. 바람직하게는 지지섬유 평균직경은 10㎚ ~ 1.0㎛일 수 있다. 또한, 섬유웹의 평량은 1 ~ 15g/㎡이다. 만일 섬유의 평균직경이 10㎚ 미만일 경우 기계적 강도가 약하고, 섬유웹 제조가 어려울 수 있다. 또한, 평균 직경이 1.5㎛를 초과하는 경우 섬유웹의 밀도(평량)가 작아지고, 열 압착 시 섬유웹의 표면이 부분적으로 용융된 것과 같이 형성될 우려가 있다. 또한, 평량이 1g/㎡ 미만일 경우 섬유웹 제조 시 핸들링이 용이하지 않은 우려가 있고, 15g/㎡를 초과하는 경우 압착롤에서 섬유웹이 용융될 수 있다. 또한, 이러한 지지섬유 직경과 평량 조건을 만족하지 못하는 경우 세포배양에 적합한 표면 모폴로지의 구현이 어려울 수 있고, 본 발명이 목적하는 수준의 세포배양 효율 등을 달성하기 어려울 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 1.0㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 3.0, 보다 바람직하게는 1.3 ~ 2.6일 수 있으며, 이러한 표면 거칠기를 갖는 섬유웹 상에 배양 시 본 발명의 목적을 달성하기에 보다 유리할 수 있다. 여기서 발달한 표면적 비율(Sdr, developed surface area ratio)이란, 3차원으로 조도가 측정된 영역의 면적에 대비한 상기 영역 내 실제 표면적의 비를 의미하며, 발달한 표면적 비율이 1이란 측정된 영역이 평활한 평면을 의미하고, 이 비율이 커질수록 비표면적이 커짐을 의미한다. 만일 중심선 평균조도가 0.15 미만 및/또는 발달한 표면적 비율이 1.3미만일 경우 증식된 세포가 뭉쳐서 분리회수율이 저하될 우려가 있다. 또한, 기능성 코팅층으로 인해서 폐색되는 표면 기공이 많아 섬유웹 표면에 부착된 파종 세포의 아랫부분에 충분한 영양이 공급되기 어려워서 세포배양효율도 저하될 우려가 있다. 또한, 만일 중심선 평균조도가 1.0㎛를 초과하거나, 및/또는 발달한 표면적 비율이 3.0을 초과할 경우 배양된 줄기세포의 평균직경이 파종시 대비 유사수준으로 배양될 수 있고, 이에 따라서 ??고 노화가 덜된 세포를 수득하기 어려울 수 있다. 또한, 배양 후 섬유웹과 배양 세포간 부착정도가 강해서 배양된 세포의 분리가 용이하지 않고, 이로 인해 분리 시 분리 회수율이 저하되거나 배양세포의 손상이 발생할 우려가 있다. 또한, 배양된 줄기세포를 특정 세포로 분화시 분화효율이 저하될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 세포배양시트는 줄기세포 배양 용도로 매우 적합할 수 있고, 상기 줄기세포는 일 예로 인간 유도만능줄기세포(hiPSC), 인간 심장 줄기세포(hCSC), 간엽 줄기세포(MSC), 쥐 배아줄기세포(mESCs) 및 골모세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이 경우 세포배양시트 내 섬유웹에 구비된 지지섬유의 평균직경은 200 ~ 600㎚, 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 0.6㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 2.3일 수 있고, 이러한 인자를 구비한 섬유웹의 표면 모폴로지는 줄기세포 증식 효율이 매우 우수할 수 있고, 나아가 배양된 줄기세포들이 막을 이루지 않고, 낱 개의 세포 회수가능함에 따라서 분리 회수되는 세포 수를 증대시킬 수 있는 이점이 있다. 또한, 배양되는 줄기세포의 평균 직경이 파종 시 보다 15% 이상 감소된, 달리 말하면 노화가 진행되지 않거나 덜 진행된 세포 상태가 우수한 줄기세포를 회수할 수 있다. 또한, 이와 같은 세포배양시트에 줄기세포를 분화 시킬 경우 지방세포, 골세포, 연골세포 등으로 분화 시 분화효율이 다른 표면 모폴로지를 갖는 섬유웹이나, 평평한 플레이트에 대비해 개선될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 세포배양시트는 구비된 지지섬유 평균직경이 500 ~ 600㎚이며, 평량이 3 ~ 12g/㎡이고, 공기투과도가 4.5 ~ 8.0cfm인 섬유웹을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 평량이 3 ~ 10g/㎡, 일예로 4.0 ~ 5.5g/㎡로 구현된 것일 수 있다. 또한, 이때 섬유웹의 두께는 3 ~ 6㎛, 보다 바람직하게는 5 ~ 6㎛일 수 있다 이러한 표면 모폴로지를 갖는 섬유웹을 통해서 줄기세포의 분화효율에 있어서 상승효과를 달성하기 유리함에 따라서 줄기세포 분화용도의 세포배양시트로 사용될 수 있다.
또한, 상기 지지섬유는 세포배양에 사용되는 통상적인 재질, 일예로서 폴리카보네이트(PC), 폴리아크릴로나이트릴(PAN), 폴리스티렌(PS), 폴리이더술폰(PES), 불소계 화합물 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 세포증식 및 회수성을 모두 고려하여 지지섬유는 불소계 화합물을 포함할 수 있고, 이 중에서도 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)를 포함할 수 있다. 지지섬유가 PVDF인 경우 세포 회수 특성이 우수할 뿐만 아니라, 배양된 세포가 파종 시 세포 직경 보다 작게 구현하기에 유리할 수 있다.
상술한 섬유웹 표면에는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 유도하거나 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 코팅층이 구비된다. 상기 기능성 코팅층이 형성된 섬유웹 상의 표면 모폴로지가 본 발명에 따른 조건들을 만족할 시, 평활한 필름 상의 세포배양시트에 동일한 기능성 코팅층이 조합되는 경우에 대비해 상승된 세포배양효율을 달성할 수 있는 등 본 발명의 목적을 달성하기에 보다 유리할 수 있다.
상기 기능성 코팅층은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물 및 세포 중 어느 하나 이상의 생리활성성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 생리활성성분들은 구체적으로 세포외 기질에 존재하는 물질 또는 이와 동일하거나 유사하게 인공적으로 제조한 물질일 수 있다.
또한, 상기 생리활성성분은 모티프를 포함할 수 있다. 상기 모티프는 생장인자(growth factor) 또는 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 단백질, 당단백질 및 프로테오글리칸 중에서 선택된 어느 하나 이상에 구비된 소정의 아미노산 서열을 포함하는 천연 펩타이드 또는 재조합 펩타이드일 수 있다. 구체적으로 상기 모티프는 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor , KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin , GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 모티프는 성장인자에 포함되는 소정의 아미노산 서열 및 상기 세포외기질에 포함되는 소정의 아미노산 서열을 모두 포함할 수도 있다. 보다 바람직하게는 상기 모티프는 서열목록 번호 9 내지 서열목록 번호 30의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 세포배양시트는 접착성을 향상시키는 생리활성 성분을 더 구비할 수 있다. 이러한 성분은 배양세포를 초기에 세포배양시트 상에 고정시켜 배양용액상에 로딩된 세포가 부유하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 접착성이 없거나 약한 생리활성성분을 세포배양시트 상에 고정시켜 생리활성성분이 세포배양 과정에서 세포배양시트에서 탈리되는 것을 방지하는 기능을 수행할 수 있다.
또한, 이러한 성분은 세포의 부착성을 증진시키기 위하여 공지된 홍합단백질 또는 홍합단백질 중 특정한 도메인이나 모티프를 포함할 수 있다. 상기 접착성분은 통상의 생체적합성이 있어서 세포독성을 발생시키지 않는 공지된 접착성분의 경우 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열이 1회 내지 20회 반복하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있고, 이를 통해 세포독성이 현저히 저하되고, 다른 종류의 생리활성성분과의 접착력이 우수한 동시에 세포배양 중 배양용액에 용해되지 않음에 따라서 다른 종류의 생리활성성분의 탈리나 세포의 단리가 방지될 수 있는 이점이 있다.
또한, 접착성을 나타내는 단백질 또는 이의 일부분에 해당하는 모티프는 생리활성을 나타내는 다른 종류의 모티프와 공유결합 되어 일체로 구현될 수 있다. 즉, 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 펩티드와 접착 단백질 간의 융합단백질이 구비될 수 있다. 일예로, 접착성을 나타내는 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 상술한 성장인자 등의 모티프를 직접 공유결합 시키거나 이종의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 개재시켜 공유결합 시킬 수 있으며, 이 경우 세포배양시트에 더욱 견고히 다른 종류의 생리활성성분을 부착시키고, 세포배양효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 더욱 구체적인 일 예로써 접착단백질과 성장인자가 융합된 단백질로써 서열번호 8번의 아미노산 서열을 갖는 접착단백질과 서열번호 30번의 아미노산 서열을 갖는 단백질 간 융합단백질을 사용할 수 있다.
또한, 상기 섬유웹은 스펀본드, 멜트블로운 등의 공지된 방법으로 웹 형상을 구현한 것이거나, 또는 용해 또는 용융된 방사용액을 이용해 전기방사된 것일 수 있다. 다만, 섬유웹을 구성하는 섬유의 평균직경 등을 고려 시 전기방사를 통해 제조된 것일 수 있다. 이때 전기방사를 통한 섬유웹의 제조방법은 공지된 방법을 적절히 채용할 수 있다.
또한, 상술한 기능성 코팅층은 섬유웹 표면에 공지된 방법을 통해 구비될 수 있다. 일예로, 상기 생리활성성분이 코팅공정을 통해 섬유웹(이 경우 섬유웹을 형성하는 섬유 표면에 코팅될 수 있다. 또는, 상기 생리활성물질은 섬유웹을 형성하는 고분자화합물과 함께 혼합되어 섬유웹 제조를 위한 조액 제조단계에서부터 구비될 수 있다. 이 경우 생리활성물질을 제조된 섬유웹이나 필름의 외부면에 별도의 코팅공정이나, 생리활성물질의 고정을 위한 별도의 접착성분 없이도 용이하게 구비시킬 수 있는 이점이 있다.
한편, 동일한 평균직경을 가지도록 전기 방사된 섬유웹의 경우에 전기방사 시 에어를 방사용액과 함께 방사 시키는지 여부, 가해주는 에어의 압력, 에어갭의 거리, 방사용액 내 섬유형성성분의 종류, 방사 후 열 압착 시 온도, 압력, 시간 조건 등의 변경을 통해서 섬유웹의 표면 모폴로지를 원하는 수준으로 적절히 변경할 수 있다.
또한, 상기 세포배양시트는 낱장이 1장 또는 여러 장의 적층 합지된 섬유웹 단독으로 구성될 수 있다. 또는, 섬유웹과 1장 또는 여러 장의 지지필름이 결합된 적층체일 수 있다. 이때, 섬유웹과 지지필름이 결합되는 경우 실리콘 재질 등의 접착제를 통해 형성된 실리콘계 접착층을 통해 결합되거나, 접착제 없이 지지필름 및/또는 섬유웹의 부분용융을 통해 결합될 수 있다.
이러한 섬유웹의 구조적 특징으로 인해 하기 배양조건1로 배양 후 회수된 세포 수는 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 9배 이상 증식시킬 수 있고, 바람직하게는 15배, 보다 바람직하게는 20배 이상, 보다 더 바람직하게는 30배 이상을 증식시킬 수 있어서 매우 높은 세포 배양효율을 가진다.
이때, 배양조건 1은 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 세포배양시트를 총 60장 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 4일간 배양하는 조건으로서, 배지의 교체 없이 4일간 배양하는 조건이다.
이때, 세포배양시트는 세포가 배양되는 유효면인 상, 하부면이 하우징 내벽에 닿지 않도록 고정되어 배치된다. 세포배양시트가 하우징에 고정되는 일 예시를 도 1을 통해 참조하여 설명하면, 세포배양시트(11,12,13) 테두리를 따라서 소정의 간격을 두고 홀을 천공시키고, 상기 홀에 지지대(30)를 관통시킨 뒤 하우징 상부면/하부면 및 세포배양시트(11,12,13) 간 닿지 않도록 이격시키는 스페이서(20)를 구비시켜 세포배양시트(11,12,13) 간 이격 간격이 조절된 세포배양시트 적층체(100)를 통해 하우징에 고정시킬 수 있다. 또는 다른 일예로 세포배양시트는 하우징 내부면에 형성된 슬릿에 삽입되는 방식으로 끼워져 세포배양시트의 양 측단, 세 측단, 또는 네 측단이 고정됨을 통해 하우징에 고정될 수도 있다. 이때, 슬릿의 간격을 통해 세포배양시트 간 이격 간격의 조절이 가능하다.
이때, 상기 하우징은 세포배양에 사용되는 통상의 재질일 수 있다. 또한, 파종될 세포와 배지가 유입될 수 있는 유입구를 구비할 수 있다. 또한, 하우징 내부와 외부 간 외기의 이동이 없도록 밀폐가 가능한 구조일 수 있다.
또한, 배양조건1에 사용되는 세포배양시트는, 섬유웹 단독으로 사용 시 발생하는 처짐을 방지하고 이를 통해 세포배양 시트 간 이격간격을 1㎜로 유지시키기 위해서 두께 0.5㎜인 폴리카보네이트(PC)필름이 합지된 것을 사용한다.
한편, 배양조건 1에서 세포배양시트를 1㎜ 간격으로 60장 다단 배열한 것에 따른 효과를 설명하면, 세포의 배양에 필요한 배지가 하우징 내 채워져 있더라도 시간이 지나면 세포 증식에 따라서 위치 별로 배지 성분의 농도 차나, pH 차이가 유발될 수 있고 이로 인해 세포증식 효율이 저하되거나 세포배양시트의 위치 별로 세포가 증식되는 정도가 현격하게 달라질 수 있는데, 본 발명에 따른 세포배양시트는 매우 좁은 간격으로 다수 장이 이격되어 배치되는 경우에도 단위면적 당 세포증식 효과가 매우 큼에 따라서 배지가 교체되지 않고 대용량으로 세포가 배양되는 조건에서도 우수한 효율로 세포를 배양시킬 수 있는 이점이 있다. 또한, 배양된 세포들이 콜라겐 등의 세포 증식 시 발생된 물질로 인해 서로 엉켜 막을 형성하거나 뭉치게 배양되지 않음에 따라서 회수된 세포를 온전히 사용할 수 있는 이점이 있다.
또한, 배양조건1과 같이 시트 간 간격이 1㎜가 되도록 다단으로 세포배양시트를 적층시켜 세포를 배양할 때, 세포배양시트의 면적이 커지면 위치 별로 균일하지 않을 수 있는 배지성분, pH로 인해 세포배양 효율이 더욱 현저히 저하될 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양시트는 면적이 100㎠ 이상, 200㎠ 이상, 또는 400㎠ 이상으로 대면적화 된 경우에도 우수한 세포배양효율을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양시트는 하기의 배양조건 2와 같이 세포배양시트가 더욱 많은 수로 구비되어 세포가 배양되는 경우에도 배양 후 회수된 세포 수가 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 25배 이상 증식될 수 있다. 보다 바람직하게는 30배 이상으로 증식시킬 수 있다.
배양조건2는 낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 100장의 세포배양시트를 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 5일간 배양하되, 줄기세포 파종 후 24시간 경과 시 1회 배지를 교체하여 배양하는 조건으로서, 배지를 1회 교체해 세포증식이 더욱 활발히 이루어지는 조건을 구현할 경우 100장의 세포배양시트를 1㎜ 간격으로 적층할 때에도 파종 시 세포 수 대비 25배, 보다 바람직하게는 35배 이상 세포를 증식시킬 수 있는 이점이 있다. 한편, 배양조건2에 사용되는 세포배양시트는, 섬유웹 단독으로 사용 시 발생하는 처짐을 방지하고 이를 통해 세포배양 시트 간 이격간격을 1㎜로 유지시키기 위해서 두께 0.5㎜인 폴리카보네이트(PC)필름이 합지된 것을 사용한다.
한편, 배양조건 1 및 2로 소정의 일 수 동안 배양한 뒤 증식된 세포를 회수 및 세포 수를 카운팅하는 방법은 당해 기술분야의 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 일예로 하우징에서 배지를 제거한 뒤, 37℃로 온도가 조절된 0.05 ~ 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 하우징 내부로 주입시킨 뒤, 소정의 시간 경과 후 다시 배지를 주입시켜 세포배양시트에서 분리된 세포를 부유 시켜서 이를 수거한 뒤, 원심분리기를 사용해 세포를 침강시키고 상층액을 제거한 뒤 추출한 세포 용액을 Trypan blue 용액과 1:1 비율로 섞어주고, 섞어준 용액을 세포 계수기(cell counter)를 사용해 세포 수를 카운팅 할 수 있다.
또한, 상술한 배양조건 1 및 2에 사용되는 배지는 줄기세포의 종류에 따라서 공지된 적합한 것을 사용할 수 있다. 일예로 간엽 줄기세포(MSC)를 배양할 경우 사용되는 배지는 KBS-3 Basal medium(B1001) 500㎖에 KSB-3 supplyments(S2901) 2㎖를 혼합시킨 배지에 FBS(Fetal Bovine Serum)를 전체 배지 중량의 10%가 되도록 투입하고, Penicillin/Streptomycin을 전체 배지 부피의 1/100이 되도록 포함시켜 제조한 배지일 수 있다.
본 발명은 상술한 세포배양시트를 구비시켜 대용량 세포 배양기를 구현할 수 있다. 상기 대용량 세포배양기는 하우징 및 상기 하우징 내부에 다수 장의 시트가 일방향을 따라 소정의 간격을 두고 다단으로 배열되는 세포배양시트를 포함하여 구현된다. 또한, 본 발명은 상기 대용량 세포배양기를 이용해 대용량 세포 배양시스템을 구현할 수 있다. 상기 대용량 세포배양시스템은 대용량 세포 배양기, 상기 대용량 배양기 일 측으로 세포 배양 시 필요한 배지를 공급하는 배지공급장치 및 상기 배지를 순환시키기 위한 펌프를 구비하여 구현될 수 있다.
대용량 세포배양기를 구성하는 하우징, 배지공급장치, 펌프는 당해 기술분야에서 통상적으로 세포를 대용량으로 배양 시 사용되는 구성을 적절히 채용, 변경할 수 있는 것으로써 이에 대해서는 구체적인 설명을 생략한다. 또는 상기 대용량 세포배양기, 배지공급장치 및 펌프를 구비하는 대용량 세포 배양시스템은 본 발명의 출원인에 의한 특허출원번호 제10-2018-0140008호가 참조되며, 당해 특허문헌에 본 발명에 따른 세포배양시트가 채용될 경우 보다 현저하고, 수득된 세포의 크기가 작은 젊고, 건강한 세포를 대량으로 배양하기에 유리할 수 있다.
하기 표 1은 상술한 기능층 코팅층에 구비되는 생리활성성분에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 아미노산 서열
1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro
3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu
4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
8 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
9 Arg Gly Asp
10 Arg Gly Asp Ser
11 Arg Gly Asp Cys
12 Arg Gly Asp Val
13 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro
14 Gly Arg Gly Asp Ser
15 Gly Arg Gly Asp Thr Pro
16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro
17 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys
18 Tyr Arg Gly Asp Ser
19 Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr
20 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
21 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
22 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr
23 Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
24 Ile Lys Val Ala Asn
25 Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln
26 Val Ala Glu Ile Asp Gly Ile Gly Leu
27 Pro His Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
28 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
29 Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
30 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser Pro
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예 1>
먼저, 방사용액을 제조하기 위하여 섬유형성성분으로 폴리비닐리덴플루오라이드(Arkema사, Kynar761) 12g을 디메틸아세트아마이드와 아세톤의 중량비를 70:30으로 혼합한 혼합용매 88g에 80℃의 온도로 6시간 동안 마그네틱바를 사용하여 용해시켜 혼합용액을 제조했다. 상기 제조된 방사용액을 전기방사 장치를 사용하여 전압 25kV, 집전체와 방사구까지의 거리 25cm, 토출량 0.05ml/hole의 조건으로 RH 65%, 30℃의 환경에서 전기방사를 실시하였다. 또한, 이때 토출구에 인접해서 에어가 방사구 방향으로 수직하게 가해지도록 하였다. 최종 구현된 섬유웹은 섬유 평균직경이 500nm, 평량이 5.0g/㎡, 두께가 5㎛, 중심선 평균조도(Ra)가 표면조도가 0.374㎛, 발달한 표면적 비율이 1.873이었다.
준비된 섬유웹을 일면에 실리콘계 접착제를 구비한 두께가 500㎛인 폴리카보네이트(PC) 필름의 상기 실리콘계 접착제가 구비된 면에 접하게 합지한 뒤 상온에서 코팅기(digital-3500plus)를 이용해서 부착시킨 일체화된 적층체 타입의 세포배양시트를 제조하였다.
이후 섬유웹의 노출면에 기능성 코팅층을 형성시켰다. 구체적으로 하기의 준비예1에서 제조된 세포배양 코팅조성물에 섬유웹 부분을 함침시킨 뒤 30℃ 항온 배양기에서 한 시간 반응하여 섬유웹 표면에 기능성 코팅층을 형성시켰다. 이후 3차 증류수를 이용하여 5분씩 3회 세척한 뒤, 클린벤치 내에서 플레이트 뚜껑을 열어둔 채로 공기 중에서 건조시켜 세포배양시트를 제조하였다.
* 준비예1 - 세포배양 코팅조성물 제조
생리활성성분은 융합단백질로써 서열번호 8인 아미노산 서열을 갖는 접착단백질의 카르복시 말단에 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 기능성 펩타이드를 아미노 말단에 결합시킨 것을 준비하였다. 이때, 융합단백질은 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법으로 제조하였다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 Sulfo-NHS 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 Sulfo-NHS을 제조했다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 Sulfo-NHS 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 Sulfo-NHS을 제조했다.
세포배양 코팅조성물을 제조하기 위해서 코니칼 튜브에 EDC 용액을 투입한 뒤, Sulfo-NHS 용액을 넣고 교반하면서 준비된 활성용액에 세포배양용 융합단백질을 투입한 뒤 교반시켜 세포배양 코팅조성물을 제조하였다. 이때, 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 EDC가 1 중량부 포함되도록 하고, EDC와 Sulfo-NHS는 1:2 중량비가 되도록 혼합하였으며, 코팅조성물에 포함된 NaOAc는 EDC 100 중량부에 대해서 100 중량부가 되도록 포함시켰다. 이때, 세포배양 코팅조성물에서 세포배양용 융합단백질의 농도는 0.1㎎/㎖이었다.
<실시예 2 ~ 3>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 준비예1의 융합단백질 중 서열번호 30번의 기능성 펩타이드를 서열번호 28 및 서열번호 29로 변경한 융합단백질로 변경하여 하기 표 2와 같은 세포배양시트를 제조하였다.
<비교예 1>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 방사 시 전압, 토출량, 에어갭을 변경해서 지지섬유 평균직경이 1.65㎛, 평량이 16.4g/㎡, 두께가 5㎛, 중심선 평균조도(Ra) 1.469㎛, 발달된 표면적 비율이 3.087인 섬유웹을 준비했고, 이를 통해 세포배양시트를 제조했다.
<비교예2>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 섬유웹 없이 표면에 플라즈마 처리된 두께가 500㎛인 폴리카보네이트 필름 단독을 세포배양시트로 사용하고, 필름 일면에 준비예1에 따른 세포배양 코팅조성물을 동일하게 처리하여 생리활성성분을 구비시켰다.
<실험예1>
제조된 세포배양시트를 가로, 세로 각각 25㎝, 25㎝로 타발한 뒤, 도 2의 오른쪽 대용량 배양기 하우징 내부 지지대에 대응되도록 세포배양시트를 타공하였다. 이후 준비된 세포배양시트에 γ-ray를 5 kGy 세기로 조사하여 세포배양시트를 멸균시켰다.
이후 대용량 배양기 하우징 내부 지지대에 두께가 1㎜이며, 상기 지지대의 직경에 대응되도록 타공된 스페이서를 통과시켰다. 이후 세포배양시트 한 장을 타공된 홀이 상기 지지대를 통과하도록 대용량 배양기 내부에 장착하였다. 이후 다시 두께가 1㎜인 스페이서를 지지대에 통과시키고 다시 한 장의 세포배양시트를 장착하는 방식으로 총 60 장의 세포배양시트가 1㎜ 수직거리로 이격되어 형성된 세포배양시트 집합체를 구현했다. 이후 대용량 배양기 하우징을 외기와 밀폐시킨 뒤, 일 측면에 구비된 세포배양액 유입관을 통해 간엽 줄기세포가 혼합된 세포배양액을 투입시키고, 37℃ 온도조건에서 4일간 배양했다.
이때, 상기 세포배양액은 KBS-3 Basal medium(B1001) 500㎖에 KSB-3 supplyments(S2901) 2㎖를 혼합시킨 배지에 FBS(Fetal Bovine Serum)를 전체 배지 중량의 10%가 되도록 투입하고, Penicillin/Streptomycin을 전체 배지 부피의 1/100이 되도록 포함시켜 제조한 세포배양액에 간엽 줄기세포(MSC) 수가 세포배양시트 단위면적 당 8,000개/㎠ 되도록 구비시킨 것을 사용하였다.
이후 배양을 통해 증식된 세포를 회수 및 세포 수를 카운팅하였다. 구체적으로 대용량 배양기에서 배지를 제거한 뒤, 37℃로 온도가 조절된 0.15% Trypsin-EDTA 용액을 하우징 내부로 주입시킨 뒤, 소정의 시간 방치해서 배양된 세포를 세포배양시트에서 분리시켜 부유시킨 뒤, 트립신 성분을 중화시키기 위해 다시 동일한 세포배양용액을 주입시킨 뒤 이를 수거하였다.
이후 수거한 용액을 원심분리기를 사용해 세포를 침강시키고 상층액을 제거한 뒤 추출한 세포 용액을 Trypan blue 용액과 1:1 비율로 섞어주고, 섞어준 용액을 세포 계수기(cell counter)를 사용해 세포 수를 카운팅하였고, 파종된 세포 수에 대비한 증식 후 회수된 세포수를 비율로 계산한 세포증식회수율을 하기 표 2에 나타내었다.
<실험예2>
실험예1과 동일한 대용량 배양기를 제조했다. 이후 간엽 줄기세포가 혼합된 세포배양액을 투입시키고, 37℃ 온도조건에서 배양하되, 세포 파종 후 24시간 경과한 뒤 간엽 줄기세포가 없는 동일한 세포배양액으로 1회 세포배양액을 교체하여 총 5일간 배양시켰다.
이때, 상기 간엽 줄기세포가 혼합된 세포배양액은 KBS-3 Basal medium(B1001) 500㎖에 KSB-3 supplyments(S2901) 2㎖를 혼합시킨 배지에 FBS(Fetal Bovine Serum)를 전체 배지 중량의 10%가 되도록 투입하고, Penicillin/Streptomycin을 전체 배지 부피의 1/100이 되도록 포함시켜 제조한 세포배양액에 간엽 줄기세포(MSC) 수가 세포배양시트 단위면적 당 4,000개/㎠ 되도록 구비시킨 것을 사용하였다.
<실험예3>
실험예2에서 세포 배양 후 대용량 배양기를 관찰하여 증식된 세포들이 뭉쳐져서 형성한 필름막의 유무를 육안으로 관찰했고, 그 결과 필름막이 형성되지 않은 경우 ×, 형성된 경우 ○로 표기했다. 또한, 실시예1과 비교예2에서 5일 배양 후 대용량 배양기 사진을 촬영해 그 결과를 도 3과 도 4에 각각 나타내었다.
도 3을 통해 확인할 수 있듯이 실시예1의 경우 배양된 세포들이 뭉침이 없는 반면에 도 4와 같이 비교예2의 경우 배양된 세포들이 뭉쳐서 만들어진 필름막이 형성되어 있는 것을 알 수 있다.
실시예1 실시예2 실시예3 비교예1 비교예2
지지섬유 평균직경(㎛) 500 500 500 1.65 무기공 필름
섬유웹 평량(g/㎡) 5.0 5.0 5.0 16.4
두께(㎛) 5 5 5 5 500
생리활성성분 서열번호8+서열번호30 서열번호8+
서열번호28		 서열번호8+
서열번호29		 서열번호8+
서열번호30		 서열번호8+
서열번호30
중심선 평균조도(Ra,㎛) 0.374 0.376 0.374 1.469 0.008
발단된 면적비율 1.873 1.870 1.868 3.087 1.002
파종세포수(개/㎠) 8,000 8,000 8,000 8,000 8,000
세포증식회수율(배)(4일배양, 배지교체없음) 10.8 9.2 9.3 7.2 5.8
세포증식회수율(배)(5일배양, 배지1회교체) 34.5 25.3 26.1 20.5 18.6
세포필름막 형성유무 × × × ○ ○
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이,실시예1에 따라서 제조된 섬유웹에 서로 상이한 생리활성성분을 구비시킨 실시예1 ~ 3의 경우 4일 배양하고 배지 교체 없는 경우 증식 및 회수된 세포 수가 파종 세포수 대비해 9배 이상으로 우수한 증식효율을 가지는 것을 알 수 있다.
그러나 무기공 필름인 비교예2의 경우 4일 배양하고 배지 교체 없는 경우 증식 및 회수된 세포 수가 파종 세포수 대비해 5.8배에 불과해 플라즈마 처리를 한 경우에도 표면 모폴로지가 줄기세포의 배양에 적합하지 않은 것을 알 수 있다.
또한, 섬유웹을 사용한 경우에도 지지섬유의 평균직경이 1.5㎛를 초과하고, 평량도 15g/㎡를 초과하는 섬유웹을 사용한 비교예1의 경우 4일 배양하고 배지교체 없는 경우 증식 및 회수된 세포 수가 파종 세포수 대비해 7.2배에 불과해 실시예1에 대비해 표면 모폴로지가 줄기세포의 배양에 적합하지 않은 것을 알 수 있다.
<실험예4>
실험예2에서 파종 전 세포의 직경 및 실험예2를 통해서 실시예1과 비교예2에서 회수된 세포의 직경을 시포 계수기를 이용해 측정하여 하기 표 3에 나타내었다. 또한, 배양 전 파종된 세포에 대비해 실시예1과 비교예2를 통해 증식, 회수된 세포에 대한 형질변화 유무를 CD마커(CD29, CD44, CD73, CD10, CD11b, CD34, CD45)를 이용해서 FACS를 통해 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 함께 나타내었다. 이때, FACS 분석에서 양성 컨트롤이 95% 초과, 음성 컨트롤이 5% 미만을 기준으로 하였다.
평가결과 실시예1의 경우 양성 컨트롤이 97 ~ 99%, 음성 컨트롤이 0.07 ~ 2.9%로 도출되어 세포 형질변화 없이 증식되었음을 확인했다.
<실험예5>
실시예1 및 비교예2에 따른 세포배양시트를 이용해 간엽 줄기세포를 하기 각각의 세포로 분화시키고, 분화 결과를 표 3에 나타내었다.
1. 뼈세포 분화
분화 시 사용된 성장 배지로써 DMEM + 10% FBS + 1x GlutaMAX + P/S + 5 ng/ml bFGF인 배지를 사용했고, 뼈 분화 시 뼈분화 배지로써 상용품인 Stemcell Technologies, MesenCult™ Osteogenic Differentiation Kit (Human)를 사용했다. 또한, 지방분화 배지로써, 상용품인 Stemcell Technologies, MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit (Human)를 사용했다. 또한, 연골분화 배지로써, 상용품인 DMEM + 0.3 mM Ascorbic acid + 0.35 mM Proline + 10-7 M Dexamethasone + 1x ITS-3 + 10 ng/ml TGF-β3을 사용했다.
구체적으로 셀 쏘잉(Cell thawing) 및 5일간 배양 후 배양된 줄기세포를 이용해 뼈 분화를 시도했다. 구체적으로 셀 쏘잉 및 배양은 1x106 cells/vial stock을 75T flask 2개에 cell seeding 후 다음 날 배지를 교환 했고, 그 후 3일째, 5일째 배지를 교환했다. 이때, T-flask에 세포가 90% 정도 찼을 때 Subculture를 진행했고, 구체적으로 4 × 103 cells/㎠ 농도로 세포배양시트 상에 세포를 파종했다.
1. 뼈 분화
이후 뼈 분화를 위해서 위에서 배양된 줄기세포를 4 × 103 cells/㎠로 세포배양시트가 각각 구비된 12 웰-플레이트에 파종했다. 세포가 웰-플레이트에 가득 찰 때까지 성장배지로 세포 배양을 했고, 세포가 플레이트에 가득 차면 성장배지를 제거하고 PBS 1회 세척 후 각 웰에 뼈 분화 배지 1 ml씩 넣어 주고, 3일 간격으로 뼈 분화 배지를 교환했고, 2주간 분화를 진행했다. 분화 종료 후 세포액의 상층액을 제거 후 PBS로 1회 세척하고 3.7% 포름알데하이드를 넣어 상온에서 10분간 고정 시켰다. 이후 포름알데하이드를 제거 후 PBS로 3회 세척하고, PBS 제거 후 2% Alizarin red S solution 1 ml을 투입한 뒤 10분간 염색했다. 이후Alizarin red S solution 제거 후 DW를 이용하여 3회 세척했고, 육안 및 현미경으로 Alizarin red S 염색여부를 관찰했다(관련 사진 도 5 및 도 6).
이후 10% CPC(Cetylpyridinium chloride) 용액을 이용해 10배로 희석 후 562 nm로 흡광도를 측정했다.
2. 지방세포 분화
이후 지방세포 분화를 위해서 뼈분화와 동일하게 수행하되, 배지를 지방세포 분화 배지로 변경하고, 3.5주간 배양했다. 이후 분화가 종료된 세포의 상층액 제거 후 PBS로 1회 세척하고 3.7% 포름알데하이드를 넣어 상온에서 10분간 고정 시켰다. 이후 포름알데하이드를 제거 후 PBS로 3회 세척하고, 60% 이소프로판올 1 ml을 넣은 후 5분간 반응시켰다. 반응시간 동안 Oil Red O walking solution 준비했고, 이때 Oil Red S stock solution(Sigma제품)과 물을 3:2 비율로 혼합한 것을 사용했다. 이후 PBS 제거 후 Oil Red O walking solution 1 ml을 투입하여 20분간 염색 진행하고, Oil Red O walking solution 제거 후 물을 이용하여 5회 세척했다. 이후 현미경을 이용하여 Oil Red O 염색여부 분석(지방이 생성된 부위에 빨간색으로 염색)했고, 이후 60% 이소프로판올 1ml을 넣은 후 5분간 세척하고 다시 100% 이소프로판올 300μl를 넣어 5 분간 흔들어 준 뒤 염색 된 Oil Red O 용출시키고 492 nm로 흡광도를 측정했다.
3. 연골 분화
다음으로 연골조직으로 분화를 위해서 뼈분화와 동일하게 수행하되, 배지를 연골조직 분화 배지로 변경하고, 2주간 배양했다. 이후 분화가 종료된 연골조직을 PBS로 옮겨서 세척 후 B. 연골조직 표면에 뭍은 PBS 제거 후 미세저울을 이용하여 젖은 중량(wet weigh)을 측정했다.
실시예1 비교예2 파종 세포
단리 세포 평균크기(㎛) 15.5 19.9 21.3
세포 형질변화 유무 없음 없음 -
뼈세포 분화(562nm에서 흡광도임) 1.58 0.56 -
지방세포 분화(492nm에서 흡광도임) 1.4 0.98 -
연골세포 분화(mg/펠렛) 1.91 0.78 -
표 3을 통해 확인할 수 있듯이,실시예1 및 비교예2의 세포배양시트를 통해 증식, 회수된 세포는 세포형질의 변화가 없음을 확인했다. 그러나 실시예1의 세포배양시트에서 증식, 회수된 세포의 크기는 비교예2의 세포배양시트에서 증식, 회수된 세포의 크기에 대비해 다소 많이 작았고, 이를 통해 배양된 세포가 매우 젊고, 세포 상태가 우수하다는 것을 알 수 있다. 실시예1에 따른 세포배양시트를 통해 증식, 회수된 세포의 크기가 작은 것은 섬유웹 모폴로지에 의한 토폴로지 효과와 필름과 대비되는 섬유웹 특성에 기인하며, 본 발명에 구비되는 섬유웹을 통해 이러한 효과를 더욱 우수하게 달성할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4 ~ 7>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 에어갭, 토출량, 에어 세기를 변경하여 하기 표 4와 같은 세포배양시트를 제조하였다.
<실험예 6>
실시예1, 4 ~ 7에 따른 세포배양시트에 대해서 실험예2, 3, 5를 동일하게 실시하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
실시예1 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7
지지섬유 평균직경(㎛) 500 300 800 1000 100
섬유웹 평량(g/㎡) 5.0 4.2 6.5 8.2 2.0
두께(㎛) 5 5 5 5 5
생리활성성분 서열번호8+서열번호30 서열번호8+
서열번호30		 서열번호8+
서열번호30		 서열번호8+
서열번호30		 서열번호8+
서열번호30
중심선 평균조도(Ra,㎛) 0.374 0.196 0.594 0.871 0.103
발단된 면적비율 1.873 1.919 2.287 2.499 1.142
파종세포수(개/㎠) 4,000 4,000 4,000 4000 4000
세포증식회수율(배)(5일배양, 배지1회교체) 34.5 32.8 30.5 25.2 22.1
세포필름막 형성유무 × × × ○ ○
뼈세포 분화(562nm에서 흡광도임) 1.4 1.3 1.1 1.0 0.9
연골세포 분화(mg/펠렛) 1.91 1.69 1.46 1.10 1.05
표 4를 통해 확인할 수 있듯이, 실시예 6 ~ 7에 따른 세포배양시트에 대비해 실시예 1, 4, 5에 따른 세포배양시트가 배양된 세포의 분리회수율이 우수하며, 줄기세포의 분화효율은 실시예1과 실시예4의 경우 다른 종류에 대비해 매우 우수했고, 특히 실시예1에 따른 세포배양시트가 우수한 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
11,12,13: 세포배양시트
20: 스페이서
30: 지지대
<110> AMOLIFESCIENCE <120> Cell culture sheet for mass culture apparatus and mass culture apparatus comprising the same <130> 1068088 <150> KR 10-2019-0110831 <151> 2019-09-06 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 582 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu 20 25 30 Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala 35 40 45 Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg 65 70 75 80 Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser 85 90 95 Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr 100 105 110 His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg 115 120 125 Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg 130 135 140 Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser 145 150 155 160 Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr 165 170 175 Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Ala Gly Leu Ala 180 185 190 Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Thr 195 200 205 Tyr Arg Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Ala Leu Ala Thr Tyr 210 215 220 Arg His Ile Ser Thr Tyr Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr Tyr Arg His Ile Ser Gly Leu Tyr Ser 245 250 255 Glu Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg His Ile Ser Gly Leu Tyr Gly Leu 260 265 270 Tyr Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu 290 295 300 Tyr Ser Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser 325 330 335 Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Leu Tyr Ser Leu 340 345 350 Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg His Ile 355 360 365 Ser Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 370 375 380 Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser 385 390 395 400 Glu Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr 405 410 415 Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 420 425 430 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro 435 440 445 Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu 450 455 460 Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala 465 470 475 480 Pro Arg Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu 485 490 495 Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg 500 505 510 Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser 515 520 525 Pro Arg Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr 530 535 540 His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg 545 550 555 560 Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His Arg 565 570 575 Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 580 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 9 Arg Gly Asp 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 10 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 11 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 12 Arg Gly Asp Val 1 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 13 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 14 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 15 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 17 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 18 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 19 Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 20 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 21 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 22 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 23 Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 24 Ile Lys Val Ala Asn 1 5 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 25 Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 26 Val Ala Glu Ile Asp Gly Ile Gly Leu 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 27 Pro His Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 28 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for cell culture scaffold <400> 29 Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 30 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg 1 5 10 15 Gly Asp Ser Pro 20

Claims (15)

  1. 평균직경이 1.5㎛ 이하인 지지섬유들이 축적되어 형성된 3차원 네트워크 구조이며, 평량이 1 ~ 15g/㎡인 섬유웹; 및
    적어도 상기 섬유웹의 일 표면 상에 노출되는 지지섬유에 피복되며, 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 기능성 코팅층;을 포함하며, 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 1.0㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 3.0인 세포배양시트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포배양시트는 줄기세포 배양 용도인 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC), 인간 심장 줄기세포(hCSC), 간엽 줄기세포(MSC), 쥐 배아줄기세포(mESCs) 및 골모세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 지지섬유는 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포배양시트는 줄기세포 배양용도이며, 지지섬유 평균직경이 200 ~ 600㎚이며, 기능성 코팅층이 형성된 상기 섬유웹 일면의 중심선 평균조도(Ra)는 0.15 ~ 0.6㎛이며, 발달한 표면적 비율(Sdr)은 1.3 ~ 2.3인 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹 일면에 고정된 지지필름을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 지지필름과 섬유웹 사이에 실리콘계 접착층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  9. 제1항에 있어서,
    하기의 배양조건1로 배양 후 회수된 세포 수는 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 9배 이상인 것을 특징으로 하는 세포배양시트:
    [배양조건1]
    낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 60장의 세포배양시트를 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 4일간 배양한다.
  10. 제1항에 있어서,
    하기의 배양조건2로 배양 후 회수된 세포 수는 파종된 세포 수에 대비해 단위면적(㎠) 당 25배 이상인 것을 특징으로 하는 세포배양시트:
    [배양조건2]
    낱장의 가로, 세로가 25㎝×25㎝인 100장의 세포배양시트를 세포배양시트 간에 상하 1㎜ 간격이 되도록 이격시켜 하우징 내부에 고정시킨 뒤 줄기세포가 혼합된 배지를 하우징 내부로 주입 후 하우징을 외기와 밀폐시키고 37℃ 온도조건에 5일간 배양하되, 세포를 파종 한 뒤 24시간 경과 후 1회 줄기세포를 포함하지 않은 동일한 배지로 교체하여 배양한다.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    배양조건1 또는 배양조건2에서 배양 후 회수된 줄기세포의 평균직경은 파종된 줄기세포의 평균직경보다 15% 이상 작은 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양 후 회수된 줄기세포의 평균직경은 18㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 코팅층은 기능성 펩티드와 접착 단백질 간의 융합단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양시트.
  14. 하우징; 및
    상기 하우징 내부에 다수 장의 구비되어 일방향을 따라 소정의 간격을 두고 다단으로 배열되는 제1항에 따른 세포배양시트;를 포함하는 대용량 세포 배양기.
  15. 제14항에 따른 대용량 세포 배양기;
    상기 대용량 세포 배양기의 일 측으로 세포 배양 시 필요한 배지를 공급하는 배지공급장치; 및
    상기 배지를 순환시키기 위한 펌프;를 구비하는 대용량 세포 배양시스템.
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