CN115151631A - 细胞培养基材及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种细胞培养基材。本发明一实施例的细胞培养基材包括：纤维网，由多个纤维聚集而成；以及细胞培养涂层，包括涂膜，上述涂膜连接位于上述纤维网的一个表面的多个纤维中的至少一些纤维之间，上述细胞培养涂层通过功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白实现。据此，尽管包含有助于细胞培养的蛋白质样物质，也可以在常温下长期保存数年，因此具有非常优异的保存稳定性，同时使得有助于细胞培养的物质的活性保持原样或仅略微降低，从而能够以初始设计水平培养细胞。并且，对细胞培养基材具有优异的细胞粘附性，可以稳定地增殖粘附的细胞，因此可以实现高细胞培养效率，从而可广泛应用于干细胞等各种细胞培养。

Description

细胞培养基材及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基材及其制备方法。
背景技术
近年来，随着培养细胞在疾病治疗方面的使用扩大，对细胞培养的兴趣和研究正在增加。细胞培养是从活体中采集细胞并在活体外培养的技术，培养的细胞分化成皮肤、器官、神经等身体的各种组织，然后移植到人体或在分化前状态下移植到人体内，以同时进行移植存活及分化，从而可应用于治疗各种疾病。
哺乳动物细胞的培养是生命科学和健康科学中的众多过程之一。作为用于培养及分析伴随固定-依赖性细胞的哺乳动物细胞的细胞培养基材，多使用例如由高分子聚合物或玻璃制成的孔-板等容器或薄膜等板，但需要额外的表面处理以使细胞粘附到容器或板表面。这种表面处理可以包括例如通过吸附、接枝或等离子体聚合技术在表面上形成吸附层或呈现适当的表面形状。或者，上述表面处理可以通过容器或板表面本身的化学改性，例如大气电晕、射频真空等离子体(radio frequency vacuum plasma)、直流(DC)辉光放电(glow discharge)及微波等离子体处理(microwave plasma treatments)等进行。
另一方面，目前用于培养、分化、交叉分化和重编程包括例如成体干细胞(adultstem cells，ASCs)、多能干细胞(Pluriopotent stem cell)在内的各种干细胞及体细胞的方法通常利用复杂环境，例如细胞外基质蛋白质或其他有助于细胞增殖的多种蛋白质，在固体基材表面上形成涂层，从而形成类似于细胞外基质的微环境，从而培养干细胞。
另一方面，上述涂层是通过简单地用包含上述各种蛋白质的溶液处理容器或板等细胞粘附表面之后干燥而成的，由于涂层内蛋白质的活性稳定性非常低，因此存在涂层形成后在常温下数小时内容易失去活性的问题，进而存在难以预先制备形成涂层的细胞培养基材，即使制备也必须在低温下保存，并且即使在低温下保存，保存天数也非常短，不到30天的问题。并且，由于保存稳定性如此差，因此通常在进行细胞加载工作之前在细胞粘附表面形成涂层，这给细胞细胞培养工作带来不便，并延长细胞培养前的准备时间。
发明内容
技术问题
本发明考虑到如上所述的问题而提出，其目的在于，提供一种如下细胞培养基材及其制备方法：可以在常温下长期保存数年，因此具有非常优异的保存稳定性，即便如此，也使有助于细胞培养的物质的活性保持原样或仅略微降低，从而能够以初始设计水平培养细胞。
并且，本发明的再一目的在于，提供一种如下细胞培养基材及其制备方法：具有优异的细胞粘附性，可以稳定地增殖粘附的细胞，因此可以实现高细胞培养效率。
进一步地，本发明的另一目的在于，提供一种如下细胞培养涂层组合物：能够实现如上所述的优异特性。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明提供一种细胞培养基材，其包括：纤维网，由多个纤维聚集而成；以及细胞培养涂层，包括涂膜，上述涂膜连接位于上述纤维网的一个表面的多个纤维中的至少一些纤维之间，上述细胞培养涂层由功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白形成。
根据本发明的一实施例，上述功能性肽可以具有促进细胞的粘附、迁移、增殖及分化中的一种以上的功能。
并且，上述纤维网可以包含选自由聚苯乙烯(PS)、聚酯、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯及聚丙烯组成的组中的一种以上成分。
并且，上述贻贝粘蛋白可以是选自由序列号1至序列号14的氨基酸序列组成的组中的一种蛋白质，或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的蛋白质。
并且，上述功能性肽可以包含RGD序列。
并且，上述功能性肽可以是选自由序列号15至序列号18的氨基酸序列组成的组中的一种以上肽，或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的肽。
并且，上述细胞培养基材还可包括配置在与上述纤维网的一面相向的另一面的支撑体。
并且，上述纤维网的平均直径可以为200～1000nm，厚度可以为2～20μm，单位面积重量可以为3～20g/㎡。
并且，本发明提供一种细胞培养基材的制备方法，其包括：步骤(1)，准备包含碳二亚胺偶联剂及反应剂的活性溶液和功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白；步骤(2)，将准备的活性溶液与细胞培养用融合蛋白混合来制备细胞培养涂层组合物；以及步骤(3)，用细胞培养涂层组合物处理纤维网表面来形成细胞培养涂层。
根据本发明的一实施例，上述碳二亚胺偶联剂可以为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，上述反应剂可以为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。
并且，上述碳二亚胺偶联剂和反应剂能够以1：0.1～10的重量比包含在活性溶液中，在上述细胞培养涂层组合物中，相对于100重量份的细胞培养用融合蛋白，可以混合1～100重量份的有碳二亚胺偶联剂。
并且，本发明提供一种多孔细胞培养基材用细胞培养涂层组合物，上述细胞培养涂层组合物形成封闭多孔细胞培养基材表面的至少一些气孔的涂膜，其特征在于，上述细胞培养涂层组合物包含功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白、碳二亚胺偶联剂及反应剂。
以下，对本发明所使用的术语进行描述。
本发明的“细胞外基质(extracellular matrix，ECM)”是包围细胞外部的基质，占据细胞与细胞之间，是指具有主要由蛋白质和多糖类组成的网状结构。
发明的效果
根据本发明的细胞培养基材尽管包含有助于细胞培养的蛋白质样物质，也可以在常温下长期保存数年，因此具有非常优异的保存稳定性，同时使得有助于细胞培养的物质的活性保持原样或仅略微降低，从而能够以初始设计水平培养细胞。并且，对细胞培养基材具有优异的细胞粘附性，可以稳定地增殖粘附的细胞，因此可以实现高细胞培养效率，从而可广泛应用于干细胞等各种细胞培养。
附图说明
图1至图2为本发明一实施例的细胞培养基材表面的SEM(扫描电子显微镜)照片。
图3至图4为本发明比较例的细胞培养基材表面的SEM照片及细胞培养结果照片。
图5至图7为在本发明一实施例及比较例的细胞培养基材中培养诱导多能干细胞后拍摄2种标志物(Nanog、Sox2)的表达程度的照片。
图8为在本发明一实施例及比较例的细胞培养基材中，在相同条件下继代培养诱导多能干细胞13次后，使用细胞染色法对第1代和第13代中的培养细胞进行染色，并拍摄是否培养的照片。
图9为在本发明一实施例及比较例的细胞培养基材中培养诱导多能干细胞后，通过每小时培养细胞数量的吸光度测量细胞生长的图表。
图10为在本发明一实施例及比较例的细胞培养基材中继代培养诱导多能干细胞后，拍摄表达第3代和第9代中的Oct4标志物的培养细胞的照片。
图11及图12为在本发明一实施例及比较例的细胞培养基材中培养诱导多能干细胞后，利用流式细胞仪评价表达Oct4标志物的细胞的表达程度的图表。
图13至图15为在对本发明一实施例及比较例的细胞培养基材分别进行1～3个月的加速实验后培养诱导多能干细胞的照片。
图16至图18为在对本发明一实施例及比较例的细胞培养基材分别进行1～3个月的加速实验后培养诱导多能干细胞的照片。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的实施例进行说明，使得本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施。但是，本发明能够以多种不同的方式实现，而不局限于在此所说明的实施例。
根据本发明一实施例的细胞培养基材包括：纤维网，由多个纤维聚集而成；以及细胞培养涂层。
上述纤维网是可使接种的细胞置于其中并增殖的支撑体，为后述细胞培养涂层的待涂布面。上述纤维网具有由多个纤维聚集而成三维网状结构，具体地，每个纤维独立折叠和/或在不确定纤维长度方向的情况下分别排列，通过将它们层叠起来，可以形成结构更复杂、更多样化的三维网状结构。以这种方式形成为复杂多样的内部结构作为含有细胞的增殖所需的营养成分的培养溶液的流路发挥作用，能够将营养成分容易地供给至位于纤维网内部的细胞，防止细胞凋亡，可以提高细胞增殖。
在此情况下，单股纤维内的不同表面之间和/或不同纤维表面之间可能发生粘合或熔敷，由此可以使三维网状结构在结构上更加稳定。
并且，由纤维随机排列并堆积形成的纤维网的表面可以通过表面形态诱导细胞的立体培养。作为表面形态的一例，纤维网表面可能不平坦，可以形成凹凸表面，并且表面粗糙度可能大。纤维网的凹凸的表面形状示例性地包括多个凹部和/或凸部，除了细胞的立体生长效果之外，细胞可以更容易且牢固地置于凸部之间的空间或凹部的槽中，具有能够显着减少置于细胞培养片后脱落的细胞数量的优点。
作为形成上述纤维网的纤维，可以使用用于细胞培养的常规材质而没有限制。例如，上述纤维可以包含选自由聚酯例如聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚碳酸酯；氟类化合物例如聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)等；聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯及聚丙烯组成的组中的一种以上成分。然而，考虑到细胞增殖及回收性，纤维可以包含氟类化合物，可以包含其中的聚偏二氟乙烯(PVDF)。当纤维为PVDF时，不仅具有优异的细胞回收特性，而且可有利于将培养的细胞实现为直径小于接种时的细胞直径。
上述纤维网可以通过纺粘法、熔喷法等公知方法实现为网状，也可以通过电纺丝法实现。并且，上述纤维网由平均直径为10nm～1.5μm的多个纤维形成，单位面积重量可以为1～20g/㎡。若纤维平均直径小于10nm，则机械强度差，并且可能难以制备纤维网。若纤维平均直径超过1.5μm，则纤维网的密度(单位面积重量)变小，并且在热压接时存在纤维网的表面可能形成为如部分熔融的形状的隐患。并且，由于纤维网形态难以实现有利于细胞培养的拓扑结构，因此存在细胞培养效率降低的隐患。并且，若单位面积重量小于1g/㎡，则在制备纤维网时存在不易处理的隐患，若单位面积重量超过20g/㎡，则纤维网可能在压辊中熔融，并且在纤维网与作为后述的单独支撑体的薄膜贴合来实现细胞培养片时，可能难以粘附于薄膜。并且，若不满足纤维直径和纤维网单位面积重量条件，则可能难以实现适合细胞培养的表面形态，并且本发明可能难以实现期望水平的细胞培养效率等。另一方面，为了使纤维网表面实现有利于细胞培养，尤其干细胞的培养的形态，优选地，纤维网的纤维平均直径可以为200～1000nm，厚度可以为2～10μm，单位面积重量可以为3～7g/㎡，由此，提高细胞培养效率的同时，可以将培养的细胞培养成具有比接种时更小的直径，因而有利于培养更年轻、状态更优异的细胞。尤其，若厚度小于2μm，则存在细胞增殖速率可能大幅降低的隐患。并且，若厚度超过10μm，则可能难以在显微镜下观察细胞，因此可能不易观察增殖的细胞。
然后，对设置于上述纤维网上的细胞培养涂层进行说明。
上述细胞培养涂层是提供细胞粘附表面的层，该细胞粘附表面可以使待培养的细胞接种后置于其中并提高增殖。上述细胞培养涂层包含功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白。
参照图1，上述细胞培养涂层包括连接位于纤维网表面的多个纤维中一些纤维之间的空间的涂膜。上述涂膜在纤维网表面各处随机形成，由连接纤维之间的涂膜和位于纤维网表面的多个纤维形成的形态可以为细胞培养创造更有利的环境。并且，由于上述涂膜未完全覆盖纤维网的一个表面，因此可以使培养基向内部流入及流出，由此，可以向置于纤维网表面的细胞供给三维的培养基，从而有利于获得细胞培养的协同效应。
并且，上述细胞培养涂层除了涂膜之外，还可以包括在形成纤维网的多个纤维的一些或全部外部面中至少一些表面上形成的覆盖层。同时，上述涂膜还可以形成为不仅连接位于纤维网表面的纤维，还连接位于纤维网内部的纤维或位于纤维网另一面的多个纤维中一些纤维之间的空间。
包括通过细胞培养用融合蛋白形成且连接纤维之间空间的涂膜的细胞培养涂层具有非常优异的细胞培养效率，同时即使在常温下保存数年以上，也防止或最小化由于形成细胞培养涂层的细胞培养用融合蛋白分解、变性而引起的功能性肽的活性降低，从而具有保存稳定性显著提高的优点。并且，上述细胞培养涂层不使用聚合物类粘合剂成分，例如不是使用丙烯酸粘合剂成分，而是将功能性肽引入到细胞培养基材表面，因此没有细胞毒性，具有细胞细胞更具有生物相容性的优点。
上述细胞培养涂层通过功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白形成，上述功能性肽是一种具有有助于细胞培养的功能的物质，具体地，可以是执行促进细胞的粘附、迁移、增殖及分化中的一种以上功能的物质。作为上述功能性肽，可以使用执行这些功能的公知的肽，而没有限制。作为其非限制性示例，可以包括包含在选自由如下组成的组中的一种以上生长因子(GF)中的预定氨基酸序列：肾上腺髓质素(Adrenomedullin)、血管生成素(Angiopoietin)、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growthfactor)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophagecol ony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growth diff erentiationfactor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growthfactor，HDGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)、角质形成细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)、迁移刺激因子(Migrati on-stimulatingfactor，MSF)、肌肉生长抑制素(Myostatin，GDF-8)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、T-细胞生长因子(T-cell growth factor，TCGF)、神经纤毛蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6及IL-7。或者，可以包括包含在选自由如下组成的组中的一种以上细胞外基质(extracell ular matrix)中的预定氨基酸序列：透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、藻酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘蛋白及层粘连蛋白。
例如，上述功能性肽可以包含氨基酸序列中的RGD序列。并且，上述功能性肽可以是选自由序列号15至序列号18的氨基酸序列组成的组中的一种以上肽或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的肽。并且，上述功能性肽可以是玻连蛋白多肽、胶原多肽、层粘连蛋白多肽、纤连多肽或它们的变异体。
另一方面，上述功能性肽可以是例如具有a～b个氨基酸的肽，由此，即使在常温下以包含在涂层的状态长时间保存，也能够更有利于最小化或防止分解、变形等。
并且，上述功能性肽与贻贝粘蛋白结合，具体地，可以与贻贝粘蛋白的羧基末端、氨基末端或羧基末端和氨基末端这两端结合。在此情况下，上述结合为共价键，具体地，可以是氨基键。另一方面，功能性肽和贻贝粘蛋白可通过公知方法结合，例如，可以通过利用大肠杆菌的重组蛋白生产方法制备。另一方面，贻贝粘蛋白与功能性肽之间可以通过共价键直接结合，但不限于此，需要说明的是，可以通过介导诸如交联剂的预定物质来使贻贝粘蛋白与功能性肽之间间接结合。
将功能性肽与贻贝粘蛋白结合的原因是贻贝粘蛋白有利于将功能性肽固定在基材表面以提高粘附特性，并且如上所述，与上述聚合物基粘合剂成分相比，不会对培养细胞产生毒性，且生物相容性优异。并且，由于与接种的细胞之间的粘附特性优异，因此具有在将接种的细胞置于细胞粘附表面后可以最小化脱落的优点。
上述贻贝粘蛋白是从贻贝衍生的粘蛋白，可以使用统称为贻贝粘蛋白的公知粘蛋白而没有限制。优选地，上述贻贝粘蛋白可以是选自由序列号1至序列号14的氨基酸序列组成的组中的一种蛋白质或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的蛋白质，例如，可以是序列号13。
另一方面，根据本发明一实施例的细胞培养基材还可以包括配置在与上述纤维网的一面相向的另一面的支撑体。作为上述支撑体，可以使用补充纤维网的机械强度的部件而没有限制。例如，上述支撑体可以是织物、编织物、无纺布或薄膜。并且，支撑体的材质优选不影响细胞培养的材质，例如可以是聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺等材质。另一方面，通过支撑体的一部分和/或纤维网的一部分的熔融引起的热熔敷或通过单独的粘合剂，上述支撑体和纤维网可以相互粘附。在此情况下，作为粘合剂，可以使用可以最小化对细胞培养的影响的硅材质粘合剂。
上述细胞培养涂层设置于基材表面的本发明一实施例的细胞培养基材可包括如下步骤来制备：步骤(1)，准备包含碳二亚胺偶联剂及反应剂的活性溶液和功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白；步骤(2)，将准备的活性溶液与细胞培养用融合蛋白混合来制备细胞培养涂层组合物；以及步骤(3)，用细胞培养涂层组合物处理纤维网表面来形成细胞培养涂层。
首先，作为本发明的步骤(1)，执行准备包含碳二亚胺偶联剂及反应剂的活性溶液和功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白的步骤。
上述活性溶液包含碳二亚胺偶联剂和反应剂，还可以包含溶剂。活性溶液作为将细胞培养用融合蛋白引入基材表面的物质，与通过常规方法简单地用细胞培养用融合蛋白处理纤维网表面的情况相比，具有提高细胞培养涂层与细胞培养基材表面之间的粘附力，并且允许形成连接纤维之间空间的涂膜的优点。
作为上述碳二亚胺偶联剂，可以使用允许融合蛋白之间相互结合的偶联剂而没有限制，例如，可以是1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳亚胺盐酸盐(EDC)或N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)。
并且，具备上述反应剂是为了通过防止处于与碳二亚胺偶联剂偶联状态的融合蛋白水合，从而增加融合蛋白相互结合的效率，例如，可以是N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。另一方面，在作为反应剂已知的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的情况下，可能不易于实现本发明的期望效果。
上述活性溶液能够以1：0.1～10的重量比包含上述碳二亚胺偶联剂和反应剂。若不以适当比例包含它们，则难以实现本发明的期望效果，并且存在实现的细胞培养涂层中的细胞的粘附性显着降低的隐患。
并且，为了提高反应性，上述活性溶液还可以包含乙酸钠。在此情况下，相对于100重量份的碳二亚胺偶联剂，上述乙酸钠的含量可以是1～100重量份。
并且，上述活性溶液还可以包含溶剂，上述溶剂可以是水或有机溶剂，例如可以是水。
上述活性溶液的制备方法没有特别限制，但例如，将乙酸钠溶液分别放入碳二亚胺偶联剂溶液和反应剂溶液中，通过混合制备2种溶液后，以适当的比例混合2种溶液，然后诱导反应20～50分钟，然后在28～35℃恒温培养箱中再次反应25～40分钟来制备最终的活性溶液。
然后，作为本发明的步骤(2)，制造将准备的活性溶液与细胞培养用融合蛋白混合来制备细胞培养涂层组合物的步骤。
在此情况下，可以通过调节含量来混合上述细胞培养用融合蛋白和活性溶液，使得相对于100重量份的细胞培养用融合蛋白，包含1～100重量份的碳二亚胺偶联剂。若碳二亚胺偶联剂的含量小于1重量份，则细胞可能无法粘附或可能分化，若超过100重量份，则细胞可能在粘附后脱落，因此可能难以稳定培养细胞。
并且，将准备的活性溶液与细胞培养用融合蛋白混合后诱导反应大于0且小于或等于2小时，即可制备成最终的细胞培养用涂层组合物。
然后，作为本发明的步骤(3)，执行用细胞培养涂层组合物处理纤维网表面来形成细胞培养涂层的步骤。
用准备的细胞培养涂层组合物处理基材表面的方法可以采用常规涂布方法，例如，可以通过利用移液器的分注或浸渍。用细胞培养涂层组合物处理表面后，在25～32℃恒温培养箱诱导反应30分钟～2小时，即可形成细胞培养涂层。
然后，可以进一步进行洗涤工序，例如，可以通过三次蒸馏水重复洗涤工序共2～5次，每次执行3～6分钟。在经过洗涤工序之后，可在空气中自然干燥，即可制备细胞培养基材。
另一方面，随着进行干燥工序，最终制备的细胞培养基材中的细胞培养涂层的水分率可以小于5％，这种特征是随着使用本发明的融合蛋白而表达的效果。即，由于有助于细胞培养的商品化物质在纤维网上处理后无法长期保存，因此在纤维网上处理后通常只能在几天内使用，由此一般不需要在涂布后进行干燥工序。相反，本发明的细胞培养基材可以在常温下长期保存数年，结果，残留在细胞培养涂层中的溶剂或洗涤工序中的洗涤水均蒸发，因此可以表达非常小的水分率。
下表1示出上述贻贝粘蛋白和功能性肽的氨基酸序列。
表1
Figure BDA0003815023290000111
Figure BDA0003815023290000121
Figure BDA0003815023290000131
Figure BDA0003815023290000141
本发明的实施方式
将通过以下实施例对本发明进行更具体的说明，但以下实施例并不用于限制本发明的范围，而是应解释为有助于理解本发明。
实施例1
准备了由平均直径为260nm的PVDF纤维形成，且单位面积重量为4.5g/㎡、厚度为5μm的无菌处理的纤维网。然后，利用移液器将以下准备例中制备的细胞培养涂层组合物分注于纤维网表面，然后在30℃恒温培养箱中反应1小时来在纤维网表面形成细胞培养涂层。然后，利用三次蒸馏水洗涤3次，每次5分钟后，在洁净工作台中打开板盖并在空气中干燥，从而制备细胞培养基材。
*准备例-细胞培养涂层组合物的制备
通过使序列号19的功能性肽与序列号13的贻贝粘蛋白的羧基末端的氨基末端结合来准备了细胞培养用融合蛋白。在此情况下，通过利用大肠杆菌的重组蛋白生产方法制备了融合蛋白。
另一方面，为了准备活性溶液，首先制备溶解在三次蒸馏水中的NaOAc、NaHCO3、2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesu lfonic acid)溶液，然后分别放入分别分注有EDC和Sulfo-NHS试剂的微管中来制备EDC溶液和Sulfo-NHS。
为了制备细胞培养涂层组合物，将EDC溶液放入锥形管中，加入Sulfo-NHS溶液，在搅拌下将细胞培养用融合蛋白放入准备的活性溶液中，然后通过搅拌来制备细胞培养涂层组合物。在此情况下，相对于100重量份的细胞培养用融合蛋白，细胞培养涂层组合物包含1重量份的EDC，EDC和Sulfo-NHS以1：2的重量比混合，相对于100重量份的EDC，涂层组合物中包含的NaOAc的含量为100重量份。在此情况下，细胞培养涂层组合物中的细胞培养用融合蛋白的浓度为0.05㎎/ml。
实施例2
以与实施例1相同的方式实施来制备，但不同之处在于，纤维网由平均直径为500nm的PVDF纤维形成，并使用单位面积重量为5.8g/㎡、厚度为3μm的纤维网制备细胞培养基材。
比较例1
以与实施例1相同的方式实施来制备，但不同之处在于，将未涂布细胞培养涂层组合物的纤维网用作细胞培养基材。
比较例2
以与实施例2相同的方式实施来制备，但不同之处在于，将未涂布细胞培养涂层组合物的纤维网用作细胞培养基材。
实验例1
拍摄实施例1～2及比较例1～2的细胞培养基材表面的SEM照片，其如图1～3所示。
拍摄结果，可以观察到在实施例1～2中，细胞培养涂层包括连接位于表面的多个纤维中的一些纤维之间的涂膜。
比较例3～4
根据相应涂层组合物制造商的方案，通过将作为细胞培养用涂层组合物市售中的Matrigel、Vitronectin-XFTM涂布在比较例1的细胞培养基材中来制备细胞培养基材。
实验例2
将等量的诱导多能干细胞分注到实施例1、比较例3及4的细胞培养基材中，然后在干细胞培养基(StemMACSTM)条件下培养后，观察了是否表达DAPI、NANOG、SOX2、Merge标志物，其结果如图5(实施例1)、图6(比较例3)、图7(比较例4)所示。
从图5至图7可以确认，与市售中的Matrigel、Vitronectin-XF TM相比，实施例1的细胞培养基材具有相似的细胞培养性能，并且NAN OG、SOX2等未分化标志物的表达良好。
实验例3
将等量的诱导多能干细胞分注到实施例1及比较例3的细胞培养基材中，然后在干细胞培养基(StemMACSTM)条件下培养后，针对培养细胞的第1代(P1)和第13代(P13)形态，使用细胞染色法确认细胞是否培养，结果如图8所示。并且，通过吸光度分析确认每小时增殖率，结果如图9所示。并且，通过免疫细胞化学法(Immunocytoche mistry)确认并评价第3代(P3)及第9代(P9)的OCT4标志物的表达，其照片分别如图10所示。并且，在干细胞培养基(StemMACSTM)条件下培养诱导多能干细胞5天后，评价Oct4标志物的表达程度，其结果如图11(实施例1)及图12(比较例3)所示。
从图8可以确认，与作为使用市售中的细胞培养涂层组合物的细胞培养基材的比较例3相比，从第1代和第13代可知，即使长时间培养，实施例1的细胞培养基材的形态也没有差异。
并且，从图9可以确认，实施例1的倍增时间为29.2小时、比较例3的倍增时间为29.0小时，可知在细胞培养效率方面，也表达相似的性能。
并且，从图10可以确认，与作为使用市售中的细胞培养涂层组合物的细胞培养基材的比较例3相比，即使长期培养，实施例1的细胞培养基材在第3代和第9代中也表现出良好的Oct4表达，可知细胞培养性能相似。
并且，从图11及图12可知，当通过实施例1的细胞培养基材培养时，细胞特异性标志物Oct4的表达反而更优异。
比较例5
以与比较例3相同的方式实施来制备，但不同之处在于，通过变更为比较例4的纤维网来制备细胞培养基材。
比较例6
以与比较例4相同的方式实施来制备，但不同之处在于，通过变更为比较例4的纤维网来制备细胞培养基材。
实验例4
通过以下方法，将实施例1、实施例2、比较例3～6的细胞培养基材按照医疗器械保质期和稳定性评价的指南进行加速老化试验，然后培养诱导多能干细胞来评价细胞培养基材的保存稳定性。
具体地，为了在缩短的时间内重现细胞培养基材的实时老化，在高温(60℃)下将细胞培养基材保存0个月、1个月、2个月、3个月，并将细胞培养基材准备为使其老化期为0年、1年、2年、3年。
将等量的诱导多能干细胞分注到每个实施例及比较例中分别准备的3个细胞培养基材中，然后利用干细胞培养基(StemMACSTM)培养5天后,使用细胞染色法染色来确认细胞是否培养，并用光学显微镜进行拍摄，细胞培养结果照片如图13(实施例1)、图14(比较例3)、图15(比较例4)、图16(实施例2)、图17(比较例5)、图18(比较例6)所示。
从图13至图18可知，在实施例1及实施例2的细胞培养基材的情况下，即使将老化期加速至1年、2年、3年，也均可以细胞培养，并且培养性能也很优异。但是在比较例3～比较例6的细胞培养基材的情况下，在将老化期均加速至1年～3年的试片中未培养细胞，由此可知，实施例1的细胞培养基材的保存稳定性及细胞培养性能非常优异。
以上，对本发明的一实施例进行了说明，但本发明的思想不限于本说明书所提出的的实施例，理解本发明思想的本领域技术人员可在相同思想范围内，通过结构要素的附加、变更、删除、增加等可以容易地提出其他实施例，但这也将落入本发明的思想范围内。
序列表
<110> 阿莫生命科学有限公司
<120> 细胞培养基材及其制备方法
<130> SOP115825CN
<150> KR 10-2019-0177073
<151> 2019-12-27
<160> 19
<170> PatentIn version 3.2
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
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Pro Thr Tyr Lys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 3
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
50 55 60
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 4
Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 5
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Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys
20 25 30
Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
35 40 45
Glu Phe Glu Phe
50
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 6
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1 5 10 15
Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp
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Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 7
Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His
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Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His
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Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val
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Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
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Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
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50 55 60
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65 70 75
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
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<220>
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<400> 10
Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr
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Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr
35 40 45
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50 55 60
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<213> 人工序列
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<223> 贻贝粘蛋白
<400> 11
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Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 12
Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser
1 5 10 15
Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg
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Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys
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Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn
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Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg
85 90 95
Ser Gly Tyr
<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 13
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Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
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Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
165 170 175
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
180 185 190
Tyr Lys
<210> 14
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白
<400> 14
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
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Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
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Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
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Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys
195
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性肽与
<400> 15
Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
1 5 10 15
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性肽与
<400> 16
Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性肽与
<400> 17
Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性肽与
<400> 18
Arg Gly Asp
1
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性肽与
<400> 19
Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
1 5 10 15
Gly Asp Ser Pro
20

Claims (12)

1.一种细胞培养基材，其特征在于，包括：
纤维网，由多个纤维聚集而成；以及
细胞培养涂层，包括涂膜，上述涂膜连接位于上述纤维网的一个表面的多个纤维中的至少一些纤维之间，上述细胞培养涂层由功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白形成。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，上述功能性肽具有促进细胞的粘附、迁移、增殖及分化中的一种以上的功能。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，上述纤维网包含选自由聚苯乙烯、聚酯、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯及聚丙烯组成的组中的一种以上成分。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，上述贻贝粘蛋白为选自由序列号1至序列号14的氨基酸序列组成的组中的一种蛋白质，或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，上述功能性肽包含RGD序列。
6.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，上述功能性肽为选自由序列号15至序列号18的氨基酸序列组成的组中的一种以上肽，或连接有选自上述组中的一种以上的氨基酸序列的肽。
7.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，还包括配置在与上述纤维网的一面相向的另一面的支撑体。
8.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其特征在于，
上述纤维网的平均直径为200～1000nm，厚度为2～20μm，单位面积重量为3～20g/m2。
9.一种细胞培养基材的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(1)，准备包含碳二亚胺偶联剂及反应剂的活性溶液和功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白；
步骤(2)，将准备的活性溶液与细胞培养用融合蛋白混合来制备细胞培养涂层组合物；以及
步骤(3)，用细胞培养涂层组合物处理纤维网表面来形成细胞培养涂层。
10.根据权利要求9所述的细胞培养基材的制备方法，其特征在于，上述碳二亚胺偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺，上述反应剂为N-羟基磺基琥珀酰亚胺。
11.根据权利要求9所述的细胞培养基材的制备方法，其特征在于，
上述碳二亚胺偶联剂和反应剂以1：0.1～10的重量比包含在活性溶液中，
在上述细胞培养涂层组合物中，相对于100重量份的细胞培养用融合蛋白，混合1～100重量份的碳二亚胺偶联剂。
12.一种多孔细胞培养基材用细胞培养涂层组合物，上述细胞培养涂层组合物形成封闭多孔细胞培养基材表面的至少一些气孔的涂膜，其特征在于，上述细胞培养涂层组合物包含功能性肽与贻贝粘蛋白结合的细胞培养用融合蛋白、碳二亚胺偶联剂及反应剂。
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