CN117964785A - 重组胶原贻贝粘蛋白及其表达方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组胶原贻贝粘蛋白及其表达方法和应用。所述重组胶原贻贝粘蛋白由胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段（A）和贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段（B）重组而成，其序列特征是ABA或者BAB，所述胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了提供的重组胶原贻贝粘蛋白具有高粘合性、良好生物兼容性和创口修复功能，且无致敏源性，可应用于制作角膜或结膜手术的医用生物粘合剂、皮肤修复中的喷涂剂和化妆品原料。
Description
技术领域
本发明涉及核苷酸工程技术领域，特别涉及一种重组胶原贻贝粘蛋白及其表达方法和应用。
背景技术
贻贝是一种广泛分布于沿海和近海的甲壳类海洋生物，一种海洋软体动物，属于双壳贝类，俗称“青口”和“淡菜”，遍布世界各沿海国家。贻贝种类繁多，经济价值较高，其中紫贻贝、翡翠贻贝和后壳贻贝是主要的养殖品种。贻贝富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、核黄素、烟酸等营养元素，而且具有很高的药用价值。
天然的贻贝粘蛋白是从贻贝中提取得到。贻贝粘蛋白（mussel adhesiveprotein，MAP），也称为贻贝足丝蛋白，是海洋贻贝足丝腺分泌的一类能够在水环境中牢固粘附于礁石、船体等不同材料表面的复合蛋白簇，不仅具有高强度、高韧性、极强的防水性和广泛的基材粘附性，还具有良好的生物相容性和可降解性。贻贝粘蛋白富含赖氨酸，在生理pH值下带正电荷，可以促进细胞的爬行和替代，促进创面或溃疡面愈合，形成微观生物膜，保护创面免受外界细菌感染，且其贻贝粘蛋白不易引起人体的免疫反应，生物相容性好。
然而，天然的贻贝粘蛋白产量极低，成本昂贵，难以满足工业需求。目前，已经研究并鉴定至少13种贻贝粘蛋白，包括8种粘性蛋白，即MAP-1、MAP-2、MAP-3F、MAP-3S、MAP-4、MAP-5、MAP-6、MAP-7，以及5种足丝纤维骨架蛋白，即preCOL-D、preCOL-P、preCOL-NG、PTMP-1和TMP-1。其中，MAP-5的生物活性物质多巴含量最高，约30%，其次MAP-3生物活性物质多巴含量约20%，MAP-1生物活性物质多巴含量约10%。科学家尝试用大肠杆菌表达重组贻贝粘蛋白，主要是I型贻贝粘蛋白（MAP-1），但DOPA含量低，无生物活性，无法进行临床或商业应用。科学家用大肠杆菌成功表达重组贻贝粘蛋白（I型，III型，V型，IVI型等），其虽然有生物活性，但仍面临包涵体表达，产量低，成本高昂，不适合大规模生产等问题，限制了其在一些应用领域的推广和使用。现有的重组贻贝粘蛋白仍有改进空间。
而胶原蛋白是生物高分子是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，其在医疗器械和医疗美容等领域具有广泛应用，同时与人体细胞有良好的生物兼容性。然而，目前胶原蛋白仅作为“填充”材料，发挥了“支架”基础功能，但缺少细胞牵引，组织修复，湿环境黏附等功能，无法有效用于组织修复，缝合等场合。
如何提供一种兼具胶原蛋白与贻贝粘蛋白的优点的新蛋白成为一个新的研究方向。
发明内容
现有技术中，如何提供一种兼具胶原蛋白与贻贝粘蛋白的优点的新蛋白成为一个新的研究方向，因此，本发明提供一种重组胶原贻贝粘蛋白及其表达方法和应用于解决上述问题。
第一方面，本发明提供了一种重组胶原贻贝粘蛋白，所述重组胶原贻贝粘蛋白由胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段（A）和贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段（B）重组而成，其序列特征是ABA或者BAB。所述胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实现方式中，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实现方式中，编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实现方式中，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实现方式中，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一种实现方式中，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一种实现方式中，编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
第二方面，本发明还提供了一种表达重组胶原贻贝粘蛋白的重组载体，所述重组载体包括初始载体和编码上述的重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸，所述初始载体为大肠杆菌或酵母。
第三方面，本发明还提供了一种重组胶原贻贝粘蛋白的表达方法，用于表达上述的重组胶原贻贝粘蛋白，其包括以下具体步骤：
S1、编码核苷酸序列：编码重组胶原贻贝粘蛋白的多肽的核苷酸序列；
S2、构建重组载体：将上述核苷酸序列与原始载体进行重组，获得重组载体；
S3、表达：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
第四方面，本发明还提供了上述的重组胶原贻贝粘蛋白在制备医用生物粘合剂、喷涂剂和/或化妆品产品中的应用。
有益效果：本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白将胶原蛋白和贻贝粘蛋白序列相结合，得到新的蛋白，使其兼具胶原蛋白与贻贝粘蛋白的优点，具有高粘合性、良好生物兼容性和创口修复功能，且无致敏源性，可应用于制作角膜或结膜手术的医用生物粘合剂、皮肤修复中的喷涂剂和化妆品原料。
附图说明
图1是本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白对上皮细胞粘附的影响对比图，其中图1中的a)为细胞形貌观察图，图1中的b)为定量分析图；
图2是采用本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白处理和未处理的材料表面细胞形貌观察对比图；
图3是采用本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白处理和未处理的材料表面细胞活性评估对比图；
图4是本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白溶液皮肤刺激性评估对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”，或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供一种重组胶原贻贝粘蛋白，所述重组胶原贻贝粘蛋白由胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段（A）和贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段（B）重组而成，其序列特征是ABA或者BAB。
其中，所述胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段序列为：
MSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS，如SEQ ID NO.1所示。
所述贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段的序列为：
MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG，如SEQ IDNO.2所示。
实施例1、
本实施例中，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列为：
MSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSMMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGMSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS，如SEQ IDNO.3所示。
编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列为：
ATGAGCAGCGAAGAATATAAAGGTGGCTACTATCCGGGCAATACCTACCATTATCATAGCGGCGGCAGCTACCATGGCAGCGGCTACCATGGTGGCTACAAAGGTAAATATTATGGCAAAGCGAAAAAATATTACTATAAATACAAAAACAGCGGTAAATATAAATATCTGAAAAAAGCGCGCAAATATCATCGCAAAGGCTATAAAAAATATTATGGCGGCGGCAGCAGCATGATGAGCTTTGTTCAGAAAGGTAGCTGGCTGTTGCTGGCCCTGCTGCATCCGACCATTATTCTGGCGCAGCAGGAAGCGGTGGAAGGCGGCTGCTCCCACCTGGGCCAGAGCTATGCGGATCGCGATGTGTGGAAACCGGAACCGTGCCAGATTTGCGTGTGTGACAGCGGCTCAGTGCTGTGCGATGATATTATTTGTGATGATCAAGAACTGGATTGCCCGAATCCGGAAATTCCGTTTGGTGAATGCTGTGCCGTTTGTCCGGGCCCGCAGGGCCCGCGTGGCGATAAAGGTGAGACCGGCGAACGTGGCGCAGCCGGCATCTGCGGCGGTGTGGGCGCGGCGGCCATTGCGGGCATTGGCGGCGAAAAAGCCGGCGGTTTTGCCCCGTATTACGGTATGAGCAGCGAAGAATATAAAGGCGGCTACTATCCGGGCAACACCTATCATTATCATAGCGGTGGCAGCTATCATGGCAGCGGCTACCATGGCGGCTATAAAGGCAAATATTACGGCAAAGCGAAAAAATATTACTATAAATATAAAAACAGCGGCAAATACAAATATCTGAAAAAAGCCCGCAAATATCATCGCAAAGGCTACAAAAAATACTACGGCGGCGGCAGCAGCTAA，如SEQ ID NO.4所示。
需要说明的是，SEQ ID NO.4序列仅为表达上述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列的一个示例，任何能表达上述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列均为本发明所公开的范围。后续的实施例中的核苷酸序列也仅为表达重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列的一个示例。
实施例2、
所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列为：
MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGMSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS，如SEQ IDNO.5所示。
编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列为：
ATGATGAGCTTTGTTCAAAAAGGCAGCTGGCTGCTGCTGGCGCTGCTGCATCCGACCATTATTCTGGCCCAGCAGGAAGCGGTGGAAGGCGGCTGTAGCCATCTGGGCCAGAGCTATGCGGATCGCGATGTTTGGAAACCGGAACCGTGCCAGATTTGCGTTTGTGATAGCGGTAGCGTGCTGTGCGATGATATTATTTGCGATGATCAGGAACTGGATTGCCCGAATCCGGAAATTCCGTTTGGCGAATGCTGCGCGGTGTGCCCGGGCCCGCAGGGCCCGCGTGGCGATAAAGGCGAAACCGGCGAACGTGGCGCGGCCGGCATTTGCGGCGGCGTGGGCGCGGCGGCGATTGCCGGCATCGGTGGCGAAAAAGCGGGTGGCTTCGCCCCGTATTATGGCATGAGCAGCGAAGAATACAAAGGCGGCTATTACCCGGGCAATACCTATCATTACCACTCAGGCGGCTCATATCACGGCAGCGGCTATCATGGCGGCTATAAAGGTAAATACTATGGCAAAGCCAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACAGCGGCAAATACAAATACCTGAAAAAAGCGCGCAAATACCATCGTAAAGGCTATAAAAAATATTACGGTGGCGGCAGCAGCTAA，如SEQ ID NO.6所示。
实施例3、
所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列为：
MSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSMMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG，如SEQ IDNO.7所示。
编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列为：
ATGAGCAGCGAAGAATACAAAGGTGGCTACTATCCGGGCAATACCTACCATTATCATAGCGGCGGCAGCTACCATGGCAGTGGCTATCACGGCGGCTACAAAGGCAAATACTACGGCAAAGCGAAAAAATATTATTACAAATACAAAAACAGCGGTAAATATAAATACCTGAAAAAAGCGCGCAAATATCATCGCAAAGGCTACAAAAAATACTATGGTGGCGGCAGCAGCATGATGAGCTTTGTGCAGAAAGGTAGCTGGCTGCTGCTGGCACTGCTGCATCCGACCATTATTCTGGCGCAGCAGGAGGCGGTGGAAGGTGGCTGCAGCCATCTGGGTCAGAGCTATGCGGATCGTGATGTGTGGAAACCGGAACCGTGTCAGATTTGCGTGTGTGATAGCGGCAGCGTGCTGTGCGATGATATTATTTGCGATGATCAGGAACTGGATTGTCCGAATCCGGAAATTCCGTTTGGCGAATGTTGTGCGGTGTGCCCGGGCCCGCAGGGCCCGCGCGGCGACAAAGGCGAAACCGGCGAACGCGGCGCCGCCGGCATTTGCGGCGGCGTGGGCGCGGCGGCGATTGCCGGCATTGGCGGCGAAAAAGCGGGCGGCTTCGCGCCGTACTATGGCTAA，如SEQ ID NO.8所示。
实施例4、
所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列为：
MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGMSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSMMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPGPQGPRGDKGETGERGAAGICGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG，如SEQ ID NO.9所示。
编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列为：
ATGATGAGCTTTGTGCAGAAAGGCAGCTGGCTGCTGCTGGCCCTGCTGCATCCGACCATTATTCTGGCCCAGCAGGAAGCCGTGGAAGGCGGCTGCAGCCATCTGGGCCAGAGCTATGCGGATCGTGATGTATGGAAACCGGAACCGTGTCAGATTTGTGTCTGCGATAGCGGCAGCGTGCTGTGCGATGATATTATTTGCGATGATCAGGAACTGGATTGCCCGAATCCGGAAATTCCGTTTGGCGAATGTTGCGCCGTGTGCCCGGGCCCGCAGGGCCCGCGCGGCGATAAAGGCGAAACCGGCGAACGTGGCGCGGCGGGCATTTGCGGCGGCGTGGGCGCCGCGGCAATTGCGGGCATTGGCGGCGAAAAAGCCGGTGGCTTCGCGCCGTATTACGGCATGTCAAGCGAAGAATATAAAGGCGGCTATTACCCGGGCAACACCTATCACTATCACAGCGGCGGCAGCTATCACGGCAGCGGCTACCACGGTGGCTATAAAGGCAAATATTATGGCAAGGCGAAAAAATACTACTATAAATATAAAAATAGCGGCAAATACAAATATCTGAAAAAAGCCCGCAAATATCACCGTAAAGGCTACAAAAAATACTACGGCGGCGGGTCAAGCATGATGAGCTTTGTTCAGAAAGGGAGCTGGCTGCTGCTGGCGCTGCTGCACCCGACCATTATTCTGGCCCAACAGGAAGCGGTTGAAGGCGGCTGCAGCCACCTGGGCCAGAGCTATGCCGATCGCGATGTGTGGAAACCCGAACCGTGCCAGATTTGCGTGTGCGACAGCGGTAGCGTTCTGTGTGATGACATTATTTGCGATGATCAGGAACTGGACTGCCCGAACCCGGAAATTCCGTTCGGCGAATGCTGTGCCGTGTGCCCGGGCCCGCAGGGCCCGCGTGGTGATAAAGGCGAAACCGGCGAACGCGGCGCGGCGGGCATCTGCGGCGGCGTCGGCGCGGCGGCGATTGCCGGCATCGGCGGCGAAAAAGCGGGCGGTTTTGCGCCGTATTATGGCTAA，如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供一种表达重组胶原贻贝粘蛋白的重组载体，所述重组载体包括初始载体和上述的编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸，所述初始载体为大肠杆菌或酵母。
本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白的表达方法，其包括以下具体步骤：
S1、编码核苷酸序列：编码重组胶原贻贝粘蛋白的多肽的核苷酸序列；
S2、构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列与原始载体进行重组，获得重组载体；
S3、表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
实施例5、
本实施例中以实施例1中的重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列为例，编码重组胶原贻贝粘蛋白的多肽的核苷酸序列，选择毕赤酵母为原始载体，在超净工作台中，挑取生长均一的单克隆，进行发酵。发酵过程中的材料包括：YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）培养基；1% Yeast Extract（酵母提取物） ，2% Peptone（蛋白胨） ，2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），发酵后收集培养液，加入硫酸铜和酪氨酸酶进行酶促反应，过镍柱，洗脱，透析，得到所述重组胶原贻贝粘蛋白。
其中，重组载体（含有上述核苷酸序列）的构建、转化，以及阳性重组毕赤酵母（即重组III型贻贝粘蛋白毕赤酵母基因工程菌）的筛选均参考《毕赤酵母表达操作手册》。重组III型贻贝粘蛋白毕赤酵母基因工程菌作为一级种子在发酵罐进行发酵表达所涉及一级种子培养的培养基及具体培养条件、发酵的培养基及具体培养条件均参考《毕赤酵母发酵手册》。
具体的，本实施例提供的重组胶原贻贝粘蛋白的表达方法，其包括以下具体步骤：
接种毕赤酵母（Pachia pastoris）到50ml YPD培养基中，在30℃培养箱培养2~4天。挑取直径约为2~3 mm的单克隆于4~5 mL YPD液体培养基中，180 rpm、30℃培养约8 h，转移至50 mL YPD液体培养基中过夜培养，直至OD600≈0.45。室温750 g离心6 min，完全弃尽上清，无菌水35 mL重悬菌体，重复一次该步骤，用现配的2 mL 1.1×TE/LiAc重悬菌体，在室温下750 g离心6 min，弃尽上清，重悬菌体于500ul 100mM LiCl溶液中，按每管100 μL分装，立即进行转化。
取100μL酵母感受态细胞，加入目的质粒4μg，载体DNA（如SEQ ID NO.4所示）10 μL进行98℃的金属浴6 min，迅速置于冰上2~3 min，重复一），PEG/LiAc 500 μL，用移液器轻轻吸打几次混匀。进行30℃水浴30 min（每10 min时翻转10~12次混匀）。进行42℃水浴15min（每7.5 min时翻转10~12次混匀）。在室温下5500 rpm离心6 min，弃尽上清。用ddH2O400 μL重悬菌体，离心30 s，弃尽上清。用ddH2O 45 μL重悬菌体，取35~50 μL悬液涂布于含有相应缺素的培养基上，30℃倒置培养72~96小时。
对筛选获得的重组III型贻贝粘蛋白基因工程菌进行发酵，以无机盐BSM培养基作为底料，控制pH 5.0、温度29.0°C，溶氧控制在30％，当发酵罐(100L)内菌体湿重达180~200mg/mL时开始甲醇诱导，同时添加100 μM的硫酸铜和10 μM的抗坏血酸发酵诱导40~50小时后将发酵液放罐。
发酵结束后发酵液体积59 L，经高速离心机以4000 rpm离心15 min，弃去沉淀，收集上清液，上清液体积36 L；将收集的上清液，经0.45μm中空纤维过滤设备过滤澄清，截留液用30 L纯化水稀释过滤，回收残留目标蛋白，收集滤出液，滤出液体积62 L；将收集的滤出液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率0.46 mS/cm，收集截留液，截留液体积2 L，浓缩倍数为31；向收集的截留液中加入0.0455 g/L硫酸铜和2146.5 EU/L的酪氨酸酶，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调pH至7.4，以200 rpm持续搅拌4h进行酶促反应；向酶促反应液中加入125 g/L氯化钠，并用柠檬酸调溶液pH至3.8，上样至经含130 g/L氯化钠的水溶液平衡好的苯基疏水层析柱进行纯化，上样并再平衡后，用含80 g/L氯化钠的水溶液进行洗脱，收集洗脱液4.5 L，用0.1摩尔氢氧化钠溶液清洗层析柱，清洗液取样进行电泳检测；将收集的洗脱液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率88μS/cm，收集截留液进行冷冻干燥，获取所述重组胶原贻贝粘蛋白52.36 g。每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.887 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.6%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.98%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
验证实验1、
本验证实验1中采用实施例5中制得的重组胶原贻贝粘蛋白进行细胞粘附实验，对经过所述重组胶原贻贝粘蛋白处理和未经处理的材料表面接种上皮细胞，接种1小时和4小时后进行形貌观察，以及细胞铺展率量化分析。如图1所示，图1是本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白对上皮细胞粘附的影响对比图，其中图1中的a)为细胞形貌观察图，图1中的b)为定量分析图。从图中可知，经过所述重组胶原贻贝粘蛋白处理的材料表面，其细胞粘附和铺展速率显著高于未经处理表面。表明本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白具有促细胞粘附性。
验证实验2、
本验证实验2中采用实施例5中制得的重组胶原贻贝粘蛋白进行扫描电子显微镜观察。图2是采用本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白处理和未处理的材料表面细胞形貌观察对比图，通过扫描电子显微镜观察下不同材料表面细胞的形貌，得到经过胶原贻贝粘蛋白处理后的表面上细胞铺展更充分且有更多伪足伸展。表明本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白具有良好的生物兼容性。
验证实验3、
本验证实验3中采用实施例5中制得的重组胶原贻贝粘蛋白进行细胞活性评估，对经过所述重组胶原贻贝粘蛋白处理和未经处理的材料表面接种上皮细胞，在细胞接种1天和3天后，对比其细胞活性。图3是采用本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白处理和未处理的材料表面细胞活性评估对比图，从图3可知，经过胶原贻贝粘蛋白处理的材料表面均具有显著提高的细胞活性。表明本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白具有较高的生物活性。
从验证实验1-3表明，本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白能够促进创面愈合，具有皮肤修复能力，可应用于制作角膜或结膜手术的医用生物粘合剂和/或皮肤修复中的喷涂剂。
验证实验4、
本验证实验4中采用实施例5中制得的重组胶原贻贝粘蛋白进行皮肤刺激性实验，采用生理盐水和胶原贻贝粘蛋白溶液对皮肤持续刺激4小时后去除敷贴片，观察结果。图4是本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白溶液皮肤刺激性评估对比图。从图4可知，两组皮肤在1小时及24小时后观察并无红斑和水肿发生。表明本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白对皮肤无刺激性。
综上所述，本发明提供的重组胶原贻贝粘蛋白将胶原蛋白和贻贝粘蛋白序列相结合，得到新的蛋白，使其兼具胶原蛋白与贻贝粘蛋白的优点，具有高细胞粘附性、良好生物相容性和创口修复功能，且无致敏源性，可应用于制作角膜或结膜手术的医用生物粘合剂、皮肤修复中的喷涂剂和化妆品原料。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，所述重组胶原贻贝粘蛋白由胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段（A）和贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段（B）重组而成，其序列特征是ABA或者BAB；所述胶原蛋白Ⅲ型的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述贻贝粘蛋白5型的氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求1所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，所述重组胶原贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
7.根据权利要求6所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其特征在于，编码所述重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
8.一种表达重组胶原贻贝粘蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括初始载体和编码权利要求1~7任意一项所述的重组胶原贻贝粘蛋白的核苷酸，所述初始载体为大肠杆菌或酵母。
9.一种重组胶原贻贝粘蛋白的表达方法，其特征在于，用于表达权利要求1~7任意一项所述的重组胶原贻贝粘蛋白，其包括以下具体步骤：
S1、编码核苷酸序列：编码重组胶原贻贝粘蛋白的多肽的核苷酸序列；
S2、构建重组载体：将上述核苷酸序列与原始载体进行重组，获得重组载体；
S3、表达：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
10.重组胶原贻贝粘蛋白在制备医用生物粘合剂、喷涂剂和/或化妆品产品中的应用，其特征在于，采用权利要求1~7任意一项所述的重组胶原贻贝粘蛋白。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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