KR20210132589A

KR20210132589A - 세포 배양 지지체를 사용하여 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20210132589A
Application number: KR1020210018704A
Authority: KR
Inventors: 김대성; 전병민; 연규범
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2021-11-04
Also published as: KR102562416B1; KR102590924B1; KR20210132588A

Abstract

본 발명은 세포 배양 지지체를 사용하여 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법에 관한 것으로 상기 방법을 사용하면 기존에 사용되던 세포외 기질에서 분화시키는 방법과 비교하여 줄기세포로부터 신경 전구세포 분화 효율을 현저히 향상시킬 수 있으며, 분화된 신경 전구세포는 신경세포로의 분화 능력을 유지하므로 추가로 다양한 신경세포를 분화시킬 수 있다.

Description

세포 배양 지지체를 사용하여 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법{METHOD FOR DIFFERENTIATING NEURAL PRECURSOR FROM STEM CELLS USING CULTURING SCAFFOLD}

본 발명은 세포 배양 지지체를 사용하여 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법에 관한 것으로 상기 세포 배양 지지체는 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체에 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드가 결합된 것이다.

인간 배아 줄기세포 (human embryonic stem cells, hESC)에서 파생된 신경 전구세포 (neural precursor, NP)는 고도로 증식하며 중추 신경계의 세 가지 유형의 세포 (뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포)를 생성할 수 있다. 신경 전구세포는 척추 운동 뉴런 및 중뇌 도파민성 뉴런과 같이 중추 신경계의 특정 영역에서 발견되는 특정 신경 세포를 형성하도록 조절될 수 있다(비특허문헌 1). 이는 태아 및 성인 조직의 신경 줄기세포에서는 거의 볼 수 없는 인간 배아 줄기세포에서 파생된 신경 전구세포의 독특한 특성으로, 따라서 인간 배아 줄기세포 유래 신경 전구세포는 생의학 응용 분야에서 매우 중요한 자원이다.

이에 인간 배아 줄기세포로부터 신경 전구세포를 유도하는 기술이 집중적으로 개발되었으며, 대표적으로 "이중 SMAD 억제"라는 방법이 있다. 이 방법은 골 형성 단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 및 전환 성장 인자-β (transforming growth factor-β, TGF-β) 신호와 같이 신경 외배엽 발달을 억제하는 세포 신호를 동시에 억제하여 인간 배아 줄기세포로부터 신경 분화의 효율성을 향상시키는 방법이다 (비특허문헌 2). 이 방법은 기존에 제안되었던 어떤 방법들보다도 더 높은 수율(> 80%; 최종 신경전구세포 마커인 SOX1 (SRY-Box Transcription Factor 1) 발현 세포 기준)로 신경전구세포를 생산하므로 현재 가장 널리 사용되고 있다.

이중 SMAD 억제와 같은 세포신호전달기전 조절을 통한 분화 전략과 별개로, 최근에는 신경 유도에 대한 세포외 기질의 영향이 연구되기 시작하였고, 그 결과 세포외 기질의 나노 구조를 모방한 합성 나노섬유가 인간 배아 줄기세포의 신경 분화를 향상시키는 연구 결과들이 보고되었다(비특허문헌 3). 일반적으로 다양한 생체적합성 소재로 제작된 나노섬유의 생화학적, 물리학적 특성은 줄기세포의 유전자 발현에 직접적인 변화를 주어 부착, 분열 및 분화와 같은 줄기세포의 거동에 많은 영향을 준다고 알려져 있다. 줄기세포를 신경전구세포로의 분화에 사용하기 위해서는 나노섬유 제작을 위한 원재료의 선택, 성상의 디자인, 그리고 세포 부착을 향상시킬 수 있는 여러 조건의 최적화가 선행되어야 한다.

하지만, 이미 기술 성숙도가 매우 높은 수준에 도달한 기존의 신경전구세포 분화법(이중 SMAD 억제 방법)이 있음을 고려하면 새로이 개발될 세포외 기질을 사용한 분화 효율이 기존 기술의 분화 효능을 능가해야 함은 자명해 보인다. 그러나 아직까지 기존 기술의 효과를 더 증진시키는 세포외 기질의 개발은 보고된 바 없다.

1. Kriks et al., 2011, Nature 480:547-551. 2. Chambers et al., 2009, Nat Biotechnol 27:275-280. 3. KarbalaeiMahdi et al., 2017, Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 78:1195-1202.

상기와 같은 상황에서 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포로부터 신경 전구세포 분화를 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 연구한 결과, 일정 직경의 나노섬유로 이루어진 지지체에 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드를 결합시킨 세포 배양용 지지체를 제조하였고, 이 세포 배양용 지지체를 사용하면 인간 배아 줄기세포로부터 신경 전구세포를 효율적으로 분화시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 세포 배양용 지지체를 사용하여 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은

(a) 세포 배양용 지지체에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및

(b) 배양된 줄기세포를 신경 전구세포로 분화를 유도하는 단계;를 포함하는 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 신경 전구세포 분화 방법은 상기 세포 배양용 지지체에서 줄기세포를 배양하는 것이 기술적 특징으로 상기 세포 배양용 지지체는

(i) 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체; 및

(ii) 상기 나노섬유에 결합된 홍합 접착 단백질(mussel adhesive protein)과 서열번호 1로 표시되는 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드;를 포함한다.

본 발명에서, "지지체(scaffold)"란 세포를 부착시켜 배양하기 위한 구조체를 말하며, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 역할을 하여 세포가 생장할 수 있는 환경을 제공한다.

본 발명에서, 상기 지지체는 생체적합성 나노섬유로 이루어지며, 생체적합성 나노섬유를 전기방사하여 제조하는 방법 또는 당업계에 알려진 다른 방법으로 제조될 수 있다. 전기방사 방법은 나노섬유의 직경을 자유롭게 조절할 수 있고, 나노섬유 사이에 기공이 형성되어 나노섬유 코팅이 용이한 장점이 있다.

본 발명에서, "생체적합성 나노섬유"란 생체적합성 물질로 제조된 나노섬유를 말하며, 생체적합성 물질은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 물질을 말한다.

본 발명에서, 상기 생체적합성 물질은 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV) 및 폴리비닐알코올(PVA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 PVDF일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 생체적합성 물질인 PVDF 용액을 전기방사하여 PVDF 나노섬유로 이루어진 지지체를 제조하였으며, PVDF 지지체에 홍합 접착 단백질과 펩타이드의 융합 펩타이드(VNm)를 결합시켜 세포 배양용 지지체를 제작하였다 (도 1의 A).

본 발명에서, 상기 생체적합성 나노섬유는 직경이 100 내지 1000 ㎚일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 800 ㎚, 더욱 바람직하게는 150 내지 800 ㎚일 수 있다.

또한, 본 발명에서 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체는 두께가 1 내지 10 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 8 ㎛, 더욱 바람직하게는 2 내지 6 ㎛일 수 있다.

본 발명에서 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체는 나노섬유 사이에 기공이 존재한다. 이 기공은 크기가 0.2 내지 2.0 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 1.8 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1.7 ㎛일 수 있다.

PVDF 지지체는 소수성 특성으로 인해 줄기세포 부착이 제한적인 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 줄기세포 부착 정도를 개선하기 위해 PVDF 지지체에 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드(VNm)를 결합시켜 줄기세포 배양용 지지체를 제조하였다.

홍합 접착 단백질(mussel adhesive protein, MAP)은 홍합이 파도와 부력을 이겨내고 바위 위에 붙어 있을 수 있도록 돕는 단백질이며, 현재까지 홍합 접착 단백질에서 3종의 콜라겐 단백질과 6종의 fp(족사 단백질, Foot protein)가 발견되었다. 홍합 단백질 접착제의 주된 연구 대상은 최초로 발견된 족사 단백질인 fp-1으로 습한 환경에서의 홍합 접착에 주요 역할을 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 홍합 접착 단백질은 서열번호 4로 표시되는 MAP 펩타이드, 비트로넥틴에서 유래한 펩타이드는 서열번호 1 (KGGPQVTRGDVFTMP)로 표시되는 아미노산 서열을 사용하였다. 상기 MAP 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 fp-5 펩타이드의 양 말단에 서열번호 2(AKPSYPPTYK)로 표시되는 fp-1 펩타이드가 6번 반복되는 구조이다 (표 1). 또한, 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 홍합 접착 단백질(MAP 펩타이드)과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 연결은 당업계에 알려진 펩타이드 결합 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 4와 서열번호 1의 아미노산 서열을 펩타이드 결합, 화학적 결합 등으로 연결시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명자들은 융합 펩타이드 코딩 서열을 플라스미드에 도입하고, 이 플라스미드를 대장균에서 발현시켜 융합 펩타이드(VNm)를 수득하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합 펩타이드(VNm)는 화학 가교를 통해 PVDF 지지체에 결합될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에서는 PVDF 지지체에 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS)를 처리하여 펩타이드와 결합할 수 있는 작용기를 생성시키고, 이후 융합 펩타이드와 반응시켜 PVDF 지지체에 융합 펩타이드를 결합된 VNm-PVDF 지지체를 제조하였다. PVDF 지지체에 결합되는 융합 펩타이드의 양은 PVDF 지지체와 융합 펩타이드를 반응시킬 때 융합 펩타이드의 농도, 반응 시간을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.

본 발명에서, 상기 줄기세포는 전분화능 줄기세포일 수 있고, 상기 전분화능 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포일 수 있으며, 배아 줄기세포, 구체적으로 인간 배아 줄기세포인 것이 바람직하다. 상기 "전분화능(pluripotent)"이란 피부세포, 심근세포, 생식세포 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 줄기세포의 특성을 말한다. 줄기세포의 전분화능 유지 여부는 당업계에 알려진 전분화능 마커의 발현 여부를 확인하여 판단할 수 있다.

본 발명에서, "분화(differentiation)"란 한 세포가 특정한 구조나 기능을 갖는 세포로 변화하는 것을 말하며, 예를 들어 전분화능을 갖는 줄기세포가 피부세포, 심근세포, 신경세포 등으로 변하는 것도 분화의 일종이다.

본 발명에서, 상기 (a) 단계는 세포사멸을 방지하기 위해 Y-27632, Y-30141, Y-33075 및 Y-39983으로 이루어진 군에서 선택되는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제를 포함하는 배양 배지에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 ROCK 억제제로 Y-27632를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 (b) 단계는 줄기세포를 신경 전구세포로 분화시키는 단계로 분화시키는 구체적인 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서는 이중-SMAD 저해 (dual SMAD inhibition) 방법을 사용하였으며, 이 방법은 줄기세포에서 BMP (bone morphogenetic protein) 및 TGF-β(transforming growth factor-β)의 신호전달 경로를 차단한 후 줄기세포를 신경 유도 배지에서 배양하여 수행된다. BMP 및 TGF-β의 신호전달 경로 차단은 줄기세포 배양 배지에 각각 LDN193189 및 SB431542를 처리하여 이루어진다. 그러나 줄기세포를 신경 전구세포로 분화시키는 방법이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 VNm-PVDF 지지체를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포를 배양한 후 신경 전구세포로 분화를 유도한 결과, 다른 기질을 코팅한 플레이트에서 배양한 인간 배아 줄기세포와 비교하여 신경 전구세포의 분화 효율이 우수한 것을 확인하였다 (도 3 및 4). 또한, VNm-PVDF 지지체에서 분화시킨 신경 전구세포를 신경 분화 유도 배지에서 추가로 배양한 결과, 신경세포(neuron), 신경 교세포(glial cell), 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)와 같은 다양한 신경세포로 분화하는 것을 확인하여 분화 능력을 유지하는 것을 알 수 있었다(도 6).

따라서, 본 발명의 다른 양상은

(i) 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체; 및

(ii) 상기 나노섬유에 결합된 홍합 접착 단백질(mussel adhesive protein)과 서열번호 1로 표시되는 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드;를 포함하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

상기 세포 배양용 지지체는 신경 전구세포 분화 방법에서 사용한 지지체와 동일하므로 중복되는 내용은 기재를 생략한다.

본 발명에서, 상기 세포 배양용 지지체는 세포 배양 플레이트의 바닥에 놓인 상태로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 제공하는, 세포 배양 지지체에 기반한 신경 전구세포 분화 방법을 사용하면 기존의 세포외 기질에서 분화시키는 방법과 비교하여 줄기세포로부터 신경 전구세포의 분화 효율을 현저히 향상시킬 수 있으며, 분화된 신경 전구세포는 신경세포로의 분화 능력을 유지하므로 추가로 다양한 신경세포를 분화시킬 수 있다.

도 1에서 A는 본 발명의 일 예에 따른 세포 배양 지지체(VNm-PVDF 지지체)의 제작 방법을 개략적으로 보여주고, B 및 C는 각각 섬유 직경이 200 ㎚ (이하, A형) 및 700 ㎚ (이하, B형)인 VNm-PVDF 지지체의 주사현미경 사진이며, D 내지 F는 세포 배양 플레이트에 Matrigel(MG), 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용하여 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양한 후 세포 형태를 비교한 결과이다.
도 2에서 A 및 B는 A형 및 B형 PVDF 지지체의 주사전자현미경(SEM) 사진이고, C는 PVDF 섬유의 직경 분포를 그래프로 표시한 것이다.
도 3은 Matrigel, 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양하여 신경 전구세포로 유도한 후 신경 전구세포 마커의 발현 여부를 확인한 결과이다: SOX1 (SRY-Box Transcription Factor 1) 및 SOX2.
도 4는 Matrigel, 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양하여 신경 전구세포로 유도한 후 신경 전구세포 마커의 발현 수준을 확인한 결과이다: SOX1, NESTIN 및 PLZF (promyelocytic leukaemia zinc finger protein).
도 5는 Matrigel, 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양한 후 세포 형태를 알칼라인 포스파타아제 염색으로 확인한 결과이다.
도 6은 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 분화된 신경 전구세포를 신경세포로 추가로 분화시킨 후 신경세포 마커의 발현을 확인한 결과이다: TUJ1 (NEURON-SPECIFIC CLASS III BETA-TUBULIN)-신경세포 마커, GFAP (Glial fibrillary acidic protein)-신경 교세포 마커, 및 NG2/A2B5-희소돌기아교세포 마커.
도 7은 Matrigel(MG), 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양한 후 발현이 변화한 유전자를 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)으로 비교한 결과이다.
도 8은 Matrigel(MG), 또는 VNm-PVDF 지지체 (A형 및 B형)를 적용한 플레이트에서 인간 배아 줄기세포(hESC)를 배양한 후 발현이 변화된 유전자를 확인한 결과이다: A는 각 지지체에서 분화시킨 세포에서만 특이적으로 발현이 증가하거나, 또는 다른 지지체에서 분화시킨 세포에서 같이 상승 발현되는 유전자의 수를 밴다이어그램으로 표시한 것이고, B는 각 지지체에서 분화시킨 세포에서 높게 발현되는 유전자 중 그 주석(annotation)이 알려진 유전자를 도표로 표시한 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. PVDF 지지체 제작 및 특성 확인

PVDF 지지체(PVDF scaffold)는 AMO Greentech (한국 김포)에 의뢰하여 제작하였다. 간략하게 디메틸 아세트아미드 (DMAc)/아세톤(비율 60/40; Sigma-Aldrich, 미국) 혼합 용액에 PVDF (M.W. 534 K)를 용해시켜 15 중량%(wt%)의 PVDF 용액을 제조하였다. PVDF 용액을 외경이 0.9 ㎜인 노즐 팁이 있는 주사기에 로드하고, 노즐 팁과 수집기 사이의 거리를 15 ㎝로 하여 분당 200 ㎕의 유속으로 분무했다. 45 kV의 전압을 5분 동안 인가하여, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 양면 필름(평균 두께 30 ㎛) (KONE Co., Ltd., 대한민국)의 한 면에 있는 실리콘 기판 위에 PVDF 지지체를 안정적으로 생성시켰다. PVDF 지지체는 실온에서 밤새 건조시키고, 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드(VNm)를 고정시킨 후 세포 배양에 사용하였다 (융합 펩타이드 고정 방법은 하기 참조).

PVDF 지지체를 갖는 PET 양면 필름의 전체 두께를 TESA μ-HITE height gauge (Tesa Technology UK Ltd., 영국)로 5개의 임의 영역에서 측정하였다. 전체 두께에서 측정된 PET 양면 필름의 두께를 빼서 전기방사된 PVDF 지지체의 두께를 확인하였다.

PVDF 지지체의 기공 크기는 CFP-1100A capillary flow porometer (Porous Materials Inc., Ithaca, NY, USA)로 확인했다. 각각의 전기방사 막 샘플에 대해 전형적인 건식 곡선 및 습식 곡선을 얻었으며, 평균 유동 기공 직경은 제조업체 (Porous Materials, Inc)에서 제공한 소프트웨어를 사용하여 자동으로 계산하였다.

도 1의 A에 본 발명의 일 예에 따른 세포 배양 지지체(VNm-PVDF 지지체)의 제작 방법을 개략적으로 도시하였다.

2. MAP-비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드 제조

홍합 접착 단백질 (mussel adhesive protein, MAP)은 해양 홍합에서 추출한 천연 접착제로 세포 접착에 자주 사용된다. 참고문헌 1에 개시된 fp-5 서열을 기반으로 fp-5 펩타이드(서열번호 3)의 양 말단에 fp-1(서열번호 2: AKPSYPPTYK) 펩타이드가 6번 반복되는 MAP 펩타이드(서열번호 4)를 고안하고, 이 MAP 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 이후 MAP의 C-말단에 비트로넥틴 유래의 펩타이드(서열번호 1, KGGPQVTRGDVFTMP) (이하, VN으로 기재함) 서열이 도입된 융합 펩타이드(서열번호 5)를 제작하기 위해, 상기 플라스미드에 VN 코딩 서열을 도입하여 융합 펩타이드(이하, VNm으로 기재함)를 코딩하는 플라스미드를 제작하였다. VN 코딩 서열은 NCBI 웹사이트(유전자 ID: 7448)에 공개된 아미노산 및 cDNA 서열을 참고하였다.

상기 플라스미드를 E.coli (Rosetta-gami^®)(Thermo Fisher Scientific, 미국)에서 발현시키고, 봉입체(inclusion body)로 획득하였다. 이후 봉입체는 공지된 방법(참고문헌 2)에 따라 처리하여 기능성 펩타이드 용액 형태로 정제하였다: 4℃에서 10분 동안 9000 rpm으로 원심분리한 후, NaOH를 사용하여 상층액의 pH를 12.5로 조정한 후 아세트산으로 중화하고, 증류수에 침전 및 재현탁시켰다. 용액을 탈염하고, Amicon® Ultra Centrifugal Filters (10-kDa) (Millipore, 미국)로 농축하고 동결 건조했다.

표 1에 VNm 제작에 사용한 펩타이드 서열을 기재하였다.

서열번호	설명	서열
1	vitronectin-derived peptide (VN)	KGGPQVTRGDVFTMP
2	fp-1	AKPSYPPTYK
3	fp-5	SSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNS GKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS
4	MAP peptide	(AKPSYPPTYK)₆ SSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNS GKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS (AKPSYPPTYK)₆
5	융합 펩타이드 (VNm)	(AKPSYPPTYK)₆ SSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNS GKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS (AKPSYPPTYK)₆KGGPQVTRGDVFTMP

3. PVDF 지지체에 VNm 결합

PVDF 지지체를 10 mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) (AK Scientific, 미국) 용액과 20 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 6.5)에 용해된 10 mM의 N-하이드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) (AK Scientific) 용액으로 실온에서 30분 동안 활성화시켰다. 활성화된 PVDF 지지체에 MAP-VNm 융합 단백질 용액(0.05 ㎍/㎖)을 추가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고, 이후 활성화된 PVDF 지지체를 10분 동안 증류수로 3회 세척하여 건조시켰다. 건조 후 MAP-VNm 융합 단백질이 결합된 PVDF 지지체(VNm-PVDF 지지체)는 실온에서 보관하였다. VNm-PVDF 지지체 제작의 개략적인 과정을 도 1의 A에 도시하였다.

4. hESC 배양 및 분화

인간 배아줄기세포(hESC) 라인 WA09 (통상적으로 H9로 알려짐)는 WiCell (미국)에서 제공받았다. hESC는 StemMACS^®iPS-Brew XF 배지 (Miltenyi Biotec, San Diego, CA, USA) (이하, hESC 배양 배지로 기재함)로 Matrigel^® (Thermo Fisher Scientific)이 코팅된 6-웰 플레이트에서 배양하고, 효소 계대(enzymatic passaging)로 증식시켰다.

신경 분화를 위해, 참고문헌 3에 개시된 이중-SMAD 억제 방법을 일부 수정하여 사용하였다. 간략하게, 10 μM 농도의 Y-27632 (ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제; Sigma)를 포함하는 hESC 배양 배지에 hESC를 현탁시키고, Matrigel 또는 VNm-PVDF 지지체가 적용된 플레이트에 1x10⁴ 세포/㎠의 밀도로 분주하였다. 분화 1일째부터 hESC 배양 배지에 250 nM의 LDN193189 (StemCell technology, 캐나다) 및 10 μM의 SB431542 (Sigma)를 첨가하여 hESC를 8일 동안 배양하였다. 배양 4일째에, 배양 배지를 hESC 배양 배지에서 신경 유도 배지로 교체하였다. 상기 신경 유도 배지는 1x N2, 1x 비필수 아미노산(모두 Thermo Fisher Scientific 제품) 및 20 ng/㎖의 bFGF (Peprotech, 미국)이 보충된 DMEM/F12 배지이다. 신경 유도 배지는 격일마다 교체하고, 배양 8일째에 RNA 분리를 위해 일부 세포를 회수하였다. 다른 세포는 Accutase (Thermo Fisher Scientific)로 해리시켜 면역 염색을 위해 Matrigel이 코팅된 12 ㎜ 커버 슬립에 다시 플레이팅하였다.

추가 분화를 위해, 배양 8일째에 세포를 해리시키고 5x10⁴ 세포/㎠의 밀도로 VNm-PVDF 지지체가 적용된 플레이트에 다시 분주하였다. 다시 분주한 세포(NP)는 신경 분화 배지 (1x N2, 1x B27, 1x 비필수 아미노산, 10 ng/㎖ mL BDNF (Peprotech) 및 20 μM 아스코르브산(Sigma)이 보충된 DMEM/F12 배지)로 2주 동안 추가로 분화시켰다.

5. 면역염색(immunostaining)

세포 샘플을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 PBS (phosphate buffed saline)로 세척하였다. 세포를 0.05% Triton X-100이 첨가된 PBS로 5분 동안 투과시키고, 2% 소 혈청 알부민 용액으로 1시간 이상 블록킹하였다. 이후 세포를 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 다음과 같다: SOX1 (토끼, 1:200; R&D Systems, 미국), SOX2 (토끼, 1: 200; Thermo Fisher Scientific), NESTIN (마우스, 1:200; Thermo Fisher Scientific), TUJ1 (Mouse, 1:1,000; BioLegend, 미국), GFAP (Rabbit, 1:1,000; Dako, 캐나다), A2B5 (Mouse, 1:200; Thermo Fisher Scientific) 및 NG2 (Rabbit, 1:100; Thermo Fisher Scientific).

다음날 세포 샘플을 PBS로 3회 세척하고, 형광 염료 (Alexa fluor®488 또는 594, Thermo Fisher Scientific)가 결합된 2차 항체와 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 세포 샘플을 PBS로 세척한 후, DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)를 함유하는 마운팅 용액(Vector lab, 미국)으로 커버 슬립을 유리 슬라이드에 마운트하였다. 세포 이미지는 디지털 카메라 (DP71)가 장착된 형광 현미경(IX71) (Olympus, 일본)으로 캡처하였다.

6. 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)

제조사의 지시에 따라 Easy-Spin® total RNA 정제 키트 (iNtRON Biotechnology, 경기도 성남시)로 Total RNA를 추출하였다. 총 RNA 1 ㎍을 사용하여 Power cDNA Synthesis 키트 (iNtRON Biotechnology)로 cDNA를 합성하였다. 이후 Fast SYBR® Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 StepOnePlus® 실시간 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific)에서 qRT-PCR을 수행했다. 사용한 프라이머 서열은 표 2에 기재하였다.

유전자	전방향 프라이머	역방향 프라이머
ACTB	CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C	GG TCC TTG CGG ATG TCC ACG T
SOX1	TGA ACG CCT TCA TGG TGT GGT C	GCG CGG CCG GTA CTT GTA AT
SOX2	GCT ACA GCA TGA TGC AGG ACC A	TCT GCG AGC TGG TCA TGG AGT T
PLZF	GAG CTT CCT GAT AAC GAG GCT G	AGC CGC AAA CTA TCC AGG AAC C
PAX6	CTG AGG AAT CAG AGA AGA CAG GC	ATG GAG CCA GAT GTG AAG GAG G
NANOG	CTC CAA CAT CCT GAA CCT CAG C	CGT CAC ACC ATT GCT ATT CTT CG
NESTIN	TCA AGA TGT CCC TCA GCC TGG A	AAG CTG AGG GAA GTC TTG GAG C

7. 전자 현미경 (EM)

세포를 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하고, 4℃에서 밤새 반응시킨 후 0.1 M 카코딜레이트 완충액 (cacodylate buffer; pH 7.2)으로 세척하였다. 세포를 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)과 1시간 동안 반응시키고 증류수로 세척한 다음 농도를 증가시킨 에탄올(50%, 70%, 90% 및 100%)로 점진적으로 탈수시켰다. 세포를 흄 후드 내부에서 건조시킨 후, SEM 스터브(stub)에 장착하여 스퍼터 코팅기 (sputter coater; E-1045, Hitachi, 일본)로 세포에 백금을 코팅하였다. 세포 표면 이미징은 2 kV의 SE 모드에서 SEM (TeneoVS, FEI)의 ETD 검출기로 확인하였다.

8. RNAseq 및 비교 전사체 분석(comparative transcriptomic analysis)

총 RNA는 이미 설명한 방법으로 분리하였고, 마크로젠(대한민국)에서 쌍-말단 시퀀싱(paired-end sequencing)을 수행하여 6천 만개 이상의 리드(read)를 생성하였다. 원본 FASTQ 파일은 TrimGalore (Krueger, Trim galore. Available from https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore. Accessed at Jan 20,2020)를 사용하여 어댑터에 대해 트리밍하였고, Salmon(참고문헌 4)을 사용하여 Ensembl 카탈로그에 대해 전사 수준에서 정량화하였으며, tximport (참고문헌 4)로 유전자 수준에서 집계하고, 표준 파이프 라인을 사용한 추가 분석을 위해 DESeq2를 사용하였다. 상관 관계 플롯은 ggplot2 (v3.3.0)으로 작성하고, 히트맵(heatmap)은 pheatmap (v1.0.12)으로 작성하였다. 유전자 온톨로지(gene ontology) 분석은 Metascape로 수행하였다 (참고문헌 6).

9. 데이터 표시 및 통계 분석

실험은 최소 세 번씩 수행하였고, 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 실험 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Bonferroni의 사후 테스트로 분석하였다. p <0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험 결과

1. PVDF 지지체의 특성

전기방사를 통해 섬유 직경이 200 ㎚ (A형) 및 700 ㎚ (B형)인 두 가지 유형의 PVDF 지지체를 제조하였다.

SEM(scanning electron microscope)에 의한 형태학적 검사 결과 각 PVDF 지지체가 상대적으로 일정한 직경 및 균질한 분포를 갖는 섬유로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 2의 A 및 B). 나노섬유 사이에 형성된 기공은 연속적으로 연결되어 있었으며, 기공 크기는 A형 PVDF 지지체는 0.61±0.02 ㎛, B형 PVDF 지지체는 1.42±0.06 ㎛ (각 지지체에 대해 n=3, 평균±SD)인 것을 확인하였다. A형 PVDF 지지체의 섬유는 B형 PVDF 지지체와 비교하여 평균 200 ㎚의 직경을 가지면서 더 좁은 범위의 섬유 직경을 갖는 것으로 나타났다 (도 2의 C).

2. VNm-PVDF 지지체를 이용한 hESC 배양

PVDF 지지체에서 배양한 hESC의 거동을 조사하기 위해 섬유 직경이 200 ㎚ (A형) 및 700 ㎚ (B형)로 상이한 두 가지 유형의 PVDF 지지체를 제조하였다. 본 발명자들은 사전 연구를 통해 전기방사된 PVDF 나노섬유 지지체가 소수성 특성으로 인해 hESC의 부착에 적합하지 않은 것을 확인하였다(데이터는 제시하지 않음). 이에 PVDF 지지체에 대한 hESC의 부착을 증가시키기 위해 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드(VNm)를 PVDF 지지체에 고정시켜 VNm-PVDF 지지체를 제작하였다.

전자 현미경으로 상기 두 유형의 VNm-PVDF 지지체를 확인한 결과, 지지체가 별다른 응집 없이 비교적 일정한 직경을 갖는 나노섬유로 이루어져 있음을 확인하였다(도 1의 B 및 C).

또한, 두 유형의 VNm-PVDF 지지체에서 배양된 인간 배아 줄기세포(hESC)는 Matrigel에서 배양된 hESC와 같이 부착성을 나타냈으며(도 1의 D 내지 F), 이 결과는 VNm-PVDF 지지체가 hESC를 잘 부착시켜 자라게 한다는 것을 의미한다. A형 VNm-PVDF 지지체에서 배양한 hESC는 콜로니 모양이 돔 모양인 Matrigel의 콜로니 모양과 비슷하게 나타났지만 B형 VNm-PVDF 지지체에서 배양한 hESC 콜로니는 펼쳐져 평평한 모양을 보였다 (도 1의 D 내지 F).

3. VNm-PVDF 지지체를 이용한 hESC의 신경 분화

본 발명자들은 이중 SMAD 억제 조건으로 VNm-PVDF 지지체 또는 Matrigel (대조군 ECM)이 적용된 플레이트에서 hESC를 배양하고 신경 분화(neural differentiation) 효율을 비교하였다.

분화 8일째에, hESC를 회수하여 신경 전구세포(neural precursor; 이하, NP로 기재함) 최종 마커인 SOX1 (SRY-Box Transcription Factor 1)에 대한 항체로 면역염색한 결과 Matrigel 실험군의 hESC 중에서 81.3±0.3%가 강력한 면역반응성을 보이는 것을 확인하였다(도 3의 A, 도 4의 A). 이 결과는 기존의 분화방법이 높은 수율로 신경전구세포를 분화시킬 수 있음을 다시 한번 검증해 주었다. 이에 반해, A형 및 B형 VNm-PVDF 지지체에서 배양한 hESC는 각각 91±2.5% 및 86±1.2%가 SOX1에 대해 양성인 것을 확인하여 (도 3의 B 및 C, 도 4의 A), VNm-PVDF 지지체에서 배양한 hESC에서 SOX1 양성 세포의 비율이 Matrigel보다 훨씬 높은 것을 알 수 있었다(도 4의 A; A형 VNm-PVDF 지지체는 p=0.008, B형 VNm-PVDF 지지체는 p=0.04, 각 실험군에서 n=3, Bonferroni의 사후 테스트를 사용한 단방향 ANOVA 테스트). 또한 A형 및 B형 VNm-PVDF 지지체에서 배양한 거의 모든 hESC가 SOX2와 NESTIN에 대해 양성인 것을 확인하여 NP로 분화된 것을 알 수 있었다(도 3의 D 내지 F).

또한, 상대적 유전자 발현 분석 결과를 통해 NESTIN 및 PLZF (promyelocytic leukaemia zinc finger protein)와 같은 신경 전구세포 마커의 발현이 Matrigel 실험군과 비교하여 VNm-PVDF 지지체 실험군에서 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 A형 VNm-PVDF 지지체 실험군에서 발현 수준이 높은 것을 알 수 있었다(도 4의 B 및 C). 이러한 결과는 VNm-PVDF 지지체에서 hESC를 배양하면 기존의 신경전구세포 분화 방법을 단독으로 사용한 경우보다 hESC의 신경 분화 효율을 더 향상시킬 수 있다는 것을 시사한다 (도 5의 B 및 C).

4. VNm-PVDF 지지체에서 분화된 NP의 분화 잠재력 확인

VNm-PVDF 지지체에서 분화된 NP가 신경 줄기세포 분화 잠재력을 유지하는지 확인하기 위해 NP를 신경 분화 배지에서 2주 동안 배양하여 추가로 분화시켰다. 2주 후 확인한 결과, NP가 TUJ1 양성 신경 세포, GFAP-양성 신경 아교 세포(glial cell), NG2/A2B5-이중 양성 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte) 전구세포로 분화된 것을 확인하였다(도 6). 구체적으로 VNm-PVDF 지지체에서 배양된 NP 중에서 TUJ1-양성 세포가 가장 많았고, NG2/A2B5-이중 양성 세포 및 GFAP 양성 세포가 그 뒤를 이었다. 이 결과를 통해 본 발명자들은 VNm-PVDF 지지체에서 분화된 NP가 신경 줄기 세포로서 분화 잠재력을 유지한다는 것을 확인하였다.

5. VNm-PVDF 지지체에서 분화시킨 NP에서 발현이 변화된 유전자 확인

VNm-PVDF 지지체가 hESC의 신경 분화를 촉진하는 기작을 확인하기 위해 RNAseq에 의한 비교 전사체 분석을 수행하였다.

계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 결과, Matrigel에서 분화시킨 대조군 세포와 비교하여 두 유형의 VNm-PVDF 지지체에서 분화시킨 세포들이 서로 더 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다 (도 7).

또한, 가장 높은 발현 변화를 보이는 45개 유전자를 확인했다. 이중에서 6개 유전자는 Matrigel 실험군에서만 상향 조절되었고, 6개 중에서 3개 유전자는 그 기능이 알려져 있다(도 7 및 도 8의 B에서 녹색 상자, NELL2, CA4 및 GRIN2B). 다른 의미로 이들 유전자(NELL2, CA4 및 GRIN2B)는 두 유형의 VNm-PVDF 지지체 실험군에서 발현 수준이 대조군에 비해 감소되었다고 분석할 수 있다. 대조적으로, 대조군에 비해 VNm-PVDF 지지체 실험군들에서는 총 27개 유전자(도 8의 A에서 3+17+7)가 상향 조절되었고, 이중 3개 및 7개 유전자는 각각 A형 VNm-PVDF 지지체 실험군과 B형 VNm-PVDF 지지체 실험군에 특이적이었다(도 8의 A). A형 VNm-PVDF 지지체 실험군에서 특이적으로 발현이 증가된 3개 유전자 중에서 주석이 알려진 2개는 전사 조절(VGLL3) 및 FGF 수용체 신호전달 경로 (FGFBP3)와 관련된 것으로 알려져 있다(도 7 및 도 8의 B에서 주황색 상자). 척추 동물 발달 과정에서 FGF 신호 전달이 신경 유도에 필수적이라는 점을 감안할 때(참고문헌 7), FGF 신호의 양성 조절자인 FGFBP3의 상향 조절은 A형 VNm-PVDF 지지체에서 신경 분화의 효율성을 향상시키는 요인이 될 수 있다.

B형 VNm-PVDF 지지체 실험군에서만 발현이 증가된 유전자 7개 중에서 주석이 알려진 5개 유전자는 각각 신경 세포 증식 (ATF5), 인슐린에 대한 세포 반응(TRIB3), 지질 대사(CH25H), 글루타티온 생합성 (CHAC1) 및 G-단백질 결합 수용체 신호전달 경로(AVPR1A)과 관련된 유전자들이다(도 8의 B에서 파란색 영역).

두 VNm-PVDF 지지체 실험군들에서 공통으로 발현이 증가한 17개 유전자 중에서 8개 유전자는 B형 VNm-PVDF 지지체 실험군보다 A형 VNm-PVDF 지지체 실험군에서 더 높게 발현되었고, 다른 9개 유전자의 발현은 반대로 나타났다(표 3).

확인된 유전자들의 기능 검색 결과, 여러 유전자가 신경계의 발달과 직접적으로 관련이 있는 것을 확인하였다(예를 들어, CYP26C1, PAX3, OLIG3, GBX2 및 PAX8). 다른 유전자들은 발달 및 형태 형성(TFAP2A, POU5F1 및 FOXC1), G-단백질 결합 수용체 신호 전달 (NTS 및 ADGRL4) 및 신경 유도와 관련된 세포 신호 전달 경로 (BMPER 및 TFAP2B)를 포함한 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 VNm-PVDF 지지체 실험군들에서 공통으로 발현이 증가한 유전자 중에 BMPER가 있다는 점은 중요한 의미를 가진다. BMP 신호가 신경 유도를 억제하고(참고문헌 8), ERK 신호의 활성화가 초기 척추 동물 발달 동안 신경 운명을 획득하는 데 필요하다는 것이 이전부터 알려져 있기 때문이다(참고문헌 9). BMPER는 BMP 억제와 ERK 활성화라는 이중 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 이 유전자의 상향 조절은 두 VNm-PVDF 지지체들이 신경 분화를 촉진하는 핵심 요소 중 하나일 수 있다는 것을 시사한다.

종합적으로 VNm-PVDF 지지체에서 배양한 NP에서 신경 발달과 관련 있는 유전자들의 발현이 증가하므로 VNm-PVDF 지지체는 줄기세포의 신경 분화 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

[참고문헌]

1. Hwang DS, Sim SB, Cha HJ (2007) Cell adhesion biomaterial based on mussel adhesive protein fused with RGD peptide. Biomaterials 28:4039-4046.

2. Palmer I, Wingfield PT (2004) Preparation and extraction of insoluble (inclusion-body) proteins from Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci 38:6.3.1-6.3.18.

3. Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, Tomishima M, Sadelain M, Studer L (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol 27:275-280.

4. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C (2017) Salmon provides fast and bias aware quantification of transcript expression. Nat Methods 14:417-419.

5. Soneson C, Love MI, Robinson MD (2015) Differential analyses for RNA-seq: transcript-level estimates improve gene-level inferences. F1000Res 4:1521.

6. Zhou Y, Zhou B, Pache L, Chang M, Khodabakhshi AH, Tanaseichuk O, Benner C, Chanda SK (2019) Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun 101523.

7. Wilson SI, Edlund T (2001) Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat Neurosci 4:1161-1168.

8. Wilson SI, Edlund T (2001) Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat Neurosci 4:1161-1168.

9. Kuroda H, Fuentealba L, Ikeda A, Reversade B, De Robertis EM (2005) Default neural induction: neuralization of dissociated Xenopus cells is mediated by Ras/MAPK activation. Genes Dev 19:1022-1027.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> METHOD FOR DIFFERENTIATING NEURAL PRECURSOR FROM STEM CELLS USING CULTURING SCAFFOLD <130> DP-2020-0243P1_P20U13C1964 <150> KR 10-2020-0051037 <151> 2020-04-27 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vitronectin-derived peptide (VN) <400> 1 Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 peptide <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 peptide <400> 3 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 4 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP peptide <400> 4 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 5 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP and vitronectin-derived peptide (VNm) <400> 5 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe 195 200 205 Thr Met Pro 210 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB forward primer <400> 6 caccattggc aatgagcggt tc 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB reverse primer <400> 7 ggtccttgcg gatgtccacg t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 forward primer <400> 8 tgaacgcctt catggtgtgg tc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 reverse primer <400> 9 gcgcggccgg tacttgtaat 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 forward primer <400> 10 gctacagcat gatgcaggac ca 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 reverse primer <400> 11 tctgcgagct ggtcatggag tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLZF forward primer <400> 12 gagcttcctg ataacgaggc tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLZF reverse primer <400> 13 agccgcaaac tatccaggaa cc 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 forward primer <400> 14 ctgaggaatc agagaagaca ggc 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 reverse primer <400> 15 atggagccag atgtgaagga gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG forward primer <400> 16 ctccaacatc ctgaacctca gc 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG reverse primer <400> 17 cgtcacacca ttgctattct tcg 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN forward primer <400> 18 tcaagatgtc cctcagcctg ga 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN reverse primer <400> 19 aagctgaggg aagtcttgga gc 22

Claims

(a) 세포 배양용 지지체에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 줄기세포를 신경 전구세포로 분화를 유도하는 단계;를 포함하고,
상기 세포 배양용 지지체는
(i) 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체; 및
(ii) 상기 나노섬유에 결합된 홍합 접착 단백질과 비트로넥틴 유래 펩타이드의 융합 펩타이드;를 포함하는, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 나노섬유는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV) 및 폴리비닐알코올(PVA)로 이루어진 군에서 선택되는 물질로 이루어진, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제2항에 있어서, 상기 생체적합성 나노섬유는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)로 이루어진, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 나노섬유는 직경이 100 내지 1000 ㎚인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체는 두께가 1 내지 10 ㎛인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 나노섬유로 이루어진 지지체는 기공 크기가 0.2 내지 2.0 ㎛인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 비트로넥틴 유래 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 전분화능 줄기세포인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제10항에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 Y-27632, Y-30141, Y-33075 및 Y-39983으로 이루어진 군에서 선택되는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제를 포함하는 배양 배지에서 수행되는 것인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 줄기세포에서 BMP (bone morphogenetic protein) 및 TGF-β(transforming growth factor-β)의 신호전달 경로를 차단한 후 줄기세포를 신경 유도 배지에서 배양하여 수행되는 것인, 줄기세포로부터 신경 전구세포를 분화시키는 방법.