KR20230074279A - 성장 인자에 결합하는 단백질 기판 - Google Patents

성장 인자에 결합하는 단백질 기판 Download PDF

Info

Publication number
KR20230074279A
KR20230074279A KR1020237015668A KR20237015668A KR20230074279A KR 20230074279 A KR20230074279 A KR 20230074279A KR 1020237015668 A KR1020237015668 A KR 1020237015668A KR 20237015668 A KR20237015668 A KR 20237015668A KR 20230074279 A KR20230074279 A KR 20230074279A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
tyr
lys
gly
pro
Prior art date
Application number
KR1020237015668A
Other languages
English (en)
Inventor
이상재
홍봉진
박민철
Original Assignee
주식회사 티엠이테라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 티엠이테라퓨틱스 filed Critical 주식회사 티엠이테라퓨틱스
Publication of KR20230074279A publication Critical patent/KR20230074279A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

성장 인자 수용체 및 인테그린 모두에 동시에 또는 선택적으로 결합하거나 이를 활성화시킬 수 있는 인테그린 결합 모티프 및 성장 인자(GF) 결합 펩티드 모티프를 포함하는 단백질 기판이 제공된다. 상기 기판의 단백질은 홍합 접착 단백질의 형태일 수 있고, 여기서 인테그린 결합 펩티드 모티프로부터 유래되는 세포외 기질(ECM) 단백질 및 GF 결합 펩티드 모티프가 상기 홍합 접착 단백질 내에 재조합적으로 통합된다. 또한, 생물공정, 상처 치유, 조직 공학, 및 치료 적용분야에 있어서 필수적인 공정인 세포 부착, 이동, 또는 증식을 포함하는 세포의 거동을 조절하기 위한 단백질 기판의 용도가 제공된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 프로테아제 소화 또는 세포 내로의 내재화(또는 세포 섭취)로부터 성장 인자를 안정화 및 보호하여 성장 인자의 계속적이고 지속적인 기능을 유지하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

성장 인자에 결합하는 단백질 기판
본 발명은 인테그린(integrin) 결합 펩티드 모티프(motif) 및 성장 인자/사이토카인(cytokine) 결합 펩티드 모티프 모두를 갖는 단백질 기판(substrate)을 포함하는 ECM-모방체 및 성장 인자 복합체(complex)에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 직접적으로 FGF, TGFβ, PDGF, 및 VEGF 결합 펩티드 모티프 중 하나 및 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 및 테나신(tenascin)으로부터 유래되는 인테그린 αv, α2, α4, α5, 및 α9 결합 모티프 중 하나를 포함하는 단백질 기판에 관한 것이다.
세포 부착 수용체, 인테그린, 및 성장 인자 수용체는 발생 및/또는 병리학적 공정 동안에 신호전달에 대한 특이성을 제공함에 있어서의 중요한 분자적 결정자이다. 인테그린 및 성장 인자 수용체는 독립적으로 세포내 신호를 전파할 수 있지만, 세포외 기질(ECM) 및 성장 인자(GF)에 의해 제공되는 신호의 시너지(synergy)가 배형성 동안의 혈관 발생, 상처 치유뿐만 아니라 종양 성장/전이를 포함하는 복합적인 공정을 조절하는 것으로 보인다.
GF는 다양한 세포 공정의 조절에 관여하며, 전형적으로 세포들 사이의 신호전달 분자로서 작용한다. GF는 세포 증식, 분화 및 성숙을 촉진하며, 이들은 성장 인자에 있어서 다양하다. 대부분의 성장 인자는 확산가능한 방식으로 작용하며, 일반적으로 조직 환경에서는 불안정하다. 이러한 연장된 유지는 세포 또는 그 환경에서 성장 인자의 활성을 유지하고, 생물공정(bioprocess), 재생 의학 적용분야에서 유리한 것으로 간주된다.
따라서, 성장 인자의 성능(예컨대, 그 활성 기간 및 안전성)을 개선하기 위한 많은 시도가 있어 왔다. 그 환경에서 성장 인자의 유지를 연장시키기 위한 가장 흔한 전략은 성장 인자를 화학적 결합에 의해 고체 기판 상에 고정하는 것이며, 상기 기판은 상처 치유, 조직 공학 등을 포함하는 많은 의학적 및 생물학적 적용분야를 위해 사용될 수 있다(Mirhamed Hajimiri, et al, Growth factor conjugation: Strategies and applications, J. Biomedical Materials Research, Volume103, Issue 2. 2015 p819-838). 아울러, 인공 장기를 위해 사용되는 생체물질에 세포 기능의 조절과 같은 생체기능성을 부가하는 것이 매우 중요하다. 세포 또는 스캐폴드(scaffold) 생체물질에 대한 고정화 또는 고친화성 결합을 위해 성장 인자를 변형하는 것은 다양한 연구자들에 의해 수행되어 왔다(Seiichi Tada, et al, Design and Synthesis of Binding Growth Factors, Int J Mol Sci. 2012; 13(5): 6053-6072 참조). 그러나, 이들 대부분은 그 효과가 제한적인데, 이는 주로 캐리어(carrier)와 연관시 성장 인자 활성이 상실되고, 성장 인자가 비효율적으로 방출 제어되고, 단백질분해 및/또는 분해로부터 잘 보호되지 않기 때문이다.
세포외 기질은 많은 구성성분, 예컨대 성장 인자에 결합하고 다수의 그 활성을 조절하기 위한 접착 분자, 노치(notch) 신호전달 분자, 견인-가능(traction-enabling) 부착 분자 및 프로테오글리칸 분자를 함유한다(Cao L., et al. 2009 Promoting angiogenesis via manipulation of VEGF responsiveness with notch signaling. Biomaterials 30, 4085-4093; Discher D. E., et al. 2005 Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science 310, 1139-1143; Ramirez F.& Rifkin D. B., 2003 Cell signaling events: a view from the matrix. Matrix Biol. 22, 101-107).
많은 ECM 단백질은 성장 인자가 국소적으로 방출되고 그 세포 표면 수용체에 결합하게 하는, 성장 인자 및 세포 부착 모두를 위한 결합 부위를 갖는다. 따라서, 상기 ECM은 공동인자로서 기능하고, 세포 표면 수용체에 대한 성장 인자를 제공한다. 또한, ECM 결합에 의한 성장 인자의 국소화는 가용성 케모카인(chemokine) 및 성장 인자 모르포겐(morphogen)의 농도구배의 확립에 기여하고, 이것은 발생 공정에서 핵심적 역할을 한다. 성장 인자는 또한 국소화 저장소로서 기능하게 되는 ECM에 격리될 수 있다. 이후, ECM이 분해되면 가용성 활성 리간드로 전환되는 고체 비활성 성장 인자를 방출할 것이다(Kim, S.-H., et al. 2011. Extracellular matrix and cell signalling: the dynamic cooperation of integrin, proteoglycan and growth factor receptor. The Journal of endocrinology, 209(2), p139-51; Hynes, et al. 2012. Overview of the matrisome - an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harbor perspectives Hynes, R.O., 2009; The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science (New York, N.Y.), 326(5957), pp.1216-9). 일부 성장 인자는 확산되지 않는 방식으로 작용하는 것으로 알려져 있고, 이러한 성장 인자는 HB-EGF, TGF, TNF, 및 CSF이며, 대부분의 성장 인자는 확산가능한 방식으로 작용한다(Seiichi Tada, et al. Int J Mol Sci. 2012; 13(5): 6053-6072. Design and Synthesis of Binding Growth Factors).
본 발명의 목적은 ECM-유래 GF 결합 펩티드 모티프 및 인테그린 결합 모티프를 이용함으로써 장기간 지속되는 안전성 및 기능성으로 성장 인자를 고정화하기 위한 보다 단순하고 신뢰가능한 단백질 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 인테그린 결합 모티프 및 성장 인자와 결합하거나 이를 격리할 수 있는 헤파린(heparin) 결합 모티프로 유전적으로 기능화된 재조합 접착 단백질을 포함하는 단백질 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포의 가소성(plasticity)을 조절하기 위한 세포외 미세환경 표면을 제공하는 것이며, 여기서 상기 미세환경 표면은 인테그린 및 성장 인자 수용체를 동시에 활성화시킴으로써 조합적 신호전달을 유도할 수 있는 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 단백질 기판을 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 한 측면에서, 본 발명은 인테그린 결합 모티프 및 성장 인자와 결합하거나 이를 격리할 수 있는 헤파린 결합 모티프로 유전적으로 기능화된 재조합 접착 단백질을 포함하는 단백질 기판을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 헤파린 결합 모티프는 콜라겐, 비트로넥틴, 또는 뼈 시알로단백질(sialoprotein)의 피브로넥틴 도메인(domain) Ⅲ, 라미닌 구형(globular) 도메인, 헤파린 결합 도메인으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 피브로넥틴 도메인 Ⅲ로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KYILRWRPKNS(서열번호 7), YRVRVTPKEKTGPMKE(서열번호 8), SPPRRARVT(서열번호 9), ATETTITIS(서열번호 10), VSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFG(서열번호 11), ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13), PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV(서열번호 14), WQPPRARI(서열번호 15), WQPPRARITGYIIKYEKPG(서열번호 16), YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17), 또는 KNNQKSEPLIGRKKT(서열번호 18)의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 라미닌 구형 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 GLIYYVAHQNQM(서열번호 19), RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), GLLFYMARINHA(서열번호 21), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), VVRDITRRGKPG(서열번호 23), RAYFNGQSFIAS(서열번호 24), GEKSQFSIRLKT(서열번호 25), TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL(서열번호 26), TLFLAHGRLVFM(서열번호 27), LVFMFNVGHKKL(서열번호 28), GAAWKIKGPIYL(서열번호 29), VIRDSNVVQLDV(서열번호 30), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), GPLPSYLQFVGI(서열번호 33), RNRLHLSMLVRP(서열번호 34), LVLFLNHGHFVA(서열번호 35), AGQWHRVSVRWG(서열번호 36), KMPYVSLELEMR(서열번호 37), RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), TVFSVDQDNMLE(서열번호 40), APMSGRSPSLVLK(서열번호 41), VLVRVERATVFS(서열번호 42), 또는 RNIAEIIKDI(서열번호 43)의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 콜라겐의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KGHRGF(서열번호 44), TAGSCLRKFSTM(서열번호 45), 또는 GEFYFDLRLKGDK(서열번호 46)의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 비트로넥틴의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47)의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 뼈 시알로단백질의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KRSR(서열번호 48), 또는 KRRA(서열번호 49)의 펩티드일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 헤파린 결합 모티프는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 전환 성장 인자 β(TGF-β), 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프는 αvβ3-, αvβ6-, αvβ8-, α5β1-, 또는 α9β1 결합 펩티드일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프는 인테그린 αvβ6을 활성화시킬 수 있고, 상기 헤파린 결합 모티프는 TGF-β에 결합할 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프는 인테그린 α5β1 또는 α9β1을 활성화시킬 수 있고, 상기 헤파린 결합 모티프는 bFGF에 결합할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 재조합 접착 단백질은 재조합 홍합 접착 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 홍합 접착 단백질은 서열번호 1-6, 및 60-74의 펩티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프 및/또는 헤파린 결합 모티프는 상기 재조합 접착 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프 및 헤파린 결합 모티프는 모두 상기 재조합 접착 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 인테그린 결합 모티프 및 헤파린 결합 모티프는 스페이서 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 스페이서 링커 펩티드는 서열번호 75의 펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포의 가소성을 조절하기 위한 세포외 미세환경 표면을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 미세환경 표면은 인테그린 및 성장 인자 수용체를 동시에 활성화시킴으로써 조합적 신호전달을 유도할 수 있는 본 발명의 단백질 기판을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 세포의 가소성은 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition)일 수 있다.
단백질 기판은 GF 결합 펩티드 모티프 및 인테그린 결합 펩티드 모티프를 포함하는 재조합 접착 단백질의 형태로 제공된다. 상기 단백질 기판은 성장 인자 수용체 또는 인테그린을 동시에 또는 순차적으로 활성화시킴으로써 세포 부착, 이동, 성장, 및 생존을 포함하는 넓은 범위의 세포 거동을 유도 또는 조작한다.
한 측면에서, 본 발명은 다음의 3개의 도메인을 포함하는 재조합 접착 단백질의 형태로 단백질 기판을 제공한다:
1) 세포, 조직, 또는 임의의 기판, 예컨대 플라스틱 및 유리의 표면에 부착하는 홍합 접착 단백질 도메인;
2) 동족(cognate) 성장 인자 수용체를 활성화 또는 억제하기 위해 성장 인자를 고정화 또는 격리할 수 있는 성장 인자 결합 도메인; 및
3) 인테그린을 활성화시킬 수 있는 인테그린 결합 도메인.
본 발명에 따르면, 임의의 재조합 홍합 접착 단백질이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 재조합 홍합 접착 단백질은 서열번호 1-6, 및 60-74의 펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 홍합 접착 단백질은 족사 단백질(foot protein) 1 데카펩티드 반복체(서열번호 1), 족사 단백질 3(서열번호 2), 족사 단백질 5(서열번호 3-4) 또는 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 족사 단백질 1 데카펩티드 반복체 및 족사 단백질 3, 족사 단백질 1 데카펩티드 반복체 및 족사 단백질 5, 또는 족사 단백질 1, 족사 단백질 3 및 족사 단백질 5의 하이브리드(hybrid)이다. 바람직하게는, 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis)의 족사 단백질 5(서열번호 3) 또는 미틸러스 갈로프로빈시알리스(Mytilus galloprovincialis)의 족사 단백질 5(서열번호 4)의 N- 및 C-말단에 족사 단백질 1 데카펩티드의 6개 반복체로 이루어진 하이브리드 단백질(서열번호 5 및 서열번호 6)이 본 발명을 위해 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 GF 결합 도메인은 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 피브리노겐(fibrinogen), 테나신, 또는 뼈 시알로단백질을 포함하는 ECM 단백질로부터 유래되는 헤파린 결합 또는 신데칸(syndecan) 결합 펩티드 모티프일 수 있다. 헤파린 결합 또는 신데칸 결합 모티프에 의해 결합 또는 격리되는 성장 인자는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 상피 성장 인자(EGF), 및 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함하고, 헤파린 또는 신데칸 결합 모티프에 의해 결합 또는 격리되는 사이토카인은 전환 성장 인자 β(TGF-β), 인터루킨(interleukin)-2, 및 인터루킨-6이다.
다른 측면에서, 본 발명은 ECM-유래 인테그린 결합 펩티드 및 외인성 성장 인자를 고정하기 위한 하나 이상의 GF 결합 모티프를 포함하는 가치있는 세포를 배양하기 위한 합성 세포외 미세환경을 생성하기 위한 단백질 기판을 제공한다. 헤파린 또는 신데칸 결합 모티프에 결합되는 외인성 성장 인자는 본 발명에 따른 단백질 기판 내에 유지된다.
다른 측면에서, 본 발명은 생물공정 또는 조직 공학 적용분야를 위한 서방형(sustained) 성장 인자 운반을 위한 단백질 기판을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 단백질 기판 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 세포 치료법, 상처 치유 또는 조직 공학을 위한 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 성장 인자 또는 사이토카인을 유지하는 합성 세포외 기질로서 단백질 기판을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 성장 인자 수용체 및 인테그린 모두에 결합하는 단백질 기판을 이용하는 단계를 포함하는 세포 이동을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 조직, 또는 기관에 운반하기 위하여 성장 인자 또는 사이토카인을 고정하기 위한 기판을 제공한다. 본 발명의 구현예뿐만 아니라 특징 및 이점은 본 명세서의 추가적인 기술로부터 명확할 것이다.
본 발명의 단백질 기판은 세포 배양 관련 적용분야, 예를 들면, 줄기 세포 확장, 조직 공학을 위한 성장 인자의 운반, 또는 치료적 적용분야를 위한 생물공정을 위한 표면 코팅용으로 사용될 수 있다.
도 1a는 인테그린 결합 모티프 및 다양한 성장 인자를 활성화시키거나 이에 결합할 수 있는 헤파린 결합 모티프를 제공하는 단백질 기판의 2가지 기본적 방식을 나타낸다. 방식 A는 C-말단 및 N-말단에 인테그린 결합 및 GF 결합 펩티드 모티프를 갖는 단백질 기판이며, 방식 B에서는 결합 펩티드 모티프가 모두 단백질 기판의 C-말단에 통합되어 있다.
도 1b는 본 발명의 단백질 기판의 작용 메커니즘을 나타낸다. 특이성을 위하여, 코팅된 표면이 코팅된 단백질 기판은 도 1b에 나타낸 것과 같이 결합 모티프 및 성장 인자 수용체 또는 인테그린 사이의 특이적 상호작용을 허용하는 섬과 유사한 지형을 형성한다.
도 2a 및 도 2b는 GF에 높은 친화도를 갖는 임의의 펩티드 모티프를 스크리닝하기 위한 헤파린 결합 펩티드 모티프 배열의 레이아웃(layout)을 나타낸다. 도 2a는 피브로넥틴, 콜라겐, 및 라미닌 유래의 헤파린 또는 신데칸 결합 펩티드 모티프이 레이아웃이고, 도 2b는 라미닌 LG 도메인 유래의 헤파린 또는 신데칸 결합 펩티드의 레이아웃이다.
도 3은 GF 결합 모티프에 대한 계산된 GF 결합 친화도를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각각 bFGF(도 4a) 및 TGF-β(도 4b)에 대한 다양한 ECM-유래 GF 결합 펩티드 모티프의 스크리닝 결과를 나타낸다. 도 4c는 각각 bFGF, TGF-β, 및 PDGF에 대한 라미닌-유래 GF 결합 펩티드 모티프의 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 TGF-β에 높은 친화도를 갖는 단백질 기판에 결합된 TGF-β의 서방형 방출을 나타낸다. 도 5a는 TGF-β에 높은 친화도를 갖는 TGF-β 결합 펩티드 모티프의 레이아웃이고, 도 5b는 TGF-β의 장기간의 서방형 방출을 보여주는 TGF-β에 대해 높은 친화도를 갖는 GF 결합 모티프의 흡수 프로필을 나타낸다.
도 6a는 상피-간엽 이행(EMT) 유도가능한 인테그린 αv, α2, 및 α9에 결합하는 ECM 유래 펩티드 모티프의 레이아웃을 나타내고, 도 6b는 EMT-유도가능한 인테그린 결합 모티프가 코팅된 표면에서 배양된 유방 상피 세포인 MCF-10A의 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 나타낸다. 도 6b에서, 피브로넥틴 발현은 단백질 기판에 결합된 TGF-β 유도 EMT 마커로서 나타낸다. TGF-β에 대해 높은 친화도를 갖는 GF 결합 모티프(YEK & ANG)를 갖는 단백질 기판은 피브로넥틴의 높은 발현을 유도하였지만, TGF-β에 대해 낮은 친화도를 갖는 GF 결합 모티프(WQ)를 갖는 단백질 기판은 피브로넥틴 발현을 유도하지 않았다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 분석된 트립신-매개 TGF-β 절단을 나타낸다. 단백질 기판에 결합된 TGF-β는 낮은 레벨의 트립신 소화를 갖지만, 단백질 기판이 없는 TGF-β는 트립신으로 처리될 때 대부분 소화되었다.
도 8a 및 도 8b는 낮은 혈청 조건(0.5% FBS)에서 인간 포피(foreskin) 섬유아세포의 성장 및 증식에 대한 단백질 기판에 결합된 GF의 효과를 나타낸다. 도 8a는 세포 성장 및 증식에 대한 단백질 기판에 결합된 PDGF의 효과이고, 도 8b는 단백질 기판에 결합된 FGF2의 효과이다.
본 발명은 세포 거동을 조절하기 위하여 인테그린 및 성장 인자/사이토카인 수용체에 의해 동시에 또는 선택적으로 매개된 신호전달을 유도하는 단백질 기판에 관한 것이다. 단백질 기판은 다음의 3개의 도메인을 포함하는 재조합 접착 단백질의 형태로 제공될 수 있다:
1) 세포, 조직, 또는 임의의 기판의 표면, 예컨대 플라스틱 또는 유리에 부착하는 재조합 홍합 접착 단백질 도메인;
2) 동족 성장 인자 수용체 또는 사이토카인 수용체를 활성화 또는 억제하기 위해 성장 인자 또는 사이토카인을 고정화 또는 격리할 수 있는 성장 인자 결합 도메인; 및
3) 인테그린 수용체를 활성화시킬 수 있는 인테그린 결합 도메인.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "기판"은 다른 물질이 적용되는 물질을 의미한다. 생물학에서, 유기체, 예컨대 식물, 진균, 또는 동물이 살아가는 표면은 기판으로 불릴 수 있다. 상기 표면은 모두 생물적, 또는 비생물적 구성성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 재조합 홍합 접착 단백질은 홍합 족사 단백질 FP-5 및 홍합 족사 단백질 FP-1 데카펩티드를 포함하는 융합 단백질을 나타낸다. 한 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 단백질 기판은 서열번호 5-6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 홍합 족사 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "GF 결합 펩티드 모티프"는 예컨대, 피브로넥틴 도메인 Ⅲ, 라미닌 LG 도메인, 콜라겐 헤파린 결합 도메인, 비트로넥틴 헤파린 결합 도메인, 또는 피브리노겐을 비제한적으로 포함하는 세포외 기질 단백질의 헤파린 결합 또는 신데칸 결합 도메인으로부터 유래되는 짧은 펩티드를 나타낸다. 한 구현예에서, 상기 GF 결합 펩티드 모티프는 5-40개 아미노산 또는 그의 조합을 포함한다. 다양한 구현예에서, 상기 GF 결합 펩티드 모티프는 피브로넥틴-유래 KYILRWRPKNS(서열번호 7), YRVRVTPKEKTGPMKE(서열번호 8), SPPRRARVT(서열번호 9), ATETTITIS(서열번호 10), VSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFG(서열번호 11), ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13), PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV(서열번호 14), WQPPRARI(서열번호 15), WQPPRARITGYIIKYEKPG(서열번호 16), YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17), KNNQKSEPLIGRKKT(서열번호 18), 또는 라미닌-유래 GLIYYVAHQNQM(서열번호 19), RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), GLLFYMARINHA(서열번호 21), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), VVRDITRRGKPG(서열번호 23), RAYFNGQSFIAS(서열번호 24), GEKSQFSIRLKT(서열번호 25), TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL(서열번호 26), TLFLAHGRLVFM(서열번호 27), LVFMFNVGHKKL(서열번호 28), GAAWKIKGPIYL(서열번호 29), VIRDSNVVQLDV(서열번호 30), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), GPLPSYLQFVGI(서열번호 33), RNRLHLSMLVRP(서열번호 34), LVLFLNHGHFVA(서열번호 35), AGQWHRVSVRWG(서열번호 36), KMPYVSLELEMR(서열번호 37), RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), TVFSVDQDNMLE(서열번호 40), APMSGRSPSLVLK(서열번호 41), VLVRVERATVFS(서열번호 42), RNIAEIIKDI(서열번호 43), PGRWHKVSVRWE(서열번호 76), 또는 콜라겐-유래 KGHRGF(서열번호 44), TAGSCLRKFSTM(서열번호 45), GEFYFDLRLKGDK(서열번호 46), 또는 비트로넥틴-유래 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47), 또는 뼈 시알로단백질 유래 KRSR(서열번호 48), KRRA(서열번호 49)로 이루어진 헤파린 결합 또는 신데칸 결합 펩티드의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "인테그린 결합 모티프"는 예컨대, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 비트로넥틴, 또는 테나신을 비제한적으로 포함하는 세포외 기질 단백질로부터 유래되는 짧은 펩티드를 나타낸다. 상기 인테그린 결합 모티프는 인테그린 αv, α5, α8 또는 α9에 결합하고 이를 활성화시켜 세포 부착을 지지하며, 헤파린 결합 모티프에 결합된 성장 인자와 함께 형태형성(morphogenesis)을 유도할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 헤파린 결합 펩티드는 인테그린 αv 결합 RGD(서열번호 50), RGDV(서열번호 51), PQVTRGDVFTMP(서열번호 52), 또는 인테그린 α5 결합 GRGDSP(서열번호 53), PHSRNSGSGSGSGSGRGDSP(서열번호 54), 또는 인테그린 α9 결합 EDGIHEL(서열번호 55), VAEIDGIEL(서열번호 56), 또는 인테그린 α8 결합 VFDNFVLK(서열번호 57)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 성장 인자를 동시에 또는 선택적으로 격리하거나 이에 결합하는 GF 결합 펩티드 모티프를 제공하는 단백질 기판을 개시한다. 임의의 적합한 GF 결합 펩티드 모티프는 상기 헤파린 결합 모티프의 용어 정의에서 상세히 기술된 것과 같이 피브로넥틴 도메인 Ⅲ, 라미닌 LG 도메인, 콜라겐 헤파린 도메인, 비트로넥틴 헤파린 도메인, 또는 뼈 시알로단백질로부터 유래되는 헤파린 결합 또는 신데칸 결합 모티프로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 구현예에서, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 격리하거나 이에 결합하기 위한 단백질 기판이 개시된다. 일반적으로, 상기 GF 결합 펩티드 모티프는 bFGF 결합을 위한 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐의 헤파린/신데칸 결합 도메인으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 피브로넥틴-유래 펩티드 PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV(서열번호 14), WQPPRARI(서열번호 15), 라미닌-유래 펩티드 RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), VLVRVERATVFS(서열번호 42), 또는 콜라겐-유래 KGHRGF(서열번호 44)가 bFGF를 격리하거나 이에 결합하기 위해 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 전환 성장 인자 β(TGF-β)를 격리하거나 이에 결합하기 위한 GF 결합 펩티드 모티프를 제공하기 위한 단백질 기판을 개시한다. 상기 GF 결합 펩티드 모티프는 TGF-β 결합을 위한 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 비트로넥틴, 또는 뼈 시알로단백질의 헤파린/신데칸 결합 도메인으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 피브로넥틴-유래 모티프 ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13), PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV(서열번호 14), WQPPRARI(서열번호 15), WQPPRARITGYIIKYEKPG(서열번호 16), YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17), 또는 라미닌-유래 펩티드 GLIYYVAHQNQM(서열번호 19), RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), GLLFYMARINHA(서열번호 21), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), VVRDITRRGKPG(서열번호 23), RAYFNGQSFIAS(서열번호 24), GEKSQFSIRLKT(서열번호 25), TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL(서열번호 26), TLFLAHGRLVFM(서열번호 27), LVFMFNVGHKKL(서열번호 28), GAAWKIKGPIYL(서열번호 29), VIRDSNVVQLDV(서열번호 30), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), GPLPSYLQFVGI(서열번호 33), RNRLHLSMLVRP(서열번호 34), LVLFLNHGHFVA(서열번호 35), AGQWHRVSVRWG(서열번호 36), KMPYVSLELEMR(서열번호 37), RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), TVFSVDQDNMLE(서열번호 40), APMSGRSPSLVLK(서열번호 41), VLVRVERATVFS(서열번호 42), RNIAEIIKDI(서열번호 43), 또는 콜라겐-유래 KGHRGF(서열번호 44), TAGSCLRKFSTM(서열번호 45), GEFYFDLRLKGDK(서열번호 46), 또는 비트로넥틴-유래 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47), 또는 뼈 시알로단백질 유래 KRSR(서열번호 48), KRRA(서열번호 49)가 TGF-β에 결합하거나 이를 격리하기 위해 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 헤파린 결합 모티프는 피브로넥틴 유래 ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13), YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17), 또는 라미닌 유래 KNSFMALYLSKG(서열번호 22), RYVVLPR(서열번호 38), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), VLVRVERATVFS(서열번호 42), 또는 비트로넥틴 유래 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47), 또는 뼈 시알로단백질 유래 KRSR(서열번호 48), KRRA(서열번호 49)로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)를 격리하거나 이에 결합하기 위한 GF 결합 펩티드 모티프를 제공하기 위한 단백질 기판을 개시한다. 상기 PDGF 결합 모티프는 라미닌 유래 모티프 GLIYYVAHQNQM(서열번호 19), RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), GLLFYMARINHA(서열번호 21), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), VVRDITRRGKPG(서열번호 23), RAYFNGQSFIAS(서열번호 24), GEKSQFSIRLKT(서열번호 25), TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL(서열번호 26), TLFLAHGRLVFM(서열번호 27), LVFMFNVGHKKL(서열번호 28), GAAWKIKGPIYL(서열번호 29), VIRDSNVVQLDV(서열번호 30), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), GPLPSYLQFVGI(서열번호 33), RNRLHLSMLVRP(서열번호 34), LVLFLNHGHFVA(서열번호 35), AGQWHRVSVRWG(서열번호 36), KMPYVSLELEMR(서열번호 37), RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), TVFSVDQDNMLE(서열번호 40), APMSGRSPSLVLK(서열번호 41), VLVRVERATVFS(서열번호 42), RNIAEIIKDI(서열번호 43), PGRWHKVSVRWE(서열번호 76), 또는 비트로넥틴 유래 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47), 또는 뼈 시알로단백질 유래 KRSR(서열번호 48), KRRA(서열번호 49)로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 PDGF 결합 모티프는 RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), RYVVLPR(서열번호 38), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), VLVRVERATVFS(서열번호 42), 또는 비트로넥틴 유래 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47), 또는 뼈 시알로단백질 유래 KRSR(서열번호 48)로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 생리적 조건에서 성장 인자의 서방형 방출을 위한 단백질 기판을 개시한다.
세포외 기질에 존재하는 헤파린 설페이트와의 상호작용은 조직의 항상성에서 FGF와 같은 성장 인자의 확산(Duchesne L, et al, Transport of fibroblast growth factor 2 in the pericellular matrix is controlled by the spatial distribution of its binding sites in heparan sulfate. PLoS Biol. 2012; 10(7):e1001361., Dowd CJ, et al, Heparan sulfate mediates bFGF transport through basement membrane by diffusion with rapid reversible binding. J Biol Chem. 1999 19; 274(8):5236-44) 뿐만 아니라 FGF의 저장 및 방출을 직접적으로 조절함이 잘 알려져 있다(Bashkin P, et al., asic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules. Biochemistry. 1989 21; 28(4):1737-43).
한 구현예에서, 본 발명은 생리학적 조건에서 수 일의 기간에 걸쳐서 기능의 손실이 없는 TGF-β의 서방형 방출 시스템으로서 단백질 기판을 제공한다. 상기 단백질 기판은 생리적 조건에서 TGF-β의 서방형 방출을 위하여 KNSFMALYLSKG(서열번호 22), RYVVLPR(서열번호 38), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), VLVRVERATVFS(서열번호 42)로부터 선택되는 TGF-β 결합 모티프를 제공한다.
본 발명은 또한 인테그린 결합 펩티드 모티프 및 GF 결합 펩티드 모티프를 동시에 제공하기 위한 단백질 기판을 개시한다. 인테그린 결합 모티프는 재조합 접착 단백질의 N-말단 내로 통합될 수 있고, 성장 인자 또는 사이토카인 결합 모티프는 상기 접착 단백질의 C-말단 내로 통합될 수 있으며, 그 반대일 수도 있다.
인테그린 및 성장 인자 수용체 사이의 크로스토크(crosstalk)는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 장 등은 FGF2-FNIII9-10 융합 단백질이 FNIII9-10 단독과 비교하여 MG63 세포의 세포 부착 및 증식의 현저한 증가를 나타내고(Jun-Hyeog Jang & Chong-Pyoung Chung, Engineering and expression of a recombinant fusion protein possessing fibroblast growth factor-2 and fibronectin fragment. Biotechnology Letters volume 26, p1837-1840(2004)), FNIII9-10-매개 부착이 PC12 세포의 신경돌기 성장물(neurite outgrowth)에 대한 FGF1의 효과를 촉진함을 보고하였다(Choung PH, et al., Synergistic activity of fibronectin and fibroblast growth factor receptors on neuronal adhesion and neurite extension through extracellular signal-regulated kinase pathway. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 295: 898-902).
한 구현예에서, 본 발명은 RGDSGSGSGSGSGANGQTPIQRYIK(서열번호 58)를 갖는 피브로넥틴 도메인 Ⅲ을 모방하는 단백질 기판을 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 피브로넥틴 도메인 Ⅲ(서열번호 59)을 모방하는 단백질 기판을 개시하며, 여기서 인테그린 결합 모티프 RGD(서열번호 50)는 접착 단백질의 C-말단에 통합되고, 성장 인자 또는 사이토카인, 예를 들면, TGF-β 결합 모티프 ANGQTPIQRYIK(서열번호 12)는 접착 단백질의 N-말단에 통합된다.
본 발명은 또한 상처 치유, 혈관형성 또는 발병, 예컨대 섬유증 또는 종양의 전이와 직접적으로 연관되는 표현형 가소성을 제어하기 위하여 인테그린 및 성장 인자 수용체를 동시에 활성화시키는 미세환경 표면을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 상피 세포에서 상피 간엽 이행(EMT)을 유도하기 위하여 상기 단백질 기판을 포함하는 합성 종양 미세환경 표면을 제공한다.
EMT는 상피 세포가 E-카드헤린(Cadherin)을 포함하는 상피 단백질을 잃고, N-카드헤린, 비멘틴(Vimentin) 및 피브로넥틴과 같은 간엽 마커를 획득하는 공정이다. EMT는 배아 또는 암 발생 및/또는 진행(Kalluri R, et al. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2009;119:1420-8. Jordan NV, et al. Tracking the intermediate stages of epithelial-mesenchymal transition in epithelial stem cells and cancer. Cell Cycle. 201; 10:2865-73), 상처 치유 및 조직 복구, 및 세포 이동을 포함하는 많은 공정과 연관된다(Hosaka K, et al. Pericyte-fibroblast transition promotes tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E5618-27. Yang X, et al. Silencing Snail suppresses tumor cell proliferation and invasion by reversing epithelial-to-mesenchymal transition and arresting G2/M phase in non-small cell lung cancer. Int J Oncol. 2017; 50:1251-60). EMT 사건은 발생 및 상처 복구를 위해 필수적이기는 하지만, 이것은 또한 섬유성 질환 및 암에 대한 기여 인자로서 인식되어 왔다. TGF-β 및 ECM 단백질을 포함하는 많은 가용성 및 불용성 인자가 EMT 사건의 정도 및 기간을 결정한다. 구체적으로, 사이토카인, 예컨대 TGF-β, TNFα, 및 IL6 및 저산소증은 다양한 종양에서 EMT를 유도할 수 있다.
콜라겐-I, 피브로넥틴, 및 히알루로난(hyaluronan)을 포함하는 몇 가지 세포외 기질(ECM) 단백질, 및 세포외 라이실 옥시다아제(lysyl oxidase)를 통한 ECM 리모델링이 또한 EMT의 조절에 영향을 미친다(Hae-Yun Jung, et al. Clin Cancer Res; 21(5) March 1, 2015. Molecular Pathways: Linking Tumor Microenvironment to Epithelial-Mesenchymal Transition in Metastasis). 몇 가지 인테그린은 EMT를 매개하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, EMT는 TGF-β1-Smad2/3 신호전달 경로의 활성화를 통해 인테그린 αvβ6에 의해 조절된다(Wang J, et al. (2015) Interleukin-1beta promotes epithelial-derived alveolar elastogenesis via αvβ6 integrin-dependent TGF-beta activation. Cell Physiol Biochem 36:2198-2216). 피브로넥틴에 결합하는 α5β1, 및 콜라겐 I과 상호작용하는 인테그린 α1β1 및 α2β1을 포함하는 몇 가지 인테그린 복합체의 발현이 또한 EMT 동안에 상향조절되고, E-카드헤린 복합체의 파괴를 매개하는 것으로 나타났다. ECM과 세포의 상호작용은 ECM-연관 단백질, 예컨대 콜라겐 및 α2β1의 상호작용을 촉진하기 위한 당단백질인 SPARC에 의해 조정되는 것으로 나타났다.
한 구현예에서, 본 발명은 유방암 세포주인 MCF-10A에서 EMT를 유도하기 위하여 인테그린 α5β1, α9β1, 또는 αvβ3 결합 모티프로부터 선택되는 인테그린 결합 모티프, 및 ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13) 또는 YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17)로부터 선택되는 사이토카인 결합 모티프를 포함하는 단백질 기판을 제공한다.
본 발명은 또한 세포 배양 배지 또는 버퍼 용액, 예컨대 PBS 버퍼에서 성장 인자 또는 사이토카인 결합 모티프를 포함하는 단백질 기판을 성장 인자 또는 사이토카인과 혼합함으로써 세포 배양 조건에서 장기간 동안 생물학적 활성의 손실에 대해 성장 인자 또는 사이토카인을 안정화시키기 위한 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 사이토카인 결합 모티프 ANGQTPIQRYIK(서열번호 12) 및 성장 인자 결합 모티프 YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17)를 제공하는 단백질 기판을 포함하는 조성물은 DMEM과 같은 세포 배양 배지 또는 PBS와 같은 버퍼 용액에 용해된다. 상기 조성물은 유방 상피 세포주인 MCF-10A에서의 EMT 촉진 테스트에서 실증되는 것과 같이 그 생물학적 활성의 손실 없이 적어도 1주 동안 보관될 수 있다.
이하, 본 발명은 제조예, 실시예, 및 그의 실험예를 참조하여 상세히 기술될 것이다.
그러나, 다음의 제조예, 실시예, 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 제공될 뿐, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아님이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1. 인테그린 결합 모티프 및 헤파린 결합 모티프를 제공하는 단백질 기판의 제조
홍합 족사 단백질 1 및 족사 단백질 5의 융합 단백질을 포함하는 다양한 홍합 접착 단백질을 효율적인 방식으로 생산하기 위한 대장균(E. coli) 기반의 단백질 발현 시스템이 상업화되어 있으며(US2020/0062809A1 및 WO2011/115420A2 참조), 상기 홍합 접착 단백질은 콜로디스 바이오사이언스, 인코포레이티드에 의해 시판되는 상표명 MAPTrix™ 하에 상업적으로 이용가능하다. 홍합 접착 단백질을 제조하기 위한 방법은 본 명세서에 완전히 개시된 것과 같이 모든 목적을 위하여 인용에 의해 본 명세서에 통합되는 US20200/062809A1 및 WO2011/115420A2에 완전히 기술되어 있다.
단백질 기판의 기본적인 방식은 도 1a에 예시되어 있다. 도 1a에 나타낸 것과 같이, 2개의 펩티드 모티프는 각각 홍합 접착 단백질의 N-말단 및 C-말단 내로 통합될 수 있다(방식 A). 대안적으로, 도 1b에 나타낸 것과 같이, 양쪽 모티프는 C-말단 또는 N-말단 내로 통합될 수 있으며(방식 B), 여기서 SGSGSGSGSG와 같은 스페이서 링커 펩티드는 상승 효과를 위하여 2개의 펩티드를 효과적으로 분리한다.
서열번호 58(이하, "MAP-RGD-GF"라 함) 및 서열번호 59(이하, "GF-MAP-RGD"라 함)를 갖는 2가지 타입의 단백질 기판을 US2020/0062809A1 및 WO2011/115420A2에 개시된 것과 같이 재조합적으로 디자인하고, 대장균 발현 시스템에서 발현 및 정제하였다. GF 결합 모티프를 갖는 다수의 단백질 기판을 동일한 절차로 생산하였다. 모든 단백질 기판을 동결건조하였고, 추가적인 실험을 위해 냉장고에 보관하였다.
실시예 2. 성장 인자 결합 분석법
성장 인자 또는 사이토카인 결합 분석법을 위한 복수의 배열은 도 2a 및 도 2b에 나타낸 것과 같이 96 웰 포맷에 정렬된 많은 수의 헤파린 결합 펩티드 모티프로 구성되어 있다. 도 2a는 피브로넥틴, 콜라겐, 및 라미닌 유래 GF 결합 모티프의 배열 레이아웃이고, 도 2b는 라미닌 구형 도메인 유래 GF 결합 모티프의 배열 레이아웃이다.
성장 인자 또는 사이토카인에 대한 펩티드 모티프의 특이적 결합을 위하여, 낮은 세포-부착 또는 초소수성 표면을 기판 단백질로 코팅하였고, 여기서 상기 기판 단백질은 입자로 형성되었다. 따라서, 상기 표면은 도 1b에 나타낸 것과 같이 입자 섬처럼 보인다. 상기 코팅 방법은 최신 기술이며, 상세한 절차는 본 발명자들에 의해 개발되고 참조로서 본 명세서에 완전히 통합되는 미국 특허 출원 US 16/546,966에 기술되어 있다. 상기 표면은 GF와 같은 생체분자 또는 표적 세포가 표면에 제공되는 펩티드 모티프에 특이적으로 결합하게 한다. 비-표적 생체분자 또는 세포는 현탁되도록 강제되고, 결국 세척되어 버린다.
재조합 염기성 FGF, TGF-β, PDGF-BB는 R&D 시스템즈(Camarillo, CA)로부터 구입하였고, 초저(Ultralow) 세포-부착 96 웰 플레이트는 코닝(Corning, NY)으로부터 구입하였다. 지방산-부재 소 혈청 알부민(BSA)은 시그마-알드리치 코퍼레이션(St. Louise, MO)로부터 구입하였고, 소 태아 혈청은 써모 피셔 사이언티픽(Waltham, MA)으로부터 구입하였다.
재조합 성장 인자의 임의의 비-특이적 결합을 제거하거나 최소화하기 위하여, 기판 단백질로 코팅된 96 웰 플레이트 표면을 PBST 버퍼(4 mM 포스페이트 및 155 mM 염화나트륨, 0.05 wt% Tween-20, pH 7.4) 중의 2 wt% BSA를 이용해 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 교반함으로써 차단하였다. 이후, PBST에 용해된 개별 재조합 성장 인자(50 nM)를 헤파린 결합 모티프를 포함하는 차단된 웰 플레이트에 첨가하였고, 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 교반하였다. 상기 웰 플레이트에 코팅된 단백질 기판에 대한 성장 인자의 결합은 면역친화도 분석법에 의해 확인하였다. 간략하게, 상기 웰 플레이트를 상기 성장 인자에 대한 1차 항체 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)로 표지된 2차 항체로 순차적으로 처리하였다. 마지막으로, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 기판을 HRP에 의해 화학적으로 교환하고, 450 nm에서의 흡광도 값을 사용하여 각각의 결합 모티프에 대한 성장 인자의 결합을 분석하였다. 도 3은 성장 인자 결합에 대응하는 TMB 흡광도 값을 보여준다. 상기 값에 성장 인자가 없은 블랭크 샘플의 흡광도 값을 뺐다. 0.1을 초과하는 흡광도 판독값은 유의미한 상호작용으로 간주하였다.
도 4a 및 도 4b에 나타낸 것과 같이, 본 발명자들은 bFGF, TGF-β, 및 PDGF-BB에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 유래 GF 결합 모티프를 확인하였다. 각각의 성장 인자에 대해 높은 친화도를 갖는 GF 결합 모티프는 다음의 표 1에 요약되어 있다.
펩티드 모티프 염기성 FGF TGF-β PDGF
KYILRWRPKNS 높음
YRVRVTPKEKTGPMKE
SPPRRARVT
ATETTITIS
VSPPRRARVTDATETTITIS-WRTKTETITGFG
ANGQTPIQRYIK 높음 높음
KPDVRSYTITG 높음
PRARITGYIIKYEKPGSPPR-EVVPRPRPGV 높음
WQPPRARI 중간 중간
WQPPRARITGYIIKYEKPG
YEKPGSPPREVVPRPRP 높음 중간
KNNQKSEPLIGRKKT
RYVVLPR 높음
KGHRGF
도 4c에 나타낸 것과 같이, 대부분의 라미닌 유래 GF 결합 펩티드 모티프는 TGF-β 및 PDGF에 대해 더 높은 친화도를 보였지만, 피브로넥틴 GF 결합 모티프의 경우와 유사하게 bFGF에 대해서는 상대적으로 낮은 친화도를 보였다.
실시예 3. 단백질 기판에 결합된 성장 인자의 서방형 방출
ECM 단백질 내의 헤파린 결합 도메인은 생리학적 조건에서 성장을 안정화시키는 것으로 나타났다. 상기 GF 결합 펩티드 모티프가 성장 인자에 대한 임의의 보호 효과를 부여하는지 여부를 결정하기 위하여, 실시예 2에서 확인된 GF 결합 펩티드 모티프의 존재 또는 부재 하에 TGF-β를 PBS 버퍼 또는 세포 배양 배지인 DMEM을 이용해 조건화하였다. bFGF(0.5 ㎍)를 상기 단백질 기판 코팅 표면에 첨가하였고, 37℃에서 2, 4, 및 7일 동안 인큐베이션하였다. 본 발명자들은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용해 37℃에서 시간에 따른 TGF-β의 안전성을 평가하였고, 단백질 기판으로부터 천천히 방출되는 것과 그 반감기가 4일임을 밝혔다. 도 5b에 나타낸 것과 같이, TGF-β에 대해 높은 친화도를 갖는 GF 결합 모티프(ANG-MAP-RGD-IDAP)는 세포 배양 조건에서 TGF-β의 장기간의 서방형 방출을 나타낸다.
실시예 4. 상피 세포의 간엽 세포로의 트랜스분화(transdifferentiation)를 유도하기 위한 합성 미세환경
실시예 2 및 실시예 3에서 확인된 TGF-β 결합 모티프를 6 웰 플레이트에 배열하였다. 실시예 2에 개시된 것과 같이 TGF-β(5 ng)를 처리한 후, 상기 6 웰 플레이트를 소정의 시간 동안(예컨대, 각각 2, 4 및 7일) 37℃의 CO2 인큐베이터에 보관하였다. 유방 상피 세포인 MCF-10A를 접종하고, TGF-β 결합 펩티드 모티프가 코팅된 웰 플레이트에서 배양하였다. 도 6b에 나타낸 것과 같이, TGF-β에 대한 높은 친화도를 갖는 2개의 모티프는 MCF-10A가 EMT를 겪는 것을 유도할 수 있었지만, 낮은 TGF-β 결합 친화도 모티프인 WQPPRARI(서열번호 15)는 피브로넥틴 상향조절이 없는 것에 의해 입증되는 것과 같이 EMT를 유도할 수 없었다.
실시예 5. 트립신 활성으로부터의 GF 보호
실시예 2 및 실시예 3에서 확인된 TGF-β 결합 펩티드 모티프를 30℃에서 15분 동안 TGF-β(2 ㎍) 및 트립신(0.3 ㎍)과 함께 인큐베이션하였다. 트립신화 후, 샘플의 단백질을 크기-의존적 방식으로 15% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이후, SDS-PAGE를 2시간 동안 쿠아마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였다. 탈염색 후, 쿠아마시 블루 용액에 의해 염색된 밴드의 강도를 분석하였다. 도 7에 나타낸 것과 같이, ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), ANG-M-RGD(서열번호 59), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), KRSR(서열번호 48), 및 RKRLQVQLSIRT(서열번호 20) 모티프는 MAP-융합 모티프가 없는 경우와 비교하여 TGF-β의 트립신화를 억제하였다.
실시예 6. 세포 성장을 위한 성장 인자 결합 단백질 기판
총 96-웰의 플레이트(비-조직 배양 처리됨, SPL Life Science)를 나트륨 아세테이트 버퍼에서 실온에서 1시간 동안 GF 결합 펩티드 모티프를 갖는 단백질 기판을 이용해 50 ㎍/㎖로 코팅하였다. 0.5% FBS를 갖는 DMEM 중의 20 ng/㎖의 FGF2 및 PDGF-BB(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 개별 웰에 첨가하였고, CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.5% 우 태아 혈청(FBS)으로 보충된 DMEM 배지(Invitrogen)에서 인간 포피 섬유아세포(Hs68, ATCC)를 이용해 세포 성장 분석법을 수행하였다. 세포를 GF 결합 기판이 사전-코팅된 플레이트 상에 1,500 세포/웰로 접종하였고, CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, CCK-8 분석법을 수행하여 세포 성장을 결정하였다. Hs68 세포에 대해 마이코플라즈마(mycoplasma) 오염을 체크한 후, 5 내지 10의 계대배양에 사용하였다. GF 결합 펩티드 모티프 및 헤파린이 없는 단백질 기판을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다.
도 8a 및 도 8b에 나타낸 것과 같이, GF 결합 단백질 기판은 세포의 성장 및 증식을 뒷받침하였다. 단백질 기판에 결합된 GF는 헤파린 결합 GF와 비교할 때 낮은 혈청 조건(0.5% FBS)에서 인간 포피 섬유아세포의 성장 및 증식을 강하게 뒷받침하였다.
상기 기술로부터, 본 개시된 주제에 대해 다양한 용법 및 조건에 채택되기 위한 변경 및 변형이 행해질 수 있음이 자명할 것이다. 이러한 구현예는 또한 다음의 청구항의 범위 내에 속한다.
본 명세서에 개시된 변수들의 임의의 정의에서 요소들의 목록을 인용하는 것은 임의의 단일 요소 또는 열거된 요소들의 조합(또는 하위-조합)과 같은 해당 변수의 정의들을 포함한다. 본 명세서에서 구현예를 인용하는 것은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 그의 일부와의 조합으로서의 해당 구현예를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공개문헌은 각각의 독립적인 특허 또는 공개문헌이 구체적으로 및 개별적으로 인용에 의해 통합되는 것을 시사하는 것과 동일한 정도로 인용에 의해 본 명세서에 통합된다.
<110> TME Therapeutics Co. Ltd. <120> PROTEIN SUBSTRATE TO BIND GROWTH FACTOR <130> 2020-OPA-4820PC/KR <150> US 63/126,245 <151> 2020-12-16 <160> 76 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein 1 decapeptide repeat <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus edulis) <400> 2 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Glu Phe Glu Phe 50 <210> 3 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 5 (FP-5, Mytilus edulis) <400> 3 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 5 (FP-5, Mytilus galloprovincialis) <400> 4 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 5 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-151, MEFP-5 based: Kollodis) <400> 5 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 130 135 140 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 165 170 175 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 180 185 190 Tyr Lys <210> 6 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-151, MGFP-5 based) <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin I-derived peptide (KYILRWRPKNS) <400> 7 Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (YRVRVTPKEKTGPMKE) <400> 8 Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (SPPRRARVT) <400> 9 Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (ATETTITIS) <400> 10 Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser 1 5 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (VSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFG) <400> 11 Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 1 5 10 15 Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (ANGQTPIQRYIK) <400> 12 Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Tyr Ile Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (KPDVRSYTITG) <400> 13 Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV) <400> 14 Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val 20 25 30 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (WQPPRARI) <400> 15 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile 1 5 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (WQPPRARITGYIIKYEKPG) <400> 16 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu 1 5 10 15 Lys Pro Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (YEKPGSPPREVVPRPRP) <400> 17 Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin III-derived peptide (KNNQKSEPLIGRKKT) <400> 18 Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha1-derived peptide (GLIYYVAHQNQM) <400> 19 Gly Leu Ile Tyr Tyr Val Ala His Gln Asn Gln Met 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha1-derived peptide (RKRLQVQLSIRT) <400> 20 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha2-derived peptide (GLLFYMARINHA) <400> 21 Gly Leu Leu Phe Tyr Met Ala Arg Ile Asn His Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha3-derived peptide (KNSFMALYLSKG) <400> 22 Lys Asn Ser Phe Met Ala Leu Tyr Leu Ser Lys Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (VVRDITRRGKPG) <400> 23 Val Val Arg Asp Ile Thr Arg Arg Gly Lys Pro Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (RAYFNGQSFIAS) <400> 24 Arg Ala Tyr Phe Asn Gly Gln Ser Phe Ile Ala Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (GEKSQFSIRLKT) <400> 25 Gly Glu Lys Ser Gln Phe Ser Ile Arg Leu Lys Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL) <400> 26 Thr Leu Phe Leu Ala His Gly Arg Leu Val Phe Met Phe Asn Val Gly 1 5 10 15 His Lys Lys Leu 20 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (TLFLAHGRLVFM) <400> 27 Thr Leu Phe Leu Ala His Gly Arg Leu Val Phe Met 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (LVFMFNVGHKKL) <400> 28 Leu Val Phe Met Phe Asn Val Gly His Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (GAAWKIKGPIYL) <400> 29 Gly Ala Ala Trp Lys Ile Lys Gly Pro Ile Tyr Leu 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha4-derived peptide (VIRDSNVVQLDV) <400> 30 Val Ile Arg Asp Ser Asn Val Val Gln Leu Asp Val 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (GKNTGDHFVLYM) <400> 31 Gly Lys Asn Thr Gly Asp His Phe Val Leu Tyr Met 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (RLVSYSGVLFFLK) <400> 32 Arg Leu Val Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (GPLPSYLQFVGI) <400> 33 Gly Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Gln Phe Val Gly Ile 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (RNRLHLSMLVRP) <400> 34 Arg Asn Arg Leu His Leu Ser Met Leu Val Arg Pro 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (LVLFLNHGHFVA) <400> 35 Leu Val Leu Phe Leu Asn His Gly His Phe Val Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (AGQWHRVSVRWG) <400> 36 Ala Gly Gln Trp His Arg Val Ser Val Arg Trp Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (KMPYVSLELEMR) <400> 37 Lys Met Pro Tyr Val Ser Leu Glu Leu Glu Met Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (RYVVLPR) <400> 38 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg 1 5 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin-derived peptide (VRWGMQQIQLVV) <400> 39 Val Arg Trp Gly Met Gln Gln Ile Gln Leu Val Val 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin-derived peptide (TVFSVDQDNMLE) <400> 40 Thr Val Phe Ser Val Asp Gln Asp Asn Met Leu Glu 1 5 10 <210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin-derived peptide (APMSGRSPSLVLK) <400> 41 Ala Pro Met Ser Gly Arg Ser Pro Ser Leu Val Leu Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin-derived peptide (VLVRVERATVFS) <400> 42 Val Leu Val Arg Val Glu Arg Ala Thr Val Phe Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin-derived peptide (RNIAEIIKDI) <400> 43 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen I-derived peptide (KGHRGF) <400> 44 Lys Gly His Arg Gly Phe 1 5 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen IV-derived peptide (TAGSCLRKFSTM) <400> 45 Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met 1 5 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen IV-derived peptide (GEFYFDLRLKGDK) <400> 46 Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vitronectin-derived peptide (KKQRFRHRNRKGYRSQ) <400> 47 Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bone sialoprotein-derived peptide (KRSR) <400> 48 Lys Arg Ser Arg 1 <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bone sialoprotein-derived peptide (KRRA) <400> 49 Lys Arg Arg Ala 1 <210> 50 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (RGD) <400> 50 Arg Gly Asp 1 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (RGDV) <400> 51 Arg Gly Asp Val 1 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (PQVTRGDVFTMP) <400> 52 Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (GRGDSP) <400> 53 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (PHSRNSGSGSGSGSGRGDSP) <400> 54 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg 1 5 10 15 Gly Asp Ser Pro 20 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin-derived peptide (EDGIHEL) <400> 55 Glu Asp Gly Ile His Glu Leu 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tenascin-derived peptide (VAEIDGIEL) <400> 56 Val Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tenascin-derived peptide (VFDNFVLK) <400> 57 Val Phe Asp Asn Phe Val Leu Lys 1 5 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin domain III mimetic (RGDSGSGSGSGSGANGQTPIQRYIK) <400> 58 Arg Gly Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asn Gly 1 5 10 15 Gln Thr Pro Ile Gln Arg Tyr Ile Lys 20 25 <210> 59 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin domain III mimetic (ANGQTPIQRYIK - FP151 - RGD) <400> 59 Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Tyr Ile Lys Ala Lys Pro Ser 1 5 10 15 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 20 25 30 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 35 40 45 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 50 55 60 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His 85 90 95 Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala 100 105 110 Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu 115 120 125 Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Arg Gly 195 200 205 Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Asp Ala Pro Ser 210 215 220 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 times repeated sequence derived from foot protein 1 (FP-1) <400> 60 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys 20 <210> 61 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 times repeated sequence derived from foot protein 1 (FP-1) <400> 61 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 62 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of foot protein type 2 (FP-2) <400> 62 Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys 35 <210> 63 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus galloprovincialis : mgfp-3A) <400> 63 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 64 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus edulis: mefp-3F) <400> 64 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Asn Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Asn Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Arg Tyr Gly 20 25 30 Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Asn Arg Gly Arg Arg Gly Lys 35 40 45 Tyr Trp 50 <210> 65 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus californianus) <400> 65 Gly Ala Tyr Lys Gly Pro Asn Tyr Asn Tyr Pro Trp Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Asn Gly Tyr Lys Gly Tyr Pro Arg Gly Tyr Gly Trp Asn Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Lys Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 <210> 66 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence from foot protein type 4 (Mytilus californianus) <400> 66 Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His 1 5 10 15 Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His 20 25 30 Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val 35 40 45 Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His 50 55 60 <210> 67 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein 5 (FP-5, Mytilus edulis) <400> 67 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 68 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein 5 (FP-5, Mytilus coruscus) <400> 68 Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr 20 25 30 Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr 35 40 45 Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys 50 55 60 His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 65 70 <210> 69 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mussel adhesive protein foot protein type 6 <400> 69 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg 35 40 45 Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys 50 55 60 Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg 85 90 95 Ser Gly Tyr <210> 70 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-151, MCFP-5 based) <400> 70 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Tyr Asp Gly Tyr 50 55 60 Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gly Ser 65 70 75 80 His Gly Tyr His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly 85 90 95 Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu 100 105 110 Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 130 135 140 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 165 170 175 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185 190 <210> 71 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-131) <400> 71 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Arg Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu 100 105 110 Phe Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 115 120 125 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 130 135 140 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys 165 170 175 Leu <210> 72 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-251) <400> 72 Met Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg 1 5 10 15 Cys Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly 20 25 30 Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly 35 40 45 Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His 50 55 60 Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala 65 70 75 80 Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly 100 105 110 Gly Ser Ser Glu Phe Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 115 120 125 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys Lys 180 <210> 73 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-353) <400> 73 Gly Cys Arg Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly 20 25 30 Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg 35 40 45 Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe Tyr Asp Gly Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gly Ser His Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr 85 90 95 Lys Tyr Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys 100 105 110 Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly 115 120 125 Cys Arg Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 130 135 140 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys 165 170 175 Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe 180 <210> 74 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mussel adhesive protein (FP-13151) <400> 74 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Arg Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu 100 105 110 Phe Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 115 120 125 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 130 135 140 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Lys 165 170 175 Leu Tyr Asp Gly Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn 180 185 190 Tyr Pro Ser Gly Ser His Gly Tyr His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys 195 200 205 Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Arg Thr Gly 210 215 220 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 245 250 255 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 260 265 270 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 275 280 285 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 290 295 300 Pro Pro Thr Tyr Lys 305 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer linker peptide <400> 75 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laminin alpha5-derived peptide (PGRWHKVSVRWE) <400> 76 Pro Gly Arg Trp His Lys Val Ser Val Arg Trp Glu 1 5 10

Claims (19)

  1. 인테그린 결합 모티프 및 성장 인자에 결합하거나 이를 격리할 수 있는 헤파린 결합 모티프로 유전적으로 기능화된 재조합 접착 단백질을 포함하는 단백질 기판.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 헤파린 결합 모티프는 콜라겐, 비트로넥틴, 및 뼈 시알로단백질의 피브로넥틴 도메인 Ⅲ, 라미닌 구형 도메인, 및 헤파린 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 유래되는 단백질 기판.
  3. 청구항 2에 있어서,
    피브로넥틴 도메인 Ⅲ로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KYILRWRPKNS(서열번호 7), YRVRVTPKEKTGPMKE(서열번호 8), SPPRRARVT(서열번호 9), ATETTITIS(서열번호 10), VSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFG(서열번호 11), ANGQTPIQRYIK(서열번호 12), KPDVRSYTITG(서열번호 13), PRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGV(서열번호 14), WQPPRARI(서열번호 15), WQPPRARITGYIIKYEKPG(서열번호 16), YEKPGSPPREVVPRPRP(서열번호 17), 및 KNNQKSEPLIGRKKT(서열번호 18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 기판.
  4. 청구항 2에 있어서,
    라미닌 구형 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 GLIYYVAHQNQM(서열번호 19), RKRLQVQLSIRT(서열번호 20), GLLFYMARINHA(서열번호 21), KNSFMALYLSKG(서열번호 22), VVRDITRRGKPG(서열번호 23), RAYFNGQSFIAS(서열번호 24), GEKSQFSIRLKT(서열번호 25), TLFLAHGRLVFMFNVGHKKL(서열번호 26), TLFLAHGRLVFM(서열번호 27), LVFMFNVGHKKL(서열번호 28), GAAWKIKGPIYL(서열번호 29), VIRDSNVVQLDV(서열번호 30), GKNTGDHFVLYM(서열번호 31), RLVSYSGVLFFLK(서열번호 32), GPLPSYLQFVGI(서열번호 33), RNRLHLSMLVRP(서열번호 34), LVLFLNHGHFVA(서열번호 35), AGQWHRVSVRWG(서열번호 36), KMPYVSLELEMR(서열번호 37), RYVVLPR(서열번호 38), VRWGMQQIQLVV(서열번호 39), TVFSVDQDNMLE(서열번호 40), APMSGRSPSLVLK(서열번호 41), VLVRVERATVFS(서열번호 42), PGRWHKVSVRWE(서열번호 76) 및 RNIAEIIKDI(서열번호 43)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 기판.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 콜라겐의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KGHRGF(서열번호 44), TAGSCLRKFSTM(서열번호 45), 및 GEFYFDLRLKGDK(서열번호 46)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 기판.
  6. 청구항 2에 있어서,
    비트로넥틴의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KKQRFRHRNRKGYRSQ(서열번호 47)인 단백질 기판.
  7. 청구항 2에 있어서,
    뼈 시알로단백질의 헤파린 결합 도메인으로부터 유래되는 상기 헤파린 결합 모티프는 KRSR(서열번호 48), 또는 KRRA(서열번호 49)인 단백질 기판.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 헤파린 결합 모티프는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 전환 성장 인자 β(TGF-β), 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)에 결합할 수 있는 단백질 기판.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프는 αvβ3-, αvβ6-, αvβ8-, α5β1-, α9β1 결합 펩티드로부터 선택되는 단백질 기판.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프는 인테그린 αvβ6을 활성화시킬 수 있고, 상기 헤파린 결합 모티프는 TGF-β에 결합할 수 있는 단백질 기판.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프는 인테그린 α5β1 또는 α9β1을 활성화시킬 수 있고, 상기 헤파린 결합 모티프는 bFGF에 결합할 수 있는 단백질 기판.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 접착 단백질은 재조합 홍합 접착 단백질로부터 유래되는 단백질 기판.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 홍합 접착 단백질은 서열번호 1-6, 및 60-74으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 단백질 기판.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프 및/또는 헤파린 결합 모티프는 상기 재조합 접착 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결합되는 단백질 기판.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프 및 헤파린 결합 모티프는 모두 상기 재조합 접착 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 단백질 기판.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 인테그린 결합 모티프 및 헤파린 결합 모티프는 스페이서 링커 펩티드를 통해 연결되는 단백질 기판.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 스페이서 링커 펩티드는 서열번호 75의 펩티드인 단백질 기판.
  18. 세포의 가소성을 조절하기 위한 세포외 미세환경 표면으로서,
    상기 미세환경 표면은 인테그린 및 성장 인자 수용체를 동시에 활성화시킴으로써 조합적 신호전달을 유도할 수 있는 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 단백질 기판을 포함하는 세포외 미세환경 표면.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 세포의 가소성은 상피-간엽 이행인 세포외 미세환경 표면.
KR1020237015668A 2020-12-16 2021-12-16 성장 인자에 결합하는 단백질 기판 KR20230074279A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063126245P 2020-12-16 2020-12-16
US63/126,245 2020-12-16
PCT/KR2021/019159 WO2022131809A1 (en) 2020-12-16 2021-12-16 Protein substrate to bind growth factor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230074279A true KR20230074279A (ko) 2023-05-26

Family

ID=82059394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237015668A KR20230074279A (ko) 2020-12-16 2021-12-16 성장 인자에 결합하는 단백질 기판

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230416340A1 (ko)
EP (1) EP4244241A4 (ko)
JP (1) JP2024500845A (ko)
KR (1) KR20230074279A (ko)
CN (1) CN116710477A (ko)
AU (1) AU2021403054A1 (ko)
CA (1) CA3201919A1 (ko)
WO (1) WO2022131809A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023158285A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 TME Therapeutics Co., Ltd. Gf binding ecm mimetic coated microcarrier

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008150101A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Postech Academy-Industry Foundation Chimeric polypeptide including a mussel adheisve protein and extracellular matrix
US9540428B2 (en) * 2012-07-03 2017-01-10 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Extracellular matrix heparin-binding domains
KR101311325B1 (ko) * 2012-09-13 2013-09-30 이상재 합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물
US20160355780A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Amogreentech Co., Ltd. Defined three dimensional microenvironment for cell culture
AU2016431869B2 (en) * 2016-12-07 2021-12-09 Amolifescience Co., Ltd. Three-dimensional micro-environment structure for controlling cell behavior, three-dimensional surface for controlling cell behavior, and method for manufacturing array and three-dimensional micro-environment structure

Also Published As

Publication number Publication date
EP4244241A4 (en) 2024-05-01
WO2022131809A1 (en) 2022-06-23
CA3201919A1 (en) 2022-06-23
US20230416340A1 (en) 2023-12-28
CN116710477A (zh) 2023-09-05
EP4244241A1 (en) 2023-09-20
JP2024500845A (ja) 2024-01-10
AU2021403054A1 (en) 2023-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2321177C (en) Recombinant fibronectin-based extracellular matrix for wound healing
Ishikawa et al. Production of a biologically active epidermal growth factor fusion protein with high collagen affinity
WO2008150101A2 (en) Chimeric polypeptide including a mussel adheisve protein and extracellular matrix
KR101179678B1 (ko) 성장인자 복합체 및 세포 이동 및 성장의 조절
US9540428B2 (en) Extracellular matrix heparin-binding domains
CA2624900A1 (en) Fibronectin polypeptides and methods of use
Elloumi et al. Construction of epidermal growth factor fusion protein with cell adhesive activity
CA2821715A1 (en) Chimeric fibronectin matrix mimetics and uses thereof
KR20230074279A (ko) 성장 인자에 결합하는 단백질 기판
AU7565294A (en) Methods and compositions for stimulating and inhibiting TGF-beta activity
US8871709B2 (en) Synthetic chimeric proteins comprising epidermal growth factor and vitronectin
EP1151116A1 (en) Collagen-binding physiologically active polypeptide
Kitajima et al. A chimeric epidermal growth factor with fibrin affinity promotes repair of injured keratinocyte sheets
Hozumi et al. Mixed peptide–chitosan membranes to mimic the biological activities of a multifunctional laminin α1 chain LG4 module
Imen et al. Construction of multifunctional proteins for tissue engineering: Epidermal growth factor with collagen binding and cell adhesive activities
CA2321933C (en) Fibronectin peptides-based extracellular matrix for wound healing
US20020102709A1 (en) Collagen-binding physiologically active polypeptide
Jung et al. Recombinant tetra-cell adhesion motifs supports adhesion, migration and proliferation of keratinocytes/fibroblasts, and promotes wound healing
McMullen et al. Spatial and temporal expression of transforming growth factor‐β isoforms during ovine excisional and incisional wound repair
US20100143442A1 (en) Growth factor complexes and modulation of cell migration and growth
Zheng et al. Pleiotypic actions of the seminiferous growth factor on two testicular cell lines: comparisons with acidic and basic fibroblast growth factors
US20070009571A1 (en) Novel haptotactic peptides
Kitajima et al. Artificial binding growth factors
Spiller et al. Protease-Triggered Release of Stabilized CXCL12 from Coated Scaffolds in an Ex Vivo Wound Model. Pharmaceutics 2021, 13, 1597
AU2004208856B2 (en) Growth factor complexes and modulation of cell migration and growth

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal