CN110655624B - 一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜及其制备方法和在检测心肌细胞的应用，本发明利用不同水凝胶材料细胞粘附率的差异控制细胞的生长区域，并通过在材料表面复制特定的图案，实现光子晶体传感和细胞定向生长的功能分区，制备出一种基于还原氧化石墨烯掺入的异性结构色水凝胶薄膜。相对于现有技术，本发明提供的制备方法，操作简单，成本低廉，并且不需要大型检测仪器；制备的各项异性结构色水凝胶薄膜具有良好的生物相容性、稳定的光学特性、灵活的可调性、高效的传感属性，不依赖大型检测仪器，并可实现对心肌细胞的跳动频率和收缩力的肉眼观察。

Description

一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜及其制备方法和应用，属于水凝胶薄膜技术领域。
背景技术
心脏是脊椎动物最重要的器官之一，其主要功能是为血液流动提供动力，为各器官、组织提供充足的血流，以供应氧气和各种营养物质，带走代谢废物，维持其他器官、组织细胞的正常代谢和功能。近年来，一些投入临床应用的非心血管类药物可能会导致心脏复极化延迟，导致恶性心律失常风险增加，甚至导致猝死。心脏安全性评价是各类新药进入临床试验前必须考察的一个重要的因素。
在评价药物的心脏安全性时，必须结合体外和体内实验，目前主要是通过体外细胞培养和动物体内实验，检测药物对靶标物的作用及药物对其他细胞、组织、器官等正常生理结构的影响，从而对药效进行评估。然而，体外细胞培养趋向与平面二维培养，该模式不能真实有效的模拟体内微环境及各组织和器官之间的复杂生理过程。动物实验在研究应用中存在不敏感、周期长、所需受试物样品多、所需实验动物量大、难以揭示毒作用位点和毒作用机制以及结果可靠性差等问题。并且由于人体的复杂性，现有的体外评价模型和动物实验并不能准确地反映人体对危害因素的反应。因此，在细胞或组织水平上构建体外模型来模拟生理过程、进行药物筛选和评估已经引起了广泛的关注。在心脏及心肌细胞的研究中，心肌细胞的跳动频率和收缩力是极为重要的评测参数，是用于评价心肌细胞活性的重要指标。然而，构建心脏芯片需要复杂的检测系统，通常依赖大型仪器设备，缺乏直观性。因此，设计并开发具备高灵敏度的心肌细胞跳动频率和收缩力的传感材料，并据此构建稳定的新型药物评估平台仍面临这严峻的挑战。
现有研究公开了基于反蛋白石结构水凝胶的心肌细胞检测方法，虽然也能方便、快捷地检测心肌细胞，但是其在检测灵敏性和高效性方面仍然有待进一步改进。
发明内容
发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜，及其制备方法和其在心肌细胞检测，或者在心脏药物筛选评估中的应用，该各向异性结构色水凝胶薄膜中掺入了还原氧化石墨烯，检测更加灵敏和高效。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种各向异性结构色水凝胶薄膜，所述水凝胶薄膜以还原氧化石墨烯片层结构作为基底，基底上表面具有相邻的光学传感区和细胞生长区，光学传感区包括第一水凝胶以及分布在第一水凝胶中的胶体粒子刻蚀结构，细胞生长区包括还原氧化石墨烯掺杂的第二水凝胶以及分布在第二水凝胶表面的拓扑结构。
其中，所述光学传感区具有反蛋白石结构，具有光子晶体特性，能够实现光学传感，所述细胞生长区的拓扑结构能够为细胞提供定向生长空间，两者功能区分，能同时实现光学传感和细胞培养。所述水凝胶薄膜的反射峰可通过胶体粒径大小来控制，反射峰位置可控制在550nm-620nm之间，结构色可覆盖整个可见光范围。
所述第二水凝胶的细胞粘附率大于第一水凝胶。
所述第一水凝胶是由细胞粘附率低的第一水凝胶前聚体制成，第一水凝胶前聚体选自聚乙二醇二丙烯酸脂、聚乙二醇或丙烯酰胺；所述第二水凝胶是由细胞粘附率高的第二水凝胶前聚体和还原氧化石墨烯制成，第二水凝胶前聚体选自甲基丙烯酸化明胶、海藻酸钠或细胞外基质水凝胶。
所述胶体粒子刻蚀结构是先由二氧化硅、聚苯乙烯球或二氧化钛等胶体粒子制成胶体晶体阵列模板，随后去除所形成；优选，通过刻蚀技术将胶体晶体阵列模板去除，胶体粒子的粒径选择范围为100～300nm。
所述拓扑结构为微槽结构，微柱阵列或微针阵列。
所述的各向异性结构色水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用胶体粒子自组装法，分别制备胶体晶体阵列模板和还原氧化石墨烯片层结构；
(2)将上述胶体晶体阵列模板和还原氧化石墨烯片层结构上下平行放置，中间留出空隙，还原氧化石墨烯片层结构的区域范围大于胶体晶体阵列模板；
(3)将第一水凝胶前聚体溶液填充到上述胶体晶体阵列模板中，聚合；在还原氧化石墨烯片层结构正上方的非胶体晶体阵列模板区域，放置具有图案的掩膜版，中间注入第二水凝胶前聚体和还原氧化石墨烯的混合溶液，固化，两种凝胶形成混合模板；
(4)去除混合模板中的胶体晶体阵列模板，即获得具有反蛋白石结构即光学传感区，以及图案对应拓扑结构即细胞生长区的石墨烯杂化结构色水凝胶。
作为优选：
步骤(1)中胶体晶体阵列模板采用二氧化硅、聚苯乙烯球或二氧化钛等制成。所述胶体粒子自组装法包括如下：
将表面带同种电荷的胶体颗粒(如非晶二氧化硅微球、聚苯乙烯微球等)按一定的浓度分散于溶剂中，由于颗粒表面之间的电荷相互作用，随着溶剂的蒸发，胶体粒子自动排列成具有六方密堆积结构的胶体晶体。
步骤(3)中第一水凝胶前聚体选自聚乙二醇二丙烯酸脂、聚乙二醇或丙烯酰胺等，其溶液质量浓度可以选择5-40％；第二水凝胶前聚体选自甲基丙烯酸化明胶、海藻酸钠或细胞外基质水凝胶等，第二水凝胶前聚体和还原氧化石墨烯的混合溶液中，第二水凝胶前聚体质量浓度可以选择5-40％，还原氧化石墨烯的浓度可以选择0.1-1mg/ml。
步骤(3)中具有图案的掩膜版，其中图案为条纹，圆形阵列或点阵等，优选排列整齐的条纹，圆形阵列或点阵等，相对应的固化后水凝胶的拓扑结构是微槽结构，微柱阵列和微针阵列等。
步骤(4)中优选通过刻蚀技术将混合模板中的胶体晶体阵列模板去除。
本发明还提供了所述各向异性结构色水凝胶薄膜在检测心肌细胞中的应用。
优选，所述的各向异性结构色水凝胶薄膜在检测心肌细胞跳动频率和收缩力中的应用，包括以下步骤：
(1)利用所述各向异性结构色水凝胶薄膜进行心肌细胞的培养；
(2)水凝胶薄膜上心肌细胞的收缩和舒张引起有反蛋白石结构的特征反射峰周期性变化，采集特征反射峰周期性变化数据；
(3)对步骤(2)采集的特征反射峰周期性变化数据进行分析，得到心肌细胞的收缩力和跳动频率(心肌细胞自主搏动)情况。
所述的心肌细胞自主搏动造成的还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜结构色的变化，即还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜表面结构微观变化造成的颜色变化。
优选，步骤(1)所述心肌细胞的培养方法为：
首先将心肌细胞悬浮液加入到放有所述各向异性结构色水凝胶薄膜的孔板中，培养后心肌细胞贴附在材料表面，并将材料转移至新的孔板中，加入可抑制成纤维细胞生长的培养液继续培养。培养后换成普通的培养液进行长期的培养。在整个培养过程中，每隔一定时间换一次新鲜细胞培养液。
优选，所述的采集特征反射峰周期性变化数据是指用光谱仪对反蛋白石结构水凝胶的特征反射峰进行检测；所述的反蛋白石结构水凝胶为平面的水凝胶或者图案化的水凝胶；所述的心肌细胞为不同种属及诱导分化得到的各类心肌细胞，例如直接提取的SD乳大鼠心肌细胞，或人源多功能干细胞诱导的心肌细胞等。
所述心肌细胞跳动频率和收缩力的检测可以是多种因素引起的心肌细胞跳动频率和收缩力的变化，比如生物电刺激、化学离子或生物因子等因素的影响。
本发明最后提供了所述各向异性结构色水凝胶薄膜在心脏药物筛选评估中的应用。应用时，是在上述心肌细胞收缩力和跳动频率检测方法的基础上，将刺激因素替换为药物刺激即可，比如心肌药物维拉帕米、异丙肾上腺素等药物的刺激。
在申请人前期研究成果的基础上，本发明利用不同水凝胶材料细胞粘附率的差异控制细胞的生长区域，并通过在材料表面复制特定的图案，实现光子晶体传感和细胞定向生长的功能分区。还原氧化石墨烯掺入能够进一步增强细胞间的联系并可以作为背景增加反射率。借助还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜的光学传感属性，可实现对心肌细胞跳动频率和收缩力的检测，并具有构建药物筛选、评估功能的器官芯片的潜在应用前景。所制备的还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜具有良好的生物相容性，细胞生长区的表面拓扑结构有利于心肌细胞的黏附、定向生长；光学传感区利用光子晶体特性，具有良好的稳定性与可调控性。当心肌细胞粘附在生长区并恢复自主跳动后，会改变光学传感区表面微结构，从而结构色发生变化。可借助光子晶体的光学传感特性，对心肌细胞的跳动频率和收缩力进行高效传感。
还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜的结构色受外界干扰较小，具有一定的抗性，主要依赖生长在其上的心肌细胞自主搏动实现光学传感，因此，在检测中具备灵敏、高效、稳定和可观性等优势。
技术效果：相对于现有技术，本发明提供的制备方法，操作简单，成本低廉，并且不需要大型检测仪器；制备的各项异性结构色水凝胶薄膜具有良好的生物相容性、稳定的光学特性、灵活的可调性、高效的传感属性，不依赖大型检测仪器，并可实现对心肌细胞的跳动频率和收缩力的肉眼观察。
附图说明
图1为本发明水凝胶薄膜的横切面结构示意图。
图2为本发明水凝胶薄膜的表面结构示意图：其中，a为还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜整体示意图；b为心肌细胞在还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜表面的生长示意图。
图3为本发明水凝胶薄膜分区结构示意图：其中，a为还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜光学传感区侧面示意图；b为还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜细胞生长区侧面示意图。
图4为本发明水凝胶薄膜检测心肌细胞时结构变化示意图：其中，a为未拉伸的还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜光学传感区侧面示意图；b为细胞拉伸后心肌细胞在还原氧化石墨烯掺入的各向异性结构色水凝胶薄膜细胞生长区侧面示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1一种基于还原氧化石墨烯-甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸脂的各向异性结构色水凝胶薄膜的制备
(1)首先通过二氧化硅粒子的自组装在玻璃片局部制备胶体晶体阵列。在溶液挥发过程中，二氧化硅粒子形成具有重复结构单元的排列紧密的纳米结构，这种结构能够允许聚乙二醇二丙烯酸脂溶液的渗透。之后，在另一个玻璃片上用同样的方法得到还原氧化石墨烯片层结构。所述自组装方法是将表面带同种电荷的胶体颗粒按一定的浓度分散于溶剂中，由于颗粒表面之间的电荷相互作用，随着溶剂的蒸发，胶体粒子自动排列成具有六方密堆积结构的胶体晶体。
(2)接下来，将具有胶体晶体阵列的玻璃片反扣在具有还原氧化石墨烯片层上，中间保留一定的空隙。
(3)在空隙注入质量浓度为10％的聚乙二醇二丙烯酸脂前聚体溶液，聚乙二醇二丙烯酸脂溶液处于胶体晶体模板的部分，等聚乙二醇二丙烯酸脂完全填充到胶体晶体阵列中后利用紫外将其聚合。在非胶体阵列部分的正上方放置一个具有条纹结构的掩膜版用以阻挡光线聚集，并注入含有甲基丙烯酸化明胶前聚体和还原氧化石墨烯的混合溶液，其中甲基丙烯酸化明胶的质量浓度为15％，还原氧化石墨烯的浓度为0.5mg/ml，通过紫外光光聚使溶液固化，得到具有沟槽结构的甲基丙烯酸化明胶水凝胶部分。
(4)最后，通过刻蚀技术将混合模板中的二氧化硅粒子去除，获得具有反蛋白石结构及条纹结构的石墨烯杂化结构色水凝胶。
所得各向异性结构色水凝胶薄膜的结构如图1所示，以还原氧化石墨烯片层结构作为基底，基底上表面具有相邻的光学传感区和细胞生长区，光学传感区包括第一水凝胶(聚乙二醇二丙烯酸脂水凝胶)以及分布在第一水凝胶中的胶体粒子(二氧化硅粒子)刻蚀结构，细胞生长区包括还原氧化石墨烯掺杂的第二水凝胶(甲基丙烯酸化明胶和还原氧化石墨烯的混合水凝胶)以及分布在第二水凝胶表面的拓扑结构(沟槽结构)。
实施例2还原氧化石墨烯-甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸脂的各向异性结构色水凝胶薄膜用于心肌细胞的检测：
(1)细胞培养：将提取的SD乳大鼠心肌细胞种植在制备的还原氧化石墨烯-甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸脂的各向异性结构色水凝胶薄膜表面，方法如下：
首先将心肌细胞悬浮液加入到放有所述各向异性结构色水凝胶薄膜的孔板中，培养20h后心肌细胞贴附在材料表面，并将材料转移至新的孔板中，加入可抑制成纤维细胞生长的DMEM/F12培养液继续培养。培养三天后换成普通的DMEM/F12培养液进行长期的培养。在整个培养过程中，每36小时换一次新鲜细胞培养液。
(2)当生长在水凝胶薄膜表面的心肌细胞产生规律性收缩时，聚乙二醇二丙烯酸脂部分的结构色会随之发生规律性周期变化，引起有反蛋白石结构的特征反射峰周期性变化，用光谱仪采集特征反射峰周期性变化数据；
(3)对步骤(2)采集的特征反射峰周期性变化数据进行分析，得到心肌细胞的收缩力和跳动频率(心肌细胞自主搏动)情况。
具体分析过程如下：
聚乙二醇二丙烯酸脂水凝胶膜在一定拉伸范围内是弹性形变。随着拉伸比例的增大，结构色水凝胶膜的微观结构也发生了变化，对外表现为颜色变化，并可以得到应变与反射峰的关系曲线。通过测量应力应变曲线，根据公式
E＝σ/ε(E是杨氏弹性模量，σ是应力，ε是应变)
能够算出材料的杨氏模量。由于同一材料的杨氏模量是不变的，根据拉伸比例与反射峰的曲线，能够得到拉伸比例与应力的关系。
本发明检测方法基于光子晶体晶格的变化，相对于角度变化来说检测设备更加简单；将光学传感区与细胞生长区分隔开，避免了细胞触角对检测结构的影响，延长了材料的寿命；石墨烯的掺入提高了材料的导电性，增强了细胞间的联系。
实施例3基于还原氧化石墨烯-甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸脂的各向异性结构色水凝胶薄膜的药物筛选评估应用
与实施例2方法基本相同，不同之处仅在于在心肌细胞中加入异丙肾上腺素，观察还原氧化石墨烯-甲基丙烯酸化明胶-聚乙二醇二丙烯酸脂的各向异性结构色水凝胶薄膜的颜色变化，按上述相同方法评估异丙肾上腺素对心肌细胞的跳动频率和收缩力的影响。

Claims (8)

1.一种各向异性结构色水凝胶薄膜，其特征在于，所述水凝胶薄膜以还原氧化石墨烯片层结构作为基底，基底上表面具有相邻的光学传感区和细胞生长区，光学传感区包括第一水凝胶以及分布在第一水凝胶中的胶体粒子刻蚀结构，细胞生长区包括还原氧化石墨烯掺杂的第二水凝胶以及分布在第二水凝胶表面的拓扑结构；
所述第一水凝胶是由第一水凝胶前聚体制成，第一水凝胶前聚体选自聚乙二醇二丙烯酸脂、聚乙二醇或丙烯酰胺；所述第二水凝胶是由第二水凝胶前聚体和还原氧化石墨烯制成，第二水凝胶前聚体选自甲基丙烯酸化明胶、海藻酸钠或细胞外基质水凝胶；
所述胶体粒子刻蚀结构是先由二氧化硅、聚苯乙烯球或二氧化钛制成胶体晶体阵列模板，随后去除所形成；通过刻蚀技术将胶体晶体阵列模板去除。
2.根据权利要求1所述的各向异性结构色水凝胶薄膜，其特征在于，所述第二水凝胶的细胞粘附率大于第一水凝胶。
3.根据权利要求1所述的各向异性结构色水凝胶薄膜，其特征在于，所述拓扑结构为微槽结构，微柱阵列或微针阵列。
4.权利要求1-3任一项所述的各向异性结构色水凝胶薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用胶体粒子自组装法，分别制备胶体晶体阵列模板和还原氧化石墨烯片层结构；
(2)将上述胶体晶体阵列模板和还原氧化石墨烯片层结构上下平行放置，中间留出空隙，还原氧化石墨烯片层结构的区域范围大于胶体晶体阵列模板；
(3)将第一水凝胶前聚体溶液填充到上述胶体晶体阵列模板中，聚合；在还原氧化石墨烯片层结构正上方的非胶体晶体阵列模板区域，放置具有图案的掩膜版，中间注入第二水凝胶前聚体和还原氧化石墨烯的混合溶液，固化，两种凝胶形成混合模板；
(4)去除混合模板中的胶体晶体阵列模板，即获得具有反蛋白石结构即光学传感区，以及图案对应拓扑结构即细胞生长区的石墨烯杂化结构色水凝胶。
5.权利要求1-3任一项所述的各向异性结构色水凝胶薄膜在检测心肌细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的各向异性结构色水凝胶薄膜在检测心肌细胞跳动频率和收缩力中的应用，包括以下步骤：
(1)利用所述各向异性结构色水凝胶薄膜进行心肌细胞的培养；
(2)水凝胶薄膜上心肌细胞的收缩和舒张引起有反蛋白石结构的特征反射峰周期性变化，采集特征反射峰周期性变化数据；
(3)对步骤(2)采集的特征反射峰周期性变化数据进行分析，得到心肌细胞的收缩力和跳动频率情况。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的采集特征反射峰周期性变化数据是指用光谱仪对反蛋白石结构水凝胶的特征反射峰进行检测；所述的反蛋白石结构水凝胶为平面的水凝胶或者图案化的水凝胶；所述的心肌细胞为不同种属及诱导分化得到的各类心肌细胞。
8.权利要求1-3任一项所述的各向异性结构色水凝胶薄膜在心脏药物筛选评估中的应用。
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