CN101962613A - 一种无边缘效应的96孔细胞培养板 - Google Patents
一种无边缘效应的96孔细胞培养板 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物学中培养细胞使用的细胞培养板，尤其是：一种无边缘效应的96孔细胞培养板，该细胞培养板，是由：上盖、培养板和培养板孔组成；其特征在于：培养板上有96个培养板孔，培养板孔为8×12分布，每个孔为大小、形状均相等的正圆形或方形，底端封闭，周边有侧壁围绕孔的周围；培养板孔的高度稍高于侧壁形成的平面；在最外一圈孔与培养板侧围之间存在槽的结构；上盖平坦，与培养板上面孔形成的平面平行，有裙边，与培养板之间存在缝隙；这种结构可以在细胞培养时减少内、外孔之间的热动力不平衡问题，使细胞沉降均一，从而消除边缘效应，使细胞生长更加均一，减少实验系统误差。
Description
所属技术领域
本发明涉及生物学中培养细胞使用的细胞培养板，细胞培养板，尤其是一种可以避免细胞培养边缘效应产生的96孔细胞培养板。
背景技术
目前，在生物学中培养细胞使用的细胞培养板，在使用这些细胞培养的过程中，经常会发生边缘效应，边缘效应是指在使用多孔板的细胞培养中，周边孔中的细胞会集中在孔的外侧，这种现象在实验中常用的96孔板中十分明显；而边缘孔的数量占到总数的1/3，这就意味着因为此误差所导致的影响相当巨大。
由于大多细胞的生长会受周围接触细胞的抑制，所以边缘效应导致边缘孔内细胞平均生长速度要比其他孔快，从而在实验过程中引入系统误差；在很多大规模药物筛选实验中，人们甚至弃去周围孔的实验结果，这就意味着每三块96孔培养板只能被当作两块板使用。
边缘效应产生的原因是由于在室温下的培养板转移到37℃培养箱后，培养板上产生的温度差影响细胞沉降引起的；为证实这一结论，有人做了两种不同的实验，第一个实验是将细胞接种后直接放入37℃培养箱，1小时后取出在显微镜下观察，发现外侧孔的大部分细胞都迁移到孔的外侧聚集生长，而不是象内部孔一样平均生长；另一个实验证据是细胞培养板在37℃条件下放置一段时间以后取出，加入细胞而不放入37℃环境，发现细胞呈相反的沉降趋势；这两点足以证明产生细胞边缘效应的决定性因素就是细胞沉降过程中内、外孔之间热动力学失衡(BETINA KERSTIN LUNDHOLT，KURT M.SCUDDER，and LEN PAGLIARO，A SimpleTechnique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays.Journal of BiomolecularScreening 2003：566-570)。
目前克服该现象的方法是在培养板内分入细胞后，在室温下放置1-2个小时，让细胞在没有温度差的情况下沉降，然后再转移到37℃培养箱内，该方法至少适合CHO等在室温下能贴壁的细胞；该方法的缺陷是对于脆弱的细胞外界环境温度降低会导致细胞应激反应产生，从而改变细胞的性状，尤其是原代培养的细胞更加不能承受如此苛刻的生存条件，因此会发生细胞生长状态不佳、细胞凋亡甚至死亡。
导致目前常规的96孔细胞培养板产生边缘效应的原因是：目前应用的96孔细胞培养板外圈的孔侧壁直接与外界接触，对温度非常敏感，从而在温度波动很大时不能调控细胞的迁移；而内侧的孔由于仅从底部接触外界，细胞生长就很均匀；因此如果能够在外侧孔的侧面设计结构使其仅从底部感受外界温度变化，将会避免边缘效应的产生。
发明内容
本发明的发明目的是：提供了一种无边缘效应的96孔细胞培养板，该细胞培养板是通过改变原有96孔板的结构，在最外侧孔的外侧设计了不同宽度及厚度的槽形结构，达到最大程度消除边缘效应的目的，同时又保证了细胞培养的最佳状态；为了实现上述目的，本发明是这样实现的：一种无边缘效应的96孔细胞培养板，是由：上盖、培养板和培养板孔组成；其特征在于：培养板上有96个培养板孔，培养板孔为8×12分布，每个孔为大小、形状均相等的正圆形或方形，底端封闭，上端敞开便于培养液加入，周边有侧壁围绕孔的周围；培养板孔的高度稍高于侧壁形成的平面；在最外一圈孔与培养板侧围之间存在槽的结构；上盖平坦，与培养板上面孔形成的平面平行，有裙边，与培养板之间存在缝隙，间距为0.1-2mm孔的分布为矩阵形，每个孔的中心距相等，距离为0.5-2cm；培养板，采用透明或不透明的塑料制作；其中：培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在间隔，距离为：12孔长边侧1-4mm，8孔短边侧2-6mm；在培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在槽结构，该槽结构为四周连通的，四边可以设计有一条或多条的槽，或者四个转角处相连通的槽，槽的高度为0-15mm，将孔与外界从底部隔开；其中：槽的宽度为：12孔长边侧0.5-3.5mm，8孔短边侧0.5-5.5mm，槽的内径为：12孔长边侧0-3.5mm，8孔短边侧0-5.5mm，可以是实心槽，其长度覆盖周边所有的孔；槽的材质可以是培养板的材质，也可以是任何其他材质；槽可拆卸，或者与培养板为一体，槽内可以加入任何气体、液体或固体；槽可以是上端敞开的，或者上端封闭，在一处或多处有孔与外界连通；培养板的底部经过不同的亲水或疏水处理可以进行酶联免疫反应等其他实验。
实施例1无边缘效应96孔板的制造
在通用的96孔细胞培养板的外侧设计一圈相连通的槽状结构，具体为：培养板上有96个培养板孔，培养板孔为8×12分布，每个孔为大小、形状均相等的正圆形，底端封闭，上端敞开便于培养液加入，周边有侧壁围绕孔的周围；培养板孔的高度稍高于侧壁形成的平面，形成一圈突出的槽；上盖可以平整地覆盖在培养板上，保证与每个培养板孔形成的平面平行；上盖上设计有凸起的圆圈，正好覆盖在培养板孔的上方并保持0.15mm的间距；每个培养板孔的中心距相等，距离为1cm；培养板采用透明塑料制作；其中：培养板上最外一圈孔与培养板侧围之间存在间隔，距离为：12孔长边侧1mm，8孔短边侧2mm在培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在槽结构，该槽结构为四周连通的12孔长边侧3mm，8孔短边侧4mm，以达到阻隔外界与外圈孔侧壁直接接触的目的。
实施例2抑制边缘效应效果试验
为证明本发明的细胞培养板具有消除边缘效应的目的，特进行了细胞培养实验；优先选用CHO细胞作为宿主细胞，宿主细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)；将此细胞培养于100mm培养皿中，37℃培养，待细胞长至70～80％满时，吸出培养基，以胰酶消化细胞，按100个/ml稀释细胞，按200ul分别加入10块96孔细胞培养板，继续培养72小时；进行如下指标观察：
1)光学显微镜下观察：观察整个培养板96个孔的细胞生长状况，包括细胞在孔内的分布，细胞生长状态差异。
2)细胞克隆数形成实验：给每个孔接入一定的细胞数，定期观察细胞的克隆形成情况，并观察每个克隆的细胞数量，以统计学方式记录。
3)细胞染色观察：用经典的台盼兰染色法观察细胞的分布，不同于光学显微镜观察的是它可以观察到整个96孔的总体水平。
4)细胞活力观察：细胞用经典MTT法染色，细胞活力强的MTT活力高，显色深；酶联分析仪读取数据，以数字方式记录。
5)统计学分析：将上述数据进行统计学分析，得出结论。
实验结果
1)光学显微镜下观察：各孔细胞生长均一性较好，外孔与内孔无大差别。
2)细胞克隆数形成实验：各孔细胞克隆数平均值如下表：
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 16.2 | 15.2 | 15.4 | 16.1 | 15.4 | 15.8 | 15.4 | 15.7 | 16.1 | 15.3 | 15.2 | 15.5 |
| B | 15.5 | 16.2 | 17.0 | 15.3 | 15.2 | 15.4 | 15.3 | 16.3 | 16.4 | 15.8 | 16.0 | 16.2 |
| C | 16.1 | 15.6 | 15.8 | 16.3 | 15.4 | 15.6 | 14.9 | 16.3 | 15.9 | 16.4 | 16.4 | 16.2 |
| D | 16.0 | 14.9 | 15.7 | 17.1 | 16.9 | 15.2 | 16.4 | 16.5 | 15.7 | 16.9 | 17.1 | 17.4 |
| E | 16.6 | 17.3 | 16.4 | 15.5 | 16.7 | 16.0 | 15.7 | 15.6 | 16.3 | 16.8 | 15.4 | 16.3 |
| F | 17.2 | 16.8 | 15.6 | 16.1 | 16.3 | 16.6 | 15.3 | 15.4 | 16.6 | 17.1 | 16.8 | 16.4 |
| G | 16.3 | 15.3 | 15.8 | 16.3 | 16.6 | 16.5 | 15.9 | 16.7 | 16.3 | 16.5 | 15.3 | 16.3 |
| H | 15.8 | 15.3 | 16.4 | 15.4 | 16.3 | 15.6 | 15.8 | 16.9 | 15.3 | 15.9 | 15.2 | 15.3 |
统计学分析表明，外侧孔的克隆形成数与内侧孔相比无统计学差异(P＜0.05)。
3)细胞染色观察：染色结果表明内、外侧孔无统计学差异。
4)细胞活力观察：10块板的各孔平均值如下表：
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.337 | 0.335 | 0.229 | 0.306 | 0.411 | 0.324 | 0.287 | 0.310 | 0.319 | 0.314 | 0.256 | 0.343 |
| B | 0.298 | 0.302 | 0.326 | 0.337 | 0.278 | 0.384 | 0.302 | 0.301 | 0.349 | 0.423 | 0.278 | 0.309 |
| C | 0.334 | 0.353 | 0.332 | 0.334 | 0.297 | 0.342 | 0.314 | 0.405 | 0.289 | 0.356 | 0.376 | 0.323 |
| D | 0.316 | 0.325 | 0.366 | 0.271 | 0.381 | 0.347 | 0.415 | 0.366 | 0.309 | 0.373 | 0.360 | 0.333 |
| E | 0.401 | 0.302 | 0.356 | 0.310 | 0.323 | 0.399 | 0.322 | 0.308 | 0.375 | 0.367 | 0.343 | 0.288 |
| F | 0.321 | 0.309 | 0.299 | 0.333 | 0.402 | 0.332 | 0.334 | 0.325 | 0.316 | 0.377 | 0.317 | 0.324 |
| G | 0.323 | 0.374 | 0.337 | 0.287 | 0.334 | 0.293 | 0.416 | 0.314 | 0.315 | 0.316 | 0.332 | 0.355 |
| H | 0.283 | 0.336 | 0.367 | 0.326 | 0.325 | 0.378 | 0.347 | 0.378 | 0.329 | 0.343 | 0.372 | 0.367 |
统计学分析表明，各孔的吸光值无统计学差异(P＜0.05)。
实验结果说明无边缘效应的96孔细胞培养板达到了消除外界孔与内部孔在细胞培养时产生的差异，消除了边缘效应。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图为一种无边缘效应的96孔细胞培养板的简单示意图
具体实施方式
下面结合附图(如图所示)对本发明做进一步的说明：一种无边缘效应的96孔细胞培养板，是由：上盖、培养板和培养板孔组成；其特征在于：培养板上有96个培养板孔，培养板孔为8×12分布，每个孔为大小、形状均相等的正圆形或方形，底端封闭，上端敞开便于培养液加入，周边有侧壁围绕孔的周围；培养板孔的高度稍高于侧壁形成的平面；在最外一圈孔与培养板侧围之间存在槽的结构；上盖平坦，与培养板上面孔形成的平面平行，有裙边，与培养板之间存在缝隙，间距为0.1-2mm；孔的分布为矩阵形，每个孔的中心距相等，距离为0.5-2cm；培养板，采用透明或不透明的塑料制作；其中：培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在间隔，距离为：12孔长边侧1-4mm，8孔短边侧2-6mm；在培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在槽结构，该槽结构为四周连通的，四边可以设计有一条或多条的槽，或者四个转角处相连通的槽，槽的高度为0-15mm，将孔与外界从底部隔开；其中：槽的宽度为：12孔长边侧0.5-3.5mm，8孔短边侧0.5-5.5mm，槽的内径为：12孔长边侧0-3.5mm，8孔短边侧0-5.5mm，可以是实心槽，其长度覆盖周边所有的孔；槽的材质可以是培养板的材质，也可以是任何其他材质；槽可拆卸，或者与培养板为一体，槽内可以加入任何气体、液体或固体；槽可以是上端敞开的，或者上端封闭，在一处或多处有孔与外界连通；培养板的底部经过不同的亲水或疏水处理可以进行酶联免疫反应等其他实验。
Claims (9)
1.一种无边缘效应的96孔细胞培养板，是由：上盖、培养板和培养板孔组成；其特征在于：培养板上有96个培养板孔，孔呈8×12矩阵分布，每个孔为大小、形状均相等的正圆形或方形，底端封闭，上端敞开便于培养液加入，周边有侧壁围绕孔的周围；培养板孔的高度稍高于侧壁形成的平面；在最外一圈孔与培养板侧围之间存在槽的结构。
2.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：上盖平坦，与培养板上面孔形成的平面平行，有裙边，与培养板之间存在缝隙，间距为0.1-2mm。
3.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：孔的分布为矩阵形，每个孔的中心距相等，距离为0.5-2cm；培养板上最外一圈培养板孔与培养板侧围之间存在间隔，距离为：12孔长边侧1-4mm，8孔短边侧2-6mm；
4.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：制作材料为透明或不透明的塑料。
5.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：该槽为四周连通的，或者四边各有一条或多条的槽，或者四个转角处相连通的槽，槽的高度为10-15mm，将孔与外界从底部隔开；槽的宽度为：12孔长边侧0.5-3.5mm，8孔短边侧0.5-5.5mm，槽的内径为：12孔长边侧1-3.5mm，8孔短边侧1-5.5mm。
6.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：槽可以是实心的，其长度覆盖周边所有的孔。
7.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：槽的材质可以是培养板的材质，也可以是任何其他材质。
8.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：槽可拆卸，或者与培养板为一体，槽内可以加入任何气体、液体或固体；槽可以是上端敞开的，或者上端封闭，在一处或多处有孔与外界连通。
9.根据权利要求1所述的无边缘效应的96孔细胞培养板，其特征是：该培养板的底部经过不同的亲水或疏水处理可以进行酶联免疫反应等其他实验。
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