TWI383048B - 細胞的培養方法，細胞培養皿及細胞培養多層皿 - Google Patents

Description

細胞的培養方法、細胞培養皿及細胞培養多層皿

本發明係關於一種可控制細胞之伸展方向的細胞培養方法，其具有判定藥物等之效果和藥物之毒性試驗時，用在採用培養細胞進行的生物化驗法，以及以治療為目的的細胞培養中。

在生物科技相關領域中將組織中單獨分離出的細胞使用於實驗與檢查的方法，是一種不可或缺的方法。其用途相當地廣泛，包括疾病、病態的診斷，新藥的探索與藥效的判定，或應用於動物檢查、植物檢查與環境污染物質的實驗等等。

其所單獨分離出的細胞也有馬上被用在實驗裏之情況，但是大多數都是採用細胞培養的方法在培養皿中進行培養及在實驗管等之中進行培養等。然後在這類培養系統下進行各式各樣的檢查。

這些檢驗一般設定好均一的培養系統，以改變要評估的藥物的數量和濃度等，以觀察其效果。而培養所使用的培養器，也採用均一形成的物體。該培養器一般多採用培養皿。

一般被拿來當作培養皿使用的物體包含實驗室之培養皿或6孔培養皿、12孔培養皿、48孔培養皿及96孔培養皿(參照專利文獻1)等。另外，近來隨著微量化發展的趨勢下，也開始使用由複數個培養皿所組成的384孔培養皿。

然而，組織細胞的培養若使用市售的細胞培養皿來進行，則存在著細胞呈薄薄延伸且沒有方向性的型態，而無法顯示出在活體內具備的功能等問題。

要確認細胞活性，其方法可利用排放廢棄物所產生的pH變化，或者透過電氣化學感測器等來測量二氧化碳氣體的排出。目前雖然嘗試著比較生物體組織的測量數據，以及在培養皿中所培養之細胞的測量數據，但現階段代表生物體組織數據的數值仍然無法在培養皿當中顯現。究其主因，儘管係為單一圓形孔培養皿的容器形狀，但是對大小為數微米到數10微米的細胞來說，會認為其與在平板上的培養沒有兩樣。而且會更難以進行培養，譬如在肝臟細胞等的組織細胞增殖中，要使之發揮在活體內所具備的功能則會更加的困難。

就解決相關問題的方法而言，目前嘗試著在培養皿上面形成適合組織細胞增殖的精密容器圖樣，再於該精密容器圖樣內使細胞培養(參照專利文獻2)。在精密容器圖樣內培養細胞，使細胞培養呈現立體狀增殖，藉此試著發現其在生物體內所具備的功能。

然而，這個方法現階段只適用於一部分的生化檢驗，還有以少部份治療為目的細胞培養。譬如心臟組織中的心肌細胞是藉由來自大腦的電訊號傳遞，不斷地搏動。心肌細胞組織為了執行該搏動功能，是以具備方向性的排列所構成。因此生物科技領域當中，和人工臟器之組織再生相關的研究裡，和組織一樣能控制伸展方向的細胞培養是必要的；然而，現階段在培養皿上的培養， 不只立體性的培養很困難，連伸展方向也無法控制，因此依據研究目的之不同，具有其適用上的問題。

另外以治療為目的的心肌培養，其中之一是把已經培養的心肌組織移植到因心肌梗塞而壞死的一部分心肌組織，藉此續命。心臟是藉由來自大腦的電訊號，使心臟整體大幅搏動。一旦因為心肌梗塞而導致一部分的心肌組織壞死，會因為心肌內部的訊號傳遞被阻斷，心臟重複著被稱為「細動」的小幅收縮，結果因為通往心臟內部的血液滯留而產生血栓，當運輸到大腦組織時，就會引起名為「腦梗塞」的二次症狀。細動如果長期持續下去，甚至會導致死亡。這類治療中，就不是以完成人工臟器為目的，而是朝儘早能取代部分組織的目標邁進。

然而，現階段在培養皿上的培養，不只立體性的培養很困難，連伸展方向也無法控制，因此依據此研究目的具有其適用上的問題。

[專利文獻1]JP11-169166

[專利文獻2]JP8-322593

當要判定藥物的效果和試驗其毒性等之情況時，其所採用培養細胞所進行的生物測定法，以及以治療為目的之細胞培養當中，若使用市售的細胞培養皿，則存在著細胞呈薄薄延伸且沒有方向性的型態，而無法顯示出在活體內具備的功能等問題。另外，目前雖嘗試著在培養皿上面形成適合組織細胞增殖的精密容器圖樣，再於 該精密容器圖樣內使細胞培養，但是因為無法控制伸展方向，因此存在著在以治療為目的的心肌細胞培養相關研究中仍不適用的問題。

本發明著眼於解決上述問題，其目的係為提供可控制培養細胞之伸展方向的細胞培養方法，以及用於該細胞培養方法中的細胞培養皿。

本發明所係用以解決上述之問題，其細胞培養方法的特徵為使用一種培養皿，該培養皿具備複數個側壁，而且設有複數個空間構造，用來配置因這些側壁所形成的培養細胞，並進一步在側壁設置開口部，再藉此於細胞培養皿上設置複數個空間構造互相鏈結的連接構造，於側壁面上形成細胞培養中等同於仿生支架(biomimetic scaffold)的橋體(desmosome)，在空間構造內培養出的細胞會伸展至對向的側壁，且在各自的空間構造中培養出的細胞會因開口部而結合，而可控制培養細胞的伸展方向。

另外，一種細胞培養方法，其中前述細胞培養皿的側壁之高度為3μm~3000μm、厚度為3μm~1000μm、寬度為3μm~3000μm。又，一種培養細胞方法，其中前述細胞培養皿具備灌流培養液的流路，而且該流路之寬度為1μm~1000μm、深度為1μm~1000μm。

此外，一種培養細胞方法，其中前述細胞培養皿其配置細胞的空間構造中，具有高度或深度為0.001μm~50μm之精密凹凸圖樣。

此外，另一本發明係一種心肌細胞的培養方法，其 特徵為：使用細胞培養皿，該細胞培養皿具有複數個凹或凸圖樣(pattern)、且具有連通此等凹圖樣之上部或凸圖樣之底部的面；並藉由使成為細胞培養中之仿生支架的橋體形成於連通面或凹凸圖樣之側壁面，使該細胞於其得以伸展之連通面增殖，以控制培養細胞之伸展方向。

另一方面，本發明為一種心肌細胞培養皿，其特徵為：具有複數個側壁；具有藉由此等側壁所形成之用以配置細胞之複數個空間構造；並進一步藉由於側壁設置開口部，而具有連通複數個空間構造之連結構造。利用設置複數個凹或凸圖樣的方法，該細胞培養皿將具備可通往凹圖樣上方或凸圖樣底部互通的面。

而且，另一本發明之上述細胞培養皿，其施加了為使細胞固定化的表面處理。又，本發明的上述細胞培養皿是由樹脂成型品所構成，而且其他本發明之上述細胞培養皿，其中前述樹脂成型品是水溶性樹脂成型品。

又，另一本發明之上述細胞培養皿，其係經多片積層之構造。

本發明係關於一種可控制細胞之伸展方向的細胞培養方法，其於判定藥物的效果和試驗其毒性等時，所用於採用培養細胞進行的生物測定法，以及以治療為目的的細胞培養中。

譬如，將本發明使用在「一部分心肌組織因心肌梗塞而壞死，導致心臟因心肌內部的訊號傳遞被阻斷而引起細動」的病例時，可利用移植心肌細胞之伸展受到控 制的組織，藉此讓心肌的訊號傳遞恢復，重新出現正常的心臟搏動。

以下詳細說明本發明。

[實施發明的最佳型態]

以下詳細說明本發明。

若在市售的細胞培養皿(或孔盤)上進行組織細胞的培養，則細胞會呈現薄薄延伸且沒有方向性的型態。研究者要確認細胞活性，其可利用排放廢棄物所產生的pH變化，或者透過電化學感測器等來測量二氧化碳氣體的排出，目前雖嘗試著藉此比較活體組織之測量數據以及在培養皿中所培養之細胞之測量數據，但是代表活體組織數據的數值仍無法在培養皿當中顯現。為此已展開新的研究，其係在培養皿上形成適合組織細胞增殖的精密容器圖樣，再於該精密容器圖樣內使細胞培養，使細胞呈立體狀增殖，藉此發現其在活體內所具備的功能。

然而，在具備精密容器圖樣的培養皿上培養出細胞後，若要把由該細胞所構成的組織實際應用在治療中，會受限於該培養細胞所構成之組織構造沒有呈現和活體相同的排列構造，即使可以達成細胞的立體培養，但現階段要適用在治療用途仍存在著很大的障礙。譬如應用於「一部分心肌組織因心肌梗塞而壞死，導致心臟因心肌內部的訊號傳遞被阻斷而重複細動」的病症時，如果不移植該心肌細胞培養之伸展方向被控制的組織，就無法讓心肌的訊號傳遞恢復，重新出現正常的心臟搏動。

本發明係為一種細胞之培養方法，其係使用一種培養皿，其具有複數個側壁，並具備複數個空間構造，用來配置因這些側壁所形成的培養細胞，並進一步在側壁設置開口部，藉此在細胞培養皿上設置連接構造，再利用該細胞培養皿來達成立體增殖，而且還可以控制培養細胞的伸展方向，使在各個空間構造上培養出的細胞能夠連結，如此一來，將有助於以想要的面積和厚度取得和活體組織相同的組織。也就是說，可以實現醫師、醫藥工程學的研究者及患者所期望的培養組織。

藉由設置複數個側壁的方式，可製作出複數個空間構造，再依所需的用途來設定空間構造的區域大小。所需的複數個空間構造之集合尺寸為縱/橫0.5mm~30mm，至少要1mm~20cm的大小，才可適用。

於細胞培養中成為仿生支架的橋體係形成於側壁。而細胞是在空間構造中的中央立體增殖，並形成骨架構造。而亦伸展至對向側壁之細胞橋體，係經由開口部使得培養於各別空間構造中之細胞的橋體之間連結，而得以製造伸展方向受到控制之培養組織。

依照其所培養的細胞種類，來設定側壁、空間構造以及開口部的尺寸，如此一來，推測應可在多樣化的培養系中得以控制伸展方向。所謂的開口部係指因側壁而形成的空間構造能彼此連結之構造。例如，側壁彼此之間的空隙、側壁的凹陷構造、側壁內部所形成的隧道構造等，可有效的將開口部用來結合細胞彼此之橋體。

細胞培養皿中的側壁以及因側壁而形成的空間構造 ，其尺寸必須符合以培養細胞為目的之最佳範圍內。因側壁而形成的空間構造，若太大的話，細胞會和在平板上的培養一樣，只會薄薄的伸展，不會呈現出立體的構造，而無法控制其伸展方向。如果空間構造太小的話，細胞又會無法進入其空間構造中。因此，空間構造的尺寸最好能順應其所培養細胞之種類，介於能收納單一或者複數個的範圍裏。

較佳的側壁高度大多介於3μm~1000μm的範圍，5μm~500μm為更佳。其厚度大多介於3μm~1000μm的範圍，5μm~500μm更佳。其寬度大多介於3μm~3000μm的範圍，5μm~1000μm更佳。

以下係解說灌流培養液所需的流路。為了灌流培養液而設計之流路，其目的之一係為常態供應新鮮的培養液給細胞，藉此防止細胞所排放出的廢棄物而導致培養液的新鮮度下滑，甚至因此導致細胞不會顯示出在活體內所具備的功能。

進一步，藉由用以灌流培養液的流路，可望在培養皿中控制培養細胞之伸展方向。據推測：培養液在其流動方向上，經由流速以及培養液所流經的空間等等之設定，將對於培養細胞產生位移應力，藉由該位移應力將可以控制培養細胞的伸展方向。

另外，用以灌流培養液的流路，也可以用於將細胞培養後的產物予以回收或者供應給其他系列的培養基中發揮效用。透過裝設於流路或流路末端的細小流體連接器，可以將該產物予以回收並應用於新藥開發，或經由 供應給其他培養皿，以達成更接近活體組織的模型。流路的形狀只要能供應培養液，不論哪種形狀皆可使用。例如，將基板和細胞培養皿之具複數個空間構造的面密合時，亦可將具有該空間構造的面之整體和基板之間的空隙作為流路用以灌流培養液。

如果使流路的寬度或深度更精密，雖然可以得到高密度的細胞培養皿，但是最好考量能否確保培養液充足的供應量並做適當的選擇。流路的寬度或深度應該設計成能供應培養液，達成整合化且高效率的細胞培養皿，從這個觀點來看，實質上較佳的係為1μm~1000μm，更佳係為3μm~500μm。上述的流路可以設置在由複數個空間構造所組成的複數個集合區塊之間。

用來培養細胞的空間構造中，也可以在側壁的壁區或空間構造的底部等空間構造內部，具有用來促進細胞增殖的精密凹凸圖樣。經由具有上述的精密凹凸圖樣，較容易形成使細胞固定化所需的橋體(仿生支架)，而且可以促進細胞的分化和增殖。上述精密凹凸圖樣的高度或深度較佳係介於0.001μm~50μm的範圍，0.005μm~25μm為更佳。而上述精密凹凸圖樣的縱向或橫向尺寸較佳係介於0.001μm~50μm的範圍，0.005μm~25μm更佳。

作為形成高度在1μm以下的凹凸圖樣的方法，可列舉例如：噴沙(Sand blast)處理方法，若要形成更小的凹凸圖樣，則可列舉採用Ar電漿的蝕刻處理等。

作為形成高度在1μm以上的凹凸圖樣的方法，可設定為：針對矽晶材料和玻璃材料施加乾式蝕刻與濕式蝕 刻等方法。而針對樹脂材料所做的成型方法，例如可以採用押出成型、射出成型、熱壓成型(Hot Embossing)、奈米壓印成型、吹模成型(Blow)、延壓成型(calendar)、注模成型(Cast)、壓製(Press)成型等等。

使用具有複數個凹或凸圖樣，且進一步具有連通凹圖樣之上部或凸圖樣之底部的細胞培養皿可望控制培養細胞的伸展方向。

如果採用具有複數個凹圖樣的細胞培養皿來進行細胞培養，可於凹圖樣中，只培養在連通之上部。凹圖樣的底部面積如果夠大，由於培養細胞亦將伸展至底部，因此凹圖樣底部的縱橫向尺寸，較好係使兩者或一者介於1μm~500μm。僅將凹圖樣底部的縱向尺寸設定在1μm~500μm的範圍，而橫向尺寸，例如於神經細胞和血管內部皮膚細胞的培養，經由設定為1mm、10mm、50mm，可以獲得因應目的所形成之培養細胞的長度。

採用具有複數個凸圖樣的細胞培養皿來進行細胞培養，可望於凸圖樣中只培養在連通的底部。凸圖樣的上部面積如果夠大，由於培養細胞亦將伸展至上部，因此凸圖樣上部的縱橫向尺寸，較好係使兩者或一者介於1μm~500μm。僅將凸圖樣上部的縱向尺寸設定在1μm~500μm的範圍，而橫向尺寸，例如於神經細胞和血管內部皮膚細胞的培養，經由設定為1mm、10mm、50mm，可以獲得因應目的所形成之培養細胞的長度。

凹或凸圖樣的深度或高度，為細胞識別凹凸所必要，較佳係成為1μm~500μm的範圍。

由於成為細胞培養中之仿生支架的橋體是形成於互通的面之上，或者凹凸圖樣的側壁面上，而細胞係於可伸展的互通面上增殖，伸展方向可獲得控制。

已經過精密加工的細胞培養皿，為了排除氣泡且使細胞固定化，施予表面處理較佳。為了排除氣泡，讓培養液接觸基板表面，使基板表面親水化較具效果。用以使基板表面親水化的表面處理，其方法有很多種。例如，有採用低溫電漿處理、電暈(Corona)放電處理及紫外線照射等的方法，使親水性的高分子材料在水溶液中溶解後塗布之方法，或者蒸鍍聚合及電漿聚合等。另外，要針對經塗布後的高分子材料，提高其對於培養液中的耐溶解性，習知的方法就是將塗布材料接枝(Graft)到基板表面的官能基上。

用以使細胞固定化之方法包括：基板表面的疏水化、惰性金屬的成膜、或者塗布可促進細胞附著的蛋白質「膠原蛋白(Collagen)」等等。疏水化的方法，可列舉例如：藉由濺鍍、蒸鍍等的疏水性金屬成膜；藉由蒸鍍聚合、電漿的高分子材料成膜等等。惰性金屬成膜則可列舉例如：將金予以蒸鍍或濺鍍之方法等。另外，表面處理時，有時可事先被覆一部分，並針對任何一部分進行改質。

培養皿所使用的材質，從表面處理的效率來看，以塑膠素材較為合適。另外，在逐步觀察細胞的成長過程時，例如使用螢光顯微鏡來觀察，則較好是可以穿透光觀察的透明材料。就樹脂材料而言並沒有特定限制，諸 如壓克力類樹脂、聚合乳酸、聚乙二醇、苯乙烯類樹脂、壓克力/苯乙烯類共聚合樹脂(MS樹脂)、聚碳酸類樹脂、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)等聚酯類樹脂，以及聚乙烯醇(PVA)類樹脂、乙烯/聚乙烯醇類共聚合樹脂、苯乙烯類彈性體(Elastomer)、聚氟乙烯(PVC)類樹脂、聚雙甲基矽氧烷等聚矽氧樹脂，醋酸乙烯酯類樹脂(商品名：Exceval)和聚乙烯丁醛類樹脂等等。

其成形方法係採用金屬構造體作為模具來形成樹脂成型品的方法較為合適。樹脂成型品的形成方法並無特別限定，可列舉例如：射出成型、壓製成型、單體注模成型、溶劑鑄造成型、以及利用擠壓成型的滾壓轉寫法等，而從生產性和模具轉寫性的觀點來看，使用射出成型較佳。選擇既定大小的金屬構造體當作模具，並採射出成型來形成樹脂成型品時，可以高轉寫率將金屬構造體的形狀再現於樹脂成型品上。作為確認轉寫率之方法，可使用光學顯微鏡、掃瞄式電子顯微鏡(SEM)、穿透式電子顯微鏡(TEM)等來進行。

這些樹脂視需求可以含有一種或兩種以上的潤滑劑、光安定劑、熱安定劑、防霧劑、顏料、阻燃劑、帶電防止劑、離型劑、封端防止劑、紫外線吸收劑及防氧化劑等。

細胞培養後，由於將所培養的細胞組織自細胞培養皿予以剝離後可以單獨的形態獲得，因此可以飛躍地擴大培養細胞的發展用途。經培養的細胞若被固定在基板上，就發展用途而言，將被局限在研究實驗目的，如進 行毒性等判定的檢測等。若要開展醫藥用途甚至其中的治療目的，將細胞培養皿用來取代諸如人工透析模組等已是極限，而無法開展「利用移植來使心肌已壞死的組織恢復」等的治療目的。另外，將所培養的組織予以剝離時，若傷及細胞將無法為移植所用。

為達成在不傷及所培養的細胞下將其予以剝離，可使細胞培養皿為水溶性樹脂成型品。用水溶性樹脂製造細胞培養皿後，譬如在表面上塗布可促進細胞附著的蛋白質「膠原蛋白」等。細胞藉由膠原蛋白的塗布，黏著性獲得滿足並進行增殖。細胞培養後，可藉由把基板保持浸泡在培養液中的方式，只取出培養細胞。例如，細胞培養之後，為了迅速回收組織，可藉由提高培養液溫度，以提高水溶性樹脂的溶解性，快速回收培養組織。水溶性樹脂可以列舉出聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇(PVA)系樹脂、乙烯/乙烯醇系共聚合樹脂、聚雙甲基矽氧等聚矽氧樹脂，醋酸乙烯酯系樹脂(商品名：Exceval)和聚乙烯丁醛系樹脂等等。

藉由積層複數個細胞培養皿，可同時進行複數個細胞培養，並得以良好效率提供適合的用於生物檢測之培養皿。

藉由將複數個細胞培養皿予以積層，可表現例如：人工透析模組的替代功能。積層複數個細胞培養皿使成為多層細胞培養皿，將可提高透析功能，而使用實際的活體組織，將可提高廢棄物的去除效率，可望使患者延長生命。

對象為肝臟細胞的情況時，也是藉由在複數個培養皿的各層中整合進行庫氏細胞(Kupffer cell)及表皮細胞等之培養，可望於使用作為人工肝臟模組的治療、或於應用血清白蛋白等產物之新藥開發上使用。

又，開展培養皿之醫藥用途，其中又以治療為目的時，藉由將複數個細胞培養皿予以積層，可望亦可適用於例如：一部分心肌組織因心肌梗塞壞死，已無法獲得正常搏動而引起細動等的疾病。採用水溶性樹脂作為細胞培養皿的材料時，積層複數個細胞培養皿進行培養後，藉由使基板溶解於培養液中，可獲得能移植且多層化的心肌細胞片。

[實施例]

依據本發明，參照圖式說明培養細胞之伸展方向之控制法及形狀如下。雖然基於實施例，就本發明作具體之說明，但本發明之範疇並未局限於這些實施例。

<製造細胞培養皿A>

以金屬構造體作為模具，將樹脂成型品予以成形。金屬構造體是經由以UV光作為曝光光源的微影法，製作光阻圖形體，再於該表面上以濺鍍法堆積500A的鎳，然後進行電鍍，獲得厚度為0.5mm的鎳製金屬構造體。

接著把鎳製金屬構造體固定在成型模具的型腔(Cavity)上，以射出成型製造如第1圖所示之樹脂製細胞培養皿A。用於射出成型之材料係採用可樂麗(股)製的壓克力(Parapet G-HS)。

細胞培養皿A的外形是直徑100mm、厚度1mm的基板 ，於中央部縱40mm×橫40mm的區域，具有藉由複數個側壁1所形成的複數個空間構造3的構造。側壁1的厚度為10μm、高度15μm、寬度60μm，藉由4個側壁1形成一個縱100μm×橫100μm、高度15μm的空間構造3。用來連通複數個空間構造3的開口部2，係一直線排列的側壁與側壁彼此的間隙，側壁1的間隔為40μm。

本成型品屬於平板形狀，但也可以因應使用用途，譬如在培養皿的底部上貼合具有由複數個側壁所形成之空間構造3的培養皿，試著提高研究效率。

<製造細胞培養皿B>

利用與製造樹脂製細胞培養皿A之方法相同之製造方法，製造第2圖所示之細胞培養皿B。

細胞培養皿B的外形是直徑100mm、厚度1mm的基板，在中央部縱40mm×橫40mm的區域裏，將構造設計成具備由複數個側壁1所形成的複數個空間構造3。側壁1的厚度設計為10~20μm、高度30μm與寬度250μm，由側壁1形成一個縱100μm×橫100μm、高度30μm的空間構造3。用來連通複數個空間構造3的開口部2，只需將側壁1的間隔設為40μm即可獲得。

<製造細胞培養皿C>

利用與製造樹脂製細胞培養皿A相同之製造方法，製造出如第4圖所示之細胞培養皿C。

細胞培養皿B的外形是縱80mm×橫140mm、厚度1mm的基板，在中央部縱40mm×橫40mm的區域裏，將構造設計成具備由複數個側壁所形成的複數個空間構造，而且 其兩側具有兩個用來灌流培養液的貫通孔(直徑為2mm)。側壁1的厚度設計為10μm、高度15μm與寬度60μm，由四個側壁形成一個縱100μm×橫100μm、高度15μm的空間構造3。用來連通複數個空間構造3的開口部2，也就是一直線並列的側壁與側壁彼此的間隙，該側壁1的間隔設為40m。

樹脂製細胞培養皿C在細胞培養實驗中，是伴隨著浸泡在培養液，同時覆蓋壓克力製培養皿，在運用貫通孔4使培養液循環的環境下進行培養實驗。培養液流動的流路5是複數個空間構造之上方面的整體，和壓克力製皿之間的空隙設為0.5mm。

<製造細胞培養皿D>

利用和製造樹脂製細胞培養皿A相同的製造方法，製造出如第5圖所示之細胞培養皿D。

細胞培養皿D的外形是縱70mm×橫140mm、厚度1mm的基板，在中央部縱40mm×橫40mm的區域裏，將構造設計成具備由複數個側壁1所形成的複數個空間構造3，而且其兩側具有兩個用來灌流培養液的貫通孔4(直徑為2mm)。側壁1的厚度設計為10μm、高度15μm與寬度60μm，由四個側壁1形成一個縱100μm×橫100μm、高度25μm的空間構造3。用來連通複數個空間構造3的開口部2，是一直線並列的側壁與側壁彼此的間隙，該側壁1的間隔設為40m。

樹脂製細胞培養皿D在細胞培養實驗中，是伴隨著浸泡在培養液，同時覆蓋壓克力製培養皿，在運用貫通孔4 使培養液循環的環境下進行培養實驗。培養液流動的流路5(寬2mm、長40mm)在構造上是於設有複數個空間構造3的區域間以等間隔設有5條路徑。壓克力製培養皿和複數個空間構造3的上方之間是密合的。

<製造細胞培養皿E>

利用和製造樹脂製細胞培養皿A相同的製造方法，製造出如第6圖所示之樹脂製細胞培養皿E。

細胞培養皿E的外形是直徑100mm、厚度1mm的基板，在中央部縱40mm×橫40mm的區域裏，將構造設計成具備複數個凹圖樣6。凹圖樣6設計為20μm、深30μm與長度180μm，在縱向80μm、橫向20μm的間隔採用連續的構造。

<細胞培養皿之製作> (細胞培養皿A~E)

使用細胞培養皿A~E，進行經由紫外線之殺菌處理。接著塗布促進細胞附著的膠原蛋白，製作用以培養細胞的皿，然後固定在培養皿內。

(比較用培養皿1、2)

使用玻片1、2進行經由紫外線之殺菌處理。接著塗布促進細胞附著的膠原蛋白，製作用以培養細胞的皿，然後固定在培養皿內。

<培養皿上的細胞培養環境> (細胞培養皿A~D與比較用皿A)

將大鼠的心肌細胞配置在設有細胞培養皿A~D空間構造的區域，以及比較用皿1上，並浸泡於培養液。細 胞培養皿C~D除浸泡於培養液，同時覆蓋壓克力製皿，並藉由貫通孔4使培養液循環。

(細胞培養皿E與比較用皿B)

將分離培養自大鼠的骨髓與雞胚胎心臟之大鼠骨髓間質細胞與雞胚胎纖維母細胞配置在細胞培養皿E的凹圖樣區與比較用培養皿2上，並浸泡於培養液。

<比較培養皿上的細胞培養> (細胞培養皿A~D與比較用培養皿1)

在上述的環境下，進行四天的細胞培養實驗。採用細胞培養皿C~D的實驗中，因為一直能將新鮮的培養液供應給細胞，而沒有進行培養液的交換，但是在採用細胞培養皿A~B與比較用培養皿1的實驗中，係於試驗開始的第三天進行培養液的交換。

於細胞培養皿A~D中，經確認：在由複數個側壁1所形成的複數個空間構造3中，心肌細胞呈立體狀培養。成為心肌細胞之仿生支架的橋體是形成於側壁1，並在複數個空間構造3中呈立體狀培養。而培養於空間構造3中的心肌細胞亦於對向的側壁1上形成為橋體的仿生支架。而在各個空間構造3中呈立體狀培養的心肌細胞，藉由開口部2而連結，其結果成功取得了伸展方法獲控制的心肌細胞片。藉此所得到之伸展方向有所控制的心肌細胞片，經確認：除以連接單位進行同步搏動外，且藉由控制伸展其搏動跳動再現如活體組織。

藉由將藉此所得到之伸展方向有所控制之心肌細胞片予以積層，未來可望應用於以回復心臟正常功能為治 療目的之活體移植，並獲得治療效果。

又，採用細胞培養皿C~D的實驗中，在未交換培養液下，獲得上述的結果。因為持續供應新鮮的培養液，所以不必擔心會因細胞所排出的廢棄物而導致pH改變及培養細胞的活性降低等。因此上述本發明的細胞培養皿可望應用於肝細胞培養等一般被認為細胞難以成長之情形，又，還具有可使培養自動化等之優點。

採用細胞培養皿A培養大鼠心肌細胞之結果如第3圖之照片所示。

另一方面，藉由比較用培養皿1的培養中，培養細胞薄薄伸展並沒有顯示出立體的構造。細胞的伸展呈現沒有方向性的型態，並觀察到培養皿中個別心肌獨自搏動的情形。其結果顯示：除因為培養細胞未呈現立體構造，因而未表現細胞於活體內所具有的功能外，而且因為心肌細胞的伸展方向呈現無方向性的型態，因此預測難以使用在檢測試驗的判定。

(細胞培養皿E與比較用培養皿2)

藉由細胞培養皿E的試驗中，成功以伸展方向受到控制的型態，培養大鼠骨髓間質細胞與雞胚胎纖維母細胞。經確認：大鼠骨髓間質細胞與雞胚胎纖維母細胞在凹圖樣6的側壁或凹圖樣6的上部形成成為仿生支架之橋體後，並未伸展到凹圖樣6的內部，而是選擇性伸展到連通面7，也就是凹區的上方。即，培養細胞的伸展方向受到控制，是沿著連通面7的方向。

另一方面，採用比較用培養皿2的實驗中，細胞薄薄 伸展，呈現在玻片之一面上擴散開來的型態，而無法控制伸展方向。

又，於玻片上未能使培養面具有空隙，而細胞培養皿E中卻可以藉由凹圖樣6控制培養面空隙的型態進行培養。藉由該技術將培養細胞予以複合化，例如共培養血管內皮細胞，可望藉此達成能更正確再現活體組織的細胞培養。

1‧‧‧側壁

2‧‧‧開口部

3‧‧‧空間構造

4‧‧‧貫通孔

5‧‧‧流路

6‧‧‧凹圖樣

7‧‧‧連通面

10‧‧‧複數個側壁所形成之空間構造區域

第1圖表示細胞培養皿實施型態的範例，(A)為上面圖及(B)為側面圖，單位為μm。

第2圖表示細胞培養皿實施型態的範例，(A)為上面圖及(B)為側面圖，單位為μm。

第3圖表示採用第1圖所示之細胞培養皿所培養之細胞。

第4圖表示細胞培養皿實施型態的範例，(A)為上面圖及(B)為側面圖，單位為μm。

第5圖表示細胞培養皿實施型態的範例，(A)為上面圖及(B)為側面圖，單位為μm。

第6圖表示細胞培養皿實施型態的範例，(A)為上面圖及(B)為側面圖，單位為μm。

Claims (12)

1. 一種心肌細胞的培養方法，其特徵係使用細胞培養皿，該細胞培養皿係具有複數個側壁、具有藉由此等側壁所形成之用來配置培養細胞之複數個空間構造、進一步具有藉由於側壁設置開口部而使複數個空間構造連通的連結構造，藉由使用此細胞培養皿，使成為細胞培養中之仿生支架(biomimetic scaffold)的橋體(desmosome)形成於側壁面，培養於空間構造內之細胞伸展至對向側壁，培養於各空間構造內之細胞經由開口部而結合，獲得伸展方向被控制的心肌細胞的同時，該心肌細胞片以連接單位進行同步搏動。
2. 如申請專利範圍第1項之心肌細胞的培養方法，其中該細胞培養皿的側壁為高3μm~1000μm、厚度為3μm~1000μm、寬度為3μm~3000μm。
3. 如申請專利範圍第1項之心肌細胞的培養方法，其中該細胞培養皿具備灌流培養液的流路。
4. 如申請專利範圍第3項之心肌細胞的培養方法，其中該流路之寬度為1μm~1000μm、深度為1μm~1000μm。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之心肌細胞的培養方法，其中在該細胞培養皿中，配置細胞的空間構造內，設有高度或深度為0.001μm~50μm的精密凹凸圖樣。
6. 一種心肌細胞的培養方法，其特徵為：使用細胞培養皿，該細胞培養皿具有複數個凹或凸圖樣(pattern)、且具有連通此等凹圖樣之上部或凸圖樣之底部的面；並藉由使成為細胞培養中之仿生支架的橋體形成於連通面或凹凸圖樣之側壁面，使該細胞於其得以伸展之連通面增殖，以控制培養細胞之伸展方向。
7. 一種心肌細胞培養皿，其特徵為：具有複數個側壁；具有藉由此等側壁所形成之用以配置細胞之複數個空間構造；並進一步藉由於側壁設置開口部，而具有連通複數個空間構造之連結構造。
8. 一種心肌細胞培養皿，其特徵包括具有複數個凹或凸的圖樣，並利用設置這些凹或凸圖樣，而具有連通凹圖樣上部或凸圖樣底部的面。
9. 如申請專利範圍第7或8項之心肌細胞培養皿，其中該心肌細胞培養皿經施以用來使細胞固定化的表面處理。
10. 如申請專利範圍第7或8項之心肌細胞培養皿，其係由樹脂成型品而成。
11. 如申請專利範圍第10項之心肌細胞培養皿，其中該樹脂成型品係水溶性樹脂成型品。
12. 一種心肌細胞培養多層皿，其係將如申請專利範圍第7至11項中任一項之心肌細胞培養皿予以多數積層之結構。