TWI424058B - 細胞培養容器及其製法 - Google Patents

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Description

細胞培養容器及其製法
本發明係關於細胞培養容器及其製造方法。
細胞死亡可大別為凋亡(apoptosis)與壞死(necrosis)。所謂凋亡，係意味著構成多細胞生物體之細胞死法的一種，為了保持個體良好之狀態所主動引起、受到管理、調節的細胞自殺。另一方面，壞死係由於血行不良、外傷等藉由細胞內外環境的惡化所引起的細胞死亡，即稱為壞死。
壞死，係指生物組織的一部分死去。與通常的死亡不同，僅構成身體之一部分的細胞死亡，其原因係感染、物理的破壞、化學的損傷、血流的減少等。由於血流減少而引起者特別稱為梗塞。同樣係細胞死，但像血球、皮膚、消化管的黏膜上皮正常的細胞、組織陸續地補充而不會造成機能的障礙、組織學的異常者不稱為壞死。壞死之組織，藉由生體的免疫系統最後將其除去，缺損的部分由原來的組織再生或織維化來彌補。
為了試驗、研究如此的細胞，通常有必要從組織將細胞單離而培養。近年來，此種細胞培養以多樣目的被使用於新藥的探索、藥劑之產生、再生醫療之基礎試驗、藥效的判斷等，在生物技術相關領域成為不可或缺的方法。細胞培養器中培養的細胞之附著能力，由於係與細胞之分化．增殖能力有關之極重要的因子，而左右研究開發的速度。又，培養試驗中使用之細胞培養株量極大，亦直接影響試驗成本。
於塑膠製器皿、玻璃製器皿、容器內固定的玻璃平盤、孔平盤等細胞培養容器中培養細胞的場合，已知由培養細胞排出的碳酸氣體等造成pH變化，非常影響培養細胞之活性。因此，向來長期間培養時研究者會定期地替換培養液以保持培養細胞之活性。
又，專利文獻1提議一種細胞培養容器，其特徵為在細胞培養容器之表面上形成相當直徑為10nm~1mm之突起群。此為，藉由突起群之形成，培養液會滲透至細胞之下方，同時促進細胞之必要營養物供給與細胞放出之老廢物排出，由於細胞與容器接觸為點接觸而防止細胞剝離時產生細胞損傷。
[專利文獻1]特開2005－168494號公報
然而，為了抑制像神經細胞或心肌、骨骼肌等不會再生之組織的壞死，神經細胞或心肌、肝臓細胞所謂難培養的組織之細胞死亡，現況僅更換新鮮的培養液仍無法實現細胞死亡之抑制。特別是難以培養之培養種即使更換新鮮的培養液，對於最初配置之細胞數的生存率僅20~40%左右。
又，依專利文獻1所示方法，藉由突起群之形成，使培養液滲透至細胞下方，可促進細胞必要之營養物供給與細胞放出之老廢物排出。然而，由於細胞與容器接觸為點接觸，形成細胞附著斑之擬似腳架無法於基板表面上形成，有細胞無法充分分化．增殖的問題。
為解決此等問題點，本發明之目的係提供一種可提高培養細胞之生存率之細胞培養容器及其製造方法。
本發明中該細胞培養容器，為於細胞培養面上具備複數個微細突起構成的突起群之細胞培養容器，該微細突起之寬度或直徑為20nm~3μm，該微細突起之縱橫比為0.2~3.0。
本發明中該細胞培養容器之製造方法，具備於基板上形成圖案之步驟、隨著該基板上形成的圖案或其轉印圖案使金屬附著而形成金屬構造體之步驟、轉印該金屬構造體之圖案而形成細胞培養容器之步驟、以及於該細胞容器之培養細胞面上形成複數個微細突起所構成的突起群之步驟。
依據本發明，可提供可提高培養細胞生存率之細胞培養容器及其製造方法。
本發明者們專注研究的結果發現可提供一種細胞培養容器，於平盤、器皿等之細胞培養容器中培養細胞之面上形成所欲範圍之微細突起的尺寸及縱橫比，最適合培養細胞之附著、分化．增殖的細胞培養容器。以下，使用附圖説明本發明實施之形態。
發明之實施形態1
第1(a)圖係顯示實施形態1中該細胞培養容器之構成的平面圖，第1(b)圖為第1(a)圖之IB－IB’的剖面圖。實施形態1中該細胞培養容器於培養細胞的面上具備微細突起1。又，第1(a)及(b)圖所示微細突起1為四角柱狀，亦可為圓柱狀或多角柱狀。
培養細胞的面上微細突起1的寬度或直徑為20nm~3μ m為較佳，100nm~1.5μm為更佳。微細突起1之寬度或直徑較20nm為小時，具有約3μm~20μ m直徑的細胞認識微細突起1會變困難。因此，形成擬似腳架構成的附著斑變困難，會降低細胞分化．增殖速度。相反地，微細突起1之寬度或直徑大於3μm時，由於接近細胞直徑，變得難以形成擬似腳架，而降低細胞附著能力。微細突起1之縱橫比，由完成細胞擬似腳架構成的附著斑且再現性容易的工業技術觀點，以0.2~3.0為較佳，0.5~2.0為更佳。
所謂縱橫比係指培養細胞的面之微細突起1之寬度或直徑與高度之比，例如，微細突起1之直徑為3μ m、高度為9μm的場合，縱橫比為3.0。
茲說明微細突起1之形成法。以下列舉之方法為代表例，其並未限定於此。藉由使用真空裝置的氬電漿等之蝕刻，可形成寬度或直徑為30nm左右之微細突起1。以真空蒸鍍法，經調整真空度、原材料與基板距離，可形成具有寬度或直徑為30nm~400nm左右之微細突起1的無機材料。形成寬度或直徑為400nm~3μm之微細突起1之方法有噴砂法(sand blast method)、乾冰洗淨、雷射切割、有機．無機粒子塗覆、電機電鍍、無電解電鍍、以Kanigen電鍍之無機材料堆積等。
微細突起1亦可由奈米序列(nanoorder)之圖案，即奈米圖案所形成。此奈米圖案之形成法為，首先，以電子射線描繪、X射線曝光、縮小曝光等，於感光性樹脂或矽基板上形成奈米圖案。其次，藉由電氣電鍍製作金屬製原盤，經由奈米壓印成形法製作奈米圖案平盤。以此等之製造法，微細突起1之縱橫比超過3.0的場合，必須有精密尺寸的金屬製原盤。然而，因設備及形成奈米圖案用之曝光用光罩費用會變高，具有製作的奈米圖案平盤為高成本的問題。本發明者們專心研究的結果發現適合細胞附著、分化．增殖的微細突起1之縱橫比為0.2~3.0。據此，可實現低成本化。
培養細胞之觀察以使用倒立顯微鏡之透過光觀察為主流。因此，培養細胞的面上形成的微細突起1之尺寸及縱橫比，要求不會散亂波長450nm~600nm之可見光，即，要求透明性。於細胞之附著能力、分化．增殖性能力與透明性並存的範圍上，微細突起1之寬度或直徑為20nm~400nm、縱橫比為0.2~1.0為較佳，微細突起1之寬度或直徑為100nm~300nm、縱橫比為0.5~1.0為更佳。
為使透過光觀察為可能，將樹脂平盤作成與玻璃平盤同等之光透過率，含紫外線領域之波長300nm~800nm之光透過率為80%以上，霧值為10%以內為較佳。為滿足上述要求，於細胞培養容器，使用不含紫外線吸收劑之丙烯酸樹脂，必須選擇PC(聚碳酸酯)、聚苯乙烯等化學構造不具有環構造之材料。又，抗氧化劑、黏度向上劑、耐熱安定劑、膠著防止劑等添加物中，不含紫外線吸收劑為必要。
以螢光觀察法，用於使螢光色素發光之光(激發光)若未透過細胞培養容器，無法識別由此產生的螢光(螢光放射光)。因此細胞培養容器要求高的光透過性。為識別螢光(螢光放射光)上必要的透明性，可見光之全光線透過率必須為80%以上、霧值10%以內。為滿足上述要求，細胞培養容器中使用例如聚甲基丙烯酸甲酯等光學特性優異的材料為較佳，使用為結晶性樹脂之聚烯烴系樹脂時，以非結晶狀態使用為較佳。
所謂自家螢光，係指聚合物分子吸收紫外．可見光後，放出光而自己發出螢光者。由於相對於玻璃平盤不產生自家螢光，樹脂平盤多為自家螢光，故無法識別由樣品產生之螢光(螢光放射光)，使螢光分析特徵之微量分析成為困難。
為了不受自家螢光影響，要求照射波長230nm~800nm之光而不會成為自家螢光。如此，於細胞培養容器中選擇PC(聚碳酸酯)、聚苯乙烯等化學構造上不具有環構造之樹脂材料為必要。又，為極力排除自家螢光之可能性，抗氧化劑、黏度向上劑、耐熱安定劑、膠著防止劑等添加物，可於少量範圍內，但以不添加為較佳。
為了不降低微分干渉(differential interference)觀察法之對比度，而可以偏光顯微鏡或微分干渉顯微鏡觀察，要求光學形變小的材料。因此，細胞培養容器必須選擇PC(聚碳酸酯)、聚苯乙烯等化學構造上不具有環構造之樹脂材料係必要的。
細胞培養容器上經被覆有機膜或無機膜，可成為親水化或疏水化。據此，可防止對微細突起之氣泡附著或控制細胞之附著程度。例如，使用低溫電漿處理、電暈放電處理、紫外線照射等方法，塗布為促進細胞附著之蛋白質的膠原等之方法。又，經由遮蔽細胞培養容器之一部分，亦可以有機膜或無機膜僅被覆其他部分。如此可進一步擴大培養試驗條件。
發明實施之形態2
上述細胞之培養面上，可使用具有複數個微米空間構造之樹脂製細胞培養容器。實施形態2中該細胞培養容器之構成使用第2(a)圖、第2(b)及第2(c)圖説明。第2(a)圖係顯示構成實施形態2之該細胞培養容器構成的平面圖。第2(b)圖為擴大第2(a)圖所示點線內之構成的平面圖。第2(c)圖為第2(b)圖之Ⅱ C一Ⅱ C’剖面圖。
細胞培養容器，如第2(a)圖所示，形成具有複數個微米空間構造構成之凹凸圖案。凹凸圖案如第2(c)圖所示，形成2層階梯狀。即，細胞培養容器之細胞培養面由格子狀地形成的第1凸部3及於其上形成的長方體狀之第2凸部4所構成之2層凸部5所形成。此2層凸部5所形成的空間成為凹部2。即，凹部2係以第1凸部3完全包圍的凹部與第2凸部4所形成的凹部所構成。第1凸部3之側壁6及第2凸部4之側壁7係大略垂直於底面所形成。進一步於凹部2之底面上形成微細突起1。又，微細突起1亦可於培養細胞的面之全體上形成，又、亦可於一部分形成。
第1凸部3，如第2(a)圖所示格子狀地配置包圍矩形狀凹部2之四邊。第2凸部4係為隣接凹部2之間的第1凸部3之上以島狀地配置。第2凸部4各自設置於矩形狀之凹部2之四邊。因此，凹部2未完全被隔開，矩形狀之凹部2之4個頂點部分與隣接的凹部2連通。又，凹凸圖案以2層以上階梯狀形成者為較佳，但1層亦可。
於具有上述複數個微米空間構造之樹脂製細胞培養容器，形成滿足所欲寬度或直徑及縱橫比之微細突起1，可提供廣泛用途於細胞之附著能力、分化．增殖機能外，用於細胞之伸展方向或形態之控制試驗等。又，此細胞培養容器，與向來附有圖案之玻璃製平盤相比亦可發揮充分高的精確度。再者，因可便宜形成細胞培養容器，特別適合可發揮此利點的產業上大量使用的用途。
說明上述培養細胞的面上具有複數個微米空間構造的樹脂製細胞培養容器之製造方法。此製造方法具備於基板上形成微米空間構造之步驟，隨著基板上形成的微米空間構造圖案或其轉印圖案使金屬附著，而形成具有該樹脂平盤之構造圖案之相對圖案的金屬構造體之步驟、及轉印該金屬構造體之圖案而形成樹脂平盤之步驟。
其細節如以下所示，進行：(i)基板上第1光阻層之形成(ii)基板與光罩A之位置配合(iii)使用光罩A之第1光阻層之曝光(iv)第1光阻層之熱處理(v)第1光阻層上之第2光阻層之形成(vi)基板與光罩B之位置配合(vii)使用光罩B之第2光阻層之曝光(viii)第2光阻層之熱處理(ix)光阻層之顯像而形成所欲光阻圖案。
(x)又，於形成的光阻圖案經導電化處理後，隨著所形成的光阻圖案，於基板上電鍍金屬構造體而堆疊。
(xi)作成此金屬構造體之模型，而形成樹脂成形品，如此，製造細胞培養容器。
(v)~(viii)步驟任一者可省略。另一方面，亦可重複(v)~(viii)步驟複數次。
詳細説明光阻圖案形成處理。
基板上，例如獲得深度30μm與深度100μm構造體的場合，依次形成第1光阻層(厚度70μm)、第2光阻層(厚度30μm)，於各層曝光、或進行曝光、熱處理。顯影步驟中最初於第2光阻層得到深度30μm之圖案，其次配合第1光阻層與第2光阻層而得到深度100μm之圖案。得到深度100μ m圖案的時點，將第2光阻層深度30μm之圖案溶解於顯影液中，或為了不變形，控制各層顯影液之溶解性被要求。
使用光分解型正型光阻，使其表現耐鹼性之方法之一者，為拉長烘乾時間(溶劑之乾燥時間)，而使光阻硬化。通常，光阻視膜厚、稀釋劑等溶劑濃度及敏感度來設定烘乾時間。經由加長此時間可使其帶有耐鹼性。又，由於第1光阻層之烘乾進行超過時，光阻會極度硬化，使之後顯影時光照射部分溶解而形成圖案變成困難，故可適宜選擇短的烘乾時間等。烘乾所使用的裝置，只要可乾燥溶劑即可並未特別限定，可為烘箱、加熱平盤、熱風乾燥機等。將光分解型正型光阻與光交聯型負型光阻作比較，由於受限於耐鹼性之表現範圍，設定之光阻厚共計各層為5~200μ m範圍內為較佳、10~100μm範圍內為更佳。
作為使用光交聯型負型光阻而表現耐鹼性之方法，除烘乾時間最適化以外，可使交聯密度最適化。通常，負型光阻之交聯密度，可依曝光量設定。化學放大系負型光阻之場合，可依曝光量及熱處理時間設定交聯密度。藉由增加此曝光量、或熱處理時間，可表現耐鹼性。光交聯型負型光阻之場合，設定之光阻厚度共計各層為5~500μm範圍內為較佳，10~300μm範圍內為更佳。
(i)説明基板11上第1光阻層12之形成第3(a)圖顯示基板11上形成第1光阻層12的狀態。成形品形成步驟所得樹脂製細胞容器之平面度由基板11上形成第1光阻層12之步驟決定。即，基板11上形成第1光阻層12之時點之平面度反映金屬構造體、進而反映細胞培養容器之平面度。
基板11上形成第1光阻層12之方法並未限定，可以列舉一般旋轉塗布方式、浸漬方式、輥方式、乾膜光阻之貼合等。其中，旋轉塗布方式係於回轉的玻璃基板上塗布光阻之方法，超過直徑300mm的玻璃基板上以高平面度塗布光阻為有利點。因此，由可實現高平面度的觀點，旋轉塗布方式為較佳。
作為第1光阻層12所用之光阻，可為正型光阻、負型光阻任一者皆可。任一場合亦可依光阻敏感度、曝光條件，而變換光阻之焦點深度。因此，例如，使用UV曝光裝置的場合，曝光時間、UV輸出功率值視光阻厚度、敏感度可適宜選擇種類。
作為第1光阻層12使用之光阻為濕光阻的場合，例如以旋轉塗布方式可得所定光阻厚度的方法，依旋轉塗布回轉數之變更或黏度調整的方法。依旋轉塗布回轉數變更之方法，由適當設定旋轉塗布機之回轉數得到所欲光阻厚度。藉黏度調整之方法，光阻厚度為厚的場合或塗布面積為大的場合，因恐會降低平面度，實際使用上視要求的平面度調整黏度。
例如旋轉塗布方式的場合，考慮到保持高平面度，1次塗布的光阻層厚度較佳為10~50μm，更佳為20~50μm之範圍內為宜。為保持高平面度，且得到所欲光阻層之厚度，可分數次形成光阻層。
於第1光阻層12上使用正型光阻的場合，一旦過度進行超過烘乾時間(溶劑之乾燥)，光阻會極度硬化，之後顯影時形成圖案變困難，因而可適宜選擇設定光阻厚度非100μm以上的場合，而縮短烘乾時間等。
(ii)説明基板11與光罩A13之位置配合為了設計所欲第1光阻層12之圖案與第2光阻層14之圖案的位置關係，使用光罩A13曝光時，必須實施正確的位置配合。位置配合可以將基板11與光罩A13之同位置上實施切削加工的針固定方法、使用雷射干渉計定位之方法、基板11與光罩A13之同位置上製作位置標記而以光學顯微鏡進行位置配合之方法等。使用光學顯微鏡位置配合之方法，例如以光蝕刻法於基板11上製作位置光罩，於光罩A13以雷射描繪裝置描繪位置標記。即便使用光學顯微鏡之手動操作，可有效簡便得到5μ m以內之精確度的點。
(iii)說明使用光罩A13之第1光阻層12之曝光第3(b)圖所示步驟使用的光罩A13並未作任何限定，可列舉乳劑光罩、鉻光罩等。光阻圖案形成步驟，左右使用光罩A13之尺寸、及精確度。因而，此尺寸及精確度亦反映樹脂製細胞培養容器。因此，為作出樹脂製細胞培養容器之各種尺寸、及所定精確度，必須規定光罩A13之尺寸及精確度。提高光罩A13精確度之方法並未作任何限定，可列舉例如於光罩A13之圖案形成上變換成使用較雷射光源波長短者，但設備費用高，因光罩A13製作費變高，樹脂製細胞培養容器視實用上要求的精確度適宜地規定者為宜。
光罩A13之材質由溫度膨張係數、UV透過吸收性能之方面以石英玻璃為宜，但由於比較昂貴，以視樹脂成形品實用上要求的精確度適宜規定者為宜。依所欲深度或高度設計不同構造體，或，為了得到與第1光阻圖案及第2光阻圖案相異的構造體，於第1光阻層12及第2光阻層14之曝光所用之光罩之圖案設計(透過/遮光部)必須確實，使用CAE解析軟體之模擬亦為解決方法之一。
曝光所用之光源以設備費用便宜的紫外線或雷射光較佳。同步加速器(synchrotron)放射光之設備費用高，雖然實質上樹脂製平盤之價格會變高，但可用於欲獲得曝光深度深的場合等。
曝光時間或曝光強度等曝光條件會因第1光阻層12之材質、厚度等而變化，視所得圖案可適宜調節。特別是因給與空間構造圖案之尺寸、及精確度的影響，曝光條件之調節係重要的。又，因由光阻種類而變換焦點深度，例如使用UV曝光裝置的場合，視光阻之厚度、敏感度可選擇曝光時間、UV輸出功率值。
(iv)説明第1光阻層12之熱處理曝光後之熱處理係為補正光阻圖案之形狀用的熱處理為已知，其中，以化學交聯為目的，僅使用化學放大系負型光阻的場合進行熱處理。化學放大系負型光阻主要由2成分系或3成分系構成，藉由曝光時之光，例如，將化學構造末端之環氧基開環，經熱處理使其交聯反應。熱處理時間，例如膜厚100μm之場合，設定溫度100℃條件下進行數分鐘交聯反應。
因過度進行第1光阻層12之熱處理時，會使之後的顯影中溶解未交聯部分而形成圖案變困難，可適宜選擇設定的光阻厚度非100μm以上的場合，來縮短熱處理時間，或僅作之後第2光阻層14之熱處理等。
(v)説明於第1光阻層12上第2光阻層14之形成第3(c)圖顯示第2光阻層14被形成的狀態。此第2光阻層14之形成，依上述(i)中説明的第1光阻層12之形成的同樣方法。又，以旋轉塗布方式，使用正型光阻而形成光阻層的場合，將烘乾時間設成通常之1.5~2.0倍左右，可表現耐鹼性。由此，第1光阻層12與第2光阻層14之顯影終了時，可防止第2光阻層14之光阻圖案之溶解、或變形。
(vi)説明基板11與光罩B15之位置配合基板11與光罩B15之位置配合，依上述(ii)説明之基板11與光罩A13之位置配合的同樣方法。
(vii)説明使用光罩B15之第2光阻層14之曝光使用光罩B15之第2光阻層14之曝光，依上述(iii)説明之使用光罩A13之第1光阻層12之曝光的同樣方法。第3(d)圖顯示第2光阻層14之曝光之樣子。
(viii)説明第2光阻層14之熱處理第2光阻層14之熱處理，依上述(iv)説明之第1光阻層12之熱處理的同樣方法。又，第2光阻層14之熱處理，係為了使於之後顯影中得到第1光阻層12之圖案的時點，第2光阻層14之圖案不會溶解、或變形。藉由熱處理而進行化學交聯，提高交聯密度而表現耐鹼性。為表現耐鹼性之熱處理時間視光阻之厚度可由通常之1.1~2.0倍的範圍適宜選擇。
(ix)説明光阻層12及14之顯影第3(e)圖所示顯影步驟，對應使用的光阻使用規定之顯影液為較佳。顯影時間、顯影溫度、顯影液濃度等顯影條件視光阻厚度或圖案形狀可適宜調節，例如，為了得到必要的深度一旦加長顯影時間，因會變得較規定尺寸更大，以設定適宜條件為較佳。由此顯影步驟，形成光阻圖案16。
作為提高細胞培養容器上面、或微細圖案底部之平面精確度的方法，例如可列舉，變更光阻塗布上使用的光阻種類(負型、正型)之方法、研磨金屬構造體表面之方法等。
又，為了能得到所欲造型深度而形成複數光阻層的場合，將此等複數光阻層同時曝光．顯影處理，或，可於一個光阻層形成及曝光處理後，又進行光阻層之形成及曝光處理，而同時處理2個光阻層之顯影。
(x)詳細説明金屬構造體形成步驟金屬構造體形成步驟係沿著光阻圖案形成步驟所得光阻圖案16而堆疊金屬，而金屬構造體18之微米空間構造面沿著光阻圖案16所形成，而得到金屬構造體18之步驟。
如第3(f)圖所示，此步驟係沿著預先之光阻圖案16形成導電性膜17。導電性膜17之形成方法並未特別限定，但較佳為真空蒸鍍法、噴濺法等。導電性膜17所用之導電性材料可列舉金、銀、白金、銅、鋁等。
如第3(g)圖所示，形成導電性膜17後，沿光阻圖案16將金屬電鍍而堆疊，形成金屬構造體18。電鍍方法並未特別限定，例如可列舉電解電鍍、無電解電鍍等。所用金屬並未特別限定，可列舉鎳、鎳－鈷合金、銅、金，但由經濟性．耐久性之觀點使用鎳為較佳。
金屬構造體18視其表面狀態亦可研磨。惟，因恐有汙濁物附著於造形物，較佳為研磨後實施超音波洗浄。又，金屬構造體18為改善其表面狀態，亦可以脫模劑等表面處理。又，金屬構造體18之深度方向之傾斜角度，因樹脂成形品之形狀所欲者為50°~90°，更所欲者為60°~87°。經電鍍形成的金屬構造體18自光阻圖案16分離。
(xi)詳細説明成形品形成步驟成形品形成步驟，如第3(h)圖所示，為將前述金屬構造體18作成模型，而形成樹脂成形品19之步驟。樹脂成形品19之形成方法並未特別限定，例如可列舉藉由射出成形、壓製成形、單體流延(monomer cast)成形、溶劑流延成形、押出成形之輥轉印法等，由生產性、型轉印性之觀點，使用射出成形為較佳。選擇規定尺寸的金屬構造體18作為模型而以射出成形形成樹脂成形品19的場合，可再現具高轉印率之金屬構造體18之形狀的樹脂成形品19。確認轉印率之方法，可使用光學顯微鏡、掃描式電子顯微鏡(SEM)、穿透式電子顯微鏡(TEM)等方法。
樹脂成形品19之平面度之最小值，由工業上再現容易的觀點以1μm以上為較佳。樹脂成形品19之平面度之最大值，例如由該成形品上產生彎曲而未與光學系單元接觸等、未構成故障的觀點，以200μm以下為較佳。對於樹脂成形品之造形部之尺寸精確度，由工業上再現容易的觀點以±0.5~10%之範圍內為較佳。
以下，顯示本發明之該實施例及比較例。此等實施例及比較例，將微細突起之尺寸及縱橫比作為變量，以解析培養細胞之附著能力及分化．增殖能力。微細突起之尺寸及縱橫比，藉由ULVAC股份公司製之表面形狀測定器(DEKTAK3030)以觸針法測定。光學物性值之全光透過率及霧值使用Suga股份公司試驗機製之可見光線透過率計(型式：HA－TR)測定。具體而言，全光線透過率依據JIS K6714之方法進行2次測定，求得其平均值。又，細胞之附著能力以比色分析法之結晶紫法解析。細胞之分化．增殖能力，以比色分析法之MTT法解析，比較例1作為100%。
結晶紫法係利用活細胞攝取結晶紫之比色分析法。具體而言，於培養箱中培養5.0×105 個之HeLa細胞2小時後，以生理食鹽水洗浄，區分基板上附著的細胞與浮游(已死亡)細胞。其次，以結晶紫染色後，使用SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液溶解附著於基板之細胞，測定波長540nm之吸光度，與比較例1比較。
MTT法係利用MTT(四唑鎓鹽之一種)經細胞內脫氫酵素反應，變化成甲之染色法。細胞健康時酵素活性高，甲之還原高，則甲濃度變高。利用細胞數計測將此濃度差作為吸光度。具體而言，將5.0×105 個HeLa細胞於培養箱中培養3小時後，以生理食鹽水洗浄，區分附著於基板上之細胞與浮游(死亡)細胞。培養箱內48小時培養後，以含MTT之培養液交換進一步繼續培養3小時。之後，加入異丙醇使甲溶解，測定波長570nm之吸光度，與比較例1比較。
〔比較例1〕
使用市售已滅菌聚苯乙烯製器皿(φ 90mm、深度20mm)。培養面之突起形狀為寬度10nm、縱橫比0.05。光學物性值為全光線透過率87%、霧值2.0%。
〔比較例2〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，經由射出成形法，製作出寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，亦可能於對應光媒體的鏡面上施予加工。培養面之突起形狀為寬度7nm、縱橫比0.1。光學物性值為全光線透過率91%、霧值2.1%。
〔比較例3〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。培養面之突起形狀為寬度15nm、縱橫比0.1。光學物性值為全光線透過率90%、霧值2.8%。
〔比較例4〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體，以具有寬度5.5μm、縱橫比5之打印機固定成形。培養面之突起形狀為寬度5μm、縱橫比4.5。光學物性值為全光線透過率72%、霧值25.6%。
〔實施例1〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。其次，於樹脂平盤上進行噴砂處理，培養面上形成微細突起。培養面之突起形狀為寬度2.5μm、縱橫比2.0。光學物性值為全光線透過率76%、霧值17.3%。
〔實施例2〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。其次，於樹脂平盤上進行噴砂處理，培養面上形成微細突起。之後，使用ULVAC股份公司(型式：UEP)之蒸鍍裝置，以真空蒸鍍法於微細突起上堆積無機膜。蒸鍍所用目標材料為SiO2 ，膜厚為0.5μm。培養面之突起形狀為寬度800nm、縱橫比1.0。光學物性值為全光線透過率78%、霧值13.8%。
〔實施例3〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。其次，使用ULVAC股份公司(型式：UEP)之蒸鍍裝置，以真空蒸鍍法形成微細突起。蒸鍍所用目標材料為SiO2 ，膜厚為0.2μm。培養面之突起形狀為寬度280nm、縱橫比1.0。光學物性值為全光線透過率88%、霧值3.0%。
〔實施例4〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，以射出成形法製作寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤後，進行滅菌。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。其次，使用ULVAC股份公司(型式：UEP)之蒸鍍裝置，以真空蒸鍍法形成微細突起。蒸鍍所用目標材料為SiO2 ，膜厚為0.1μm。培養面之突起形狀為寬度150nm、縱橫比0.8。光學物性值為全光線透過率90%、霧值2.5%。
〔實施例5〕
使用Kuraray股份公司製之丙烯酸樹脂(Parapet GH－S)，經使用打印機的射出成形法，於寬度24mm、長度74mm、厚度1.0mm之樹脂平盤上，製作具有高度20μm之複數個側壁所形成的微米空間構造的平盤。第4圖顯示實施例5中該細胞培養容器構成之平面圖。其為如第2圖所示無第1突起3，僅具有第2突起4的構成。此第2突起4之尺寸為寬度10μ m、長度60μm、高度20μm，配列間距為縱．橫共100μm。樹脂平盤之表面正對模體鏡面，使用廣泛使用的樹脂。將此樹脂平盤滅菌後，使用ULVAC股份公司製之蒸鍍裝置(型式：UEP)，依真空蒸鍍法形成微細突起。蒸鍍所用目標材料為SiO2 ，膜厚為0.3μm。培養面之突起形狀為寬度180nm、縱橫比0.6。光學物性值為全光線透過率89%、霧值6.6%。
以上之比較例及實施例結果歸納於表1。
與比較例1比較，細胞培養面之突起寬度較20nm小或較3μm大時，細胞附著能力降低或不認為有提升之效果。縱横比較0.2小或較3.0大時，同様地，細胞附著能力降低或不認為有提升之效果。突起寬度、縱横比變大時，亦有害透明性。
於實施例，突起寬度為20nm~3μm、縱横比為0.2~3.0之範圍，顯示較比較例1有更飛躍性高的附著能力。本試驗使用的HeLa細胞，突起寬度為800nm時顯示最高附著能力。因視細胞，此大小、活性會不同，細胞種別之最適值會變動被予測，只要滿足所欲範圍內，期待其附著性能優異。
實施例3~5中，突起寬度為400nm以下時，滿足高透明性與細胞附著性兩者性能，以透過光進行觀察之細胞觀察用途中，顯示其高適用性。
與比較例1比較，細胞培養面之突起寬度為較20nm小或較3μm大時，細胞分化‧增殖能力降低或不認為有提升之效果。縱横 比較0.2小或較3.0大時，同様地，細胞分化‧增殖能力降低或不認為有提升之效果。突起寬度、縱横比變大時，亦有害透明性。
實施例中，於突起寬度為20nm~3μm、縱横比為0.2~3.0之範圍，顯示較比較例1有更飛躍性高的細胞分化‧增殖能力。本試驗使用的HeLa細胞，突起寬度為800nm時顯示最高細胞分化‧增殖能力。因視細胞，此大小、活性會不同，細胞種別之最適值會變動被予測，只要滿足所欲範圍內，期待其細胞分化‧增殖能力優異。
實施例3~5中，突起寬度為400nm以下時，滿足高透明性與細胞分化‧增殖能力兩者性能，以透過光進行觀察之細胞觀察用途中，顯示其高適用性。特別是實施例5，褐色細胞腫瘤(PC12)之培養試驗結果，確認培養細胞相互間形成網路。
1‧‧‧微細突起
2‧‧‧凹部
3‧‧‧第1凸部
4．．．第2凸部
5．．．2層之凸部
6．．．第1凸部側壁
7．．．第2凸部側壁
11．．．基板
12．．．第1光阻層
13．．．光罩A
14．．．第2光阻層
15．．．光罩B
16．．．光阻圖案
17．．．導電性膜
18．．．金屬構造體
19．．．樹脂製成型品
第1圖顯示本發明實施形態1中該細胞培養容器構成之模式圖。
第2圖顯示本發明實施形態2中該細胞培養容器構成之模式圖。
第3圖顯示本發明實施形態2中該細胞培養容器之製造方法之模式圖。
第4圖顯示實施例5中該細胞培養容器模式平面圖。
1．．．微細突起

Claims (10)

  1. 一種細胞培養容器，其為於細胞培養面上具備複數個微細突起構成的突起群之細胞培養容器，該微細突起之寬度或直徑為20nm~3μm，該微細突起之高度為4nm~3μm，且於該細胞培養面上具有複數個高度為10μm~500μm之微米空間構造。
  2. 如申請專利範圍第1項之細胞培養容器，其中該微細突起之寬度或直徑為20nm~400nm。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之細胞培養容器，其中細胞培養容器之全體或一部分上被覆有機膜或無機膜。
  4. 一種如申請專利範圍第1至3項中任一項之細胞培養容器之製造方法，其具備於基板上形成圖案之步驟、隨著該基板上形成的圖案或其轉印圖案附著金屬而形成金屬構造體之步驟、轉印該金屬構造體之圖案而形成細胞培養容器之步驟、及於該細胞容器之細胞培養面上形成複數個微細突起構成的突起群之步驟。
  5. 如申請專利範圍第4項之細胞培養容器之製造方法，其中於該細胞容器之細胞培養面上形成複數個微細突起構成的突起群之步驟係真空蒸鍍法。
  6. 如申請專利範圍第4項之細胞培養容器之製造方法，其中於該細胞容器之細胞培養面上形成複數個微細突起構成之突起群之步驟為噴砂法(sand blast method)。
  7. 如申請專利範圍第4至6項中任一項之細胞培養容器之製造方 法，其中該於基板上形成圖案之步驟中，形成光阻圖案之步驟至形成具有光阻層為所欲高度或深度之構造體為止，包含重複複數次光阻層之形成、曝光之步驟。
  8. 如申請專利範圍第7項之細胞培養容器之製造方法，其中該重複複數次光阻層之形成、曝光之步驟中，具備為配合圖案位置而配合光罩位置之步驟。
  9. 如申請專利範圍第7項之細胞培養容器之製造方法，其中該重複複數次光阻層之形成、曝光步驟中，使用相異圖案之光罩。
  10. 如申請專利範圍第8項之細胞培養容器之製造方法，其中該重複複數次光阻層之形成、曝光之步驟中，使用相異的圖案之光罩。
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