JP7106141B2 - 細胞培養基材、がん細胞集合体及び該基材を用いたその製造方法、並びに該がん細胞集合体を用いた薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、
ここで
粗面部分の形状は、径が20μm~100μmのスポットであるか、又は幅が3μm~30μmのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、
2つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも10μm以上であり、
粗面部分はその表面に高さ20nm~200nmの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材。
(2) 粗面部分の界面展開面積比(Sdr)が0.002以上である、(1)に記載の細胞培養基材。
(3) 2つの隣接する粗面部分間の距離が10~1200μmである、(1)又は(2)に記載の細胞培養基材。
(4) 粗面部分表面の算術平均粗さ(Ra)が4nm以上、最大高さ粗さ(Rz)が30nm以上、及び/又は山頂点算術平均曲(Spc)が300以上である、(1)~(3)のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
(5) 生体適合性ポリマーが生物学的材料との非特異的吸着を抑制する両親媒性ポリマーである、(1)~(4)のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
(6) 生体適合性ポリマーが2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、(1)~(5)のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
(7) 以下の(a)~(e)の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体。
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(8) さらに以下の(f)~(k)のうちの少なくとも1つの特徴を持つ、(7)に記載のがん細胞集合体。
(f)生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である
(9) (7)又は(8)に記載のがん細胞集合体が3次元構造を有する細胞培養基材に接着してなる、複合体。
(10) (1)~(6)のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、(7)又は(8)に記載のがん細胞集合体の製造方法。
(11) (1)~(6)のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、(9)に記載の複合体の製造方法。
(12) (7)又は(8)に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
以下のがん細胞集合体の特徴
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも1つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び/又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
(13)(7)又は(8)に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び/又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
(14)薬剤が、がんの浸潤及び/又は転移を抑制する薬剤である、(12)又は(13)に記載のスクリーニング方法。
(15)薬剤が、がんの免疫回避機構を抑制及び/又は解除する薬剤である、(12)又は(13)に記載のスクリーニング方法。
(16)(1)~(6)のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び
上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程
を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法。
本発明の第1の態様は、基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、ここで粗面部分の形状は、径が20μm~100μmのスポットであるか、又は幅が3μm~30μmのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、2つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも10μm以上であり、粗面部分はその表面に高さ20nm~200nmの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材に関する。
本発明の第2の態様は、以下の(a)~(e)の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体に関する。
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である
本発明のさらなる態様は、第2の態様のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、以下のがん細胞集合体の特徴
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも1つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程を含む、がんの予防及び/又は治療のための薬剤のスクリーニング方法に関する。
本発明のまたさらなる別の態様は、第1の態様の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法に関する。
1)細胞及び培地
・ヒト膵管腺癌細胞株:PCI-55、PCI-24及びPCI-43(いずれも北海道大学病院にて外科切除された膵癌原発巣組織から樹立されたヘテロ接合型KRAS G12D変異(KRASG12D/WT)を有する細胞株)並びにPANC-1(ATCC)、MIA PaCa-2(JCRB細胞バンク)
・ヒト舌癌細胞株 :HSC-3(JCRB細胞バンク)、SCC-9(ATCC)
・ヒト肺癌細胞株 :H1975(ATCC)、A549(JCRB細胞バンク)、
・ヒト大腸癌細胞株 :DLD-1、WiDr(いずれもJCRB細胞バンク)
以上のがん細胞株は、10% fetal bovine serum(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMで継代培養した。
15%FBSを含むDMEM中で維持した。
・ヒトNK細胞株 :KHYG-1(JCRB細胞バンク)
100Uの組換えヒトIL-2、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地で継代培養した。
細胞核の染色にDAPI(Vector Laboratories社)又はヘキスト33342(Molecular Probes)を、アクチンの染色にAlexa Fluor(登録商標) 488標識ファロイジン(Phalloidin,Molecular Probes)を、α-チューブリンの免疫染色にマウス抗ヒトα-チューブリンモノクローナル抗体(クローンDM1A、eBioscience)を、微小管関連タンパク質軽鎖3B(LC3B)の免疫染色にウサギ抗LC3B/MAPLC3Bポリクローナル抗体(Novus Biologicals)を、蛍光免疫染色の二次抗体としてAlexa Fluor標識抗ヒトIgGヤギポリクローナル抗体(Molecular Probes)、免疫組織化学染色の発色にはENVISIONキット/HRP(DAB)(DAKO)を、生細胞の染色に5-(and 6-)carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE、同仁化学研究所)及びPKH26(Sigma-Aldrich)を、ホスファチジルセリンの染色にアネキシンV Alexa Flour 488(Molecular Probes)を、死細胞の核染色にエチジウムホモダイマー(EthD-1;Molecular Probes)を使用した。
3)統計解析
Student’s t-test及び反復測の定分散分析を用い、P値が0.05以下を有意差とした。
ガラス基板(20mm×20mm)にMPCポリマー液をスピンコーティングして平均厚み40nm(湿潤時)のMPCポリマー層を形成した後、MPCポリマー層の上に1μm厚のポリパラキシレン(パリレン(登録商標))層を蒸着させ、さらにその上にアルミニウム及びフォトレジストの層を形成させた。
直径300μmの円形スポットが900μm間隔で1mm2あたり1個並んだパターン(図4のパターン2)を持つ細胞培養基材、及び直径95μmの円形スポットが最短約57μmの間隔で1mm2あたり10個並んだパターン(図4のパターン3)を持つ細胞培養基材それぞれのRoughness(+)と(-)とを、実施例1と同様にして作製した。図4のパターン1~3では、細胞培養基材の表面積に占めるスポット総面積の割合はいずれも約7.1%である。
実施例2において細胞培養基材1上に形成されたPCI-55細胞からなる微小腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定した後、ヘキスト33342を用いて細胞核を、ファロイジンを用いてアクチンを、抗α-チューブリン抗体を用いてα-チューブリンを染色した。染色後の微小腫瘍について、2次元画像をオールインワン蛍光顕微鏡(BZ-X700、BZ-9000、キーエンス)により取得し、また3次元画像を高速共焦点顕微鏡(Ti-E、ニコン)、高速スペクトル共焦点システム(A1R、ニコン)及び画像取得ソフトウェア(NIS-Elements、ニコン)により取得し、解析した。
実施例2において細胞培養基材1上で培養したPCI-55細胞が基材に接着する様子をDICで観察した。図26に示す9つの細胞からなる鎖状凝集体は、細胞が他の細胞内に取り込まれるエントーシスという現象を起こしながらスポットに定着し、最終的には1つの微小腫瘍となった。エントーシスで他の細胞内に取り込まれた細胞が再び外に出て複数細胞の凝集体に戻った後、再度エントーシスで他の細胞内に取り込まれる様子も観察されており(図27)、微小腫瘍におけるエントーシスは可逆的であると考えられた。
実施例2において細胞培養基材1上に形成されたPCI-55細胞からなる微小腫瘍がデブリを取り込む様子を、タイムラプスDIC画像を取得して観察した。微小腫瘍は糸状仮足及び葉状仮足を使用して能動的にデブリを捕捉していた(図32、矢頭)。
実施例5において死細胞と共存させた微小腫瘍を採取し、通常の細胞培養用ディッシュ(Falcon(登録商標) セルカルチャーディッシュ 35×10mm イージーグリップタイプ、ファルコン)に戻して培養したところ、微小腫瘍の形態学的極性は低下し、表面上のアネキシンVの蓄積も失われた(図38)。以上から、微小腫瘍がその特徴を維持した状態で生存するには、足場となる3次元構造を有する細胞培養基材での培養が必要であることが推測された。
実施例5において死細胞と共存させた微小腫瘍が死細胞を取り込む様子を、タイムラプスDIC画像を取得して観察した。微小腫瘍は多数の死細胞を貪食し、その内部に多量のEthD-1を取り込んだ(図39、図40)。また、死細胞添加から48時間後の微小腫瘍は、死細胞を添加しない微小腫瘍よりも底面積が有意に増加し、腫瘍サイズの増大が確認された(図41)。以上から、微小腫瘍はあたかも単一細胞のように死細胞を貪食して成長することが示された。
実施例2において細胞培養基材1上に形成されたPCI-55細胞からなる微小腫瘍におけるヌクレオシド代謝を、予めチミジンヌクレオシド類似体である5-エチニル-2’-デオキシウリジン(EdU)を取り込ませた死細胞(EdU死細胞)を用いて調べた。EdU死細胞は、PCI-55細胞を10μM EdU添加培地で培養した以外は実施例5と同様に調製した。CSFE標識PCI-55細胞からなる微小腫瘍にEdU死細胞を添加して培養した後、微小腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定し、Click-iT(登録商標) PlusアッセイによってEdUを検出した。
実施例9 微小腫瘍を用いた抗がん剤の評価
実施例1と同様の手法により、幅10μm、長さ10000μmの直線状グルーブが50μm間隔で10mm2あたり166本並んだパターンを有する細胞培養基材、及び幅30μm、長さ10000μmの直線状グルーブが50μm間隔で10mm2あたり125個並んだパターンを有する細胞培養基材を作製した。これらの細胞培養基材におけるグルーブは、細胞培養基材1におけるスポットと同様の凹凸構造をその表面に持つ。
実施例2と同様に、3mLのDMEMに懸濁した3×106個のMIA PaCa-2細胞を細胞培養基材1上に播種し、37℃で一晩~48時間培養した。PCI-55はEMTを起こしていない、上皮系形質を維持したアノイキス耐性のないヒト膵管腺癌細胞株であるのに対し、MIA PaCa-2はEMTを起こして間葉系形質を獲得した、アノイキス耐性のヒト膵管腺癌細胞株である(https://cellbank.nibiohn.go.jp/~cellbank/cgi-bin/search_res_det.cgi?ID=245)。
Claims (15)
- 基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、
該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、
ここで
粗面部分の形状は、径が20μm~100μmのスポットであるか、又は幅が3μm~30μmのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、
2つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも10μm以上であり、
粗面部分はその表面に高さ20nm~200nmの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材。 - 粗面部分の界面展開面積比(Sdr)が0.002以上である、請求項1に記載の細胞培養基材。
- 2つの隣接する粗面部分間の距離が10~1200μmである、請求項1又は2に記載の細胞培養基材。
- 粗面部分表面の算術平均粗さ(Ra)が4nm以上、最大高さ粗さ(Rz)が30nm以上、及び/又は山頂点算術平均曲(Spc)が300以上である、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
- 生体適合性ポリマーが生物学的材料との非特異的吸着を抑制する両親媒性ポリマーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
- 生体適合性ポリマーが2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
- がん細胞集合体が接着した、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞培養基材であって、がん細胞集合体が、接着性がん細胞から構成され、かつ以下の(a)~(f)の特徴を持つ、前記細胞培養基材。
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)複数の生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある - がん細胞集合体がさらに以下の(g)~(k)のうちの少なくとも1つの特徴を持つ、請求項7に記載の細胞培養基材。
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である - 請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、がん細胞集合体の製造方法であって、がん細胞集合体が、接着性がん細胞から構成され、かつ以下の(a)~(f)の特徴を持つ、前記製造方法。
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)複数の生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある - がん細胞集合体がさらに以下の(g)~(k)のうちの少なくとも1つの特徴を持つ、請求項9に記載の製造方法。
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である - 請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程;
前記工程により得られたがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程;
以下のがん細胞集合体の特徴
(a)細胞内細胞構造を有する
(b)非スフェロイド状形態を示す
(c)表面にα-チューブリンの膜状発現がある
(d)形態学的極性を有する
(e)組織運動極性を有する
(f)生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
(g)表面に繊毛を有する
(h)糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
(i)死細胞を取り込む能力がある
(j)細胞デブリ吸引力を有する
(k)表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも1つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程;及び
被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び/又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程;
前記工程により得られたがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程;
がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程;及び
被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び/又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。 - 薬剤が、がんの浸潤及び/又は転移を抑制する薬剤である、請求項11又は12に記載のスクリーニング方法。
- 薬剤が、がんの免疫回避機構を抑制及び/又は解除する薬剤である、請求項11又は12に記載のスクリーニング方法。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び
上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程
を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法。
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