JPWO2010047132A1 - 細胞培養キット、スクリーニング方法、及び細胞培養キットの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、前記生細胞は肝細胞を含む生細胞であることが好ましく、前記肝細胞が、組織前駆細胞、組織幹細胞、ES細胞から分化させた細胞またはiPS細胞から分化させた細胞であること、あるいは、前記肝細胞を含む生細胞が、複数のドナーの肝組織内から分離されたものであることがより好ましい。
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。
1.細胞の準備
1−1.肝細胞の培養(細胞増殖)
ヒト肝幹細胞(委託番号FERM BP−11108、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞(以下、「形質転換肝細胞」と表記)を、IV型コラーゲンコートディッシュ(ベクトンデッキン社製)に播種し培養した。
培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ−インスリン(1.0μg/ml)、ニコチンアミド(10mmol/L)、デキサメタゾン(1x10−7mol/L)、L−グルタミン(2mmol/L)を加えたDMEM栄養混合F−12Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture)を用いた。培養は、37℃、5%CO2インキュベータで行い、培地交換を5日毎に行った。
前記形質転換肝細胞とは異なるドナーに由来するヒト血管内皮細胞株を、何もコートされていない細胞培養ディッシュ(ベクトンデッキンソン社製)に播種し培養した。
培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ−インスリン(1.0μg/ml)、ニコチンアミド(10mmol/L)、デキサメタゾン(1x10−7mol/L)、L−グルタミン(2mmol/L)を加えたDMEM栄養混合F−12Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture)を用いた。培養は、37℃、5%CO2インキュベータで行い、培地交換を5日毎に行った。
上記1−1、1−2で培養した細胞それぞれについて、0.25%トリプシン溶液を用いて剥離し細胞を回収した後、培地に分散させた。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ−インスリン(1.0μg/ml)、ニコチンアミド(10mmol/L)、デキサメタゾン(1x10−7mol/L)、L−グルタミン(2mmol/L)を加えたDMEM栄養混合F−12Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture)を用いた。それぞれ、トリパンブルーで細胞を染色し生細胞数をカウントした。
2−1 <実施例01>
1−3で得た形質転換肝細胞と血管内皮細胞の混合比が1:3になるように混合し、細胞密度が3.75×104細胞/cm2になるように、培養容器に播種した。培養容器は、図3および図4に示す凹凸パターンであって、a=100μm、c=50μmのマイクロ空間を有する24ウェルタイプの培養容器を用いた。
1−3で得た形質転換肝細胞を、細胞密度が3.75×104細胞/cm2になるように、培養容器に播種した。培養容器は、図3および図4に示す凹凸パターンであって、a=100μm、c=50μmのマイクロ空間を有する24ウェルタイプの培養容器を用いた。
2−3 <比較例02>
1−3で得た形質転換肝細胞を、細胞密度が3.75×104細胞/cm2になるように、24ウェル細胞培養プレート(ベクトンデッキン社製)に播種した。
上記2−1から2−3に記載したように細胞を播種した後、37℃の5%CO2インキュベータで培養した。培養24時間後、1回/1〜2日の頻度で培地交換を行った。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ−インスリン(1.0μg/ml)、ニコチンアミド(10mmol/L)、デキサメタゾン(1x10−7mol/L)、L−グルタミン(2mmol/L)を加えたDMEM栄養混合F−12Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture)にヒト組換えHGF(50ng/mL)及び、上皮増殖因子(EGF)(10ng/mL)を添加した培地を用いた。
肝臓の代表的な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)及びアルブミンの遺伝子発現は、所定日数培養した細胞からRNAを回収し、cDNA合成後、リアルタイムPCRを行うことで評価した。
表1に、実施例01及び比較例01、02における培養期間21日後のアルブミン、CYP3A4、及びCYP2C9の遺伝子発現量を示す。表中、遺伝子発現量は、比較例02の値を1とした場合の相対値を示している。また、CYP3A4、CYP2C9は、肝臓に存在する代謝酵素の一つであり、チトクロームP450酵素の分子種の名前である。CYPは種々の化学物質(医薬品を含む)、環境汚染物質、有機溶媒などの異質・異物から生体を守る重要な役目を担っている。
実施例01では、アルブミン、CYP3A4、及びCYP2C9のいずれにおいても比較例01、02よりも有意に高い発現量を示した。
なお、実験方法の条件は、異なる2種の細胞を混合して培養する以外の、細胞数、細胞の混合比は上述したものに限定されない。表面コートについても細胞が接着すればよく、上述したものに限定されるものではない。
1.細胞播種
実施例では、6ドナー肝から採取したヒト胎児肝細胞、すなわち、肝幹細胞と肝前駆細胞と成熟肝細胞の3種類の細胞を含んだ、6ドナー由来の細胞を用いた。比較例では単一ドナーから採取したヒト胎児肝細胞を用いた。いずれも、タイプIVコラーゲンをコートした、図3および図4に示すa=100μm、c=50μmのマイクロ空間を有する24ウェルタイプの培養容器に、細胞密度が3.75×104細胞/cm2になるように播種した。
培養は、37℃の5%CO2インキュベータ内で行った。培養24時間後、1回/1〜2日の頻度で培地交換を行った。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ−インスリン(1.0μg/ml)、ニコチンアミド(10mmol/L)、デキサメタゾン(1x10−7mol/L)、L−グルタミン(2mmol/L)を加えたDMEM栄養混合F−12Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture)にヒト組換えHGF(50ng/mL)及び、上皮増殖因子(EGF)(10ng/mL)を添加した培地を用いた。
3−1.形態観察
倒立顕微鏡を用いて、培養1日、4日、7日、14日、21日、35日に観察した。
3−2.チトクロームP450(CYP)及びアルブミンの遺伝子発現と、CYP3A4のタンパク発現
肝臓の代表的表的な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)及びアルブミンの遺伝子発現は、所定日数培養した細胞からRNAを回収し、cDNA合成後、リアルタイムPCRを行うことで評価した。タンパク発現は、免疫染色法を用いて分析した。
3−3.グリコーゲン貯蔵能
PAS染色法より、ヒト胎児肝臓細胞における分化能(グリコーゲン貯蔵能)を評価した。
4−1.形態観察結果
細胞は最初にフィルム底面に接着し、培養日数を追うごとに、徐々に他のマイクロ空間内(micro cavity)へと伸展してゆき、マイクロ空間内に細胞集合体を形成した。これは、以下に示した<比較例>と同様の形態であったことから、複数ドナーの細胞も単一ドナーと同じように凝集体形成が可能であることが示された。図11A〜11Fは、実施例の形態観察結果を示す写真である。また、図12は、比較例の培養14日目の形態観察結果を示す写真である。
主要な薬物代謝酵素CYP3A4、2C19、2C9、1A2、2D6とアルブミン分泌能を測定した。その結果、培養7日目でこれらCYP遺伝子が発現し、培養21日目で、アルブミンとこれらCYP遺伝子が発現した。日数が経過した場合も、この機能は維持されていた。図13は測定結果を示す写真である。図13において、左側に培養7日目、中央に培養21日目、右側に培養35日目の結果を示している。
免疫染色で、ほぼすべてのマイクロ空間内で、CYP3A4(赤)の発現が確認され(図14)、これは、以下に示した<比較例>に示したCYP3A4の染色像(図15)と類似していたことから、複数ドナーの細胞も単一ドナーと同じように、肝機能を保持した状態で培養できることが示された。
ヒト胎児肝臓細胞における分化能(グリコーゲン貯蔵能)を検討した。その結果、ヒト胎児肝臓細胞においてグリコーゲン貯蔵能が認められた。さらに、この細胞においては培養21日目で半数以上の細胞が強いPAS陽性を呈した。
11 マイクロ容器
12 側壁
13 開口部
23 スポット
24 スポットの側壁
30 細胞培養キット
31 細胞培養容器
32 細胞培養プレート
33 マイクロ容器
34 培養皿
D1、D2、D3 細胞
Claims (16)
- 細胞培養プレートとその上で培養された生細胞とを有する細胞培養キットであって、
前記細胞培養プレートは、複数のマイクロ空間を有し、前記複数のマイクロ空間に複数の異なるドナーに由来する生細胞が表面に接着された細胞培養キット。 - 前記複数の異なるドナーに由来する生細胞が、2種類以上の細胞であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養キット。
- 各マイクロ空間は、複数の異なるドナーに由来する生細胞と、一つのドナーに由来する生細胞とのいずれかが接着されていることを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養キット。
- 少なくとも二つの隣接するマイクロ空間は、異なるドナーに由来する生細胞が接着されていることを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養キット。
- 少なくとも二つの隣接するマイクロ空間は、同じドナーに由来する生細胞が接着されていることを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養キット。
- 前記複数のマイクロ空間は、所望の細胞数に培養された三次元構造体の細胞集団が隔離される大きさを有すること特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記複数のマイクロ空間は、底部面積が0.01〜0.1mm2であり、深さが25〜150μmであることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記複数のマイクロ空間は、細胞播種密度が1×102〜1×106細胞/cm2で生細胞が播種されたことを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記複数のマイクロ空間は、生細胞が集積し、細胞塊が形成されていることを特徴とする請求項1乃至8のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記細胞塊の直径は、30〜200μmであることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記生細胞は、組織前駆細胞、組織幹細胞、ES細胞から分化させた細胞またはiPS細胞から分化させた細胞であることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記生細胞が、肝細胞を含む生細胞であることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載の細胞培養キット。
- 前記肝細胞が、組織前駆細胞、組織幹細胞、ES細胞から分化させた細胞、またはiPS細胞から分化させた細胞であることを特徴とする請求項12記載の細胞培養キット。
- 前記肝細胞を含む生細胞が、複数のドナーの肝組織内から分離されたものであることを特徴とする請求項12記載の細胞培養キット。
- 請求項1乃至14のいずれか一項に記載の細胞培養キットを用いて薬剤の評価を行うスクリーニング方法。
- 複数のマイクロ空間を有する細胞培養プレートとその上で培養された生細胞とを有する細胞培養キットの製造方法であって、
前記複数のマイクロ空間へ、複数の異なるドナーに由来する生細胞を播種し、
播種した生細胞を培養する細胞培養キットの製造方法。
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