JP6035343B2 - 毒性スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
この課題を解決するために、生体内に近い組織構造をin vitroで再現する方法、例えば凝集体状の塊を作製するための方法が多く研究され市販されている。例えば、AlgiMatrix(登録商標)など3次元培養システムが販売されている。これらの方法では、操作が煩雑である上、担体の光透過性が平板と比較して低い。このため、非特許文献1に開示されたイメージング手法には適さない。
このような事情から、化合物のスクリーニング方法において、細胞機能を高度に保つことができる三次元培養細胞を用い、被験化合物が代謝されることにより毒性を生じさせる薬物代謝酵素をイメージング法で特定する分析技術が要請されていた。
一実施形態の毒性スクリーニング方法は、被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する方法であり、次の構成を含む。
(1)複数の肝細胞を立体的に培養する工程。
(2)前記被験化合物を含まない第1溶液、前記被験化合物を含む第2溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の阻害剤と前記被験化合物との第3溶液のそれぞれを、各肝細胞に曝露させることによって、異なる溶液と接触させた前記複数の肝細胞を取得する工程。ここでは、各肝細胞に第1乃至第3溶液のいずれかを曝露させ、第1乃至第3溶液のうちの一つと接触させた、3種類の肝細胞を得る。
(3)生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される蛍光プローブを含む溶液と前記複数の肝細胞とを接触させる工程。
(4)染色後の前記複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、前記蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程。
立体的に培養した細胞に、被験物質と代謝酵素阻害剤を同時に添加することによって、肝細胞と同様の代謝機能を発現することが可能になる。加えて、蛍光プローブを用いて解析することにより、培養した肝細胞の代謝酵素が被験化合物を代謝した代謝物による毒性か否かを、生細胞と死細胞を可視化して評価することができる。
用語「凝集体」は、複数の細胞が少なくとも2層以上積層し立体的な形状を有する態様をいう。
用語「チトクロムP450(CYP)」は、細菌から植物,哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物(薬物)代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
用語「薬物代謝酵素」は、薬、毒物などの生体外物質(ゼノバイオティクスXenobiotics、異物ともいう)を分解あるいは排出するための反応に関わる酵素の総称である。
用語「第I相薬物代謝酵素」は、第I相反応と呼ばれる対象物質の分子量を低くする(分解)、または大きく変えない反応として、エステルなどの加水分解、酸化反応、還元反応に関わる酵素群である。酸化反応は、主にシトクロムP450(P450)による酸化である。
用語「第II相薬物代謝酵素」は、第II相反応と呼ばれる他の分子を付加する(分子量は大きくなる)反応で、抱合(ほうごう)ともいう反応において、付加される分子として、硫酸、酢酸、グルタチオン、グルクロン酸などを抱合する酵素群である。本明細書では「第II相薬物代謝酵素」を、「第II相酵素群」とも記載する。
加えて、「A、B、・・・、C、及びこれらの組合せ」という記載の「これらの組合せ」は、その前に記載のA、B、・・・、Cのうちの二つ以上の任意の数の組合せであることを意味する。言い換えると、「A、B、・・・、C、及びこれらの組合せ」は、A、B、・・・、Cのうちのいずれか一つと、これらの任意の数の組合せとのうちの一方、ということもできる。
第1工程は、複数の肝細胞を立体的に培養する培養処理である。
第2工程は、被験化合物を含む溶液、被験化合物と薬物代謝酵素の阻害剤を含む溶液、または被験化合物を含まない溶液を立体的に培養した複数の肝細胞と接触させる被験化合物処理である。
第3工程は、蛍光プローブを含む溶液と複数の肝細胞とを接触させる蛍光プローブ処理である。
第4工程は、被験化合物の毒性を判定する判定処理である。
以下、一実施形態の評価方法について、最初に培養処理で用いる培養容器について説明し、次に、培養処理から判定処理までを実施する毒性スクリーニング方法の手順について詳細に説明する。
培養容器は、肝細胞を立体的に培養できる培養容器を用いる。言い換えると、複数の細胞が積層して立体的な形状を有する肝細胞を製造できる培養容器であればよい。特に、凝集体形状を有する肝細胞を製造することが好ましい。以下に、培養容器の一例として、凝集体を形成させるための容器の好ましい例を説明する。
図1は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図2Aは、図1に示す培養プレートのII−II線断面図であり、図2Bに、他の態様の断面図を示す。培養プレート1は、複数のウェル21を備える。複数のウェル21は、仕切り部22によって、隣り合うウェル21と隔てられる。複数のウェル21それぞれには、培養容器10が形成されている。
図3に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図4は、図3に示す培養容器のIV−IV線断面図である。
培養容器10は、培養空間11と、壁12と、底部13とを有する。
培養空間11は、壁12と底部13とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域(培養領域)となる。培養空間11は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁12は、培養空間11を仕切る隔壁であり、培養容器10に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間11が仕切り部22に隣接する場合、壁12は、図2Aに示すように、仕切り部22の壁面の一部分と同じになってもよいし、図2Bに示すように、仕切り部22の壁面に隣接して壁12が配置されてもよい。
底部13は、培養容器10の基板として機能するとともに、培養空間11が配置される側の表面は、培養領域(培養表面)の一部となる。底部13は、培養プレート1に形成された各ウェル21の底部と同じ領域であり、各ウェル21の底部が用いられる。底部13は、培養空間11の底を形成する。底部13のうち、培養空間11を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面14」とも称する。
相当直径Dは、培養空間11に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Dは、培養空間11の底部13と平行する面の形状(正面の形状)、言い換えると、培養空間11の高さHの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間11の正面の形状が、高さHに応じて異なる場合、肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径とする。
高さHは、培養空間11の底(底部培養面14)から壁12の上面までの長さであり、培養空間11の深さでもあるともいえる。また、底部培養面14が平面の場合、高さHは、壁12の高さと同じである。
壁12の幅Wは、壁12の厚さであるとともに、隣接する培養空間11間を隔てる距離であるともいえる。
* 培養空間の大きさ、形状等
細胞を播種した後、壁11を乗り越えて隣り合う培養空間11に移動しない、すなわち凝集体を形成するまでは、培養空間11に細胞を保持しておくことが重要となる。そのため、高さHが相当直径Dの0.1倍〜3倍であることが好ましく、細胞を保持するためにはHは高いほうがよく、かつ、栄養分の供給を円滑に行うためには、高さHは低い方が良いことから、高さHが相当直径Dの0.2〜1倍がより好ましい。凝集体の相当直径は、培養空間11によって規定されるため、培養空間11の相当直径Dは、所望する凝集体の直径の1〜5倍の範囲が好ましく、1.2〜4倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径100μmの肝細胞の凝集体を形成させるために、所望する凝集体の直径の1〜5倍の範囲、即ち、相当直径Dが100〜500μmの範囲で、高さHが相当直径の0.1〜3倍の範囲の培養空間11が規則的に配置されている底部13を有する培養容器10を用いる。
図1に示す培養プレート1で培養する場合、ウェル21毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル21に複数の培養空間11を形成するため、各ウェル21において、同条件で複数の凝集体を培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いて凝集体を培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
凝集体9の直径DSPを値dsp(dspは正の数値)とすると、培養空間11の相当直径Dは、値dspから値dspの5倍の範囲(dsp≦D≦5dsp)が好ましい範囲となる。また、培養空間11の高さHは、値dspの0.3倍から値dspの25倍(5×5)の範囲(0.3dsp≦H≦25dsp)が好ましい範囲となる。
加えて、培養する立体的な細胞は、凝集体9の下位概念である、スフェロイドを培養する場合であってもよい。図5Cに、培養空間11でスフェロイド9aを培養する状態を表す概略図を示し、図5Dに、培養空間で培養したスフェロイド9aの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。スフェロイド9aは、凝集体9より球状に形成される細胞塊である。
培養空間11の側面の形状は、図4に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図7A〜7Cに示すような形状であってもよい。
加えて、培養容器10の底部13を構成するポリマーの全光線透過率が、85%以上99%未満であることが好ましい。全光線透過率(total luminous transmittance)は、日本工業規格(JIS K7375)により測定する。全光線透過率を高くすることにより、底部13の上に培養された凝集体の観察性を確保することができる。さらに加えて、培養容器10(ウェル)の底部の厚さが300μm以下であることが好ましい。
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間11を囲む壁12及び底部培養面14の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間11内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間11内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を45度以下にすることが好ましい。より好ましくは0度〜20度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間11と壁12の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器10と同条件で作製して測定した値を前提とする。
上述した親水化処理を行った後、細胞接着性を促進する物質または細胞接着性を抑制する物質をコートして接着性を制御することにより、効率よく凝集体を形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を45度以下にした後、ポリ‐L-リシンをコートして細胞接着性を高めてもよい。
一実施形態の毒性スクリーニング方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、培養処理(第1工程)から蛍光プローブ処理(第3工程)までを同一のウェル21内(言い換えると、同一の細胞容器10内)で行うことがより好ましい。特に、培養プレートの各ウェルには、凹凸パターンによって形成される複数の培養空間を有する培養容器が形成されていることが好ましい。そのため、一実施形態では、図1に示す培養プレート1の複数のウェル21を用い、複数のウェル21のうち、一つのウェル21内で培養処理から蛍光プローブ処理までの工程を実施する場合を説明する。言い換えると、一つのウェル21内で培養処理、被験化合物処理、及び蛍光プローブ処理を実施し、各処理で細胞を別のウェル21に移動させることはない。
例えば、多数の化合物を同時にスクリーニングするような場合、自動培養装置や自動分析装置を用いる。このような場合には、コンタミネーションのリスクを減らすために、培養処理で形成させた立体的に培養した肝細胞を別の容器に移し替えることなく被験化合物処理及び蛍光プローブ処理を行うことが望ましい。
加えて、複数のウェルを有する培養プレート(ウェルプレート)形状を使用し検体数に応じて、6、24、48、96、384ウェルのいずれかの培養プレートを選択することが好ましい。
培養処理では、上述した培養容器10によって形成される複数の培養空間11を用いる。ウェルプレート内の各ウェル21には複数の培養空間11が形成されている。各培養空間11で肝細胞を立体的に培養し、複数の培養空間11に複数の肝細胞を形成させる。言い換えると、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、所望の大きさの複数の肝細胞を形成する。
培養する肝細胞の由来は、ヒト、げっ歯類、ラット、イヌ、及びサルのうちいずれかから選択されることが好ましい。加えて、肝細胞は、初代肝細胞であることがより好ましい。
形成した凝集体が、被験化合物を代謝する代謝酵素を発現しているかを確認したうえで添加処理を実施することが好ましい。
被験化合物処理では、被験化合物を含むまたは被験化合物を含まない、第1乃至第3溶液のいずれかを立体的に培養した肝細胞へ曝露させる。第1溶液は、被験物質を含まないコントロール溶液である。第2溶液は、被験化合物を含む被験溶液である。第3溶液は、薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の化合物(薬物代謝酵素の阻害剤)と被験化合物とを混合した混合溶液である。第1乃至第3溶液のいずれかを各肝細胞へ曝露させることにより、異なる溶液と接触させた複数の肝細胞を得る。言い換えると、第1溶液と曝露させた複数の肝細胞、第2溶液と曝露させた複数の肝細胞、及び、第3溶液と曝露させた複数の肝細胞を得る。
各肝細胞に接触させる第1乃至第3溶液に用いる溶媒としては、蛍光染色像を得る際のバックグラウンドを小さくするためにフェノールレッドを含まない培地を用いることが好ましい。加えて、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、各試験溶液と細胞を48時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため0.1〜1%の範囲の血清を加えても良い。
被験物質および薬物代謝酵素阻害剤の濃度は、任意の薬剤の濃度の溶液を1時間から96時間の範囲で肝細胞と接触させ、生存率が80%を超える濃度を採用する。濃度が低すぎる場合は反応性代謝物による毒性が観察されない場合も想定されるため、生存率が80%を下回らない範囲でできる限り高い濃度の被験物質の溶液を最大濃度として用いることが好ましい。最大濃度の1/2〜1/100の範囲の複数の濃度の被験物質を用いることがより好ましい。
蛍光プローブ処理は、蛍光プローブを含む溶液と複数の肝細胞とを接触させる。蛍光プローブは、生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
蛍光染色像を得る装置としては、共焦点レーザ顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いる。
第4工程は、被験化合物の毒性を判定する判定処理である。判定処理は、染色後の複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する。蛍光染色像から判定条件を満たすことが検出されると、肝細胞による代謝を受けた被験化合物(反応性代謝物)が細胞毒性の要因であると判定する。言い換えると、被験化合物が肝細胞に有する薬物代謝酵素によって代謝を受けると、反応性代謝物が生成され、細胞毒性の要因となると判定できる。
蛍光染色像の判定は、蛍光領域または蛍光強度を用いる。以下に、3種類の判定条件を示す。これらの判定条件のいずれか一つまたは複数を用いて判定することができる。
蛍光領域を次のように定義する。
第1溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第1生領域(A)とする。
第2溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第2生領域(B)とする。
第3溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第3生領域(C)とする。
第1溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第1死領域(D)とする。
第2溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第2死領域(E)とする。
第3溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第3死領域(F)とする。
(1)第1生領域が第2生領域より大きく、かつ、第2生領域が第3生領域より小さい(A>B、かつ、B<C)。
(2)第1死領域が第2死領域より小さく、かつ、第2死領域が第3死領域より大きい(D<E、かつ、E>F)
二つ目の判定条件は、
第1死領域を第1生領域で割った値が、第2死領域を第2生領域で割った値より小さく、かつ、第2死領域を第2生領域で割った値が、第3死領域を第3生領域で割った値より大きいとき、肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定する。記号で表すと次のような関係式になる。
(D/A)<(E/B)、かつ、(E/B)>(F/C)
蛍光強度を次のように定義する。
第1溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第1生強度(G)とする。
第2溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第2生強度(H)とする。
第3溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第3生強度(I)とする。
第1溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第1死強度(J)とする。
第2溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第2死強度(K)とする。
第3溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第3死強度(L)とする。
判定条件は、以下の(3)と(4)との少なくとも一方であるときに肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定する。
(3)第1生強度が第2生強度より大きく、かつ、第2生強度が第3生強度より小さい(G>H、かつ、H<I)。
(4)第1死強度が第2死強度より小さく、かつ、第2死強度が第3死強度より大きい(J<K、かつ、K>L)。
この方法を用いることができない場合は、死細胞の面積と生細胞の面積との割合(死細胞の面積/生細胞の面積)を計算し判定することが好ましい。
また、一実施形態の培養処理は、特許文献1の培養方法に比べ、単一の細胞で毒性が発現した場合にそれがどの代謝酵素によるものかを評価できるので、複数種の細胞を維持する手間を省くことができる点で優れている。加えて、一実施形態の培養工程は、非特許文献1のようなゲルを用いることなく立体培養できる。さらに、一実施形態のスクリーニング方法は、培養処理から蛍光プローブ処理までの工程を、光透過性の高い培養プレートを用い、かつ、一連の処理を同じ培養プレートを用いる。このため、顕微鏡を使った可視化も可能である点で優れている。
1.細胞の準備(培養処理)
(1−1)肝細胞の調製
培養に用いる初代ラット肝細胞は以下のように調製した。6週齢のSD系ラットの門脈にサーフロー留置針を挿入し、EDTA含有溶液を流して脱血液を行った後、コラゲナーゼ溶液を還流した。その後、コラゲナーゼ溶液で処理された肝臓を培養液へ入れ、メスピペットによるピペッティングで肝細胞を分散させた。肝細胞懸濁液を3回洗浄し、肝細胞以外の細胞を除去し、単離した肝細胞を培養に用いた。
図8に示す、24個のウェル21aを有する培養プレート(24ウェル培養プレート)1aを使用した。各ウェル21aの底部培養面には凹凸パターン(微細パターン)によって複数の培養容器10aが形成されている。各培養容器10aは、相当直径Dが200μm、高さHが50μmで形成される培養空間11aを、底部培養面14(培養底面)に有する。また、壁12aの幅Wは10μmである。
上述の凹凸パターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ni電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を100nm形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターンによって形成される複数の細胞容器10を得た。複数の培養容器10によって形成される複数の培養空間11で肝細胞を培養した。
ラット初代肝細胞を1×105個/cm2になるように培地に播種して5日間培養した。
培養に用いる培養液は以下のように調製した。DMEM/F12培地に10% ウシ胎児血清、1μg/ml インシュリン、1×10−7mol/L デキサメタゾン、10mM ニコチンアミド、2mmol/L L−グルタミン、50μm β−メルカプトエタノール、5mmol/L HEPES、59μg/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、20ng/ml EGFを添加した。凹凸パターン基材上に、1.0×105細胞/cm2の濃度で肝細胞を播種し、5vol%CO2、37℃で所定時間培養した。また、同組成の新鮮培地0.5mLを用い、1日から2日毎に培地交換を行った。
図9に培養した肝細胞を示す。立体的に培養できていることが分かる。
(2−1)被験化合物
表1に示す溶液(i)〜(iii)を用いた。被験物質として、アセトアミノフェン、チトクロムP450の阻害剤として、1−アミノベンゾトリアゾール(ABT)を用いた。
アセトアミノフェンはチトクロムP450種に属するCYP2E1により代謝され毒性を示すことが知られている。
項目1.細胞の準備で説明した手順に従って、肝細胞を立体的に培養する。
次に、培地を吸い取り燐酸緩衝液で洗浄した後、表1の溶液(i)〜(iii)のいずれかをそれぞれのウェルに添加し、異なる溶液を添加した複数のウェルを得る。各ウェルにおいて、肝細胞と添加した溶液とを24時間反応させた。
反応後、生細胞を染色するためにCalcein−AMとMCBの2種類の蛍光試薬を用いた。Calcein−AMは細胞透過性があり、細胞内のエステラ−ゼによる加水分解を受けてCalceinになり緑色の蛍光を示す。また、細胞死はグルタチオンの枯渇によって起こることが知られていることから、グルタチオンと反応し青色の蛍光を発するMCB(monochlorobimane)を用いて細胞を染色した。
図10に溶液(i)〜(iii)を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真を示す。
Calceinの列は、Calcein−AMで染色した蛍光染色像である。MCBの列は、MCBで染色した蛍光染色像である。Mergeの列は、Calcein−AMの蛍光染色像とMCBの蛍光染色像とを合併させた画像である。
溶液(i)〜(iii)により蛍光強度に違いが見られる。生細胞を認識するCalcein、MCBは、A>B、B<CとなりアセトアミノフェンがチトクロムP450で代謝されたことにより毒性を示すことが判断できる。
1.細胞の準備(培養処理)
培養プレートは市販されている培養底面が平板な培養プレート(ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン(登録商標)のγ線滅菌済み平面状24ウェル培養プレート)を用いた。
ラット初代肝細胞を1×105個/cm2になるように播種し7日間培養した。
上記以外は実施例と同じ条件とした。
2.試験条件・手順
(2−1)被験化合物
表2に示す溶液(i)〜(iii)を用いた。
項目1.細胞の準備で説明した手順に従って、肝細胞を平面状の培養プレートを用いて培養する。
次に、培地を吸い取り燐酸緩衝液で洗浄した後、表2の溶液(i)〜(iii)のいずれかをそれぞれのウェルに添加し、異なる溶液を添加した複数のウェルを得る。各ウェルにおいて、肝細胞と添加した溶液とを24時間反応させた。
反応後、生細胞を染色するためにCalcein−AMとMCBの2種類の蛍光試薬を用いた。
3.試験結果(目視観察結果)
図11に溶液(i)〜(iii)を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真を示す。図11は、図10と同様に、各列に染色した染色試薬ごとに結果を示している。
溶液(i)〜(iii)ともに同程度の染色強度で毒性が検知できなかった。
8 細胞
9 凝集体
9a スフェロイド
10、10a 培養容器
11、11a 培養空間
12 壁
13 底部
14 底部培養面
21、21a ウェル
22 仕切り部
Claims (20)
- 被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する毒性スクリーニング方法であって、
複数の肝細胞を立体的に培養する工程と、
前記被験化合物を含まない第1溶液、前記被験化合物を含む第2溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の阻害剤と前記被験化合物との第3溶液のそれぞれを、各肝細胞と曝露させることによって、異なる溶液と接触させた前記複数の肝細胞を取得する工程と、
生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される蛍光プローブを含む溶液と前記複数の肝細胞とを接触させる工程と、
染色後の前記複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、前記蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程と、
を含む毒性スクリーニング方法。 - 前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第1溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第1生領域、前記第2溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第2生領域、前記第3溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第3生領域、前記第1溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第1死領域、前記第2溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第2死領域、前記第3溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第3死領域とした場合、
第1生領域>第2生領域、かつ、第2生領域<第3生領域と、
第1死領域<第2死領域、かつ、第2死領域>第3死領域と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項1記載の毒性スクリーニング方法。 - 前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第1溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第1生領域、前記第2溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第2生領域、前記第3溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第3生領域、前記第1溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第1死領域、前記第2溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第2死領域、前記第3溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第3死領域とした場合、
(第1死領域/第1生領域)<(第2死領域/第2生領域)、かつ、(第2死領域/第2生領域)>(第3死領域/第3生領域)であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項1記載の毒性スクリーニング方法。 - 前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第1溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第1生強度、前記第2溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第2生強度、前記第3溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第3生強度、前記第1溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第1死強度、前記第2溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第2死強度、前記第3溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第3死強度とした場合、
第1生強度>第2生強度、かつ、第2生強度<第3生強度と、
第1死強度<第2死強度、かつ、第2死強度>第3死強度と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項1記載の毒性スクリーニング方法。 - 前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェル内で前記複数の肝細胞を培養し、培養した前記複数の肝細胞を他の容器に移し替えることなく、前記各ウェルに前記第1乃至第3溶液のいずれかを添加し反応させた後、前記各ウェルに前記蛍光プローブを添加することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。 - 各肝細胞は、細胞が凝集した凝集体を形成していることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記凝集体の相当直径が30μm以上200μm未満であることを特徴とする請求項6記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の化合物が、チトクロムP450酵素群、第II相薬物代謝酵素、及びこれらの組合せからなる群から選択される薬物代謝酵素の薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の化合物であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の化合物が、チトクロムP450酵素群であって、CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2C11、CYP2D6、及びCYP2E1からなる群から選択される薬物代謝酵素の薬物代謝酵素反応を阻害する1種類以上の化合物であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記複数の肝細胞の由来が、ヒト、げっ歯類、ラット、イヌ、及びサルのうちいずれかから選択されることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記複数の肝細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェルは、複数の培養空間を有する培養容器が形成され、
前記複数の培養空間は、各培養容器の底からの高さが25〜500μmの範囲の壁で囲まれ、かつ、相当直径50〜1000μmの範囲の空間が規則的に配列して形成され、
前記複数の肝細胞を立体的に培養する工程は、前記複数の培養空間を用いて複数の肝細胞の凝集体を作製することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。 - 前記壁の厚さが10μm以上50μm未満であることを特徴とする請求項12記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が85%以上99%未満であることを特徴とする請求項12または13に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される樹脂成形品であることを特徴とする請求項12乃至14のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部の厚さが300μm以下であることを特徴とする請求項12乃至15のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部培養面が親水化処理されていることを特徴とする請求項12乃至16のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部培養面が、ガラスであって、水接触角を45度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項12乃至17のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部培養面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を45度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項12乃至18のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
- 前記親水化処理された前記底部培養面に、さらに、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−L−リシン、ポリ−D−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びこれら組合せからなる群から選択されるポリマーが固定化されていることを特徴とする請求項17記載の毒性スクリーニング方法。
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