WO2014050139A1 - サイトカインがチトクロムｐ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法および薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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cytochrome
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花華 三村
寛 千葉
洋子 江尻
雅也 細田
賢 綾野
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention is a method of evaluating the interaction between a cytokine and cytochrome P450, for example, a method of evaluating the induction and attenuation of drug metabolism function of cytochrome P450 by a cytokine.
  • the present invention is also a method of screening for an agent that interacts with a cytokine.
  • Non-patent Document 1 When administering a drug (D1) that undergoes metabolism of cytochrome P450 to such a patient, an amount smaller than that of a healthy person is administered in anticipation of the decrease in metabolic function of the corresponding patient.
  • Non-patent Document 2 cytokine-interacting drug
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • in vivo tests such as animal studies, have poor throughput compared to in vitro systems. For this reason, there is a problem that it is not suitable for the screening of medicines which evaluate many compounds simultaneously. From such a background, evaluation methods by in vitro tests that can accurately predict in vivo reactions have been required.
  • cytokines represented by interleukins are attracting attention as drug discovery targets, and in recent years, in vitro systems for evaluating the interaction between drugs and cytokines have been required.
  • Non-Patent Document 3 discloses a method using human primary hepatocytes.
  • human primary hepatocytes have large lot-to-lot differences in the expression levels of pharmacokinetic genes and their inducibility due to genetic polymorphisms of donors and environmental factors.
  • the cost is high due to the limited access route, and the handling is difficult. Therefore, there has been a problem that it is difficult or expensive to evaluate a plurality of cytochrome P450s at the same time in cells of the same lot using various cytokines.
  • established hepatocytes can be proliferated.
  • human-derived hepatocytes can be used as a method for evaluating the effect of cytokines on the metabolic ability of cytochrome P450, it is expected that inexpensive and reproducible results can be obtained.
  • the function of hepatocytes having the metabolic function of established hepatocytes is very low compared to primary hepatocytes.
  • the metabolic ability of cytochrome P450 may fall below the measurement limit value and thus can not be analyzed.
  • the present inventors have found a method of using established hepatocytes as a method of evaluating the influence of a cytokine on the metabolic ability of cytochrome P450 and a method of screening a drug that interacts with a cytokine.
  • the inventors solved the above-mentioned problem with a method of measuring the metabolic ability of cytochrome P450 after contacting a spheroid-shaped established hepatocyte with a test solution containing a cytokine for 1 hour or more and less than 96 hours.
  • One aspect of the method for evaluating the effect of the cytokine according to the present invention on the metabolic ability of cytochrome P450 is to contact a spheroid-shaped established cell line and a test solution containing the cytokine for at least 1 hour and less than 96 hours in a culture vessel. After induction, assess the presence or absence of induction or decay of the metabolic function of cytochrome P450.
  • the metabolic function can be measured by forming the spheroid-shaped established hepatocytes and contacting the formed spheroid-shaped established hepatocytes with the test solution for an appropriate time. This method makes it possible to measure and evaluate the effects of cytokines on the metabolic ability of cytochrome P450.
  • an average value of diameters of spheroids formed from the established hepatocytes is 50 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m,
  • spheroids having a diameter within the half width range are 70% or more of all spheroids. Since the size of the diameter of the spheroid is within a predetermined range and the variation in the size of the diameter of the spheroid is reduced, it is possible to improve the accuracy of the determination of the metabolic function.
  • the test solution is a serum-free medium.
  • the cytokine concentration of the test solution is at least 1-fold, 10-fold based on the concentration in one of the range of 0.1 times to 50 times the mean blood concentration of cytokines in a healthy person. It is preferable to use each test solution containing three times the concentration of the above-mentioned cytokine by 100 times.
  • the concentration of the cytokine in the test solution is at least one of the criteria within the range of 0.1 times to 50 times the average value of the blood concentration of the diseased patient in which the cytokine is secreted. It is preferable to use each test solution containing three concentrations of cytokines at 1 ⁇ , 10 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the steps are performed in the same well.
  • One embodiment of the method for screening a drug that interacts with a cytokine according to the present invention comprises the cytokine and a first test solution not containing the drug, a second test solution containing the cytokine and not the drug, and Preparing a third test solution containing the cytokine and the drug; Bringing the first to third test solutions into contact with a spheroid-shaped established hepatocyte; A function of a drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 of the established hepatocytes in contact with the first test solution is measured to obtain a first measurement value, and similarly, the second and third test solutions are obtained.
  • 70 of the spheroids having an average diameter of 50 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m of the spheroids formed from the established hepatocytes and having a diameter within the half width range are 70 of whole spheroids. % Or more is preferable. Since the size of the diameter of the spheroid is within a predetermined range and the variation in the size of the diameter of the spheroid is reduced, it is possible to improve the accuracy of the determination of the metabolic function.
  • the solvent of the test solution is preferably a serum-free medium.
  • the third measurement value restores the drug metabolism function of cytochrome P450 when it is three times the second measurement value.
  • the concentrations of cytokines in the second and third test solutions are based on one of a range of 0.1 times to 50 times the mean blood concentration of cytokines in a healthy individual, and A measured value of measuring the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 by contacting a drug free solution containing the drug at a concentration of at least 1, 10 and 100 times the standard and containing no concentration of the cytokine
  • a concentration smaller than the first measurement value is selected.
  • the concentration of the cytokine in the second and third test solutions is based on a concentration in the range of 0.1 times to 50 times the blood concentration of the diseased patient from which the cytokine is secreted,
  • a measured value of measuring the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 by contacting a drug free solution containing the drug at a concentration of at least 1, 10 and 100 times the standard and containing no concentration of the cytokine Preferably, a concentration smaller than the first measurement value is selected.
  • a step of culturing the established cell line in a spheroid shape a step of contacting the established cell line in the spheroid shape and the first to third test solutions, a culture plate Preferably in the same well.
  • hepatocytes as a method of evaluating the influence of a cytokine on the metabolic ability of cytochrome P450 and a method of screening a drug that interacts with a cytokine.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II of the culture plate shown in FIG.
  • FIG. 2 is another cross-sectional view of the culture plate shown in FIG. 1 along the line II-II.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the culture vessel shown in FIG. 3 taken along line IV-IV.
  • It is the schematic showing the state which culture
  • It is a figure which shows the schematic diagram explaining an example of the preferable size of the spheroid cultured by culture space.
  • the inventors used a method for evaluating the effect of cytokines on the metabolic ability of cytochrome P450 (hereinafter appropriately referred to as "evaluation method") by adding a test solution containing established hepatocytes in a spheroid shape and cytokines for at least 1 hour.
  • evaluation method a method for evaluating the effect of cytokines on the metabolic ability of cytochrome P450 (hereinafter appropriately referred to as "evaluation method”) by adding a test solution containing established hepatocytes in a spheroid shape and cytokines for at least 1 hour.
  • the evaluation method involves culturing human-derived established hepatocytes to form spheroids, and forming spheroid-shaped established hepatocytes and a test solution containing a cytokine for at least 1 hour and 96 hours in a culture vessel. Make less contact and measure the cytochrome P450 value of established hepatocytes.
  • screening method for a drug that interacts with a cytokine
  • screening method can be realized by the following procedure. Providing (A) a first test solution containing no cytokine and drug, (B) a second test solution containing cytokine and no drug, and (C) a third test solution containing cytokine and drug .
  • the established hepatocytes are cultured using a culture vessel having a culture space to form spheroids.
  • the first to third test solutions and the spheroid-shaped established hepatocytes are brought into contact with each other, and the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 of the established hepatocytes in contact with the first test solution is measured Acquired the measured value of 1, and similarly measured the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 of the established hepatocytes in contact with the second and third test solutions to obtain the second and third measured values Do.
  • the first measurement value is larger than the second measurement value and the second measurement value is smaller than the third measurement value, it is determined that the drug restores the drug metabolism function of cytochrome P450.
  • cytokine is a generic term for proteinaceous factors released from cells and mediating various cell interactions, such as modulation of immune system, induction of inflammatory response, antitumor action, cell proliferation, differentiation , Substances that play a role in maintaining homeostasis, such as suppression.
  • the cytokine is specifically targeted when its presence causes a fluctuation (induction, decay) of liver function, and includes, for example, growth factors, interferons, tumor necrosis factors and the like.
  • spheroid is a cell in which a large number of cells have aggregated to form a cell mass, resulting in a three-dimensional state.
  • cytochrome P450 is an enzyme that plays a role in foreign body (drug) metabolism, which is present in almost all organisms from bacteria to plants to mammals. In animals, they are mainly present in the liver.
  • agent that interacts with a cytokine
  • agent is an agent that interacts in the presence of a cytokine, and in particular it alters the metabolic function of cytochrome P450 due to its interaction with a cytokine Drug that For example, it includes biopharmaceuticals, low-molecular-weight pharmaceuticals and the like using proteins and genes in the body.
  • value A means “value A or more and value B or less” unless otherwise specified.
  • value of cytochrome P450 is not a value of total cytochrome P450 amount, but a value representing the metabolic function of cytochrome P450, and means, for example, metabolic activity value, gene expression amount, protein amount.
  • FIG. 1 is a view showing an entire culture plate used in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a cross-sectional view taken along line II-II of the culture plate shown in FIG. 1, and FIG. 2B shows a cross-sectional view of another embodiment.
  • the culture plate 1 comprises a plurality of wells 21.
  • the plurality of wells 21 are separated from the adjacent wells 21 by the partition portion 22.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along line IV-IV of the culture vessel shown in FIG.
  • the culture vessel 10 has a culture space 11, a wall 12 and a bottom 13.
  • the culture space 11 is a region partitioned by the wall 12 and the bottom 13, and serves as a three-dimensional space region (culture region) in which cells are cultured.
  • the culture space 11 is also referred to simply as "space" or "microspace”.
  • the wall 12 is a partition that divides the culture space 11, and can be said to be a convex portion that forms a concavo-convex pattern in the culture container 10.
  • the wall 12 When the culture space 11 is adjacent to the partition 22, the wall 12 may be the same as a part of the wall of the partition 22 as shown in FIG. 2A, or as shown in FIG. 2B.
  • the wall 12 may be disposed adjacent to the wall surface.
  • the bottom portion 13 functions as a substrate of the culture container 10, and the surface on which the culture space 11 is disposed is a part of the culture region (culture surface).
  • the bottom 13 is the same area as the bottom of each well 21 formed in the culture plate 1, and the bottom of each well 21 is used.
  • the bottom 13 forms the bottom of the culture space 11.
  • the surface of the bottom which is a part of the surface of the bottom 13 which forms the culture space 11 and which is to be a culture region is also referred to as “bottom culture surface 14”.
  • FIG. 3 and 4 show the equivalent diameter D, height (depth) H, width (thickness) W of the wall 12 and thickness T of the bottom 13 with respect to the culture space 11 formed in the culture vessel 10 .
  • the bottom part 13 has shown the case where it was produced integrally with the wall 12.
  • the equivalent diameter D refers to the diameter of the inscribed circle inscribed in the culture space 11.
  • the equivalent diameter D is the shape of the surface parallel to the bottom 13 of the culture space 11 (front shape), in other words, the inscribed circle of the shape perpendicular to the direction of the height H of the culture space 11
  • the diameter of is taken as the equivalent diameter of the equivalent diameter.
  • the height H is a length from the bottom of the culture space 11 (bottom culture surface 14) to the upper surface of the wall 12, and can also be said to be the depth of the culture space 11.
  • the height H is the same as the height of the wall 12.
  • the width W of the wall 12 is the thickness of the wall 12 and can also be said to be the distance separating the adjacent culture spaces 11.
  • culture container 10 In culture container 10 (in other words, in each well 21), a plurality of culture spaces 11 are arranged in an array as shown in FIG.
  • the number or size of culture spaces 11 contained in culture vessel 10 depends on the number of wells 21 (size of wells 21) prepared in culture plate 1 and the sizes of culture spaces 11 and walls 12 . Specifically, as the number of wells 21 increases, the number of culture spaces 11 decreases. In the case of wells 21 of the same size, the number of culture spaces 11 in the wells 21 has a relation of decreasing when the equivalent diameter D is large or the width W is large.
  • FIGS. 1 to 4 are schematic views in which the number of culture spaces 11 is reduced to express the configuration in an easily understandable manner, and the number of culture spaces 11 included in the culture vessel 10 is different from the actual number. In addition, in FIGS. 3 and 4, nine culture spaces 11 are shown. This is shown for the purpose of explanation, and does not correspond to the number of culture spaces 11 included in the actual culture container 10 (each well 21).
  • the culture space has a plurality of culture spaces 11 in which the equivalent diameter D is 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, and the height H is 0.3 times to 5 times the equivalent diameter D.
  • the culture vessel 10 having a surface water contact angle of 45 degrees or less, it is possible to culture spheroid of established hepatocytes of uniform diameter. I found it. Therefore, by selecting the size of the culture space 11 disposed in the culture vessel 10 according to the size of the desired spheroid, it becomes possible to control the size of the spheroid to be cultured.
  • human-derived established hepatocytes are cultured to form spheroids as the established hepatocytes. Details will be described below.
  • the equivalent diameter D of the culture space 11 is preferably in the range of 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, and more preferably in the range of 1.2 to 4 times.
  • the height H can be equivalent to 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, ie, the equivalent diameter D is in the range of 100 to 500 ⁇ m.
  • the culture vessel 10 having the bottom portion 13 in which culture spaces 11 in a range of 0.3 to 2 are regularly arranged is used.
  • the case of culturing cancer cells which are established hepatocytes is examined.
  • the cells are grown and maintained by strengthening cell adhesion with the surface of the established hepatocyte culture space 11, the cells are detached at the time of medium replacement since the cells are sufficiently adherent to the bottom surface I have not. Therefore, as in the present embodiment, a deep space in which the equivalent diameter D of the culture space 11 is in the range of 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, and the height H is in the range of 0.3 to 2 times the equivalent diameter D. Culture is not performed in such a space.
  • the equivalent diameter D is in the range of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m to prevent excessive growth of spheroids due to cell proliferation.
  • the height H is preferably in the range of 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the height H of the culture space 11 is lower unless the spheroid is exfoliated at the time of medium exchange or test solution exchange.
  • the value obtained by dividing the height H of the culture space 11 by the equivalent diameter D is preferably in the range of 0.3 to 2, and more preferably in the range of 0.5 to 1.
  • the diameter of the spheroid in order to diffuse or transport the test solution to the center of the spheroid, is preferably at most 200 ⁇ m, preferably 150 ⁇ m or less. In addition, in order to maximize interaction between cells, the diameter of the spheroid is preferably at least 50 ⁇ m, more preferably in the range of 60 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • the interaction between cells is an interaction between a test substance (eg, a cytokine) and cytochrome P450.
  • the width W of the wall 12 is the thickness of the wall 12 separating the culture space 11 and the culture space 11 adjacent thereto. Therefore, the width W of the wall 12 is preferably in the range of 2 to 50 ⁇ m in order to prevent cell growth on the upper surface of the wall 12 and to facilitate the cell to enter the culture space 11, preferably one cell body
  • the following size is preferable, that is, the range of 5 to 30 ⁇ m, and the range of 5 to 10 ⁇ m is more preferable.
  • the angle ⁇ between the upper surface of the wall 12 and the side surface of the culture space 11 is preferably in the range of 90 to 135 degrees, and more preferably in the range of 90 degrees to 120 degrees.
  • FIG. 5A is a schematic view showing a state in which the spheroid is cultured in the culture space 11.
  • the spheroid 9 is indicated by a circle using the cross-sectional view shown in FIG.
  • Spheroids 9 are cultured in each of a plurality of culture spaces 11.
  • spheroids can be cultured using a well plate, it becomes possible to use an apparatus or the like used in conventional cell culture.
  • the equivalent diameter D of the culture space 11 is preferably in the range from the value dsp to five times the value dsp (dsp ⁇ D ⁇ 5 dsp). Further, the height H of the culture space 11 is preferably in the range of 0.3 times the value dsp to 25 times (5 ⁇ 5) the value dsp (0.3 dsp ⁇ H ⁇ 25 dsp).
  • FIG. 5B is a schematic view illustrating an example of a preferable size of the spheroid cultured in the culture space.
  • FIG. 5B is a view schematically showing an end face of a cut portion cut along the equivalent diameter D of the spheroid 9.
  • the average diameter of the spheroids is preferably 50 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m, and particularly preferably in the range of 60 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • FIG. 5B shows that the end face of the cut portion of the spheroid 9 is formed by five cells 8.
  • the diameter DCL of the cell 8 is 20 ⁇ m and the diameter DSP of the spheroid 9 forms a spheroid 9 of 60 ⁇ m, for example, three cells 8 are formed in a straight line.
  • the diameter DSP of the spheroid 9 forms a spheroid 9 of 150 ⁇ m, it is formed, for example, by arranging five cells 8 on a straight line.
  • FIG. 5B schematically shows the cells 8 aligned on a straight line for ease of explanation, and the cells 8 are not necessarily aligned on a straight line.
  • the spheroids in one test area contain 70% or more of the whole whose diameter is within the half width range.
  • the diameters of the spheroids be equal in size. The reason is as follows. First, since it is known that the value of the metabolic activity varies depending on the size of the spheroid, high accuracy results can not be obtained when the spheroids of various diameters are mixed. Also, it is known that the metabolic function of small (50 ⁇ m or less) spheroids is extremely low.
  • the “half-width range” refers to the total number NT of spheroids in one test area, the number N1 of diameters D1 having the largest number when the size of the diameter corresponds to the number existing. In contrast, it refers to the number N2 of spheroids present in the range from the smallest diameter D2 to the largest diameter D3 among a plurality of diameters that are half the number N1 (N1 / 2).
  • the number N2 is preferably 70% or more of the total number NT described above, and it is more preferable that the ratio of the number N2 to the total number NT is high.
  • the shape of the culture space 11 (the shape of the front) or the shape of the plane parallel to the bottom 13 is not limited to the shape shown in FIG. 3 and may be, for example, a shape as shown in FIGS. Also, it may be another shape (such as an ellipse or a rhombus). In order to form spheroids having higher density and uniform diameter, it is preferable to have a symmetrical structure.
  • the shape of the side surface of the culture space 11 is not limited to the shape shown in FIG. 4, and may be, for example, the shape shown in FIGS. 7A to 7C.
  • acrylic resin polylactic acid, polyglycolic acid, styrene resin, acrylic / styrene copolymer resin, polycarbonate resin, polyester resin, polyvinyl alcohol resin, ethylene / vinyl alcohol It is selected from one or a combination of a base copolymer resin, a thermoplastic elastomer, a vinyl chloride resin, and a silicone resin.
  • the thickness T of the bottom portion 13 of the culture vessel 10 is preferably 1 mm or less from the viewpoint of observability. However, 1 mm or more may be sufficient as long as it does not affect observation with a microscope, and the thickness T of the bottom portion 13 is not limited.
  • the culture surface can not cover the surface because the culture medium contains the culture medium in each culture space 11, and when the coating solution is used, the solution does not enter the culture space 11. For this reason, it is preferable to make a water contact angle 45 degrees or less. More preferably, it is in the range of 0 degrees to 20 degrees. Further, the value of the water contact angle is assumed to be a value obtained by preparing and measuring a flat plate on which the concavo-convex pattern of the culture space 11 and the wall 12 is not formed, under the same conditions as the culture vessel 10.
  • the culture space 11 When the culture space 11 is arranged in an array, if the surface is highly hydrophobic and the water contact angle exceeds 45 degrees, that is, if the wettability is low, air bubbles will form in the space when the culture medium or the coating solution is added. It may be easy to enter, resulting in spaces where cells can not be cultured. Therefore, it is necessary to perform hydrophilization so that the water contact angle is 45 degrees or less.
  • a method of making it hydrophilic a method of depositing SiO 2 and a method of performing plasma treatment may be mentioned.
  • the suppression of cell adhesion and the relationship with the water contact angle are described in, for example, Y Ikada, "Surface modification of polymers for medical applications", Biomaterials 1994, vol. 15 No. 10, pp 725-736. ing.
  • a method of making the water contact angle 45 degrees or less a method of vapor-depositing glass on the bottom culture surface 14 and a method of forming a functional group on the surface using a plasma treatment method can be mentioned.
  • a functional group is formed on the surface by plasma treatment or the like.
  • a substance that suppresses cell adhesion can be coated to further suppress adhesion, whereby a spheroid can be efficiently formed.
  • a plasma treatment is performed to make the water contact angle 45 degrees or less, a phospholipid / polymer complex or poly (2-hydroxyethyl methacrylate) may be coated.
  • test solution addition treatment A step of adding a test solution or control solution containing a cytokine to the same single well 21 (test solution addition treatment).
  • D a step of contacting a test solution containing a cytokine and a spheroid-shaped established hepatocyte in the same single well 21 for 1 hour or more and less than 96 hours (contact treatment);
  • E A step of analyzing the metabolic function of cytochrome P450 (analytical treatment).
  • F A process of evaluating the analyzed result (evaluation process).
  • a ′ A step of culturing human-derived established hepatocytes to form spheroids (a spheroid formation process).
  • B ' A step of sucking the culture medium from the same one well 21 (medium suction processing).
  • C ′ adding first to third test solutions to the same single well 21 (test solution addition processing).
  • D ′ a step of bringing a test solution containing a cytokine into contact with a spheroid-shaped established hepatocyte in the same single well 21 for 1 hour or more and less than 96 hours (contact treatment).
  • the first test solution is a solution containing no cytokine and no drug (no cytokine and no drug).
  • the second test solution is a solution containing a cytokine and no drug (with cytokine, without drug).
  • the third test solution is a solution containing a cytokine and a drug (with cytokine and drug). Further, the first to third test solutions are brought into contact with the spheroid-shaped established hepatocytes, and the results of measuring the metabolic function of cytochrome P450 are taken as first to third measured values.
  • the evaluation method of one embodiment uses a culture plate provided with a plurality of wells from the viewpoint of operability.
  • a spheroid formation treatment for culturing the established hepatocytes in a spheroid shape (contacting step D and D') in which a test solution containing a cytokine is brought into contact with the cultured cells for a predetermined time. It is more preferable to perform in the same well. Therefore, in one embodiment, using the plurality of wells 21 of the culture plate 1 shown in FIG. 1, each step from the spheroid formation process to the contact process is performed in one of the plurality of wells 21. In other words, in the processing from culture to evaluation in one well, cells are not moved to another well 21 in the middle of each step.
  • steps A ′ to D ′ will be expressed as steps A to D unless otherwise specified.
  • Step A Spheroid formation treatment
  • human-derived established hepatocytes are cultured in a medium containing 10% serum using the above-described culture vessel 10 to form a spheroid of a desired size. At least a portion of the formed spheroid adheres to the wall 12 or the bottom culture surface 14.
  • the method for obtaining the spheroid-shaped established hepatocytes is not particularly limited, such as roller bottle culture, spinner flask culture, hanging drop culture and the like. However, in these methods, since the apparatus according to the culture method is used, it becomes necessary to perform the spheroid formation process and the contact process in separate containers.
  • the inventors discovered that the spheroid formation treatment and the contact treatment can be performed in the same container by using the well 21 in which the culture container 10 described above is formed. This simplifies the procedure and allows cells to be contacted with cytokines without mobilizing the formed spheroids. In particular, it becomes possible to use for an automatic culture apparatus in the screening of medicines which evaluate many compounds at once. In addition, it becomes possible to prevent cell damage and contamination.
  • the culture vessel 10 has a height H divided by the equivalent diameter D in the range of 0.3 to 2, and at least two or more culture spaces 11 having the equivalent diameter D in the range of 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m are arranged. Is preferred.
  • the width W of the wall 12 separating the culture space 11 is preferably in the range of 2 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • Polymers that inhibit cell adhesion to the culture surface include hydrophilic polymer chains that inhibit cell adhesion, phospholipids, phospholipid / polymer complexes, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA), polyvinyl alcohol, It is a polymer consisting of one or a combination thereof selected from the group of agarose, chitosan, polyethylene glycol and albumin.
  • the polymer promoting cell adhesion is a polymer consisting of one or a combination selected from the group of poly-L-lysine, poly-D-lysine, collagen, laminin and fibronectin.
  • the coating solution is a mixture of a phospholipid, a phospholipid / polymer complex, 2-methacryloyloxyethylphosphorischoline (MPC) polymer and a poly-L-lysine solution.
  • MPC solution concentration is preferably in the range of 0.001% to 1%, and more preferably in the range of 0.01% to 0.1%.
  • concentration of the poly-L-lysine solution is preferably in the range of 0.001 to 0.1%, and more preferably in the range of 0.005 to 0.015%.
  • the mixing ratio of the MPC solution to the poly-L-lysine solution is preferably in the range of 50:50 to 100: 0, and more preferably in the range of 75:25 to 90:10.
  • the cell seeding density in the case of performing spheroid formation using culture vessel 10 is not particularly limited, but a range of 5000 cells / cm 2 to 1,000,000 cells / cm 2 is preferable, and spheroids with a diameter of 50 to 150 ⁇ m are formed. to, since it is preferable that 50 to 250 cells are present in the compartment 11, and more preferably in the range of 100,000 / cm 2 ⁇ 500,000 pieces / cm 2.
  • the culture time for forming spheroids may be 1 day to 15 days.
  • Step B Aspiration Treatment
  • Aspiration of the medium is, for example, aspiration using a Pasteur pipette.
  • the medium used in the spheroid formation treatment is preferably aspirated in its entirety. This is to remove the influence of serum contained in the medium.
  • care is taken to maintain the state in which the spheroid formed in the culture space 11 adheres to the wall 12 or the bottom culture surface 14 of the culture space 11.
  • By maintaining the adhesion of the spheroid to the wall 12 or the bottom culture surface 14 it is possible to prevent the adhesion to the spheroid formed in the other culture space 11.
  • it is better to adhere the cells to the culture space 11 because the cells can not be tested when they are detached due to the replacement of the test solution and the washing operation therefor.
  • Step C Test Solution Addition Treatment This step is described separately from step C '.
  • the test solution or the control solution is added to the well 21.
  • the control solution is used as a comparative example to the example to which the test solution is added.
  • the test solution preferably does not contain serum in order to eliminate the influence on the cells by the cytokines contained in the serum.
  • serum in the range of 0.1 to 1% may be added to maintain the physiological function of the cells.
  • the solvent of the test solution may have an osmotic pressure of 200 to 315 mOsm / kg, and may have a buffer in the pH range of 6.8 to 8.4.
  • the physiological function of the cells it is preferable to use one containing glucose and nutrients such as amino acids and vitamins.
  • one containing glucose and nutrients such as amino acids and vitamins.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Nutrient Mixture F-12 the physiological function can be kept constant.
  • the control solution is a solution obtained by removing the cytokine from the test solution described above, and the other conditions are the same as the test solution.
  • the cytokine concentration of the test solution is set to a standard value, and at least three different concentrations are used with respect to the standard value.
  • the reference value is set to a concentration in the range of 0.1 times to 50 times based on the average value of the blood levels of cytokines of target disease patients.
  • the reference value is set to a concentration in the range of 0.1 times to 50 times the average value of the blood concentration of the healthy person.
  • a test solution which contains at least three different concentrations of the cytokine relative to the reference value, for example, three concentrations of 1-fold, 10-fold and 100-fold.
  • cytochrome P450 Based on the blood levels of cytokines of the target disease patients, it is possible to evaluate the attenuation or induction of cytochrome P450 by cytokines and to understand the effects of cytokines to help adjust the dosage of the disease patients, etc. it can. In addition, it is possible to assess whether attenuation or induction of cytochrome P450 by cytokines is dependent on the concentration of cytokines by using multiple different concentrations relative to a reference value. In addition, in order to reflect the influence of metabolic enzymes by cytokines in vivo, it is preferable to evaluate the concentration in vivo for the method of setting the reference value.
  • Step C ′ Test Solution Addition Process
  • any one of the first to third test solutions is added to the well 21.
  • Each test solution preferably does not contain serum in order to eliminate the influence on the cells by cytokines contained in the serum.
  • serum in the range of 0.1 to 1% may be added to maintain the physiological function of the cells.
  • the solvent of each test solution may have an osmotic pressure of 200 to 315 mOsm / kg and be buffered at a pH range of 6.8 to 8.4.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Nutrient Mixture F-12 the physiological function can be kept constant.
  • the cytokine concentrations of the second and third test solutions are determined in advance by the following procedure.
  • a reference value is set, and each treatment of step A ′ to step F ′ is performed using at least three different concentrations with respect to the reference value to analyze the metabolic function of cytochrome P450 to obtain measured values.
  • the reference value is set on the basis of a concentration in the range of 0.1 times to 50 times the average value of the blood concentration of cytokines in healthy individuals or in patients with diseases.
  • Drug-free, three solutions containing three concentrations of cytokine at least 1, 10 and 100 times the standard value (in other words, three second test solutions), no cytokine and no drug A solution (first test solution) is prepared and brought into contact with a spheroid-shaped established hepatocyte.
  • the metabolic functions of cytochrome P450 of multiple established hepatocytes contacted with multiple types of solutions are measured.
  • a concentration smaller than the measurement value of the cells contacted with the first test solution is adopted as the cytokine concentration of the second and third test solutions.
  • the value of the metabolic function of cytochrome P450 when the viability is 80% or more and the spheroid-shaped established hepatocytes are brought into contact with the first test solution (No.
  • cytokine concentration that is less than the measured value of the first test solution
  • an environment is created in which an effect on the metabolic function of cytochrome P450 occurs.
  • the test using the third test solution it is possible to detect whether the drug affects the metabolic function of cytochrome P450 even if the metabolic function of cytochrome P450 is attenuated due to the presence of cytokines.
  • the second measurement must be significantly smaller than the first measurement.
  • the function of the drug metabolizing enzyme is obviously attenuated by the cytokine It can be determined that Based on this result, it was considered preferable that the second measured value be equal to or less than one third of the first measured value. However, attenuation and recovery can be determined by a significant difference test (for example, t-test), and it is not necessary to be in this range (one-third or more).
  • the concentration of drug in the third test solution is that a solution of any drug concentration is brought into contact with cells in the range of 1 hour to 96 hours, and a concentration of viability exceeding 80% is adopted. If the concentration is too low, it is assumed that recovery of cytochrome P450 by the drug is not seen, it is preferable to use a test solution with a drug concentration as high as possible without exceeding a viability of 80%.
  • the processing of each of the steps A to F is performed in the same manner as in the example or the comparative example.
  • Step D Contact Treatment The time of contacting the cells with the test solution or control solution (contact time) is determined by the degree of cytotoxicity of the cytokine. Cytotoxicity is the strength that causes cell death.
  • the contact time is brought into contact with cells in the range of 1 hour to 96 hours using the test solution of the maximum value of the cytokine concentration to be tested in advance, and the time when the viability is 80% or more is adopted. For example, when three concentrations of 1, 10 and 100 times are used, the viability is measured using a test solution containing 100 times the standard value of cytokines.
  • the contact time is in contact with the cells in the range of 1 hour to 96 hours using the second and third test solutions to be tested in advance, and the time when the viability is 80% or more is adopted Do.
  • concentration of a cytokine an appropriate concentration may be selected such that the survival is 80% or more. If the survival rate is 80% or less at any time, set the standard value of the cytokine concentration low, and adopt the reaction time at which the survival rate is 90% or more.
  • the contact time between each test solution and the spheroid-shaped established hepatocytes in step D ′ may be the same as the contact time of each of the first to third test solutions, and the survival rate exceeds 80%. The range is sufficient.
  • FIG. 9 shows test results showing the relationship between the length of time for which the spheroid-shaped established hepatocytes and the test solution containing a cytokine (Interleukin-1 ⁇ ) are in contact, and the reactivity of cytochrome P450.
  • Interleukin-1 ⁇ When Interleukin-1 ⁇ is contacted for 0 hours, 4 hours and 8 hours, the gene expression level of CYP3A4 decreases with time. The error was about 20 to 30%.
  • an approximate curve was created and the value for one hour of contact time was calculated. As the approximate curve, the equation shown in FIG. 9 was used. When the error is 20%, it is expected that no significant difference is observed with respect to the value of 0 hour of contact time if the contact time is shorter than 1 hour.
  • the contact time of the cell with the cytokine was at least 1 hour.
  • the contact time should be as short as possible to shorten the evaluation period.
  • costs can be reduced.
  • culture is performed using a nutrient-containing medium, since there is no serum, there is a possibility that the physiological function of the cells may be reduced.
  • medium replacement is usually carried out at a frequency at which nutrients in the medium are not completely consumed and at a frequency at which waste products accumulate and do not affect physiological functions. For example, it is necessary to change the medium every 3 to 4 days. That is, culture for 5 days or more is not suitable from the viewpoint of maintaining the physiological activity of cells. Therefore, the contact time between cells and cytokines was up to 96 hours.
  • Step E Analytical Treatment
  • the metabolic function of cytochrome P450 is analyzed using cells after contact with the test solution or control solution or the first to third test solutions.
  • the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 of the established hepatocytes contacted with the first test solution is measured to obtain a first measured value.
  • the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 of the established hepatocytes in contact with the second and third test solutions is measured to obtain second and third measured values.
  • cytochrome P450 As analysis method of cytochrome P450, measurement of gene expression level by PCR method, protein analysis by Western blotting method, liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS / MS) or high performance liquid chromatography Any method such as measurement of metabolic activity using (HPLC: High performance liquid chromatography) may be used.
  • LC / MS / MS liquid chromatography mass spectrometry
  • HPLC High performance liquid chromatography
  • Step F Evaluation Process This step is described separately from step F '.
  • the evaluation process of the process F based on the value (measurement value) of the metabolic function analyzed by the analysis process of the process E, it determines as follows. Assuming that the analysis result of the cells in contact with the test solution is “value T” and the analysis result of the cells in contact with the control solution is “value C”, the numerical value of the metabolic function analyzed in step E is evaluated as follows: Do. When the value T is larger than the value C (value T> value C), it is determined that “the metabolic substance of cytochrome P450 is induced by the test substance”. The increase in the value of the result of analysis of cytochrome P450 indicates that the cytokine induces the metabolic function of cytochrome P450.
  • cytokine when the analysis result of the function of cytochrome P 450 after contacting the cells with the test solution with three concentrations of 1, 10 and 100 times increases in a concentration dependent manner, “cytokine Preferably, it is determined that "when the metabolic function of cytochrome P450 is induced” or "decreased," the cytokine attenuates the metabolic function of cytochrome P450. However, even when there is no concentration dependency, "cytokine induces metabolic function of cytochrome P450" or predominantly low when the value of the function of cytochrome P450 is predominantly high relative to the test solution containing no cytokine Sometimes, it may be determined that "cytokine attenuates the metabolic function of cytochrome P450".
  • the hepatocytes of human origin are cultured and grown to form spheroids of a desired size, and the spheroids are used as a test substance
  • the evaluation of cytochrome P450 is either attenuation, induction or no effect as to whether the test substance affects the metabolic ability of cytochrome P450 based on the measured value of the metabolic function of the spheroid brought into contact with the test solution or control solution. It is judged whether or not.
  • the type of the determination result is not limited to the evaluation of attenuation, induction, and no influence, and other determination results indicating the influence of the test substance may be used.
  • Step F ′ Determination Process
  • the first measured value is larger than the second measured value based on the first to third measured values analyzed in the analysis process of step E ′, and If the second measured value is smaller than the third measured value, it is determined that the drug restores the drug metabolism function of cytochrome P450. It is a case where it is expressed by a mathematical expression that “first measured value> second measured value”, and “second measured value ⁇ third measured value”. In particular, when the third measurement value is three or more times the second measurement value, it is preferable to determine to restore the drug metabolism function. The reason is as described above, and the second measurement must be significantly smaller than the first measurement in order to accurately determine the attenuation and recovery.
  • Example 1 Cell preparation (spheroid formation processing) [Example] (1-1) Culture Container and Cells A culture plate 1a having a plurality of wells 21a shown in FIG. 8 was used. A plurality of culture vessels 10a are formed on the bottom culture surface of each well 21a. Each culture container 10a has a culture space 11a formed with an equivalent diameter D of 200 ⁇ m and a height H of 100 ⁇ m. Also, the width W of the wall 12a is 10 ⁇ m.
  • the cells to be cultured were FLC-4 cells, which are hepatocytes derived from Japanese origin.
  • the culture vessel was a commercially available 24-well plate with flat culture surface.
  • the culture plate grade was cell culture grade. It implemented on the same conditions as an Example except the above.
  • Test conditions for examination of evaluation method (medium suction treatment, test solution addition treatment, contact treatment) Tests were conducted under the following conditions in both the example and the comparative example.
  • (2A-1) Procedure The cultured cells were treated in the following procedure. -From each well, pipetted aspirated all the old medium (medium aspiration treatment). Test solution or control solution was added to each well (test solution addition treatment). • Incubate the cells in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 8 hours, 24 hours or 48 hours (contact treatment).
  • (2A-2) Preparation of Test Solution, Control Solution The test solution was prepared by dissolving cytokines in a serum-free DMEM / F12 solution (DMEM / E12 FBS ( ⁇ )) to a concentration shown in Table 1.
  • the control solution was a solution of DMEM / F12 without serum, and the cytokine concentration was adjusted to 0 mM.
  • (2A-3) Analysis The metabolic function of CYP3A4 was analyzed by the analysis method described in Table 1. For TNF- ⁇ , in addition to CYP3A4, the function of CYP2C9 was also analyzed.
  • 2B Examination of Cytokine Concentration of Test Solution for Examination of Screening Method and Test Conditions Examination of the cytokine concentration of the test solution was carried out according to the following procedure for both Examples and Comparative Examples.
  • (2B-1) Preparation of test solution As a cytokine, epidermal growth factor (EFG: Epidermal Growth Factor) was used. The solvent of the test solution was DMEM / F12 without serum (DMEM / E12 FBS ( ⁇ )).
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • the example is indicated by "MICRO-SPACE” and the comparative example is indicated by "CONFLUENT".
  • the results of Western blotting analysis of the amounts of CYP3A4 protein at concentrations of EGF, 0, 0.1, 1 and 10 ng / mL are shown as bands.
  • a concentration of 10 ng / mL was adopted for the second and third test solutions as the cytokine concentration of the test solution.
  • concentration dependency could not be confirmed.
  • a concentration of 10 ng / mL was adopted for comparison with the example.
  • Test conditions double earth treatment, test solution addition treatment, contact treatment
  • Tests were conducted under the following conditions in both the example and the comparative example.
  • (2B-4) Test 1 A test was conducted to compare the value of the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 when the first test solution and the second test solution were brought into contact with the spheroid-shaped established hepatocytes. As a test, 2. The test results conducted in the examination of the concentration of the test solution were used. The test procedure is as described above.
  • (2B-5) Test 2 Tests were conducted to compare the value of the function of the drug metabolizing enzyme of cytochrome P450 when the first to third test solutions were brought into contact with spheroid-shaped established hepatocytes.
  • the comparative example was not performed because the test results of the first test solution and the second test solution were almost the same in the results of Test 1 and the conditions were not satisfied.
  • the results of Test 1 will be described later.
  • EGF epidermal growth factor
  • the drug used was gefitinib (Gefitinib).
  • the solvent of the test solution was DMEM / F12 without serum (DMEM / E12 FBS ( ⁇ )).
  • the concentration of cytokine was 10 ng / mL.
  • the first test solution contains 0 mM EGF and 0 mM gefitinib.
  • the second test solution contains 10 ng / mL EGF and 0 mM gefitinib.
  • the third test solution concentration comprises 10 ng / mL EGF and 5 ⁇ M gefitinib.
  • the cultured cells were processed in the following procedure. From each well, the entire amount of old medium was aspirated with a Pasteur pipette (medium aspiration treatment). To each well, the first to third test solutions were added (test solution addition treatment). • Incubate the cells in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 8 hours, 24 hours or 48 hours (contact treatment). Analysis was performed by genetic analysis.
  • acetonitrile was evaporated using a vacuum evaporator, and 70 ⁇ L of a solution obtained by filtering the supernatant was injected into HPLC.
  • a calibration curve sample 10 ⁇ L each of methanol solution containing 10, 40, 80, 160 and 320 pmol of ⁇ - and 4-hydroxytriazolam added to 130 ⁇ L of medium was used. ⁇ - and 4-hydroxytriazolam were quantified by HPLC.
  • the calibration curve was obtained by performing linear regression on the ratio of the peak heights of ⁇ - and 4-hydroxytriazolam to the internal standard substance of the calibration curve sample by the least squares method.
  • RNA extraction was performed according to the protocol of NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel), using 2 wells 21a of culture plate 1a as one sample. DNase I recombinant, RNase-free (Roche, Branchburg, NJ, USA) was used, modifying only the Dnase-treated portion.
  • Total RNA Total RNA was reverse transcribed using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) and the attached random hexamer primer to synthesize first strand cDNA.
  • nitrocellulose membrane was blocked by shaking at room temperature for 1 hour using PBS containing 0.05% Tweet 20 (PBST) to which 5% skimmed milk was added.
  • the primary antibody was incubated overnight at 4 ° C. with an anti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) diluted 6,000-fold in PBST supplemented with 3% BSA.
  • the secondary antibody was used as an anti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) diluted 5000-fold with PBST containing 3% BSA and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the protein was detected with LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo) using ImmunoStar LD (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Test Results Figures 10 to 18 show the test results of the evaluation method study.
  • the example is indicated by "MICRO-SPACE” and the comparative example is indicated by "CONFLUENT".
  • a control solution is added to cells (non-added group) is indicated as “UNT" (Untreated)
  • a test solution is added, it is indicated by the concentration of the added cytokine (for example, 0.1 ng / mL) .
  • the results shown in FIGS. 10 to 15 are values obtained by adding the standard deviation to the standard mean values of three independent experiments in positive and negative. In the procedure for which the test results in FIG. 10 were obtained, FLC-4 cells were cultured for 10 days.
  • FIG. 10 shows the results of analysis of the expression level of CYP3A4 mRNA by RT-qPCR for cells of four EGF concentrations after culture.
  • FLC-4 cells were cultured for 10 days.
  • FIG. 11 shows the results of analysis of the expression level of CYP3A4 mRNA by RT-qPCR for cells at four HB-EGF concentrations after culture.
  • FIG. 12 shows the results of analysis of the expression level of CYP3A4 mRNA by RT-qPCR for cells at four IL-1 ⁇ concentrations after culture.
  • FLC-4 cells were cultured for 10 days.
  • FIGS. 13 and 14 show the results of RT-qPCR analysis of the expression levels of CYP3A4 (FIG. 13) and CYP2C9 (FIG. 14) mRNA in cells of four EGF concentrations after culture.
  • FIG. 15 shows the results of analysis of the expression level of CYP3A4 mRNA by RT-qPCR for cells of four types of IL-6 concentration after culture.
  • FLC-4 cells were cultured for 10 days.
  • FIG. 15 shows the results of Western blotting analysis of CYP3A4 protein levels in cells of four types of IL-6 concentration after culture.
  • FIG. 17 shows the test results of the concentration dependency of cytokines.
  • the result of having determined the test result based on the method demonstrated by evaluation process in FIG. 18 is shown.
  • the item “effect of cytokine” is a test result determined by comparing the cells to which the test solution is added (cytokine-added group) and the cells to which the control solution is added (non-addition group).
  • "Sex” shows the test result which determined concentration dependency based on the test result of a different cytokine concentration.
  • “-” indicates that the determination could not be made.
  • a decrease in gene expression level of CYP3A4 could be confirmed predominantly with respect to the control (cytokine concentration: 0 mM).
  • the gene expression level of CYP3A4 was not decreased predominantly with respect to the control (cytokine concentration 0 mM).
  • the cytokine used in the above-described example is an example, and the evaluation method of one embodiment can be applied to other cytokines.
  • Results of Test 1 It was judged using the test results of the examination of the test solution concentration shown in FIG. Among the test results of FIG. 19, in both the example and the comparative example, the result of the first test solution in which the concentration of EGF is 0 ng / mL and the result of the second test solution in which the concentration of EGF is 10 ng / mL (figure The four bands surrounded by a dotted line shown in 19 (the amount of CYP3A4 protein) are compared and judged.
  • the amount of protein of CYP3A4 when the first test solution was in contact with the spheroid was M0 in the example and C0 in the comparative example, and the amount of protein of CYP3A4 when the second test solution was in contact with the spheroid was carried out.
  • M10 M10
  • C10 C10
  • the band of the second test solution is thinner than the band of the first test solution.
  • M0 is larger than M10 (M0> M10).
  • M0 and C10 are almost the same (C0 ⁇ C10).
  • FIG. 20 shows the results of analysis by RT-qPCR of the expression level of CYP3A4 mRNA when the first to third test solutions were brought into contact with spheroid-shaped established hepatocytes.
  • the expression level of CYP3A4 mRNA is shown by (A) for the first test solution, (B) for the second test solution, and (C) for the third test solution.
  • the value of the metabolic function of CYP3A4 is lower in the case of the second test solution (with cytokine, without drug) than in the case of the first test solution (without cytokine and drug).
  • the case of the third test solution (with cytokines and drugs) is more than three times as high as the case of the second test solution. From this result, it can be determined that the drug restores the drug metabolism function of cytochrome P450.
  • cytokine used in the above-described example is an example, and the screen method of one embodiment can be applied to other cytokines.

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Abstract

　サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法およびサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用する手法を提供する。サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法は、培養空間（１１）を有する培養容器（１０）を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイド（９）を形成し、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の誘導または減衰の有無を評価する。

Description

サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法および薬剤のスクリーニング方法
　本発明は、サイトカインとチトクロムＰ４５０との相互作用を評価する方法であり、例えば、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能の誘導及び減衰を評価する方法に関する。また本発明は、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法である。
　近年、サイトカインに関して様々な研究が行われている。
　例えば、炎症性の自己免疫疾患の患者のインターロイキンの血中濃度は健常人より高く、チトクロムＰ４５０の代謝機能は健常人と比較して低く、炎症時に血中に分泌されるサイトカイン類によりＣＹＰ３Ａ４の代謝機能が低下するため薬剤が排泄されず、結果として重篤な副作用が起こることが示されている（非特許文献１）。このような患者にチトクロムＰ４５０の代謝を受ける医薬品（Ｄ１）を投与する場合、該当患者の代謝機能の低下分を見越して健常人よりも少ない量を投与する。このような患者に対し、インターロイキンの受容体をブロックするような、サイトカインと相互に作用する薬剤（Ｄ２）（例えば、分子標的医薬品）を併用すると、低下したチトクロムＰ４５０の代謝機能が回復し、医薬品（Ｄ１）の代謝が促進される。その結果、医薬品（Ｄ１）の作用が減弱化することが臨床研究で示された（非特許文献２）。このような背景から、分子標的医薬品のような薬剤とチトクロムＰ４５０の代謝を受ける医薬品のサイトカインを介した相互作用の研究が注目されるようになってきた。
　その手法のひとつとして動物実験が挙げられる。しかし、ヒトと動物には種差があるため生体内の反応を正確に予測できないという問題がある（非特許文献３）。加えて、動物実験のようなｉｎ　ｖｉｖｏの試験は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系と比較してスループット性に劣る。このため、多くの化合物を同時に評価するような医薬品のスクリーニングには適さないという問題がある。
　このような背景から、正確に生体内の反応が予測できるｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験による評価法が求められるようになってきた。また、インターロイキンに代表されるサイトカイン類は創薬ターゲットとしても注目されるようになり、近年では、薬剤とサイトカインとの相互作用を評価するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ系が求められるようになってきた。
Kenneth W. Renton著、"Cytochrome P450 Regulation and Drug Biotransformation During Inflammation and Infection"、Current Drug Metabolism、２００４年５月、ｐｐ．２３５－２４３ Leslie J. Dickmann, Sonal K. Patel, Dan A. Rock, Larry C. Wienkers, and J. Greg Slatter著、"Effects of Interleukin-6 (IL-6) and an Anti-IL-6 Monoclonal Antibody on Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatocyte Culture"、DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39、２０１１年、ｐｐ．１４１５－１４２２ C Schmitt, B Kuhn1, X Zhang, AJ Kivitz3 and S Grange著、"Disease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in Patients With Rheumatoid Arthritis"、Clinical pharmacology & Therapeutics、VOLUME 89 NUMBER 5、２０１１年５月、ｐｐ．７３５－７４０
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験として、非特許文献３ではヒト初代肝細胞を用いた方法が開示されている。しかし、ヒト初代肝細胞はドナーの遺伝子多型や環境要因に起因する薬物動態遺伝子の発現量及びその誘導能についてのロット間差が大きい。その上、入手経路が限られているためコストが高く、取り扱いが困難である。そのため、多種のサイトカインを用いて同じロットの細胞で複数のチトクロムＰ４５０を一度に評価することは困難、もしくは多大なコストを要するという問題があった。
　一方、株化肝細胞は、増殖させることが可能である。従って、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法に、ヒト由来の株化肝細胞が利用できれば、安価にかつ再現性のある結果を得ることが期待される。しかしながら、株化肝細胞の代謝機能の持つ肝細胞の機能は、初代肝細胞と比較して非常に低いことが知られている。例えば、細胞を培養する底部表面が平坦な培養容器を用いて株化肝細胞を培養した場合、チトクロムＰ４５０の代謝能が測定限界値以下となり分析できないことがある。このような場合、たとえサイトカインを添加していないコントロール群で代謝機能を検出できたとしても、サイトカインを添加した場合の代謝機能の減衰量を測定することは極めて困難である。この問題を克服するために様々な三次元培養が研究されているが、操作が煩雑、特殊な装置を用いる必要がある、または、高コストであるといった問題がある。このような背景から、株化肝細胞を用いてサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法は開発されていなかった。
　発明者らは、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法およびサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用する手法を発見した。
　発明者らは、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインを含む試験溶液を１時間以上９６時間未満接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定する方法で上述した問題を解決した。
　本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様は、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の代謝機能の誘導または減衰の有無を評価する。スフェロイド形状の株化肝細胞を形成し、形成したスフェロイド形状の株化肝細胞を適切な時間、試験溶液に接触させることにより、代謝機能の測定が可能であることを見出した。この方法によれば、チトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼすサイトカインの影響を測定し、評価することが可能になる。
　また、本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様において、前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることが好ましい。スフェロイドの直径の大きさが所定の範囲内であり、かつ、スフェロイドの直径の大きさのばらつきが小さくなることにより、代謝機能の判定の精度を向上させることができる。
　さらに、本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様において、前記試験溶液が無血清培地であることが好ましい。
　加えて、前記試験溶液のサイトカイン濃度が、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含む各試験溶液を用いることが好ましい。また、前記試験溶液のサイトカインの濃度が、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含む各試験溶液を用いることが好ましい。
　本発明に係る方法の一態様において、前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記サイトカインを含む前記試験溶液とを１時間以上９６時間未満接触させる工程とを、同一のウェル内で行うことが好ましい。
　例えば、前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用いて以下の各構成を行うことが好ましい。
（１）前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程、
（２）前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程、
（３）前記一つのウェルへ、前記サイトカインを含む前記試験溶液を添加する工程、
（４）前記一つのウェル内で、前記サイトカインを含む前記試験溶液と、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程。
　加えて、発明者らは、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインと薬剤とのいずれかを含む試験溶液を接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定する方法で上述した問題を解決した。
　本発明に係るサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法の一態様は、前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第１の試験溶液、前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第２の試験溶液、及び前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、
　前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、
　前記第１の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、前記第２及び第３の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得し、
　前記第１の測定値が前記第２の測定値より大きく、かつ、前記第２の測定値が前記第３の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。
　この方法により、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用することが可能となることを見いだした。
　また、本発明に係るスクリーニング方法において、前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることが好ましい。スフェロイドの直径の大きさが所定の範囲内であり、かつ、スフェロイドの直径の大きさのばらつきが小さくなることにより、代謝機能の判定の精度を向上させることができる。
　さらに、本発明に係るスクリーニング方法において、前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることが好ましい。
　加えて、前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。
　さらに加えて、前記第２及び第３試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。また、前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。
　本発明に係るスクリーニング方法において、前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第１乃至第３の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことが好ましい。
　本発明によれば、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法およびサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用することが可能となる。
本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。 図１に示す培養プレートのＩＩ－ＩＩ線断面図である。 図１に示す培養プレートの他のＩＩ－ＩＩ線断面図である。 本発明の一実施形態で用いる培養容器の全体を示す図である。 図３に示す培養容器のＩＶ－ＩＶ線断面図である。 培養空間でスフェロイドを培養する状態を表す概略図である。 培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。 培養空間の他の形状例を示す図である。 培養空間のさらに他の形状例を示す図である。 培養空間の他の側面の形状例を示す断面図である。 培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。 培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。 実施例で用いる培養プレートの一例を示す写真である。 スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを接触させる時間の長さとチトクロムＰ４５０の代謝機能の反応性との関係を示す試験結果を示す図である。 上皮成長因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 インターロイキン‐１βを添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 腫瘍壊死因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 腫瘍壊死因子を添加した時のＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 インターロイキン‐６を添加した時のＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。 インターロイキン‐６の試験でＣＹＰ３Ａ４のタンパク量と代謝活性の試験結果を示す図である。 サイトカインの濃度依存性の試験結果を判定した結果を示すテーブルである。 評価処理で説明した手法に基づいて試験結果を判定した結果を示すテーブルである。 試験溶液のサイトカインの濃度とＣＹＰ３Ａ４タンパク量との関係を検討した試験結果を示す図である。 第１乃至第３の試験溶液をスフェロイドに接触させたときのＣＹＰ３Ａ４の　ｍＲＮＡの発現量を示す図である。
　以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
　発明者らは、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法（以降適宜、「評価方法」と称する）に、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインを含む試験溶液を１時間以上９６時間未満接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定し、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の代謝能を評価する手法により、上述した問題を解決した。より詳細には、評価方法は、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイドを形成し、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させ、株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の値を測定する。測定結果に基づいて、チトクロムＰ４５０の代謝能の評価、言い換えると、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の代謝能の誘導または減衰の有無を、チトクロムＰ４５０の値が上昇しているときに「サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される」と判定し、チトクロムＰ４５０の値が減少しているときに「サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される」と判定する。
　また発明者らは、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法（以降適宜、「スクリーニング方法」と称する）を、次の手順により実現可能であることを発見した。（Ａ）サイトカイン及び薬剤を含まない第１の試験溶液と、（Ｂ）サイトカインを含み、薬剤を含まない第２の試験溶液、及び（Ｃ）サイトカイン及び薬剤を含む第３の試験溶液を用意する。また、培養空間を有する培養容器を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイドを形成する。そして、第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、第１の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、第２及び第３の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得する。測定した結果、第１の測定値が第２の測定値より大きく、かつ、第２の測定値が第３の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。
　用語「サイトカイン」は、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を総称するものであり、例えば、免疫系の調節、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用、細胞増殖、分化、抑制といった生体の恒常性維持に役割を果たす物質である。一実施形態では、サイトカインは、その存在によって、肝臓の機能の変動（誘導、減衰）の起因となる場合を特に対象とし、例えば、増殖因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子などを含む。
　用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。
　用語「チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）」は、細菌から植物，哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物（薬物）代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
　用語「サイトカインと相互に作用する薬剤」（以降適宜、「薬剤」とも称する）は、サイトカインが存在すると相互に作用する薬剤であり、特に、サイトカインとの相互作用によって、チトクロムＰ４５０の代謝機能を変動させる薬剤である。例えば、体内のタンパク質や遺伝子などを利用したバイオ医薬品、低分子医薬品などを含む。
　以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
　用語「チトクロムＰ４５０の値」は、総チトクロムＰ４５０量の値ではなく、チトクロムＰ４５０のもつ代謝機能を表す値であり、例えば代謝活性値、遺伝子発現量、タンパク量を意味する。
　以下、一実施形態の評価方法およびスクリーニング方法について、最初に株化肝細胞を培養する培養容器について説明し、次に、株化肝細胞を培養して評価するまでの培養・評価方法について説明する。
１．培養容器
＊　培養容器の概略
　図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ－ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
　図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ－ＩＶ線断面図である。
　培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
　培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
　壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
　底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。
　図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
　相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
　高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
　壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。
　培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数が小さくなる関係にある。同じ大きさのウェル２１のとき、ウェル２１の中の培養空間１１の数は、相当直径Ｄが大きい場合や幅Ｗが大きい場合に小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
　発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１～５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．３倍～５倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で株化肝細胞を培養することによって、均一な直径の株化肝細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。一実施形態では、株化肝細胞として、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイド形成させる。以下に詳細を説明する。
　図１乃至４を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊　培養空間の大きさ、形状等
　培養空間１１の相当直径Ｄについて、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。このため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１～５倍の範囲が好ましく、１．２～４倍の範囲がより好ましい。
　例えば、直径１００μｍの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１～５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００～５００μｍの範囲で、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３～２の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
　一例として、株化肝細胞であるがん細胞を培養する場合を検討する。
　株化肝細胞培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１～５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３～２倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
　一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。００１８に記載の好ましい範囲のスフェロイドを形成させるために好ましい高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Ｄが１００μｍ～２００μｍの範囲、高さＨが５０μｍ～１００μｍの範囲が好ましい。培養空間１１の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間１１の高さＨは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間１１の高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３～２の範囲が好ましく、０．５～１の範囲がより好ましいことを見いだした。
　一実施形態では、試験溶液をスフェロイド中心部まで拡散または輸送させるためには、スフェロイドの直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用を最大限に引き出すためには、スフェロイドの直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ～１５０μｍの範囲がより好ましい。ここで、細胞間の相互作用は、被験物質（例えば、サイトカイン）とチトクロムＰ４５０との相互作用である。
　壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、２～５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５～３０μｍの範囲が好ましく、５～１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０～１３５度の範囲が好ましく、９０度～１２０度の範囲がより好ましい。
　図５Ａに、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
　図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
　スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。
　図５Ｂに、培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、スフェロイド９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、スフェロイドの直径の平均が５０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ～１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、スフェロイド９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、スフェロイド９の直径ＤＳＰが６０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、スフェロイド９の直径ＤＳＰが１５０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。
　加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にあるスフェロイドは、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、スフェロイドの直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、スフェロイドの大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径のスフェロイドが混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）スフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られている。そのため、このようなスフェロイドが多く含まれている場合、代謝機能を減衰させるようなサイトカインを評価する際に測定限界値以下となり、代謝機能の減衰の有無が判定できない可能性がある。
　「半値幅の範囲」とは、１試験領域にあるスフェロイドの総個数ＮＴうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径Ｄ１の個数Ｎ１に対して、個数Ｎ１の半分の個数（Ｎ１／２）となる複数の直径のうち、最小の直径Ｄ２から最大の直径Ｄ３までの範囲に存在するスフェロイドの個数Ｎ２をいう。
　スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数ＮＴに対して個数Ｎ２が７０％以上であることが好ましく、総個数ＮＴに対する個数Ｎ２の割合が高くなることがより好ましい。
　培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ～６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
　培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ～７Ｃに示すような形状であってもよい。
　培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせから選択される。
　培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察や、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）などのレポータ遺伝子を使用したin situ法が可能となる。
＊　培養表面の特性
　次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度～２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
　培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。
　加えて、培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるため、細胞接着性を抑制することが好ましい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp725-736に記載されている。水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面１４に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
　また、水接触角を４５度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。
２．株化肝細胞の培養・評価方法および薬剤のスクリーニング方法
　次に、株化肝細胞を培養し、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価するまでの方法について説明する。
＊　培養・評価方法および薬剤のスクリーニング方法の概略
　一実施形態の培養から評価までには、例えば、次の（Ａ）から（Ｆ）の工程を実施する。
（Ａ）ヒト由来の株化肝細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程（スフェロイド形成処理）。
（Ｂ）同じ一つのウェル２１から培地を吸い取る工程（培地吸引処理）。
（Ｃ）同じ一つのウェル２１へ、サイトカインを含む試験溶液またはコントロール溶液を添加する工程（試験溶液添加処理）。
（Ｄ）同じ一つのウェル２１内で、サイトカインを含む試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満、接触させる工程（接触処理）。
（Ｅ）チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析する工程(分析処理)。
（Ｆ）分析した結果を評価する工程（評価処理）。
＊　スクリーニング方法の概略
　一実施形態の培養から判定までには、例えば、次の（Ａ'）から（Ｆ'）の工程を実施する。
（Ａ'）ヒト由来の株化肝細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程（スフェロイド形成処理）。
（Ｂ'）同じ一つのウェル２１から培地を吸い取る工程（培地吸引処理）。
（Ｃ'）同じ一つのウェル２１へ、第１乃至第３の試験溶液を添加する工程（試験溶液添加処理）。
（Ｄ'）同じ一つのウェル２１内で、サイトカインを含む試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満、接触させる工程（接触処理）。
（Ｅ'）チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析（測定）する工程(分析処理)。
（Ｆ'）分析した結果を判定する工程（判定処理）。
　ここで、第１の試験溶液は、サイトカイン及び薬剤を含まない溶液である（サイトカイン及び薬剤無）。第２の試験溶液は、サイトカインを含み、薬剤を含まない溶液である（サイトカイン有、薬剤無）。第３の試験溶液は、サイトカイン及び薬剤を含む溶液である（サイトカイン及び薬剤有）。また、第１乃至第３の試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、チトクロムＰ４５０の代謝機能を測定した結果を、第１乃至第３の測定値とする。
　一実施形態の評価方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、株化肝細胞をスフェロイド形状に培養するスフェロイド形成処理（工程Ａ，Ａ'）と、サイトカインを含む試験溶液を所定の時間、培養した細胞に接触させる接触処理（工程Ｄ，Ｄ'）とを同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内でスフェロイド形成処理から接触処理までの各工程を実施する。言い換えると、一つのウェル内で培養から評価までの処理において、各工程の途中で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。
　以下、特に区別しない限り、工程Ａ'乃至Ｄ'を工程Ａ乃至Ｄとして表現することとする。
＊　工程Ａ　スフェロイド形成処理
　工程Ａのスフェロイド形成処理では、上述した培養容器１０を用いて、１０％血清を含む培地でヒト由来の株化肝細胞を培養し、所望のサイズのスフェロイドを形成させる。
　形成されたスフェロイドは、少なくともその一部分が壁１２または底部培養面１４に接着している。
　スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞をサイトカインと接触させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。
　スフェロイドを形成するための培養容器１０の好ましいサイズについては上述したが、スフェロイド形成処理から接触処理を実施する場合には、特に次の培養容器１０のサイズが好ましいことを発見した。
　培養容器１０は、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３～２の範囲であって、相当直径Ｄが１００μｍ～１０００μｍの範囲の培養空間１１が、少なくとも２個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間１１を隔てる壁１２の幅Ｗは２μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。このような培養容器１０を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。
　培養空間１１を有する培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるためには、細胞接着を抑制する方が好ましい。一方、培地交換や試験溶液交換の際にスフェロイドが培養空間１１から離脱することを防ぐ目的から、スフェロイドの一部は培養表面（壁１２の表面または底部培養面１４）に接着している方が好ましい。そのため、培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーと、培養表面への細胞の接着を促進するポリマーとの混合物との混合物を培養表面にコートしてもよい。培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーは、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。細胞接着性を促進するポリマーは、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンのグループからから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。コート溶液の一例として、リン脂質、リン脂質・高分子複合体である２－メタ　クリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーとポリ－Ｌ－リシン溶液との混合物が挙げられる。ＭＰＣ溶液濃度は０．００１％～１％の範囲が好ましく、０．０１％～０．１％の範囲がより好ましい。ポリ－Ｌ－リシン溶液の濃度は０．００１～０．１％の範囲が好ましく、０．００５～０．０１５％の範囲がより好ましい。ＭＰＣ溶液とポリ－Ｌ－リシン溶液の混合比は５０：５０～１００：０の範囲が好ましく、７５：２５～９０：１０の範囲がより好ましい。
　培養容器１０を用いてスフェロイド形成を行う場合の細胞播種密度は特に限定されないが、５０００個／ｃｍ２～１，０００，０００個／ｃｍ２の範囲が好ましく、５０～１５０μｍの直径のスフェロイドを形成させるためには、５０個～２５０個の細胞が１１の区画に存在していることが好ましいことから、１００，０００個／ｃｍ２～５００，０００個／ｃｍ２の範囲がより好ましい。スフェロイドを形成させるための培養時間は１日～１５日であればよい。
＊　工程Ｂ　吸引処理
　培地の吸引は、例えば、パスツールピペットを用いて吸引する。スフェロイド形成処理で用いた培地は、全量を吸引することが好ましい。これは、培地に含まれる血清の影響を除去するためである。加えて、培地の吸引では、培養空間１１に形成されたスフェロイドが、培養空間１１の壁１２または底部培養面１４と接着している状態を維持するように留意する。スフェロイドが壁１２または底部培養面１４に接着している状態を維持することにより、他の培養空間１１に形成されたスフェロイドと接着することを防止できるからである。加えて、試験溶液を交換する際及びそのための洗浄操作により細胞が剥離すると試験できなくなるので細胞を培養空間１１に接着させておいた方がよい。
＊　工程Ｃ　試験溶液添加処理
　この工程は工程Ｃ'とは区別して説明する。
　工程Ｃの試験溶液添加処理では、試験溶液とコントロール溶液とのいずれかをウェル２１へ添加する。コントロール溶液は、試験溶液を添加する実施例に対する比較例として用いる。
　試験溶液は、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、試験溶液と細胞を４８時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため０．１～１％の範囲の血清を加えても良い。
　試験溶液の溶媒は２００～３１５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧であって、ｐＨ域が６．８～８．４に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地（DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium）とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
　コントロール溶液は、上述した試験溶液からサイトカインを除いた溶液であり、他の条件は試験溶液と同一とする。
　試験溶液のサイトカイン濃度は、基準値を設定し、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度を用いる。基準値は、対象とする疾患患者のサイトカインの血中濃度の平均値を基準に、０．１倍～５０倍の範囲の濃度を設定する。一方、疾患患者の血中サイトカイン濃度が明らかでない場合には、基準値は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍～５０倍の範囲の濃度を設定する。そして、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度、例えば、１倍、１０倍、１００倍の３種類の濃度のサイトカインを含む試験溶液を用いる。対象とする疾患患者のサイトカインの血中濃度を基準とすることにより、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の減衰または誘導を評価し、サイトカインの影響を把握することにより疾患患者の投薬量の調整等に役立てることができる。加えて、基準値に対して複数の異なる濃度を用いることにより、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の減衰または誘導がサイトカインの濃度に依存するかを評価することができる。さらに加えて、基準値の設定方法について、生体内でのサイトカインによる代謝酵素の影響を反映させるためには、生体内での濃度で評価することが好ましいからである。
＊　工程Ｃ'　試験溶液添加処理
　工程Ｃ'の試験溶液添加処理では、第１乃至第３の試験溶液のいずれかをウェル２１へ添加する。各試験溶液は、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、各試験溶液と細胞を４８時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため０．１～１％の範囲の血清を加えても良い。
　各試験溶液の溶媒は２００～３１５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧であって、ｐＨ域が６．８～８．４に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地（DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium）とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
　第２及び第３の試験溶液のサイトカイン濃度は、事前に次の手順で決定する。
　基準値を設定し、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度を用いて、工程Ａ'から工程Ｆ'の各処理を実施して、チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析して測定値を得る。
　基準値は、健常人のサイトカインまたは疾患患者のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍～５０倍の範囲の濃度を基準に設定する。基準値の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含み、薬剤を含まない、３種類の溶液（言い換えると、３種類の第２の試験溶液）と、サイトカイン及び薬剤を含まない溶液（第１の試験溶液）とを用意し、スフェロイド形状の株化肝細胞と接触させる。複数種類の溶液に接触させた複数の株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の代謝機能を測定する。測定した結果、複数のサイトカインの濃度のうち、第１の試験溶液を接触させた細胞の測定値より小さくなる濃度を第２及び第３の試験溶液のサイトカイン濃度に採用する。
　加えて、サイトカイン濃度を決定する場合、生存率が８０％以上であって、かつ、第１の試験溶液にスフェロイド形状の株化肝細胞を接触させたときのチトクロムＰ４５０の代謝機能の値（第１の測定値）に対し、第２の試験溶液にスフェロイド形状の株化肝細胞を１時間以上９６時間未満接触させた時のチトクロムＰ４５０の代謝機能の値（第２の測定値）が３分の１以下であればよく、５分の１以下がより好ましい。サイトカイン濃度の決定に当たっては、濃度依存的にチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能が減衰するように調整することが好まししい。
　第１の試験溶液の測定値より小さくなるサイトカイン濃度を選択することにより、チトクロムＰ４５０の代謝機能への影響が生じる環境を作る。そして、第３の試験溶液を用いる試験により、サイトカインの存在によってチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰する状況であっても、薬剤がチトクロムＰ４５０の代謝機能に影響するか否かを検出することができる環境を生成する。減衰と回復を正確に判定するためには、第２の測定値が第１の測定値に対して有意に小さい値でなければならない。約±３０％のばらつきを想定した場合、第２の測定値の平均値が第１の測定値の平均値の６０％の値以下であれば明らかにサイトカインにより薬物代謝酵素の機能が減衰していると判断できる。この結果を踏まえて、第２の測定値が第１の測定値の３分の１以下であることが好ましいと考えた。ただし、有意差検定（例えばｔ検定）により減衰、回復を判定することができ、この範囲（３分の１以上）である必要はない。
　第３の試験溶液の薬剤の濃度は、任意の薬剤の濃度の溶液を、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％を超える濃度を採用する。濃度が低すぎる場合は薬剤によるチトクロムＰ４５０の回復が見られない場合も想定されるため、生存率が８０％を下回らない範囲でできる限り高い薬剤濃度の試験溶液を用いることが好ましい。
　なお、サイトカイン及び薬剤の濃度を決定するための試験にあたっては、工程Ａから工程Ｆの各工程の処理を実施例または比較例と同様に実施する。
＊　工程Ｄ　接触処理
　試験溶液またはコントロール溶液と細胞を接触させる時間（接触時間）はサイトカインの細胞毒性の度合いによって決められる。細胞毒性は、細胞死を引き起こす強さである。工程Ｄにおいて接触時間は、あらかじめ試験に供するサイトカイン濃度の最大値の試験溶液を用いて、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％以上となる時間を採用する。例えば、１，１０，１００倍の３種類の濃度を用いる場合、基準値の１００倍のサイトカインを含む試験溶液を用いて生存率を測定する。また、工程Ｄ'において接触時間は、あらかじめ試験に供する第２及び第３の試験溶液を用いて、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％以上となる時間を採用する。サイトカインの濃度を決定するときに、生存が８０％以上になるように適切な濃度を選択すればよい。
　いずれの時間においても生存率が８０％以下となった場合は、サイトカイン濃度の基準値を低く設定し、生存率が９０％以上となる反応時間を採用する。工程Ｄ'において各試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させる時間は、第１乃至第３の試験溶液それぞれの接触時間が同じであればよく、かつ、生存率が８０％を超える範囲であればよい。
　図９にスフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカイン（インターロイキン－１β）を含む試験溶液とを接触させる時間の長さと、チトクロムＰ４５０の反応性との関係を示す試験結果を示す。インターロイキン－１βを０時間、４時間、８時間接触させた時、経時的にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量が減少する。誤差は２０～３０％程度であった。図９のように近似曲線を作成して接触時間１時間の値を算出した。近似曲線は、図９に示す数式を用いた。誤差２０％の時、接触時間１時間より短い場合は接触時間０時間の値に対して、有意差が見られないことが予想された。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最低１時間とした。接触時間は評価期間を短縮するためには短いほどよい。加えて、コストも削減できる。
　培養には栄養を含む培地を使用しているものの、血清を含まないため、細胞の生理機能が低下する可能性がある。また、通常培地交換は、倍地中の栄養分が完全に消費されない頻度、かつ、老廃物が蓄積して生理機能に影響を及ぼさない頻度で実施する。例えば、３～４日毎に培地を交換する必要がある。即ち、５日以上の培養は細胞の生理活性を維持する観点から適していない。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最大９６時間とした。
＊　工程Ｅ　分析処理
　工程Ｅの分析処理では、試験溶液若しくはコントロール溶液または第１乃至第３の試験溶液に接触させた後の細胞を使ってチトクロムＰ４５０の代謝機能を分析する。第１の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得する。同様に、第２及び第３の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得する。
　チトクロムＰ４５０の分析方法として、ＰＣＲ法による遺伝子発現量の測定、ウェスタンブロッティング法によるタンパク解析、または、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS: Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry）や高速液体クロマトグラフィー（HPLC: High performance liquid chromatography）を用いた代謝活性測定、などどのような手法を用いても良い。
＊　工程Ｆ　評価処理
　この工程は工程Ｆ'とは区別して説明する。
　工程Ｆの評価処理では、工程Ｅの分析処理で分析した代謝機能の値（測定値）に基づいて、次のように判定する。工程Ｅで分析した代謝機能の数値を、試験溶液に接触させた細胞の分析結果を「値Ｔ」、コントロール溶液に接触させた細胞の分析結果を「値Ｃ」とすると、次のように評価する。
　値Ｔが値Ｃより大きい（値Ｔ＞値Ｃ）ときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、と判定する。チトクロムＰ４５０の分析結果の値が増加していることにより、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝機能を誘導していることがわかる。
　一方、値Ｔが値Ｃより小さい（値Ｔ＜値Ｃ）ときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０が減衰される"と判定する。チトクロムＰ４５０の分析結果の値が減少していることにより、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝機能を減衰させていることがわかる。
　値Ｔと値Ｃが同じときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０が影響を受けない"、と判定する。
　加えて、評価処理では、１倍、１０倍、１００倍の３種類の濃度の試験溶液と細胞を接触させた後のチトクロムＰ４５０の機能の分析結果が濃度依存的に増加したときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、または減少したときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される"と判定されることが好ましい。
　しかし濃度依存性がない場合であっても、サイトカインを含まない試験溶液に対してチトクロムＰ４５０の機能の値が優位に高い時に"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、または優位に低いときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される"と判定してもよい。
　上述したように、一実施形態の評価方法は、ヒト由来の株化肝細胞を用い、当該株化肝細胞を培養して増殖させ、所望のサイズのスフェロイドを形成し、該スフェロイドを被験物質と接触させることによってチトクロムＰ４５０の代謝機能への影響を評価する。チトクロムＰ４５０の評価は、試験溶液またはコントロール溶液に接触させたスフェロイドの代謝機能を測定した測定値に基づいて、被験物質がチトクロムＰ４５０の代謝能に影響するかについて、減衰、誘導、影響なしのいずれかに判定される。判定結果の種類については、減衰、誘導、影響なしの評価に限られるものではなく、被験物質の影響を示す他の判定結果を用いても構わない。
＊　工程Ｆ'　判定処理
　工程Ｆ'の判定処理では、工程Ｅ'の分析処理で分析した第１乃至第３の測定値に基づいて、第１の測定値が第２の測定値より大きく、かつ、第２の測定値が第３の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。数式で示すと、"第１の測定値＞第２の測定値"、かつ、"第２の測定値＜第３の測定値"、となる場合である。特に、第３の測定値が、第２の測定値の３倍以上である場合、薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。その理由は、上述した通りであり、減衰と回復を正確に判定するためには、第２の測定値が第１の測定値に対して有意に小さい値でなければならないからである。
　実施例及び比較例について説明する。
１．細胞の準備（スフェロイド形成処理）
［実施例］
（１－１）培養容器及び細胞
　図８に示す複数のウェル２１ａを有する培養プレート１ａを使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には複数の培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが１００μｍで形成される培養空間１１ａを有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
　培養する細胞は日本人由来の株化肝細胞であるＦＬＣ－４細胞を使用した。
（１－２）培養容器の準備
　０．０１％ＭＰＣ溶液と０．０１％のポリ－Ｌ－リシン（ＳＩＭＧＡ社製）を９：１の割合で混合した溶液をコート剤として使用した。
　各ウェルにコート溶液を０．３ｍＬ入れ、クリーンベンチ内で乾燥させた。
　使用前にリン酸緩衝整理食塩水（PBS: phosphate-buffered saline）で洗浄した。
（１－３）細胞培養
　培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用した。細胞播種密度が１６×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調整した。
　１つのウェルあたり５００μＬの細胞懸濁液を加えた。
　ＣＯ２インキュベータ内で１０日から１１日間、細胞を培養した。培地交換は３日に１回で行った。
　培地交換の際、すべて培地を吸い取らず約１００μＬを残し、あらたに５００μＬの培地を加えた。
［比較例］
　培養容器は市販の培養面が平坦な２４ウェルプレートを使用した。培養プレートのグレードは細胞培養グレードを用いた。
　上記以外は実施例と同じ条件で実施した。
２Ａ．評価方法検討のための試験条件（培地吸引処理、試験溶液添加処理、接触処理）
　実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
（２Ａ－１）手順
　培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、試験溶液またはコントロール溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
（２Ａ－２）試験溶液、コントロール溶液の調整
　試験溶液は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２の溶液（ＤＭＥＭ／Ｅ１２　ＦＢＳ　（－））に、表１の濃度になるようにサイトカインを溶解した。
　コントロール溶液は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２の溶液を用い、サイトカイン濃度を０ｍＭとした。
（２Ａ－３）分析
　表１に記載の分析方法で、ＣＹＰ３Ａ４の代謝機能を分析した。ＴＮＦ－αについては、ＣＹＰ３Ａ４に加えてＣＹＰ２Ｃ９の機能も分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２Ｂ．スクリーニング方法検討のための試験溶液のサイトカイン濃度の検討と試験条件
　試験溶液のサイトカイン濃度の検討は実施例、比較例ともに以下の手順で実施した。
（２Ｂ－１）試験溶液の準備
　サイトカインは、表皮増殖因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を使用した。
　試験溶液の溶媒は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｅ１２　ＦＢＳ　（－））を用いた。
　第２の試験溶液及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度を検討するため、ＥＧＦ濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの試験溶液を作製した。なお、事前に各試験溶液で細胞を培養して細胞生存率を得て、これらの濃度での細胞生存率は８０％以上であることを確認した。
（２Ｂ－２）手順
　培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、サイトカインの濃度を検討するための試験溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
・分析は、ウェスタンブロッキング法により実施した。
（２Ｂ－３）結果
　図１０に試験溶液のサイトカインの濃度を検討した試験結果を示す。図中、実施例は"ＭＩＣＲＯ－ＳＰＡＣＥ"、比較例は"ＣＯＮＦＬＵＥＮＴ"で示す。ＥＧＦの濃度、０、０．１、１、１０ｎｇ／ｍＬそれぞれのＣＹＰ３Ａ４　タンパク量をウェスタンプロッティング法で分析した結果がバンドとして示されている。
　実施例では、ＥＧＦの濃度が大きくなるに従い、バンドが薄くなっていることから、濃度依存的にＣＹＰ３Ａ４の機能の低下が確認される。試験溶液のサイトカインの濃度として、濃度１０ｎｇ／ｍＬを第２及び第３の試験溶液に採用することにした。
　比較例では、濃度依存性が確認できなかった。実施例と比較するため、濃度１０ｎｇ／ｍＬを採用することにした。
・試験条件（倍地球淫処理、試験溶液添加処理、接触処理）
　実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
（２Ｂ－４）試験１
　第１の試験溶液と第２の試験溶液とを、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
　試験としては、２．試験溶液の濃度の検討で実施した試験結果を用いた。試験手順は上述した通りである。
（２Ｂ－５）試験２
　第１乃至第３の試験溶液を、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
　比較例は、試験１の結果において、第１の試験溶液と第２の試験溶液との試験結果がほぼ同じとなり、条件を満たさなかったため実施しなかった。試験１の結果については後述する。
　サイトカインは、表皮増殖因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を使用した。
　薬剤は、ゲフィチニブ（Gefitinib）を使用した。
　試験溶液の溶媒は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｅ１２　ＦＢＳ　（－））を用いた。
　サイトカインの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを採用した。
　第１の試験溶液は、０ｍＭのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
　第２の試験溶液は１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
　第３の試験溶液濃度は、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、５μＭのゲフィチニブとを含む。
　培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をパスツールピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、第１乃至第３の試験溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュ
ベートした（接触処理）。
・分析は、遺伝子解析により実施した。
３．分析方法
（３－１）代謝活性測定法
　反応後の上澄みを除去した後、５０μＭ　トリアゾラム（triazolam）を含む分析用溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートした。回収した培地１５０μＬを試験管にとり、内部標準物質としてオキザゼパム（oxazepam）(0.2μg/ｍＬ in methanol)を５０μＬ添加した後、氷冷したアセトニトリル（acetonitrile）（和光純薬工業）３００μＬを加えて攪拌し、遠心分離（3000r.p.m.，１０分，４℃）することによりタンパクを沈降させた。その後、減圧エバポレーターを用いてアセトニトリルを蒸発させ、上清をフィルターろ過して得られた溶液７０μＬをＨＰＬＣに注入した。検量線用サンプルとしては、１０、４０、８０、１６０および３２０ｐｍｏｌのα-および4-hydroxytriazolamを含むメタノール溶液各１０μＬを１３０μＬの培地に加えたものを用いた。α-および4-hydroxytriazolamはＨＰＬＣにより定量した。検量線は検量線用サンプルの内部標準物質に対するα-および4-hydroxytriazolamのピークの高さの比を最小二乗法により直線回帰を行うことにより求めた。
（３－２）遺伝子解析法（RT-qPCR）
　ＲＮＡ抽出は、培養プレート１ａの２ウェル２１ａ分を１サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。Dnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全ＲＮＡ（Total RNA）はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
　解析は、全量２０μＬ中に、 ９．６μＬ EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 ０．９６μＬ　２０×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、７．１μＬ　sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA １．８μＬを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
（３－３）ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）
　３～６ウェル分の細胞を０．１％のprotease inhibitor cocktailおよび１ｍＭ　ＰＭＳＦ （Phenylmethyl sulfonyl fluoride）を含むLysis bufferでソニケーションした後、１２０００ｇで１５分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液（10-15 μg/lane）を１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に２時間、５４Ｖの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は５％　スキムミルクを加えた０．０５％Tweem２０含有ＰＢＳ（PBST）を用いて、室温で１時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで６０００倍に希釈したものを用いて４℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで５０００倍に希釈したものを用い、室温で１時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。
４．試験結果
　図１０乃至１８に評価方法検討の試験結果を示す。図中、実施例は"ＭＩＣＲＯ－ＳＰＡＣＥ"、比較例は"ＣＯＮＦＬＵＥＮＴ"で示す。また、細胞へコントロール溶液を添加した場合（非添加群）を、"ＵＮＴ"（Untreated）と示し、試験溶液を添加した場合を、添加したサイトカインの濃度（例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ）で示す。図１０乃至１５に示す結果は、正副３回の独立した実験の標平均値に標準偏差を加えた値である。
　図１０の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１０は、培養後の４種類のＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
　図１１の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１１は、培養後の４種類のＨＢ－ＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
　図１２の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン‐１β（IL-1β）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１２は、培養後の４種類のＩＬ－1β濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
　図１３、１４の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（TNF-α:Tumor Necrosis Factor-α）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１３、１４は、培養後の４種類のＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４（図１３）及びＣＹＰ２Ｃ９（図１４）　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
　図１５の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン‐６（IL-6: Interluekin-6）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１５は、培養後の４種類のＩＬ－６濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
　図１６の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ－４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む試験溶液を添加し、４８時間培養し、その後５０μｇ／ｍＬのトリアゾラム（triazolam）を添加し、２４時間培養した。図１５は、培養後の４種類のＩＬ－６濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４　タンパク量をウェスタンプロッティング法で分析した結果を示す。
　図１７に、サイトカインの濃度依存性の試験結果を示す。
　図１８に、評価処理で説明した手法に基づいて試験結果を判定した結果を示す。図１８中、項目「サイトカインの影響」は、試験溶液を添加した細胞（サイトカイン添加群）とコントロール溶液を添加した細胞（非添加群）との比較から判定した試験結果であり、項目「濃度依存性」は、異なるサイトカイン濃度の試験結果に基づいて、濃度依存性を判定した試験結果を示す。図１８中、「－」は判定できなかったことを示す。
　実施例ではいずれのサイトカインも、コントロール（サイトカイン濃度０ｍＭ）に対し優位にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量の減少が確認できた。
　比較例ではコントロール（サイトカイン濃度０ｍＭ）に対し優位にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量が減少することはなかった。
　上述した実施例で用いたサイトカインは一例であり、他のサイトカインであっても一実施形態の評価方法を適用することができることは言うまでもない。
　スクリーニング方法検討の結果を以下に示す。
試験１の結果
　図１９に示す試験溶液濃度の検討の試験結果を用いて判定した。図１９の試験結果のうち、実施例、比較例ともに、ＥＧＦの濃度が０ｎｇ／ｍＬである第１の試験溶液の結果及びＥＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍＬである第２の試験溶液の結果（図１９に示す点線で囲んだ４つのバンド、ＣＹＰ３Ａ４　タンパク量）を比較して判定する。第１の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのＣＹＰ３Ａ４のタンパク量を、実施例ではＭ０、比較例ではＣ０とし、第２の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのＣＹＰ３Ａ４のタンパク量を、実施例ではＭ１０、比較例ではＣ１０とする。
　実施例では、第２の試験溶液のバンドが第１の試験溶液のバンドより薄くなっている。言い換えると、Ｍ０がＭ１０より大きい（Ｍ０＞Ｍ１０）。
　一方、比較例では、第１の試験溶液のバンドと第２の試験溶液のバンドとの間で差が検出できない。言い換えると、Ｃ０とＣ１０とがほぼ同じである（Ｃ０≒Ｃ１０）。
試験２の結果
　図２０に第１乃至第３の試験溶液をスフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのＣＹＰ３Ａ４の　ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで分析した結果を示す。図２０では、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現量を、第１の試験溶液の場合を（Ａ）、第２の試験溶液の場合を（Ｂ）、第３の試験溶液の場合を（Ｃ）で示す。図２０の結果では、ＣＹＰ３Ａ４の代謝機能の値が、第１の試験溶液（サイトカイン及び薬剤無）の場合に比べ、第２の試験溶液（サイトカイン有、薬剤無）の場合が低くなっている。加えて、第２の試験溶液の場合に比べ、第３の試験溶液（サイトカイン及び薬剤有）の場合が３倍以上に高くなっている。この結果から、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定できる。
　上述した実施例で用いたサイトカインは一例であり、他のサイトカインであっても一実施形態のスクリーン方法を適用することができることは言うまでもない。
　なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
　この出願は、２０１２年９月２７日に出願された日本出願特願２０１２－２１３９７７、及び２０１２年９月２７日に出願された日本出願特願２０１２－２１３９７８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１、１ａ　培養プレート
８　細胞
９　スフェロイド
１０、１０ａ　培養容器
１１、１１ａ　培養空間
１２　壁
１３　底部
１４　底部培養面
２１、２１ａ　ウェル
２２　仕切り部

Claims (23)

  1. 　サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法であって、
    　スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の代謝機能の誘導または減衰の有無を評価する方法。
  2. 　前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１の方法。
  3. 　前記試験溶液が無血清培地であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記試験溶液のサイトカイン濃度が、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記試験溶液のサイトカインの濃度が、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記サイトカインを含む前記試験溶液とを１時間以上９６時間未満接触させる工程とを、同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
    　前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
    　前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
    　前記一つのウェルへ、前記サイトカインを含む前記試験溶液を添加する工程と、
    　前記一つのウェル内で、前記サイトカインを含む前記試験溶液と、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程と、を行うこと特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
    　各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径で割った値が０．３から２の範囲であり、
    　前記培養空間の底に、前記相当直径が１００μｍから１０００μｍの範囲の培養空間が少なくとも２個以上配置されていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが２μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項８記載の方法。
  10. 　前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項８または９記載の方法。
  11. 　前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｌ－リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法であって、
    　前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第１の試験溶液、前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第２の試験溶液、及び前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、
    　前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させ、
    　前記第１の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、前記第２及び第３の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得し、
    　前記第１の測定値が前記第２の測定値より大きく、かつ、前記第２の測定値が前記第３の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定するスクリーニング方法。
  18. 　前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１７のスクリーニング方法。
  19. 　前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることを特徴とする請求項１７または１８記載のスクリーニング方法。
  20. 　前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することを特徴とする請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  21. 　前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  22. 　前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  23. 　前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第１乃至第３の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１７乃至２２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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