JP2014064545A - 薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】薬剤のスクリーニング方法は、(A)サイトカイン及び薬剤を含まない第1の試験溶液と、(B)サイトカインを含み、薬剤を含まない第2の試験溶液、及び(C)サイトカイン及び薬剤を含む第3の試験溶液、を用意し、培養空間11を有する培養容器10を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイド9を形成し、第1乃至第3の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して、第1乃至第3の試験溶液それぞれに対応する第1乃至第3の測定値を測定し、第1の測定値が第2の測定値より大きく、かつ、第2の測定値が第3の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定する。
【選択図】図5A
Description
例えば、炎症性の自己免疫疾患の患者のインターロイキンの血中濃度は健常人より高く、チトクロムP450の代謝機能は健常人と比較して低い(非特許文献1)。このような患者にチトクロムP450の代謝を受ける医薬品(D1)を投与する場合、該当患者の代謝機能の低下分を見越して健常人よりも少ない量を投与する。このような患者に対し、インターロイキンの受容体をブロックするような、サイトカインと相互に作用する薬剤(D2)(例えば、分子標的医薬品)を併用すると、低下したチトクロムP450の代謝機能が回復し、医薬品(D1)の代謝が促進される。その結果、医薬品(D1)の作用が減弱化することが臨床研究で示された(非特許文献2)。このような背景から、分子標的医薬品のような薬剤とチトクロムP450の代謝を受ける医薬品のサイトカインを介した相互作用の研究が注目されるようになってきた。
また、インターロイキンに代表されるサイトカイン類は創薬ターゲットとしても注目されるようになり、近年では、薬剤とサイトカインとの相互作用を評価するためのin vitro系が求められるようになってきた。
一方、株化肝細胞は、増殖させることが可能である。従って、ヒト由来の株化肝細胞が利用できれば、安価にかつ再現性のある結果が得られる。しかしながら、株化肝細胞の代謝機能は低く、初代肝細胞と同様の挙動(化合物やサイトカイン等による代謝酵素の誘導や減衰)を示す株化肝細胞を得ることは容易でない。細胞を培養する底部の表面が平坦な培養容器を用いて培養した場合、薬物代謝機能が低いためにサイトカインによる代謝機能の減衰及び薬剤添加による代謝機能の回復が検出できないという問題がある。このような背景から、チトクロムP450の代謝機能を回復する薬剤のスクリーニング方法は開発されていなかった。
発明者らは、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用する手法を発見した。
本発明に係るサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法の一態様は、
(A)前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第1の試験溶液、
(B)前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第2の試験溶液、及び
(C)前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第3の試験溶液、を用意し、
前記第1乃至第3の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、
前記第1の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第1の測定値を取得し、同様に、前記第2及び第3の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第2及び第3の測定値を取得し、
前記第1の測定値が前記第2の測定値より大きく、かつ、前記第2の測定値が前記第3の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定する。
この方法により、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用することが可能となることを見いだした。
加えて、前記第3の測定値は、前記第2の測定値の3倍である場合に、チトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。
さらに加えて、前記第2及び第3試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。また、前記第2及び第3の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。
加えて、前記第1乃至第3の試験溶液とスフェロイド形状の前記株化肝細胞とを1時間以上96時間未満接触させることが好ましい。
さらに加えて、前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用いて以下の各構成を行うことが好ましい。
(1)前記一つのウェル内に10%血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
(2)前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
(3)前記一つのウェルへ、前記第1乃至第3の試験溶液のうちの一つを添加する工程と、
(4)前記一つのウェル内で、前記第1乃至第3の試験溶液のうちの一つと、前記スフェロイドとを1時間以上96時間未満接触させる工程。
用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、3次元状態になったものである。
用語「チトクロムP450(CYP)」は、細菌から植物,哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物(薬物)代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
用語「サイトカインと相互に作用する薬剤」(以降適宜、「薬剤」とも称する)は、サイトカインが存在すると相互に作用する薬剤であり、特に、サイトカインと相互作用によって、チトクロムP450の代謝機能を変動させる薬剤である。例えば、体内のタンパク質や遺伝子などを利用したバイオ医薬品、低分子医薬品などを含む。
以下の説明において、「値Aから値Bの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値A以上値B以下」を意味する。
1.培養容器
* 培養容器の概略
図1は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図2Aは、図1に示す培養プレートのII−II線断面図であり、図2Bに、他の態様の断面図を示す。培養プレート1は、複数のウェル21を備える。複数のウェル21は、仕切り部22によって、隣り合うウェル21と隔てられる。複数のウェル21それぞれには、培養容器10が形成されている。
図3に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図4は、図3に示す培養容器のIV−IV線断面図である。
培養容器10は、培養空間11と、壁12と、底部13とを有する。
培養空間11は、壁12と底部13とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域(培養領域)となる。培養空間11は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁12は、培養空間11を仕切る隔壁であり、培養容器10に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間11が仕切り部22に隣接する場合、壁12は、図2Aに示すように、仕切り部22の壁面の一部分と同じになってもよいし、図2Bに示すように、仕切り部22の壁面に隣接して壁12が配置されてもよい。
底部13は、培養容器10の基板として機能するとともに、培養空間11が配置される側の表面は、培養領域(培養表面)の一部となる。底部13は、培養プレート1に形成された各ウェル21の底部と同じ領域であり、各ウェル21の底部が用いられる。底部13は、培養空間11の底を形成する。底部13のうち、培養空間11を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面14」とも称する。
相当直径Dは、培養空間11に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Dは、培養空間11の底部13と平行する面の形状(正面の形状)、言い換えると、培養空間11の高さHの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間11の正面の形状が、高さHに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
高さHは、培養空間11の底(底部培養面14)から壁12の上面までの長さであり、培養空間11の深さでもあるともいえる。また、底部培養面14が平面の場合、高さHは、壁12の高さと同じである。
壁12の幅Wは、壁12の厚さであるとともに、隣接する培養空間11間を隔てる距離であるともいえる。
* 培養空間の大きさ、形状等
培養空間11の相当直径Dについて、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間11の細胞と接触しないような培養空間11を確保することである。このため、培養空間11の相当直径Dは、所望するスフェロイドの直径の1〜5倍の範囲が好ましく、1.5〜3倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径100μmの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の1〜5倍の範囲、即ち、相当直径Dが100〜500μmの範囲で、高さHが相当直径の0.3〜2倍の範囲の培養空間11が規則的に配置されている底部13を有する培養容器10を用いる。
株化肝細胞培養空間11の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間11の相当直径Dが所望するスフェロイドの直径の1〜5倍の範囲、高さHが相当直径Dの0.3〜2倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さHを設計する必要がある。後述する好ましい大きさの範囲のスフェロイドを形成させるために、適切な高さH、相当直径Dを検討した。その結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Dが100μm〜200μmの範囲、高さHが50μm〜100μmの範囲が好ましいことを見いだした。培養空間11の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間11の高さHは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間11の高さHを相当直径Dで割った値が0.3〜2の範囲が好ましく、0.5〜1の範囲がより好ましいことを見いだした。
図1に示す培養プレート1で培養する場合、ウェル21毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル21に複数の培養空間11を形成するため、各ウェル21において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド9の直径DSPを値dsp(dspは正の数値)とすると、培養空間11の相当直径Dは、値dspから値dspの5倍の範囲(dsp≦D≦5dsp)が好ましい範囲となる。また、培養空間11の高さHは、値dspの0.3倍から値dspの25倍(5×5)の範囲(0.3dsp≦H≦25dsp)が好ましい範囲となる。
「半値幅の範囲」とは、1試験領域にあるスフェロイドの総個数NTうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径D1の個数N1に対して、個数N1の半分の個数(N1/2)となる複数の直径のうち、最小の直径D2から最大の直径D3までの範囲に存在するスフェロイドの個数N2をいう。
スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数NTに対して個数N2が70%以上であることが好ましく、総個数NTに対する個数N2の割合が高くなることがより好ましい。
培養空間11の側面の形状は、図4に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図7A〜7Cに示すような形状であってもよい。
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間11を囲む壁12及び底部培養面14の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間11内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間11内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を45度以下にすることが好ましい。より好ましくは0度〜20度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間11と壁12の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器10と同条件で作製して測定した値を前提とする。
水接触角を45度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面14に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
また、水接触角を45度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を45度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)をコートしてもよい。
次に、株化肝細胞を培養し、サイトカインがチトクロムP450の代謝能に及ぼす影響を評価するまでの方法について説明する。
* 培養・評価方法の概略
一実施形態の培養から判定までには、例えば、次の(A)から(F)の工程を実施する。
(A)ヒト由来の株化肝細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程(スフェロイド形成処理)。
(B)同じ一つのウェル21から培地を吸い取る工程(培地吸引処理)。
(C)同じ一つのウェル21へ、第1乃至第3の試験溶液を添加する工程(試験溶液添加処理)。
(D)同じ一つのウェル21内で、サイトカインを含む試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを1時間以上96時間未満、接触させる工程(接触処理)。
(E)チトクロムP450の代謝機能を分析(測定)する工程(分析処理)。
(F)分析した結果を判定する工程(判定処理)。
一実施形態の判定方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、株化肝細胞をスフェロイド形状に培養するスフェロイド形成処理(工程A)と、第1乃至第3の試験溶液を所定の時間、培養した細胞に接触させる接触処理(工程D)とを同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、図1に示す培養プレート1の複数のウェル21を用い、複数のウェル21のうち、一つのウェル21内でスフェロイド形成処理から接触処理までの各工程を実施する。言い換えると、一つのウェル内で培養から評価までの処理において、各工程の途中で細胞を別のウェル21に移動させることはない。
工程Aのスフェロイド形成処理では、上述した培養容器10を用いて、10%血清を含む培地でヒト由来の株化肝細胞を培養し、所望のサイズのスフェロイドを形成させる。
形成されたスフェロイドは、少なくともその一部分が壁12または底部培養面14に接着している。
スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器10が形成されたウェル21を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞をサイトカインと接触させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。
培養容器10は、高さHを相当直径Dで割った値が0.3〜2の範囲であって、相当直径Dが100μm〜1000μmの範囲の培養空間11が、少なくとも2個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間11を隔てる壁12の幅Wは2μmから50μmの範囲であることが好ましい。このような培養容器10を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。
培地の吸引は、例えば、パスツールピペットを用いて吸引する。スフェロイド形成処理で用いた培地は、全量を吸引することが好ましい。これは、培地に含まれる血清の影響を除去するためである。加えて、培地の吸引では、培養空間11に形成されたスフェロイドが、培養空間11の壁12または底部培養面14と接着している状態を維持するように留意する。スフェロイドが壁12または底部培養面14に接着している状態を維持することにより、他の培養空間11に形成されたスフェロイドと接着することを防止できるからである。加えて、試験溶液に交換する際及びそのための洗浄操作により細胞が剥離すると試験できなくなるので接着しておいた方がよい。
工程Cの試験溶液添加処理では、第1乃至第3の試験溶液のいずれかをウェル21へ添加する。各試験溶液は、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、各試験溶液と細胞を48時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため0.1〜1%の範囲の血清を加えても良い。
各試験溶液の溶媒は200〜315mOsm/kgの浸透圧であって、pH域が6.8〜8.4に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地(DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium)とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
基準値を設定し、基準値に対して少なくとも3種類の異なる濃度を用いて、工程Aから工程Fの各処理を実施して、チトクロムP450の代謝機能を分析して測定値を得る。
基準値は、健常人のサイトカインまたは疾患患者のサイトカインの血中濃度の平均値の0.1倍〜50倍の範囲の濃度を基準に設定する。基準値の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度のサイトカインを含み、薬剤を含まない、3種類の溶液(言い換えると、3種類の第2の試験溶液)と、サイトカイン及び薬剤を含まない溶液(第1の試験溶液)とを用意し、スフェロイド形状の株化肝細胞と接触させる。複数種類の溶液に接触させた複数の株化肝細胞のチトクロムP450の代謝機能を測定する。測定した結果、複数のサイトカインの濃度のうち、第1の試験溶液を接触させた細胞の測定値より小さくなる濃度を第2及び第3の試験溶液のサイトカイン濃度に採用する。
第1の試験溶液の測定値より小さくなるサイトカイン濃度を選択することにより、チトクロムP450の代謝機能への影響が生じる環境を作る。そして、第3の試験溶液を用いる試験により、サイトカインの存在によってチトクロムP450の代謝機能が減衰する状況であっても、薬剤がチトクロムP450の代謝機能に影響するか否かを検出することができる環境を生成する。減衰と回復を正確に判定するためには、第2の測定値が第1の測定値に対して有意に小さい値でなければならない。約±30%のばらつきを想定した場合、第2の測定値の平均値が第1の測定値の平均値の60%の値以下であれば明らかにサイトカインにより薬物代謝酵素の機能が減衰していると判断できる。この結果を踏まえて、第2の測定値が第1の測定値の3分の1以下であることが好ましいと考えた。ただし、有意差検定(例えばt検定)により減衰、回復を判定することができ、この範囲(3分の1以上)である必要はない。
なお、サイトカイン及び薬剤の濃度を決定するための試験にあたっては、工程Aから工程Fの各工程の処理を実施例または比較例と同様に実施する。
試験溶液と細胞を接触させる時間(接触時間)はサイトカインの細胞毒性の度合いによって決められる。細胞毒性は、細胞死を引き起こす強さである。接触時間は、あらかじめ試験に供する第2及び第3の試験溶液を用いて、1時間から96時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が80%以上となる時間を採用する。サイトカインの濃度を決定するときに、生存が80%以上になるように適切な濃度を選択すればよい。
いずれの時間においても生存率が80%以下となった場合は、サイトカイン濃度の基準値を低く設定し、生存率が90%以上となる反応時間を採用する。各試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させる時間は、第1乃至第3の試験溶液それぞれの接触時間が同じであればよく、かつ、生存率が80%を超える範囲であればよい。
培養には栄養を含む培地を使用しているものの、血清を含まないため、細胞の生理機能が低下する可能性がある。また、通常培地交換は、倍地中の栄養分が完全に消費されない頻度、かつ、老廃物が蓄積して生理機能に影響を及ぼさない頻度で実施する。例えば、3〜4日毎に培地を交換する必要がある。即ち、5日以上の培養は細胞の生理活性を維持する観点から適していない。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最大96時間とした。
工程Eの分析処理では、第1乃至第3の試験溶液に接触させた後の株化肝細胞を使ってチトクロムP450の代謝機能を分析する。第1の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第1の測定値を取得する。同様に、第2及び第3の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第2及び第3の測定値を取得する。
チトクロムP450の分析方法として、PCR法による遺伝子発現量の測定、ウェスタンブロッティング法によるタンパク解析、または、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS/MS: Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry)や高速液体クロマトグラフィー(HPLC: High performance liquid chromatography)を用いた代謝活性測定、などどのような手法を用いても良い。
工程Fの判定処理では、工程Eの分析処理で分析した第1乃至第3の測定値に基づいて、第1の測定値が第2の測定値より大きく、かつ、第2の測定値が第3の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定する。数式で示すと、"第1の測定値>第2の測定値"、かつ、"第2の測定値<第3の測定値"、となる場合である。特に、第3の測定値が、第2の測定値の3倍以上である場合、薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。その理由は、上述した通りであり、減衰と回復を正確に判定するためには、第2の測定値が第1の測定値に対して有意に小さい値でなければならないからである。
1.細胞の準備(スフェロイド形成処理)
[実施例]
(1−1)培養容器及び細胞
図8に示す複数のウェル21aを有する培養プレート1aを使用した。各ウェル21aの底部培養面には複数の培養容器10aが形成されている。各培養容器10aは、相当直径Dが200μm、高さHが100μmで形成される培養空間11aを有する。また、壁12aの幅Wは10μmである。
培養する細胞は日本人由来の株化肝細胞であるFLC−4細胞を使用した。
(1−2)培養容器の準備
0.01%MPC溶液と0.01%のポリ−L−リシン(SIMGA社製)を9:1の割合で混合した溶液をコート剤として使用した。
各ウェルにコート溶液を0.3mL入れ、クリーンベンチ内で乾燥させた。
使用前にリン酸緩衝整理食塩水(PBS: phosphate-buffered saline)で洗浄した。
(1−3)細胞培養
培地は、10%のウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM/F12培地を使用した。細胞播種密度が16×105個/mLになるように細胞懸濁液を調整した。
1つのウェルあたり500μLの細胞懸濁液を加えた。
CO2インキュベータ内で10日から11日間、細胞を培養した。培地交換は3日に1回で行った。
培地交換の際、すべて培地を吸い取らず約100μLを残し、あらたに500μLの培地を加えた。
培養容器は市販の培養面が平坦な24ウェルプレートを使用した。培養プレートのグレードは細胞培養グレードを用いた。
上記以外は実施例と同じ条件で実施した。
実施例、比較例ともに以下の手順で実施した。
(2−1)試験溶液の準備
サイトカインは、表皮増殖因子(EFG: Epidermal Growth Factor)を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないDMEM/F12(DMEM/E12 FBS (−))を用いた。
第2の試験溶液及び第3の試験溶液のサイトカインの濃度を検討するため、EGF濃度が0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mLの試験溶液を作製した。なお、事前に各試験溶液で細胞を培養して細胞生存率を得て、これらの濃度での細胞生存率は80%以上であることを確認した。
(2−2)手順
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をピペットで吸引した(培地吸引処理)。
・各ウェルへ、サイトカインの濃度を検討するための試験溶液を添加した(試験溶液添加処理)。
・8時間、24時間または48時間、37℃、CO2インキュベータ内で細胞をインキュベートした(接触処理)。
・分析は、ウェスタンブロッキング法により実施した。
(2−3)結果
図10に試験溶液のサイトカインの濃度を検討した試験結果を示す。図中、実施例は"MICRO−SPACE"、比較例は"CONFLUENT"で示す。EGFの濃度、0、0.1、1、10ng/mLそれぞれのCYP3A4 タンパク量をウェスタンプロッティング法で分析した結果がバンドとして示されている。
実施例では、EGFの濃度が大きくなるに従い、バンドが薄くなっていることから、濃度依存的にCYP3A4の機能の低下が確認される。試験溶液のサイトカインの濃度として、濃度10ng/mLを第2及び第3の試験溶液に採用することにした。
比較例では、濃度依存性が確認できなかった。実施例と比較するため、濃度10ng/mLを採用することにした。
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
(3−1)試験1
第1の試験溶液と第2の試験溶液とを、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
試験としては、2.試験溶液の濃度の検討で実施した試験結果を用いた。試験手順は上述した通りである。
(3−2)試験2
第1乃至第3の試験溶液を、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
比較例は、試験1の結果において、第1の試験溶液と第2の試験溶液との試験結果がほぼ同じとなり、条件を満たさなかったため実施しなかった。試験1の結果については後述する。
サイトカインは、表皮増殖因子(EFG: Epidermal Growth Factor)を使用した。
薬剤は、ゲフィチニブ(Gefitinib)を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないDMEM/F12(DMEM/E12 FBS (−))を用いた。
サイトカインの濃度は、10ng/mLを採用した。
第1の試験溶液は、0mMのEGFと、0mMのゲフィチニブとを含む。
第2の試験溶液は10ng/mLのEGFと、0mMのゲフィチニブとを含む。
第3の試験溶液濃度は、10ng/mLのEGFと、5μMのゲフィチニブとを含む。
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をパスツールピペットで吸引した(培地吸引処理)。
・各ウェルへ、第1乃至第3の試験溶液を添加した(試験溶液添加処理)。
・8時間、24時間または48時間、37℃、CO2インキュベータ内で細胞をインキュベートした(接触処理)。
・分析は、遺伝子解析により実施した。
4.分析方法
(3−1)遺伝子解析法(RT-qPCR)
RNA抽出は、培養プレート1aの2ウェル21a分を1サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。DNnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全RNA(Total RNA)はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
解析は、全量20μL中に、 9.6μL EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 0.96μL 20×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、7.1μL sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA 1.8μLを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
3〜6ウェル分の細胞を0.1%のprotease inhibitor cocktailおよび1mM PMSF (Phenylmethyl sulfonyl fluoride)を含むLysis bufferでソニケーションした後、12000gで15分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液(10-15 μg/lane)を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に2時間、54Vの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は5% スキムミルクを加えた0.05%Tweem20含有PBS(PBST)を用いて、室温で1時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、3%BSAを加えたPBSTで6000倍に希釈したものを用いて4℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、3%BSAを加えたPBSTで5000倍に希釈したものを用い、室温で1時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。
(5−1)試験1の結果
図10に示す試験溶液濃度の検討の試験結果を用いて判定した。図10の試験結果のうち、実施例、比較例ともに、EGFの濃度が0ng/mLである第1の試験溶液の結果及びEGFの濃度が10ng/mLである第2の試験溶液の結果(図10に示す点線で囲んだ4つのバンド、CYP3A4 タンパク量)を比較して判定する。第1の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのCYP3A4のタンパク量を、実施例ではM0、比較例ではC0とし、第2の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのCYP3A4のタンパク量を、実施例ではM10、比較例ではC10とする。
実施例では、第2の試験溶液のバンドが第1の試験溶液のバンドより薄くなっている。言い換えると、M0がM10より大きい(M0>M10)。
一方、比較例では、第1の試験溶液のバンドと第2の試験溶液のバンドとの間で差が検出できない。言い換えると、C0とC10とがほぼ同じである(C0≒C10)。
(5−2)試験2の結果
図11に第1乃至第3の試験溶液をスフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのCYP3A4の mRNAの発現量をRT−qPCRで分析した結果を示す。図11では、CYP3A4 mRNAの発現量を、第1の試験溶液の場合を(A)、第2の試験溶液の場合を(B)、第3の試験溶液の場合を(C)で示す。図11の結果では、CYP3A4の代謝機能の値が、第1の試験溶液(サイトカイン及び薬剤無)の場合に比べ、第2の試験溶液(サイトカイン有、薬剤無)の場合が低くなっている。加えて、第2の試験溶液の場合に比べ、第3の試験溶液(サイトカイン及び薬剤有)の場合が3倍以上に高くなっている。この結果から、薬剤がチトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定できる。
8 細胞
9 スフェロイド
10、10a 培養容器
11、11a 培養空間
12 壁
13 底部
14 底部培養面
21、21a ウェル
22 仕切り部
加えて、前記第3の測定値は、前記第2の測定値の3倍以上である場合に、チトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。
さらに加えて、前記第2及び第3試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。また、前記第2及び第3の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
(3−1)試験1
第1の試験溶液と第2の試験溶液とを、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
試験としては、2.試験溶液の濃度の検討で実施した試験結果を用いた。試験手順は上述した通りである。
(3−2)試験2
第1乃至第3の試験溶液を、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
比較例は、試験1の結果において、第1の試験溶液と第2の試験溶液との試験結果がほぼ同じとなり、条件を満たさなかったため実施しなかった。試験1の結果については後述する。
サイトカインは、表皮増殖因子(EFG: Epidermal Growth Factor)を使用した。
薬剤は、ゲフィチニブ(Gefitinib)を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないDMEM/F12(DMEM/E12 FBS (−))を用いた。
サイトカインの濃度は、10ng/mLを採用した。
第1の試験溶液は、0mMのEGFと、0mMのゲフィチニブとを含む。
第2の試験溶液は10ng/mLのEGFと、0mMのゲフィチニブとを含む。
第3の試験溶液濃度は、10ng/mLのEGFと、5μMのゲフィチニブとを含む。
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をパスツールピペットで吸引した(培地吸引処理)。
・各ウェルへ、第1乃至第3の試験溶液を添加した(試験溶液添加処理)。
・8時間、24時間または48時間、37℃、CO2インキュベータ内で細胞をインキュベートした(接触処理)。
・分析は、遺伝子解析により実施した。
4.分析方法
(4−1)遺伝子解析法(RT-qPCR)
RNA抽出は、培養プレート1aの2ウェル21a分を1サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。DNnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全RNA(Total RNA)はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
解析は、全量20μL中に、 9.6μL EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 0.96μL 20×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、7.1μL sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA 1.8μLを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
3〜6ウェル分の細胞を0.1%のprotease inhibitor cocktailおよび1mM PMSF (Phenylmethyl sulfonyl fluoride)を含むLysis bufferでソニケーションした後、12000gで15分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液(10-15 μg/lane)を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に2時間、54Vの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は5% スキムミルクを加えた0.05%Tweem20含有PBS(PBST)を用いて、室温で1時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、3%BSAを加えたPBSTで6000倍に希釈したものを用いて4℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、3%BSAを加えたPBSTで5000倍に希釈したものを用い、室温で1時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。
Claims (18)
- サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法であって、
(A)前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第1の試験溶液、(B)前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第2の試験溶液、及び(C)前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第3の試験溶液、を用意し、
前記第1乃至第3の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、
前記第1の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第1の測定値を取得し、同様に、前記第2及び第3の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定して第2及び第3の測定値を取得し、
前記第1の測定値が前記第2の測定値より大きく、かつ、前記第2の測定値が前記第3の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定するスクリーニング方法。 - 前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が50μm以上200μm未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの70%以上であることを特徴とする請求項1のスクリーニング方法。
- 前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることを特徴とする請求項1または2記載のスクリーニング方法。
- 前記第3の測定値は、前記第2の測定値の3倍である場合に、チトクロムP450の薬物代謝機能を回復させると判定することを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記第2及び第3試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記第2及び第3の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の0.1倍から50倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも1倍、10倍、100倍の3濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムP450の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第1の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第1乃至第3の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1乃至第3の試験溶液とスフェロイド形状の前記株化肝細胞とを1時間以上96時間未満接触させることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
前記一つのウェル内に10%血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
前記一つのウェルへ、前記第1乃至第3の試験溶液のうちの一つを添加する工程と、
前記一つのウェル内で、前記第1乃至第3の試験溶液のうちの一つと、前記スフェロイドとを1時間以上96時間未満接触させる工程と、を行うこと特徴とする請求項1乃至9のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。 - 前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径で割った値が0.3から2の範囲であり、
前記培養空間の底に、前記相当直径が100μmから1000μmの範囲の培養空間が少なくとも2個以上配置されていることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。 - 前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが2μmから50μmの範囲であることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が90度から135度の範囲であることを特徴とする請求項1乃至11のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を45度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を45度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項1乃至11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項1乃至14のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−L−リシン、ポリ−L−リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項1乃至14のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項1乃至16のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が85%以上99%未満であることを特徴とする請求項1乃至17のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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CN201380061684.XA CN104812911B (zh) | 2012-09-27 | 2013-09-27 | 评价细胞因子对细胞色素p450的代谢能力产生的影响的方法和药剂的筛选方法 |
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05260957A (ja) * | 1992-01-22 | 1993-10-12 | Kao Corp | 肝細胞スフェロイド及びその調製法 |
JP2005027598A (ja) * | 2003-07-09 | 2005-02-03 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology | 細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体 |
WO2005038011A1 (ja) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | 人工細胞組織の作成方法、及びそのための基材 |
JP2008022743A (ja) * | 2006-07-19 | 2008-02-07 | Scivax Kk | 新規スフェロイド及びスフェロイドの製造方法、薬剤スクリーニング、毒性評価、病体モデル動物の製造へのスフェロイドの使用、スフェロイド細胞培養キット、抗体のスフェロイド形成のための使用、レクチンのスフェロイド形成のための使用、細胞接着分子のスフェロイド形成のための使用 |
JP2008119010A (ja) * | 2001-07-26 | 2008-05-29 | Trans Parent:Kk | 動物細胞の培養構築物 |
JP2010233538A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Trans Parent:Kk | 基質代謝物の評価方法 |
-
2012
- 2012-09-27 JP JP2012213978A patent/JP2014064545A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05260957A (ja) * | 1992-01-22 | 1993-10-12 | Kao Corp | 肝細胞スフェロイド及びその調製法 |
JP2008119010A (ja) * | 2001-07-26 | 2008-05-29 | Trans Parent:Kk | 動物細胞の培養構築物 |
JP2005027598A (ja) * | 2003-07-09 | 2005-02-03 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology | 細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体 |
WO2005038011A1 (ja) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | 人工細胞組織の作成方法、及びそのための基材 |
JP2008022743A (ja) * | 2006-07-19 | 2008-02-07 | Scivax Kk | 新規スフェロイド及びスフェロイドの製造方法、薬剤スクリーニング、毒性評価、病体モデル動物の製造へのスフェロイドの使用、スフェロイド細胞培養キット、抗体のスフェロイド形成のための使用、レクチンのスフェロイド形成のための使用、細胞接着分子のスフェロイド形成のための使用 |
JP2010233538A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Trans Parent:Kk | 基質代謝物の評価方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 2011, VOL.39, NO.8, P.1415-1422, JPN6013057406, ISSN: 0002685261 * |
FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, 2012 FEB, VOL.3, NO.8, P.1-10, JPN6013057403, ISSN: 0002685259 * |
永森靜志, 高機能保持ヒト肝細胞組込型細胞チップとナノセンサーによる新薬開発における薬物動態・毒性を評, JPN6013057401, ISSN: 0002685258 * |
江尻洋子、外4名, 医薬品開発のための新規ヒト肝細胞培養系の構築, 第16回HAB研究機構学術年会プログラム・, JPN6013057404, ISSN: 0002685260 * |
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