JP2008119010A - 動物細胞の培養構築物 - Google Patents
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Abstract
長期に亘り実質細胞の機能を保持した培養細胞構築物の提供。
【解決手段】
支持体上の小領域上に実質細胞と非実質細胞の共培養物が接着しており、該小領域が一定の微細な面積または直径を有し、それらの各々が親水性ポリマーで形成された支持体上の表面で少なくとも約100μm隔離されている培養細胞構築物。
【選択図】 なし
Description
。それ故、このような共培養系では培養肝細胞の凝集物中の細胞がそれらの全体にわたって安定に肝特異的機能を発揮させることは困難である。
本発明に従えば、共培養される相互に異なる動物細胞のうち一つは、後述する共培養によりスフェロイドを形成することのできる細胞であれば、いずれの細胞であってもよいが、好ましくは実質細胞である。実質細胞とは、組織または器官で、その機能をつかさどる部分となる細胞を意味する。例えば、肝臓の実質細胞は肝細胞であり、肺の実質細胞は肺胞上皮細胞である。このような定義に包含され、本発明の目的に沿う細胞のいずれも、本発明にいう実質細胞である。限定されるものでないが、本願発明での使用が特に強く企図されている実質細胞としては、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、グリア細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞および胚性もしくは成体幹細胞を挙げることができる。しかし、上記の定義に包含される実質細胞以外の非実質細胞であっても、上述のとおり、スフェロイドを形成でき、本発明の目的に沿うものであれば、上記動物細胞に包含される。
を行うことができないか、さらには培養実質細胞も接着し難い性質の表面を作製しうる物質である。このような表面を形成することのできる物質の一部は、例えば、上述の特許文献1に記載されている細胞非親和性または疎生物性(biophobic)の単分子層を形成する物質であることができる。好ましいものとしてはポリエチレングリコール(以下「PEG」という場合あり)部分を含む化合物が挙げられる。ちなみに、該特許明細書には、6個のエチレングリコール単位を有する化合物(例、HS(CH2)11(OCH2CH2)6OH)が具体的に使用されている。
Bは式
Xは水素原子、糖残基またはペプチド残基を表し、
Yは水素原子またはデバイス表面へ、当該ポリマーを結合または付着することのできる官能基を表し、
mは0〜10,000の整数であり、そして
nは10〜20,000の整数である。
L3が原子価結合または−(CH2)r−であり、ここでrは1〜6の整数であることができる。
形成しようとするその下層(培養支持体表面、デバイス表面を直接もしくは間接的に形成する基板、フィルム、塗膜もしくは蒸着膜であることができる)の性質によって、適宜選ぶことができる。例えば、該支持体表面は、一般式(I)のポリマーを確実に付着もしくは結合することができるような表面を有することができる。限定されるものでないが、該支持体表面に、シリコーンが塗布されているかまたは、例えば水酸基を有する表面がシラン処理のような疎水化処理が施されている場合には、一般式(I)のmが0以外で、例えば5以上の整数を表わすブロックコポリマーとなるようにY−L1−(B)−部分を選び、かようなエステルセグメントの疎水性を利用して、該ポリマーを該支持体表面に付着して、親水性物質の表面を形成することができる。かような例では、ポリマーのさらなる付着を強化するために、該エステルセグメントに相当するホモポリマーを予め支持体表面に付着しておき、次いで該ブロックコポリマーを付着させると、剥離等に対して良好な抵抗性を示す親水性物質の表面を作製できる。
場依存性細胞またはフィーダー層作成細胞として内皮細胞または線維芽細胞等を選ぶ培養系では、複数の小領域がこのような間隔で親水性ポリマーの表面領域によって隔離されていると、前記小領域上の培養内皮細胞または線維芽細胞、ならびに培養実質細胞、特に肝細胞スフェロイド相互間で連接または架橋が実質的に起こらない。「連接または架橋が実質的に起こらない」とは、多数あるもののうちの1つの小領域上の培養肝細胞スフェロイドが他の小領域上のそれと形態上接続したものが、10%未満、好ましくは5%未満、より好ましくは0%であることを意味する。
されることなく使用できるが、同種の動物細胞を使用するのが好ましい。かような細胞のうち、細胞の培養も、それ自体既知の培養法(例えば、S.N.Bhatia,et al.,Biotech.Prog.1998、14、378−387参照)によって培養することができる。かような細胞として肝細胞を用いる場合の培養は、通常、少なくとも24時間後には、培養肝細胞スフェロイドが前記小領域上のフィーダー培養細胞層上に形成できる。
する目的で提供するにすぎない。
ホワイトスライドグラス(26×76×0.8mm/Takahashi Giken
Glass Co.,Ltd.)を硫酸/過酸化水素(50/50)で60分間煮沸し、次いで洗浄した後、エタノール/水(95/5)中の2%[3−(メタクリロイルオキシ)プロピル]トリメトキシシラン溶液を用いるシランカップリングにより上記グラス表面を疎水処理した。こうして調製された疎水処理スライドグラス表面に分子量20000のポリラクチドの4%トルエン溶液をスピンコーティングし、次いでアセタール−ポリエチレングリコール(分子量6000)−コーポリラクチド(分子量8000)(以下、アセタール−PEG/PLAという)のアルデヒド化物とアミノフェニルラクトースとの還元アミノ化により得たラクトース−PEG/PLAの2%トルエン溶液を、さらにスピンコーティングし、約100μm厚の高分子層表面を形成した。こうして得られた高分子層表面上にそれぞれ相互に100μm間隔で離れた100μmの円形状の孔をもつマスクパターンを置き、H2+N2のプラズマ処理した[ICP power:500W、Bias power:30W(Vdc=60V)、N2+H2=50sccm/30sccm、2×10−5Torr]。プラズマ処理により、上記マスクパターンに従うガラス表面が露出した孔が形成された(図1参照)。
a)で得た細胞培養床上に血管内皮細胞(Bovine aorti endotherial cell)を1×106cell/cm2にて播種した後、5% CO2雰囲気下、37℃で24時間静置培養した。こうして、露出した孔のガラスパターンに沿って内皮細胞が接着した(図2参照)。次いで、ラット肝臓からコラゲナーゼ灌流法により調製した初代肝細胞を1×106cell/cm2にて播種した後、5% CO2雰囲気下、37℃で24時間静置培養すると、上記パターン状にドメインを形成した内皮細胞の上だけに肝細胞が接着し、スフェロイド状のアレイを形成した(図3参照)。これらの肝スフェロイドは、少なくとも3週間は肝機能(例えば、アルブミン産生能)を維持し、細胞骨格が確認できる(スフェロイドの3次元拡大像については、図5参照)。
上記のようにして得られる、例えば、肝スフェロイドアレイは、それらの肝スフェロイドが長期にわたって肝機能を維持し、また、カルチャーディッシュ1部屋当たり、例えば、数万個の肝スフェロイドを存在せしめることができる(理論上は無制限)ので、1度に数万種の薬物アッセイを行うのに利用できる。また、該アレイから剥離される共培養物、例えば、培養肝スフェロイドは、移植医療、肝再生工学の技術分野で利用できるであろう。したがって、本発明は、薬物の作用を評価するための検査を行う産業、あるいは医療サポート用産業で利用可能である。
Claims (6)
- 支持体上の微細パターン化した複数の小領域上に相互に異なる動物細胞の共培養物が接着した培養細胞構築物であって、
該共培養物の1種が、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、グリア細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選ばれる実質細胞由来の培養細胞から形成されたスフェロイドを含んでなり;
該共培養物のもう1種が、該スフェロイドに接触した下層を形成し、そして内皮細胞または線維芽細胞に由来する培養細胞であり;
該小領域が円形、多角形または楕円形であって、約1,500μm2〜約50,000μm2の面積を有するか、または円形とした場合に約40μm〜約500μmの直径を有し;そして
該小領域の各々が親水性かつ細胞非親和性ポリマーで形成された支持体上の表面で少なくとも約100μm隔離されている、
上記培養細胞構築物。 - 請求項1記載の培養細胞構築物であって、該小領域が直径約50μm〜約200μmの円形である、上記構築物。
- 請求項1記載の培養細胞構築物であって、該小領域が直径約100μmであり、そして該小領域の各々が約100μm隔離されている、上記構築物。
- スフェロイドを形成する細胞が肝細胞である、請求項1〜3のいずれか一に記載の培養細胞構築物。
- 請求項1〜4のいずれか一つに記載の培養細胞構築物で形成された表面を含んでなるバイオデバイス。
- バイオデバイスが、スフェロイドを形成する細胞の毒性を検査するためのデバイス、スフェロイドを形成する細胞の機能を賦活化する物質をスクリーニングするためのデバイス、スフェロイドを形成する細胞不全の医療サポート用デバイスおよび実質細胞の生理作用の模擬試験をするためのデバイスからなる群より選ばれる請求項5記載のバイオデバイス。
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