JPWO2007126127A1 - 細胞培養容器およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器およびその製造方法を提供すること。本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹部は、細胞培養部と、前記細胞培養部に連通したマイクロ流路とを備え、前記細胞培養部の底面幅が培養細胞の相当直径の１．０倍〜２０倍であり、前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞接着誘導物質が形成されたものである。

Description

本発明は、細胞培養容器およびその製造方法に関する。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。

単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるｉｎ ｖｉｖｏ試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットワークを構築できることが必要とされる。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率および増殖速度の向上が望まれている。

上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートまたはシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。

しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となる。また、細胞培養容器の表面にランダムに配置されるため、細胞間のネットワークは、複雑に交錯して形成される。そのため、生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。この理由として、ウェルサイズを小口径にしても、細胞サイズは数μｍ〜数１０μｍであるため、平板上での培養と変わらないこと、ピペット等を用いて細胞を配置する際、培養液によって細胞が移動するため、規則正しく配置できないこと等が考えられる。

上記問題を解決するため、細胞接着誘導物質であるポリリジンなどを、所望するパターン通りに細胞が培養される面に被覆する方法が開示されている（特許文献１参照）。
特開２００４−８１７３号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、細胞が培養される面全体にポリリジンを被覆した後、線幅２０μｍの金属メッシュをマスクとしてその上に重ね、紫外線を照射し、洗浄後に紫外線が照射されていない２０μｍのパターンを得る。そのため、１枚のプレートの製造ごとに複雑な工程が必要となり、高コストとなる問題があった。また、１枚ごとに紫外線を照射し、微細なポリリジンパターンを製造するため、金属メッシュとポリリジンの隙間、紫外線照射条件、洗浄条件により、ポリリジンパターンが安定して製造できない問題もあった。

本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器、その製造方法および細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹部は、細胞培養部と、前記細胞培養部に連通したマイクロ流路とを備え、前記細胞培養部の底面幅が培養細胞の相当直径の１．０倍〜２０倍であり、前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞接着誘導物質が形成されたものである。

本発明にかかる細胞培養容器の製造方法は、細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器の製造方法であって、前記凹凸パターンの凹部により構成される、細胞培養部及び前記細胞培養部に連通したマイクロ流路を形成するステップと、毛細管現象により前記凹部のみに細胞接着誘導物質を導入するステップとを備えるものである。

本発明によれば、生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器および細胞培養方法を提供することができる。

本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。 図１Ａの断面図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器のＳＥＭ写真である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 比較例２にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 図４Ａの破線円内の拡大図である。 図４Ｂの断面図である。 本発明の実施例１にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 図５Ａの破線円内の拡大図である。 図５Ｂの断面図である。 本発明の実施例２にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 図６Ａの破線円内の拡大図である。 図６Ｂの断面図である。 本発明の実施例３にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 図７Ａの破線円内の拡大図である。 図７Ｂの断面図である。 本発明の実施例４にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 図８Ａの破線円内の拡大図である。 図８Ｂの断面図である。 図８Ｂの断面図である。 比較例２において、１０日間培養後の褐色細胞腫（ＰＣ１２）の写真である。 実施例１において、１０日間培養後の褐色細胞腫（ＰＣ１２）の写真である。 実施例１において、１０日間培養後の褐色細胞腫（ＰＣ１２）の写真である。

符号の説明

１ マイクロ流路
２ 交差部
３ 凸部
４ マイクロ容器
５ 導入領域
１１ 基板
１２ 第１レジスト層
１３ マスクＡ
１４ 第２レジスト層
１５ マスクＢ
１６ レジストパターン
１７ 導電性膜
１８ 金属構造体
１９ 樹脂製成型品

本発明者らは、鋭意研究した結果、プレート、シャーレ等の細胞培養容器において、細胞が培養される面（以下、培養面という）に所望の寸法のマイクロ流路を形成し、そのマイクロ流路に、毛細管現象を利用して、細胞接着誘導物質含有液を導入することにより、細胞の培養密度を高め、生体内での細胞機能を再現するのに最適な細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について説明する。

通常、細胞の培養試験では、細胞の接着・増殖を促進するため、培養面全体に、コラーゲン、ラミニン、ポリリジン等の細胞接着誘導物質を被覆し、細胞を配置する。そのため、細胞は、培養される面全体にランダム配置され、規則正しく配置できない。
ランダムに配置され、増殖した細胞は、近隣の細胞や１００μｍ以上離れた細胞との間で、無秩序で複雑かつ多数の細胞間ネットワークを形成する。したがって、例えば、蛍光プローブを用いて細胞間の信号伝達を観察する場合、容器内の細胞は、蛍光プローブにより一様に染色されてしまう。また、信号伝達に必要なネットワーク径が細くなり、蛍光強度も小さくなる。そのため、ネットワーク内信号伝達を介した秩序統制機構を解明することができない。

本発明にかかる細胞培養容器には、培養面にマイクロ流路が形成されている。そして、毛細管現象を利用して、細胞接着誘導物質をそのマイクロ流路に導入し、乾燥すれば、容易に、培養面の所定の部位のみに細胞接着誘導物質を被覆することができる。そのため、細胞は所定の部位のみに接着し、増殖する。その結果、ロジック回路のように、秩序ある細胞間ネットワークが形成される。すなわち、生体組織を再現した信号伝達モデルを実現でき、培養した細胞を用いた信号伝達過程の研究に適用できる。同様に、薬剤感受性、毒性試験でも、その信号伝達過程の研究に適用できる。ネットワーク経路が制御できるため、ネットワーク径が太くなり、蛍光強度も向上する。このため、信号伝達過程を容易に観察できる。また、将来的には、ホモ培養、ヘテロ培養または毛細血管細胞シート等と組み合わせることによって、再生医療分野への展開が期待できる。

実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載および図面は、適宜、簡略化されている。
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図１Ａ、図１Ｂおよび図２を用いて説明する。図１Ａは、実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図１Ｂは、図１Ａの断面図、図２は、ＳＥＭ写真（斜視図）である。

細胞培養容器の培養面には、図１Ａに示すように、複数のマイクロ流路１が網目状に形成されている。換言すれば、矩形状の凸部３に囲まれた領域がマイクロ流路１である。矩形状の凸部３の４つの頂点は角がＲ加工されたように丸みを帯びた形状であるが、完全な矩形や面取りされたような形状でもよい。凸部３の側壁は底面に対して略垂直に形成されている。このマイクロ流路１に細胞接着誘導物質含有液を導入し、乾燥することにより、マイクロ流路上に細胞誘導物質を被覆する。細胞培養では、マイクロ流路１の交差部２に細胞が配置・固定され、マイクロ流路１に沿って、細胞のネットワークが形成される。

培養面に形成されるマイクロ流路１の幅は、培養細胞の相当直径の０．１倍〜１０倍であることが好ましい。具体的数値としては、幅２μｍ〜５００μｍが好ましく、５μｍ〜４００μｍの範囲がより好ましい。２μｍよりも小さい、または５００μｍよりも大きいと、毛細管現象により細胞接着誘導物質含有液を導入することが困難となる。そのため、制御されたネットワーク形成が困難となる。流路の幅が２００μｍよりも大きくなると、細胞が複数配置され、細胞を培養する容器の役割を兼ねることになる。マイクロ流路１内に細胞が複数配置されても、マイクロ流路１に沿ってネットワークが形成されるため、細胞間の信号伝達等の研究に用いることはできる。また、細胞培養部である交差部２の幅は培養細胞の相当直径の１．０倍〜２０倍であることが好ましい。

マイクロ流路１の深さ（側壁の高さ）は、培養細胞の相当直径の０．１倍〜１０倍であることが好ましい。具体的数値としては、２μｍ〜５００μｍが好ましく、５μｍ〜４００μｍの範囲がより好ましい。２μｍよりも浅いと、毛細管現象により細胞接着誘導物質含有液を導入することが困難となり、５００μｍよりも深いと、製造技術上での難易度が増し、高コストとなる。

対向するマイクロ流路１同士の間隔は、縦・横いずれも５μｍ〜１５０ｍｍが好ましく、１０μｍ〜１００ｍｍがさらに好ましい。５μｍ未満では、細胞がネットワークを形成しなくても近接でき、細胞間の活動電位伝達に関する研究等には適さなくなる。１５０ｍｍを超えると、細胞の走査機能を観察することが困難になる。

細胞が培養される面に、細胞接着誘導物質含有液を導入するには、例えば、ピペット等を用いてマイクロ流路１の端部に注入することもできるが、マイクロ流路の少なくとも１つと連通する凹部からなる導入領域５を設けて、そこに細胞接着誘導物質含有液を滴下するのが、操作が簡便になり好ましい。マイクロ流路１の深さは、細胞接着誘導物質含有液のマイクロ流路１への均一な導入を促進するために、段階的に深くしてもよい。

細胞が培養される面におけるマイクロ流路１の交差部２にマイクロ容器を設けることにより、さらに高度な細胞ネットワークを構築することもできる。例えば、マイクロ流路１の幅を１０μｍ、マイクロ容器の幅を直径４０μｍとした場合、細胞は流路に入れないため、マイクロ容器に配置される。そして、マイクロ流路１に沿ってネットワークが形成される。マイクロ容器の幅または直径は、５μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜５００μｍの範囲がより好ましい。５μｍよりも小さいと、細胞を配置することが困難となり、１０００μｍよりも大きいと、複数の細胞が一マイクロ容器内で無秩序に接着し、ネットワーク形成を意図したパターンに誘導できなくなる。

本発明にかかる細胞培養容器を適用できる細胞種は限定されないが、特に、ラットやマウスの神経細胞、褐色細胞腫（ＰＣ１２）等の神経突起部からネットワークを形成する細胞種が特に好適である。

透過光観察を可能にするため、樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長３００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率を８０％以上、ヘイズ値を１０％以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いるか、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物に、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。

蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光（励起光）は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できない。したがって、高い光透過性が要求される。蛍光（蛍光放射光）を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率８０％以上、ヘイズ値１０％以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、結晶性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好ましい。

自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルから発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。

自家蛍光の影響を受けないためには、波長２３０ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。

微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。

細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、微細な突起への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法がある。また、一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることができる。

スパッタリング法、蒸着法等の無機膜形成法は、油浸レンズ観察法への適用もできる。通常、油浸レンズに用いるオイルには、細胞を培養するガラスプレートおよび光学レンズと光学物性を適合させるため、有機溶剤が配合されている。有機溶剤は、樹脂製細胞培養容器に浸透し、白化や溶解の問題を発生させるため、適用できない可能性がある。無機材料は、ガスバリヤー効果と同時に、耐有機溶剤性を有するため、油浸レンズのオイルが接触する細胞培養容器の底面に、無機膜を形成することで、油浸レンズ観察法への適用も可能となり、樹脂製細胞培養容器の適用範囲を広げることができる。透過光観察を行う場合、膜厚を４００ｎｍ以下とするか、ＳｉＯ_２等の透明無機材料を用いることが好ましい。

上記の複数のマイクロ容器を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ容器に相当するマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂プレートを形成するステップとを備える。

本方法により得られるマイクロ流路およびマイクロ容器は、原盤となる金属構造体のパターンを転写することにより樹脂プレートを形成するため、高い寸法精度と低コストを両立できる。また、そのマイクロ流路に、毛細管現象を利用して、細胞接着誘導物質を導入すればよいため、細胞接着誘導物質を形成するための複雑なパターンニングプロセスが不要である。

詳細には以下の通りである。
（ｉ）基板上への第１レジスト層の形成
（ｉｉ）基板とマスクＡとの位置合わせ
（ｉｉｉ）マスクＡを用いた第１レジスト層の露光
（ｉｖ）第１レジスト層の熱処理
（ｖ）第１レジスト層上への第２レジスト層の形成
（ｖｉ）基板とマスクＢとの位置合わせ
（ｖｉｉ）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光
（ｖｉｉｉ）第２レジスト層の熱処理
（ｉｘ）レジスト層の現像
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
（ｘ）さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより堆積させる。
（ｘｉ）この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する
ことによって、細胞培養容器が製造される。（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の工程は任意であり、省略できる。一方、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の工程を複数回繰り返すこともできる。

レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの構造体を得ようとした場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。

光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。

光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。

（ｉ）基板１１上への第１レジスト層１２の形成について説明する。
図３Ａに基板１１上に第１レジスト層１２が形成された状態を示す。成形品形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、基板１１上へ第１レジスト層１２を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板上に第１レジスト層を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。

基板１１上に第１レジスト層１２を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。

第１レジスト層１２として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、ＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好ましい。

第１レジスト層１２として用いるレジストがウェットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。

例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。

第１レジスト層１２にポジ型レジストを用いた場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。

（ｉｉ）基板１１とマスクＡ１３との位置合わせについて説明する。
第１レジスト層１２のパターンと、第２レジスト層１４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクＡ１３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板とマスクＡの同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板１１とマスクＡ１３の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、マスクＡにはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。

（ｉｉｉ）マスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光について説明する。
図３Ｂに示される工程で用いるマスクＡ１３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、用いるマスクＡ１３によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、樹脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクＡ１３の寸法、および精度を規定する必要がある。マスクＡ１３の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスクＡ１３のパターン形成に用いるレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクＡ１３製作費が高額となるため、樹脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。

マスクＡ１３の材質は温度膨張係数、ＵＶ透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、第１レジスト層１２および第２レジスト層１４の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを用いたシミュレーションもその解決策の一つである。

露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。

露光時間や露光強度等の露光条件は第１レジスト層１２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。

（ｉｖ）第１レジスト層１２の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガレジストを用いた場合のみに行う。化学増幅系ネガレジストとは、主に、２成分系または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。

第１レジスト層１２の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層１４の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。

（ｖ）第１レジスト層１２上への第２レジスト層１４の形成について説明する。
図３Ｃに第２レジスト層１４が形成された状態を示す。この第２レジスト層１４の形成は、上記（ｉ）において説明した第１レジスト層１２の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層１２と第２レジスト層１４の現像終了時、第２レジスト層１４のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。

（ｖｉ）基板１とマスクＢ１５との位置合わせについて説明する。
基板１とマスクＢ１５との位置合わせは、上記（ｉｉ）について説明した、基板１とマスクＡ１３との位置合わせと同様の方法による。

（ｖｉｉ）マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光について説明する。
マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光は、上記（ｉｉｉ）において説明したマスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光と同様の方法による。図３Ｄに第２レジスト層１４の露光の様子を示す。

（ｖｉｉｉ）第２レジスト層１４の熱処理について説明する。
第２レジスト層１４の熱処理は、上記（ｉｖ）において説明した第１レジスト層１２の熱処理と同様の方法による。また、第２レジスト層１４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層１２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層１４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。

（ｉｘ）レジスト層１２および１４の現像について説明する。
図３Ｅに示す現像工程では、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン１６が形成される。

細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で用いるレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。

なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することができる。

（ｘ）金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン１６に沿って金属を堆積させ、金属構造体１８のマイクロ空間構造面をレジストパターン１６に沿って形成することにより、金属構造体１８を得る工程である。

図３Ｆに示すように、この工程では予めレジストパターン１６に沿って導電性膜１７を形成する。導電性膜１７の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜１７に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。

図３Ｇに示すように、導電性膜１７を形成した後、レジストパターン１６に沿って金属をメッキにより堆積させ、金属構造体１８を形成する。メッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。

金属構造体１８はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体１８はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体１８の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。メッキにより堆積した金属構造体１８はレジストパターン１６から分離される。

（ｘｉ）成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図３Ｈに示すように、前記金属構造体１８を型として、樹脂成形品１９を形成する工程である。樹脂成形品１９の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体１８を型として射出成形で樹脂成形品１９を形成する場合、金属構造体１８の形状を高い転写率で樹脂成形品１９に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を用いる方法がある。

樹脂成形品１９の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂成形品１９の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。

以下に、本発明にかかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、細胞培養容器のマイクロ流路の寸法を変量し、ラット脳海馬神経細胞および褐色細胞腫（ＰＣ１２）のネットワーク構築度合および細胞興奮性を評価したものである。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計（型式：ＨＡ−ＴＲ）を用いて測定した。具体的には、全光線透過率をＪＩＳ Ｋ６７１４に準拠した方法で２回測定し、その平均値を求めた。また、蒸着膜の厚さは、株式会社アルバック製の表面形状測定器（ＤＥＫＴＡＫ３０３０）による触針法にて測定した。

細胞接着誘導物質の導入方法は以下の通りである。比較例の場合、細胞を培養する面を細胞接着誘導物質含有液に浸した後、６時間乾燥した。実施例の場合、ピペットを用いて細胞接着誘導物質含有液を導入領域５に滴下し、毛細管現象により、マイクロ流路およびマイクロ容器の側壁、低部のみに導入した後、６時間乾燥した。細胞接着誘導物質含有液は、脳海馬神経細胞ではポリリジン＋ラミニン、褐色細胞腫ではコラーゲンＩを用いた。

散布した細胞数は、いずれの細胞も２．０×１０^４個とした。脳海馬神経細胞では、細胞散布後１０日間培養した。ＰＣ１２細胞では、細胞散布２日後に神経成長因子を添加し、その後１０日間培養した。

細胞のネットワーク構築度合は、株式会社ニコン製の倒立顕微鏡（ＴＥ２０００−ＰＦＳ）を用いて観察した。ネットワーク構築度合を、○（ネットワーク構築）、△（一部構築）、×（ランダムネットワーク）に分類し、評価した。

細胞のネットワーク構築における活動状態（細胞興奮性）については、Ｄｏｊｉｎｄｏ社のＣａ^２＋感受性蛍光色素（型式：Ｆｌｕｏ−４）を用いて細胞内Ｃａ^２＋動態を測定・解析した。解析には、浜松ホトニクス株式会社製のレシオイメージングシステム（ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ／ＲＡＴＩＯ）を用い、ネットワークにおける染色性の違いにより、０、１＋〜４＋の等級に分類し、評価を行った。

［比較例１］
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ（φ９０ｍｍ−深さ２０ｍｍ）を用いた。
光学物性値は、全光線透過率８４％、ヘイズ値４．３％であった。

［比較例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、図４Ａに示す、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図４Ｂおよび（ｃ）に示す縦・横５０μｍ、深さ３０μｍの複数のマイクロ容器４を有するプレートを作製した。マイクロ容器４同士の間隔は縦・横いずれも１５μｍである。図４Ｂは、図４Ａにおける点線で示した円内の拡大図であって、比較例２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。図４Ｃは図４Ｂの断面図である。
次に、マイクロ容器への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック製の蒸着装置（ＵＥＰ）を用い、厚さ０．２μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。その後、滅菌した。
光学物性値は、全光線透過率８３％、ヘイズ値８．２％であった。

［実施例１］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、図５Ａに示す、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図５Ｂおよび（ｃ）に示す、幅２０μｍ、深さ３０μｍ、縦横いずれも間隔（凸部３の幅）１８０μｍのマイクロ流路１および細胞接着誘導物質含有液の直径４ｍｍの導入領域５を２つ有するプレートを作製した。導入領域５はマイクロ流路１よりも一段低く、凹部となっている。図５Ｂは、図５Ａにおける点線で示した円内の拡大図であって、実施例１にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。図５Ｃは図５Ｂの断面図である。
次に、マイクロ流路１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。その後、滅菌した。
光学物性値は、全光線透過率８７％、ヘイズ値９．７％であった。

［実施例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、図６Ａに示す、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図６Ｂおよび（ｃ）に示す、幅２０μｍ、深さ５０μｍ、縦横いずれも間隔（凸部３の幅）２８０μｍのマイクロ流路１および細胞接着誘導物質含有液の直径４ｍｍの導入領域５を２つ有するプレートを作製した。導入領域５はマイクロ流路１よりも一段低く、凹部となっている。また、２つの導入領域５を中心に凹部が十字状に形成され、細胞接着誘導物質含有液がプレート全体に充満しやすくなっている。図６Ｂは、図６Ａにおける点線で示した円内の拡大図であって、実施例２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。図６Ｃは図６Ｂの断面図である。
次に、マイクロ流路１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。その後、滅菌した。
光学物性値は、全光線透過率８８％、ヘイズ値５．２％であった。

［実施例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、図７Ａに示す、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図７Ｂおよび（ｃ）に示す、幅２５μｍ、深さ５０μｍ、縦横いずれも間隔（凸部３の幅）２７５μｍのマイクロ流路１および細胞接着誘導物質含有液の４ｍｍ×２０ｍｍの導入領域５を２つ有するプレートを作製した。導入領域５はマイクロ流路１よりも一段低く、凹部となっている。図７Ｂは、図７Ａにおける点線で示した円内の拡大図であって、実施例３にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。図７Ｃは図７Ｂの断面図である。
次に、マイクロ流路１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。その後、滅菌した。
光学物性値は、全光線透過率８９％、ヘイズ値４．２％であった。

［実施例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、図８Ａに示す、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図８Ｂおよび（ｃ）に示す、幅１０μｍ、深さ３０μｍ、縦横いずれも間隔（凸部３の幅）１９０μｍのマイクロ流路１および細胞接着誘導物質含有液の直径１０ｍｍの導入領域５を１つ有し、さらに、マイクロ流路１の交差部２に直径４０μｍ、深さ２０μｍのマイクロ容器４を有するプレートを作製した。導入領域５はマイクロ流路１よりも一段低く、凹部となっている。また、導入領域５を中心に凹部が十字状に形成され、細胞接着誘導物質含有液がプレート全体に充満しやすくなっている。図８Ｂは、図８Ａにおける点線で示した円内の拡大図であって、実施例４にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。図８Ｃは図８ＢのＶＩＩＩＣ−ＶＩＩＩＣ断面図、図８Ｄは図８ＢのＶＩＩＩＤ−ＶＩＩＩＤ断面図である。図８Ｄに示すように、マイクロ容器４は、マイクロ流路１の下側に位置するため、細胞接着誘導物質含有液はマイクロ容器４へ容易に導入される。
次に、マイクロ流路１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。その後、滅菌した。
光学物性値は、全光線透過率８９％、ヘイズ値６．５％であった。

以上の比較例および実施例についての、ラット脳海馬神経細胞および褐色細胞腫（ＰＣ１２）の培養結果を表１にまとめて示す。

マイクロ流路１を有さない比較例の場合、細胞は規則性のあるネットワークを構築できなかった。また、ネットワーク径が細いため、細胞興奮性も、実施例と比較して低い。マイクロ容器４のみを備える比較例２では、細胞接着誘導物質が培養面全体に被覆された結果、細胞がマイクロ容器の壁を乗り越えて、ランダムにネットワークを形成した。図９に、比較例２の細胞培養容器で１０日間培養後の褐色細胞腫（ＰＣ１２）の顕微鏡観察写真を示す。

一方、実施例では、マイクロ流路１を有することで、毛細管現象により、マイクロ流路１のみに細胞接着誘導物質含有液が導入されたため、細胞が、マイクロ流路１の壁を乗り越えることなく、高度にネットワークを形成できる。マイクロ流路１の深さは、実施例２の３０μｍよりも深くすることで、確実に流路のみに細胞接着誘導物質を導入でき、より完成度の高いネットワークを構築できる。また、ネットワーク径が太くなるため、細胞興奮性も、比較例に比べ高い。また、実施例は、透明性、ネットワーク構築および細胞興奮性すべてにおいて優れており、透過光での細胞観察用途に特に適している。図１０に、実施例１の細胞培養容器で１０日間培養後の褐色細胞腫（ＰＣ１２）について、顕微鏡観察写真（図１０Ａ）および細胞内蛍光プローブによるＣａ^２＋由来の蛍光イメージ（図１０Ｂ）を示す。

本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。

Claims (10)

1. 細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、
   前記凹凸パターンの凹部は、細胞培養部と、前記細胞培養部に連通したマイクロ流路とを備え、
   前記細胞培養部の底面幅が培養細胞の相当直径の１．０倍〜２０倍であり、
   前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞接着誘導物質が形成された細胞培養容器。
2. 前記細胞接着誘導物質を前記凹凸パターンの凹部に導入するための、前記マイクロ流路の少なくとも１つと連通する凹部からなる導入領域を備えることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 前記凹部の底面及び側壁が表面処理をされ、その上に細胞接着誘導物質が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
4. 前記表面処理は親水化処理であることを特徴とする請求項３記載の細胞培養容器。
5. 前記側壁の高さが培養細胞の相当直径の０．５倍〜１０倍であることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の細胞培養容器。
6. 前記マイクロ流路の底面幅が培養細胞の相当直径の０．１倍〜１０倍であることを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載の細胞培養容器。
7. 少なくとも前記細胞が配置される凹凸パターン領域が透明であることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の細胞培養容器。
8. 細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器の製造方法であって、
   前記凹凸パターンの凹部により構成される、細胞培養部及び前記細胞培養部に連通したマイクロ流路を形成するステップと、
   毛細管現象により前記凹部のみに細胞接着誘導物質を導入するステップとを備える細胞培養容器の製造方法。
9. 前記凹部を表面処理し、その上に細胞接着誘導物質を導入することを特徴とする請求項８記載の細胞培養容器の製造方法。
10. 前記表面処理は親水化処理であることを特徴とする請求項９記載の細胞培養容器の製造方法。