CN102203241A

CN102203241A - 细胞保存方法和细胞运输方法

Info

Publication number: CN102203241A
Application number: CN200980142214.XA
Authority: CN
Inventors: 一丁田洋子; 田崎刚; 福田始弘; 鹤田仁志; 谷口英树
Original assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Kuraray Co Ltd
Current assignee: Yokohama City University; Corning Inc
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-10-23
Also published as: KR20110073589A; EP2345714A1; WO2010047133A1; EP2345714B1; EP2345714A4; KR101746864B1; CN102203241B; JP5676265B2; US20110207215A1; JPWO2010047133A1

Abstract

本发明提供以维持活细胞的功能的状态保存活细胞的细胞保存方法。细胞保存方法的一个方式是使用具有多个微容器（11）的细胞培养容器（20）来保存活细胞（40）的方法，其中，使活细胞粘附于多个微空间的表面来进行培养，在培养后，将培养基（50）向细胞培养容器（20）注入，以覆盖多个微容器（11）。在适当大小的细胞培养容器中粘附活细胞，进行培养，形成三维结构体，由此可以以维持活细胞的三维结构体、且维持功能的状态保存活细胞。

Description

细胞保存方法和细胞运输方法

技术领域

本发明涉及保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。

背景技术

将从组织分离出的细胞用于试验、检验的方法，是生物技术相关领域中不可欠缺的方法。其广泛用于疾病、病情的诊断、新药的探索和药效的判定、或者动物检验、植物检验、环境污染物质的试验等。因此，在生物技术领域中使用的细胞类别极其多样化。

分离得到的细胞也有直接用于试验的情况，但多数情况下是在培养皿或试管中进行细胞培养。使用该培养细胞，进行各种检验。对于用于细胞培养试验的细胞培养株，要求其表现与在生物体内的试验、即所谓体内（in vivo）试验同样的药物感受性、毒性反应。即，需要在细胞培养容器的表面能够构筑有规则性地排列的细胞间的网络。另外，由于在细胞培养试验中使用的细胞培养株极为昂贵，因此期望提高细胞的生存率和增殖速度。

上述细胞培养试验是在同一条件下，以将评价的药物等的量、浓度等为变量，测定其效果。因此，细胞培养容器的材质、形状等也需要相同。作为该细胞培养容器，一般使用塑料制平皿、玻璃制平皿、固定在容器内的玻璃板、孔板等。孔板有6孔、12孔、48孔、96孔的各板或平皿。它们一般与整个板的大小几乎相同，孔数越大，1个孔的尺寸越小。该1个孔相当于1个培养皿。另外，由于最近的微量化的趋势，因此也开始使用包含更小口径且多量的培养皿的384孔板。这些培养皿的底部是平坦的平板状，使用该底面作为培养面。

但是，在组织细胞的培养中，如果使用现有的细胞培养容器，则细胞薄薄地铺展，形成没有方向性的形态。另外，由于在细胞培养容器的表面无规则地配置，因此细胞间的网络复杂地交织而形成。因此，存在不能重现在生物体内的细胞功能的问题。例如，不能形成在肝细胞中维持肝功能的已知的球体状的肝细胞团。

为了解决上述问题，公开了在平板状的培养面将特殊的高分子固定化的方法(参考专利文献1)、使用特殊的装置的方法(参考专利文献2)、在高分子凝胶中进行培养的方法(参考专利文献3)等。

但是，在专利文献1记载的方法中，存在固定化方法繁杂、不能稳定地制造、且成本高的问题。另外，在专利文献2记载的方法中，无论培养方法的复杂，仍存在细胞团的形成效率差，成本高等的问题。在专利文献3的方法中，有不能控制细胞团的大小、另外基板的操作性繁杂等的问题。这样，这些方法都繁杂，不能稳定地制造，且成本高。

专利文献1: 日本专利第3177610号公报

专利文献2: 日本特开平7-79772号公报

专利文献3: 日本特开平8-308562号公报。

发明内容

从生物体分离的活细胞期望在与生物体同样的环境下保存。例如，当保存非冷冻的肝细胞时，在平面状的培养板粘附肝细胞，装满培养基，置于保温(例如25~37℃)状态下进行保存。但是，当在平面上培养细胞时，与生物体内的环境大为不同，因此存在使细胞具有的原本的功能丧失的问题。另外，由于培养中或保存中的环境要素、例如振动、温度、CO₂浓度(培养基的pH的变化)等，有细胞的功能进一步降低这样的问题。

另外，如果用专利文献1或专利文献2公开的方法保存培养的细胞，则在发生振动等时，有由细胞的剥离或凝胶的损坏导致细胞凋亡等的担心。因此，难以在维持活细胞的三维结构体的状态下直接保存而运输，难以在离开分离位置的位置利用。另一方面，从组织分离细胞的机制与进行试验、检验的机制有许多不同，因而期望在不降低分离的细胞的功能的情况下进行保存、运输。

本发明是为了解决这种问题而作出的发明，其目的在于提供在维持细胞功能的状态下保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。

本发明的细胞保存方法的一种方式是使用具有多个微空间的细胞培养容器来保存活细胞的细胞保存方法，使活细胞粘附在上述多个微空间的表面来进行培养，在上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间，将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出，进行保存。在微空间的表面粘附活细胞，使用适于培养的微空间进行培养，在各微容器内形成三维结构体，利用微容器隔离三维结构体后，进行密封并保存，由此能够以维持功能的状态保存活细胞。

另外，上述细胞培养容器优选保持在4℃以上且小于37℃的温度、来保存上述活细胞。进一步地，优选进行培养，以使粘附于上述表面、且在各微空间的空间内形成的三维结构体的细胞群体形成被隔离的细胞数。通过使用微空间，可以防止在各微空间培养的活细胞与其他微空间的活细胞接触。

上述多个微空间优选底部面积为0.01~0.1mm²、深度为25~150μm，另外，上述活细胞是肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者，或者更优选由组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者分化的、肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、和骨细胞中的任一者。

更优选在上述培养后，除去非粘附细胞后将上述培养基向上述细胞培养容器注入，上述活细胞的培养优选在使活细胞粘附并培养后，可以进一步进行培养，使其增殖、铺展或者聚集。

更优选以1×10²~1×10⁶细胞/cm²的细胞接种密度将活细胞接种到上述多个微空间中，更优选细胞接种密度为1×10⁴~1×10⁶细胞/cm²。在上述多个微空间中，优选形成活细胞集聚的细胞团，更优选上述细胞团的直径为30~200μm。

上述培养基更优选下述情况中的至少一种，即，含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一种，和使用可透过氧或二氧化碳的膜来密封上述细胞培养容器。

另外，本发明的细胞运输方法的一种方式是将活细胞保存在具有多个微空间的细胞培养容器中并运输的细胞运输方法。该运输方法首先使活细胞粘附在上述多个微空间的表面来培养。上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间。然后，将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出。并且，使用车辆、船舶或者航空器中的任一种运输装置将密封的上述细胞培养容器进行运输。利用该细胞运输方法，能够以维持活细胞的功能的状态进行运输。另外，上述细胞培养容器优选保持在4℃以上且小于37℃的温度。

根据本发明，可以提供以维持细胞功能的状态保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。

附图说明

图1是表示实施方式的细胞培养容器的构成的平面图。

图2是表示实施方式的细胞培养容器的构成的II-II截面图。

图3是表示实施方式的细胞培养容器的其他的构成的平面图。

图4是表示实施方式的细胞培养容器的其他的构成的IV-IV截面图。

图5是表示实施方式的细胞培养容器的进而其他的构成的平面图。

图6是表示实施方式的细胞培养容器的进而其他的构成的VI-VI截面图。

图7是表示使用图5和图6所示的细胞培养容器培养细胞并进行密封的状态例的图。

图8A是表示实施例06的结果的照片。

图8B是表示实施例07的结果的照片。

符号说明

10、20 细胞培养容器

11 微容器

12 侧壁

13 开口部

23 处所（スポット）

24 处所的侧壁

30 密封装置

40 活细胞

50 培养基。

具体实施方式

本发明的细胞保存方法的一种方式是，使用适于活细胞培养的细胞培养容器，使活细胞粘附于微容器进行培养，在微容器内形成三维结构体，培养后在细胞培养容器中装满培养基进行保存。微容器使活细胞的三维结构体形成、另外维持其结构。另外，微容器将在内部形成的活细胞的三维结构体与其他的活细胞的三维结构体隔离。因此，培养活细胞的微容器需要使用合适的微容器。用于该保存的细胞培养容器例如可以使用以下的容器。

在细胞培养容器中形成凹凸格局、即多个微容器。由此，可以进行与生物体内同样的立体性的细胞生长，而且在各微容器内，可无差异地使细胞以聚集的形态培养。另外，对于微容器，例如通过将使微容器分隔的侧壁(凸部)的高度最优化，可以将聚集的活细胞(例如肝细胞团)仅在微容器内培养。其中，微空间是通过微容器形成的空间，更具体地，是指通过在平面上形成的凹凸格局而形成的空间。在以下的说明中，微容器和微空间没有特别地区分。

由侧壁围住的微容器的尺寸需要是用于培养细胞的最佳范围。如果微容器的底部面积过于大，则与在平板上的培养同样，细胞浅浅地铺展，不能形成立体结构。另一方面，如果微容器的底部面积过小，则不能收纳细胞。因此，空间的尺寸根据培养的细胞种类，优选是可收纳一个或多个的范围。例如，当形成多个细胞集聚的肝细胞团时，优选为可收纳该肝细胞团的范围。

为了不使在微容器中培养的细胞向相邻的微容器转移，侧壁的高度需要为最佳的范围。如果侧壁的高度过低，则细胞越过侧壁，不适于培养。如果侧壁的高度过高，则难以制作，而且物质扩散变难，培养环境恶化。因此，侧壁的高度根据细胞种类，优选是将配置在微容器内的培养细胞在该微容器内稳定地持续培养的范围。

另外，通过形成在侧壁设置开口部、将多个微容器连通的结构，可以高效地向细胞供给氧或营养成分以及从细胞中除去废物。应予说明，根据培养的细胞种类，适当设定侧壁的高度、微容器尺寸、开口部的宽度，由此也可以适用于多种的培养体系。

另外，本说明书中，活细胞是指从生物体组织分离出的细胞(原代培养细胞)的未经传代的细胞。另外，活细胞含有冷冻细胞和新鲜细胞这2种。另外，含有所有的株化细胞、其他的ES细胞(Enbryonic Stem Cells)等。新鲜细胞是指原代培养细胞未经冷冻过的细胞。

实施方式

以下，对于本发明的实施方式进行说明。其中，本发明不应限于以下实施方式。另外，为了清楚地说明，以下的记载和图适当地进行简略化。

首先对于在实施方式的细胞保存方法中使用的细胞培养容器进行说明，接着对于细胞保存方法进行说明。首先使用图1、2说明细胞培养容器的构成例。图1是表示本实施方式的细胞培养容器的构成的平面图，图2是图1的II-II截面图。如图1所示，细胞培养容器10具备微容器11、侧壁12、开口部13。在细胞培养容器10的培养面，多个侧壁形成为网眼状，被该侧壁12包围四周的空间形成了微容器11。另外，在各微容器11的四边形成的侧壁12的各边的中央部，形成开口部13。

图1中，表示了微容器11的底部的宽度a、用于划分微容器11的侧壁12的宽度b、高度c、用于使相邻的微容器11相互连通的开口部13的宽度d。本发明的底部面积是指，在与微容器开口水平面(与侧壁12上面为同一面)垂直的方向上、从上方向容器底部照射平行光时的投影面积。例如，当微容器的底部为U字形状时，从与其开口面为垂直方向的上方射向底部的平行光所投影的形状形成底部面积。对于投影底部的长径和短径，当为圆和椭圆时，将通过其重心的长轴和短轴与圆周的交点在各轴上的距离作为长径和短径，当为多角形时，是指与该多角形的面积之差最小且通过各顶点的外接圆或外接椭圆的长径和短径，当不能描绘通过各顶点的外接圆或外接椭圆时，是指通过最多顶点的近似圆或椭圆的长径和短径。

微容器11的底部形状没有特别地限定，除了正方形、圆、多角形以外还可以采用多种形状。在再现在生物体内的肝功能的细胞培养中，该底部面积优选为0.01mm²～0.1mm²。另外，优选底部的长径为短径的1～1.5倍。进一步地，优选为等方的形状，如果是正方形，则例如形成当量直径为100μm的肝细胞团时，优选一边的长度为100μm～300μm。

微容器11的水平面与侧壁12形成的角度必须是使细胞不越上（乗り上げ）的角度，因此优选从侧面的上部起50%以上的部分为80º～90º，特别优选85º～90º。

侧壁12的高度c只要不使在微容器11中培养的细胞越上并向相邻的微容器11转移即可，例如当形成当量直径为100μm的肝细胞团时，优选为50μm～150μm。

用于使相邻的微容器11相互连通的开口部13的宽度d，只要是使培养细胞不能从最初接种的微容器11向相邻的微容器11转移的程度即可。例如，如果培养细胞的当量直径为20μm，则优选为5～15μm。应予说明，开口部13不是必须的，如图3和图4所示，微容器11的四边也可以被侧壁12完全地围住。其中，图3是表示本实施方式的其他的细胞培养容器的构成的平面图，图4是图3的IV-IV截面图。

另外，如图5和图6所示的那样，本实施方式的细胞培养容器也可以具有包含预定数的多个微容器的、被划分的处所。其中，图5是表示本实施方式的进而其他的细胞培养部的构成的平面图，图6是图5的VI-VI截面图。在图5和图6中，表示使用图3和图4所示的微容器的结构的例子。图5中，表示划分出多个微容器的侧壁24和被划分的处所23。侧壁24的高度d只要是可保持培养液或反应液等的上清液不干燥的容量即可，可以适当设定。通过具有侧壁24，可在各处所23中使用不同的培养基。另外，在图5和图6中，表示具有侧壁24的构成例，但也可以是不具有侧壁24的构成。

作为制作细胞培养容器上的凹凸格局的方法，没有特别地限定，例如可以列举使用了模子的转印成型、3维光造形、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等的方法。优选考虑细胞培养容器的用途、要求的加工精度、成本等来适当选择这些制造方法。

作为使用模子进行转印成型方法的具体例子，可以列举以金属结构体作为模具通过树脂成型形成凹凸格局的方法。该方法可以以高的转印率将金属结构体的形状对树脂再现凹凸格局，另外通过使用通用的树脂材料，可以降低材料成本，因此是优选的。使用这种金属结构体的模具的方法是低成本的，在可满足高的尺寸精度这方面是优异的。

上述金属结构体的制造方法例如可以列举对利用光刻法制作的抗蚀图形或利用3维光造形制作的树脂图案的镀敷处理、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等。只要考虑用途、要求的加工精度、成本等进行适当选择即可。

作为使用上述得到的金属结构体作为模具来对树脂进行凹凸格局的成型的方法，例如可以列举注射成型、加压成型、单体浇铸成型、溶剂浇铸成型、热压印（ホットエンボス）成型、采用挤出成型的辊转印等的方法。从生产性和模具转印性的角度考虑，优选采用注射成型。

作为构成细胞培养容器的材料，只要是具有自身支持性的材料即可，没有特别地限定，例如可以列举合成树脂、硅、玻璃等。从成本方面或利用显微镜观察时的细胞可见性的角度考虑，优选以透明的合成树脂作为材料。作为透明的合成树脂，例如可以列举聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物等的丙烯酸系树脂、聚苯乙烯等的苯乙烯系树脂、环烯烃等的烯烃系树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸等的酯系树脂、聚二甲基硅氧烷等的有机硅系树脂、聚碳酸酯树脂等。在不损害透明性的范围内，也可以在这种树脂中含有着色剂、扩散剂、增稠剂等的各种添加剂。

对于细胞培养容器，为了提高容器表面的亲水性、生物体适应性、细胞亲和性等，也可以在凹凸格局表面侧进行表面处理，配置改性层和/或涂布层。作为设置上述改性层的方法，只要不是丧失自身支持性的方法或产生100μm以上的极端的表面粗糙的方法即可，没有特别地限定，例如可以列举药物处理、溶剂处理、利用表面接枝聚合引入接枝聚合物等的化学性处理、电晕放电、臭氧处理、等离子体处理等的物理性处理等的方法。另外，作为设置涂布层的方法，没有特别地限定，例如可以列举溅射、蒸镀等的干式涂布、无机材料涂布、聚合物涂布等的湿式涂布等的方法。为了在不混入气泡地注入培养液，期望在凹凸格局上赋予亲水性，作为形成均匀的亲水性膜的方法，优选无机蒸镀。

另外，当考虑到细胞亲和性时，更优选涂布例如胶原、纤维结合素等的细胞亲和性蛋白质。为了均匀地涂布胶原水溶液等，优选在形成上述亲水性膜后进行涂布。通常，在肝细胞培养中，期望模拟生物体内环境在细胞外基质表面进行培养，因此特别优选如上所述，在配置了均匀的亲水性无机膜后，再配置包含适合培养细胞的细胞外基质的有机膜。

另外，对于使用上述细胞培养容器的细胞培养方法，为了使细胞仅配置在培养细胞的微容器中，并在该空间内表现类似于生物体内的形态或功能，需要接种适当的细胞数，优选细胞接种密度为1.0×10²～1.0×10⁶细胞/cm²，更优选细胞接种密度为1.0×10⁴～1.0×10⁶细胞/cm²。例如当微容器为正方形、且一边长为200μm时，优选5.0×10⁴～5.0×10⁵细胞/cm²。基于这种条件，可以得到直径达到30～200μm的肝细胞团。

接着，对于本实施方式的细胞保存方法进行说明。细胞保存方法是使用上述具有多个微容器的细胞培养容器来培养活细胞，并进行保存的方法。具体来说，首先进行使活细胞粘附于细胞培养容器的多个微容器的表面并进行培养的培养工序。接着，向细胞培养容器注入培养基(培养液)以覆盖多个微容器、进行保存的准备的保存准备工序。保存这样制成的细胞培养容器(保存工序)。以下更详细地说明各工序。

首先，对于培养工序进行说明。活细胞使用粘附性的细胞。通过使活细胞粘附在微容器表面，可以防止保存、运输中活细胞冲撞微容器的表面等、防止从微容器流出。由此，抑制培养的活细胞的功能损失，或者防止由于活细胞从培养基露出而导致的干燥、由此导致的细胞功能的降低等。

培养的活细胞可以使用实质细胞。具体来说，可以使用肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、组织干细胞、ES细胞和iPS细胞(induced pluripotent stem cells)中的任一者。或者使用由组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者分化的肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞和骨细胞中的任一者。

培养工序中，包括(1)使细胞粘附的工序，(2)除去非粘附细胞的工序，(3)进一步培养细胞、使其增殖、铺展或聚集的工序。通过除去非粘附细胞，可以除去废物，能够防止培养基被污染。另外，通过进一步培养增殖等，将活细胞培养至期望的细胞团的大小。例如，进行增殖、铺展、聚集，直至使细胞聚集块的直径为30~200μm。各微容器设计成可放入期望的细胞团的大小。这样，进行活细胞的培养，以使活细胞粘附(接种)在多个微容器的表面、且在各微容器的空间内形成的三维结构体的细胞群体形成被隔离的细胞数。

通过上述工序，在微容器内形成相当于1个三维结构体份的细胞数的细胞群体，并隔离。其中，将在微容器内形成的细胞群体(细胞团)作为1份。利用微容器活细胞根据活细胞的大小而用高的壁隔离，且活细胞粘附于微容器。因此，与相邻的三维结构体不相接。由此，即使在非静置环境(运输状态等)下，活细胞也可以形成或维持均匀的三维结构体。

接着，对于保存准备工序进行说明。培养基以不使培养的活细胞干燥、还不与外部空气接触的量来注入。保存中使用的培养基是含有营养成分的介质，例如含有血清或增殖因子等的血中成分。培养基所含的成分根据保存的活细胞来确定。

另外，细胞培养容器利用密封装置密封，以使培养基不漏出。细胞培养容器是例如在具有开口部分的平皿或板、烧瓶中形成多个微容器的容器。在密封时，用膜或帽等的密封装置覆盖细胞培养容器的上面的开口部分，以使活细胞与外部隔离的状态保存。密封装置可以使用可阻断液体或气体的流入的材质的装置，也可以使用可使二氧化碳或氧透过的装置。其根据保存的活细胞或培养状态进行选择即可。另外，当运输活细胞时，必须密封，以使培养基不漏出，但在静置状态下进行保存期间，可以是加上盖子的状态，以达到能够防止培养基干燥的程度，也可以是以开口部分的状态进行保存的情况。根据活细胞的保存状态，细胞培养容器也可以是不密封的状态。

最后对于保存工序进行说明。保存时，细胞培养容器优选调节至在4℃以上且小于37℃的温度范围的任意温度，更优选6℃以上且小于25℃，进一步优选10℃以上且20℃以下。另外，保存工序还含有将在保存准备工序制作的密封的细胞培养容器进行运输的期间。优选在运输期间也实施温度调节。

这里，保存准备工序结束后的细胞培养容器的状态例示于图7。图7中，表示使用如图5和图6所示的细胞培养容器，进行培养工序和保存准备工序的一个例子，在图6所示的截面图中补加了活细胞40和密封装置30。具体来说，在细胞培养容器20内的各微容器11中粘附活细胞40，并进行培养。图7中，活细胞40用涂黑的圆简略地表示，培养基50表示放入至双点划线的位置。密封装置30将细胞培养容器20密封。图7所示的培养基的量作为一个例子，例如有注入容器的三分之一容积的培养基的情况，也有注入培养基，直至与密封装置30之间没有空气层的状态的情况。培养基的容量根据活细胞的种类、培养状态等来适当地选择。

如以上说明的那样，根据上述实施方式的一种方式，可以不使用特殊的高分子，而使活细胞以与硬塑料状的培养基板粘附的状态形成三维结构来进行保存。已知活细胞在形成三维结构体时，可以提高细胞的功能。因此，在培养活细胞后，能够以维持功能的状态进行保存。

进一步地，当使用车辆、船舶、航空器等的运输装置运输细胞时，由于运输中的环境要素、例如振动、温度、CO₂浓度(培养基的pH的变化)等，有细胞的功能进一步降低的担心，或者由于运输中产生的振动，有由于细胞的剥离或凝胶的损坏导致细胞凋亡等的担心。对于这些问题，通过使用本发明实施方式的一个方式，可以维持活细胞的功能进行运输。

例如当将从生物体分离的新鲜肝细胞运输到其他地方时，可以应用本发明。特别地，从生物体分离的新鲜肝细胞仅可生存规定的时间(60小时)。这种情况下，可以期待能够以维持新鲜肝细胞的三维结构、维持功能的状态运输细胞。另外，当将从生物体分离的新鲜肝细胞以冷冻的状态运输时，也可以应用本发明的一种方式，通过在将冷冻细胞融化后使用本发明的方法，可以期待能够以非冷冻状态保存或运输。进一步地，当使用凝胶等的高分子运输活细胞的三维结构时，有凝胶从活细胞剥落，或者凝胶的形状变形，由此破坏活细胞的三维结构的情况，但通过应用本发明的一个方式，可期待能够以维持三维结构、维持功能的状态运输活细胞。

实施例

接着，对于本发明的细胞培养方法的实施例进行说明，但本发明不限于这些实施例。

[实施例01]

用具有多个微空间的细胞培养容器保存的情况和用平板保存的情况的实施例

(培养容器)

<实施例01>

利用光刻来制作作为图3、4所示的凹凸格局形状的、a=200μm、b=20μm、c=50μm的格局，进行Ni电镀，得到具有相应的凹凸形状的模具。使用该模具，利用热压印成型在聚苯乙烯上进行凹凸格局形状的转印，制作上述尺寸的树脂基材。制作在该树脂基材表面利用真空蒸镀形成了100nm二氧化硅膜的膜，利用激光熔接法在聚苯乙烯制的没有培养底面的24孔板上贴合膜后，进行γ射线灭菌，制作24孔的具有多个微空间的培养容器，用于保存试验。

<比较例01>

将市售(ベクトン・ディッキンソン制、ファルコン(注册商标))的γ射线灭菌后的平面状24孔培养板用于保存试验。

(细胞培养)

使用培养烧瓶(CORNIGN社制)将源于人肝癌的细胞株HepG2(财团法人ヒューマンサイエンス研究资料库资源编号JCRB1054)在37℃、5%CO₂培养箱内增殖，直至预定的细胞数。培养基使用含有10%胎牛血清的DMEM(GIBCO社制)培养基。使用0.25%胰蛋白酶溶液将增殖的细胞从培养底面剥离，以离心分离法回收细胞。将回收的细胞用含有10%FBS的DMEM培养液调节，以使细胞浓度为4×10⁵个/mL，在各孔中各添加500μL。然后，将细胞在37℃、5%CO₂培养箱内培养3天。

(保存试验)

使用实施例01、比较例01所示的培养容器，在37℃、5%CO₂培养箱内培养3天后，吸取培养基，在各孔中重新加入500μL含有10%FBS的DMEM培养基，将培养板用塑料制的膜密闭后，放入37℃的培养箱中，保存24小时。

(分析:白蛋白分泌量的测定)

保存24小时后，吸取培养基，在各孔中加入含有10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂培养箱内培养2天。回收培养后的上清液，使用人白蛋白分析ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories社制)，测定2天的人白蛋白量。

(结果)

表1表示了测定白蛋白分泌量的结果。实施例01的分泌量是比较例01的3倍。

[表1]

	白蛋白分泌量[pg/mL/2天]
		实施例01	360
比较例01	120

[实施例02-05]

关于保存温度的实施例

(培养容器)

利用光刻来制作作为图3、4所示的凹凸格局形状的、a=200μm、b=20μm、c=50μm的格局，进行Ni电镀，得到具有相应的凹凸形状的模具。使用该模具，利用热压印成型在聚苯乙烯上进行凹凸格局形状的转印，制作上述尺寸的树脂基材。制作在该树脂基材表面利用真空蒸镀形成了100nm二氧化硅膜的膜，利用激光熔接法在聚苯乙烯制的没有培养底面的24孔板上贴合膜后，进行γ射线灭菌，制作24孔的具有多个微空间的培养容器(培养板)，用于保存试验。

(细胞培养)

使用培养烧瓶(CORNIGN社制)将源于人肝癌的细胞株HepG2(财团法人ヒューマンサイエンス研究资料库资源编号JCRB1054)在37℃、5%CO₂培养箱内增殖，直至预定的细胞数。培养基使用含有10%胎牛血清的DMEM(GIBCO社制)培养基。使用0.25%胰蛋白酶溶液将增殖的细胞从培养底面剥离，以离心分离法回收细胞。将回收的细胞用含有10%FBS的DMEM培养液调节，以使细胞浓度为4×10⁵个/mL，在培养容器的各孔中各添加500μL。然后，将细胞在37℃、5%CO₂培养箱内培养3天。

(保存试验)

培养3天后，吸取培养基，在各孔中加入500μL含有10%FBS的DMEM培养基。将培养容器用塑料制的膜密闭后，用以下实施例的保存方法保存。保存中的库内温度使用温度传感器进行测定，确认保持在目的温度。

<实施例02>

使用18℃的加入了定温保温剂的保存容器(日立物流社制)，保存24小时。此时的库内的温度为18℃±0.5℃。

<实施例03>

使用6℃的加入了定温保温剂的保存容器(日立物流社制)，保存24小时。此时的库内的温度为6℃±0.5℃。

<实施例04>

在发泡苯乙烯制的容器中加入冰，并在其上放置培养容器，保存24小时。此时的培养容器底面的温度为0℃±0.5℃。

<实施例05>

放入37℃的培养箱中，保存24小时。

(分析)

保存24小时后，吸取培养基，在各孔中放入含有10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂培养箱内培养24小时。然后，使用倒置显微镜进行观察，对于任意的视野，计数形成30~200μm的细胞团的数目，用以下的式子算出细胞团形成率。另外，对于保存前的细胞团形成率，也用同样的方法算出。

细胞团形成率=

×100[%] （式1）

其中，在(式1)中，

“1个视野内微空间的个数”是指1个视野(任意范围的视野)中存在的微空间(微容器)的个数。

“形成了细胞团的1个视野内微空间的个数”是指在1个视野内微空间中、形成了30~200μm的细胞团的微空间的个数。

(结果)

表2中表示了细胞团形成率。保存前的细胞团形成率为80~100%。实施例02(18℃)中，几乎完全保持了保存前的形态。实施例03(6℃)中，虽然细胞团形成率降低，但是维持60%~80%的形态。实施例04(0℃)的形成率低，为30%，几乎不能维持形态。实施例05(37℃)的形成率最低，为25%，几乎不能维持形态。

由该结果可知，保存温度优选为10℃以上且20℃以下，特别优选18℃。

[表2]

	实施例02	实施例03	实施例04	实施例05
					细胞团形成率（％）	98	60	31	25

[实施例06、07]

关于细胞密度的实施例

(培养容器)

实施例06、07使用与实施例02-05同样的培养容器。

(细胞培养)

使用培养烧瓶(CORNIGN社制)将源于人肝癌的细胞株HepG2(财团法人ヒューマンサイエンス研究资料库资源编号JCRB1054)在37℃、5%CO₂培养箱内增殖，直至预定的细胞数。培养基使用含有10%胎牛血清的DMEM(GIBCO社制)培养基。使用0.25%胰蛋白酶溶液将增殖的细胞从培养底面剥离，以离心分离法回收细胞。将回收的细胞用含有10%FBS的DMEM培养液调节至实施例所示的细胞浓度，在培养容器的各孔中各添加500μL。然后，将在37℃、5%CO₂培养箱内培养3天。

<实施例06>

在接种细胞时，将细胞浓度调节至4×10⁵个/mL，在以下所示的保存条件下保存。

<实施例07>

在接种细胞时，将细胞浓度调节至40×10⁵个/mL，在以下所示的保存条件下保存。

(保存条件)

培养3天后，吸取培养基，在各孔中加入500μL含有10%FBS的DMEM培养基，将培养板用塑料制的膜密闭后，放入18℃的加入了定温保温剂的容器(日立物流社制)中，保存24小时。

(分析)

(白蛋白分析)

保存24小时后，吸取培养基，在各孔中加入含有10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂培养箱内培养2天。回收培养后的上清液，使用人白蛋白分析ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories社制)，测定2天的人白蛋白分泌量(ng/mL/2天)。接着，用0.25%的胰蛋白酶溶液剥离细胞，用台盼蓝算出活细胞的值，将每10⁵个的值作为以下记载的表3的白蛋白分泌量(pg/10⁵/2天)。

(形态观察)

保存24小时后，吸取培养基，在各孔中加入含有10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂培养箱内培养24小时，在37℃、5%CO₂培养箱内进行培养后，使用倒置显微镜观察形态。

(结果)

图8A、8B是从保存容器中取出后，在37℃、5%CO₂培养箱内培养24小时时的照片。

实施例06(图8A)中，形成了球状的细胞团，相对于此，实施例07(图8B)中，在微空间内细胞以密集地堆满的状态形成团，死亡的细胞在区域外聚集。表3表示了白蛋白分泌量。对于白蛋白分泌量，实施例06表现为实施例07的约2.8倍的高值。

[表3]

	白蛋白分泌量[pg/10⁵/2天]
		实施例06	177
实施例07	62.5

应予说明，本发明不限于上述所示的实施方式。在本发明的范围中，可以将上述实施方式的各要素变更、追加、变换为本领域技术人员能够容易想到的内容。

Claims

1.细胞保存方法，其是使用具有多个微空间的细胞培养容器来保存活细胞的细胞保存方法，

其中，使活细胞粘附于上述多个微空间的表面进行培养，

在上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间，

将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出，保存上述活细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞保存方法，其特征在于，上述细胞培养容器保持在4℃以上且小于37℃的温度来保存上述活细胞。

3.根据权利要求1或2所述的细胞保存方法，其特征在于，进行上述培养，以使粘附于上述表面、且在各微空间的空间内形成的三维结构体的细胞群体形成被隔离的细胞数。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述多个微空间的底部面积为0.01~0.1mm²，深度为25~150μm。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述活细胞是肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者。

6.根据权利要求1~4中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述活细胞是由组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者分化的、肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞和骨细胞中的任一者。

7.根据权利要求1~6中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，在上述培养后，除去非粘附细胞后将上述培养基向上述细胞培养容器注入。

8.根据权利要求1~7中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述活细胞的培养为，在使活细胞粘附并进行培养后，进一步进行培养，使其增殖、铺展或者聚集。

9.根据权利要求1~8中任一项所述的细胞保存方法，其中，以1×10²~1×10⁶细胞/cm²的细胞接种密度将活细胞接种在上述多个微空间中。

10.根据权利要求1~9中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，在上述多个微空间中形成有活细胞集聚的细胞团。

11.根据权利要求1~10中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述细胞团的直径为30~200μm。

12.根据权利要求1~11中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，上述培养基含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一种。

13.根据权利要求1~12中任一项所述的细胞保存方法，其特征在于，使用使氧或二氧化碳透过的膜来密封上述细胞培养容器。

14.细胞运输方法，其是将活细胞保存于具有多个微空间的细胞培养容器并运输的细胞运输方法，

其中，使活细胞粘附于上述多个微空间的表面进行培养，

上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间，

将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出，

使用车辆、船舶或者航空器中的任一种运输装置将密封的上述细胞培养容器进行运输。

15.根据权利要求14所述的细胞运输方法，其特征在于，上述细胞培养容器保持在4℃以上且小于37℃的温度。