KR102233285B1 - 미세유체소자를 이용한 3차원 세포배양 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세유체소자를 이용한 3차원 세포 배양에 관한 것으로서 관통 구멍이 형성된 고분자막을 미세유체소자에 형성하고, 고분자막 위에서 세포를 배양하여 세포 전체에 빠짐없이 세포 배양액을 공급하여 세포 생장을 증가시키고 세포 사멸을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 구멍이 뚫린 고분자막을 포함한 간단한 형상의 미세유체소자를 이용하여 세포의 생장은 증가시키고 세포의 사멸은 억제할 수 있는 효과적인 3차원 세포 배양 방법을 제공할 수 있으며, 미세유체소자를 이용하나 미세유체소자의 채널에서 세포를 배양하는 방식이 아닌 미세유체소자를 덮고 있는 고분자막의 상부에서 세포를 배양하는 방식으로 기존의 미세유체소자를 이용한 세포 배양 방식과 전혀 다른 새로운 개념의 3차원 세포 배양 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

미세유체소자를 이용한 3차원 세포배양{Three-dimensional cell co-culture using microfluidic device}
본 발명은 미세유체소자를 이용한 3차원 세포배양에 관한 것이다.
최근에는 인체의 조직이나 기관과 유사한 세포 모델 개발을 위해 2차원 세포 배양이 아닌 3차원 세포 배양 기술 개발이 활발하다.
3차원 세포 배양 기술은 세포 전체에 입체적으로 세포의 증식이나 성장과 관련된 요소들이 영향을 주도록 설계된 배양 기술로서 세포 배양 조건을 적절하게 조절하여 실제 생체에서 일어나는 것과 매우 유사한 세포 모델을 제공할 수 있다.
이러한 3차원 세포 배양 기술은 기초과학 연구뿐만 아니라 의학 및 약학 분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있다.
3차원 세포 배양 기술은 주로 3차원 세포 배양에 적합한 세포 배양 용기나 3차원적으로 세포를 배양할 수 있는 고분자 지지체 개발에 집중되어 있다. 예를 들어 한국 등록특허 제10-1847044호에는 특정 위치에 돌기 구조를 가지는 3차원 배양 용기를 개시하고 있고, 한국 공개특허 제10-2018-0011656호에서는 하이드로겔을 이용한 3차원 세포 배양 지지체를 개시하고 있다.
이와 같이 다양한 3차원 세포 배양 방법이 개발 및 연구되고 있으나 특정 형상을 가지는 배양 용기나 특정 결합을 형성하는 지지체 등은 미세한 구조적 차이의 변화나 물리적 또는 화학적 결합의 변화에 의해 3차원 세포 배양이 의도한 대로 진행되지 않을 수 있다.
이에 본 발명의 발명자들은 복잡한 구조나 화학적 결합이 요구되지 않는 간단한 구조를 가진 미세유체소자를 이용하여 효과적인 3차원 세포 배양이 가능한 기술을 제공하고자 한다.
대한민국 등록특허공보 제1847044호 대한민국 공개특허공보 제2018-0011656호
본 발명은 구멍이 뚫린 고분자막이 채널을 덮도록 형성된 미세유체소자와 이를 이용하여 세포를 3차원으로 배양하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 주입부; 복수개의 채널; 및 복수개의 채널을 덮도록 형성된 고분자막을 포함하고, 상기 고분자막의 상부에서 세포를 배양하기 위한 미세유체소자로서, 상기 복수개의 채널 각각을 따라 고분자막에 복수개의 관통 구멍이 형성된 미세유체소자에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 고분자막에 형성된 복수개의 관통 구멍은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 레이저 타공으로 형성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 고분자막에 형성된 복수개의 관통 구멍의 직경은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 15 내지 60㎛일 수 있다.
본 발명에서, 상기 복수개의 관통 구멍은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 복수개의 채널 각각을 따라 고분자막에 형성될 수 있다.
또한 본 발명은 주입부, 복수개의 채널 및 복수개의 관통 구멍을 포함하는 고분자막이 복수개의 채널을 덮도록 형성된 미세유체소자를 준비하고, 상기 미세유체소자의 고분자막 상부에서 세포를 배양하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 고분자막은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)일 수 있고, 복수개의 관통 구멍은 레이저 타공으로 형성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 복수개의 관통 구멍의 직경은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 15 내지 60㎛일 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포 배양 방법은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 미세유체소자의 고분자막 상부에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하고, 미세유체소자를 세포 배양 배지에 침지시켜 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포 배양 방법은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 미세유체소자의 주입부에 배지를 주입하여 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에서, 상기 하이드로겔에 포함된 세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 인간 기관 유래 세포주일 수 있다.
본 발명에서, 상기 하이드로겔은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 둘 이상의 서로 다른 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 구멍이 뚫린 고분자막을 포함한 간단한 형상의 미세유체소자를 이용하여 세포의 생장은 증가시키고 세포의 사멸은 억제할 수 있는 효과적인 3차원 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.
그리고 본 발명은 미세유체소자를 이용하나 미세유체소자의 채널에서 세포를 배양하는 방식이 아닌 미세유체소자를 덮고 있는 고분자막의 상부에서 세포를 배양하는 방식으로 기존의 미세유체소자를 이용한 세포 배양 방식과 전혀 다른 새로운 개념의 3차원 세포 배양 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 세포 배양 방법에서 사용할 수 있는 미세유체소자의 일 예에서 채널부를 확대한 모습과 본 발명의 미세유체소자에서 세포 배양이 이루어지는 일예를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 세포 배양 방법에서 사용할 수 있는 미세유체소자의 고분자막에 형성된 관통 구멍의 실제 모습을 보여준다. 점선 동그라미(적색)는 채널을 따라 채널 위에 형성된 관통 구멍을 표시한 것이다.
도 3는 본 발명의 세포 배양 방법에서 사용할 수 있는 미세유체소자와 하이드로겔 스캐폴드를 사용한 3차원 세포 배양 준비 모습을 보여준다.
도 4는 미세유체소자와 하이드로겔 스캐폴드를 사용한 3차원 세포 배양 방법 순서를 보여준다.
도 5는 실시예에 따라 제조한 미세유체소자를 이용한 대장암 세포 배양 결과이다.
A: 레이저 타공 된 미세유체소자를 적용한 3차원 대장암세포 배양, 대장암세포 SW480 의 레이저 타공 된 미세유체소자 유무에 따른 B: 세포생장, C: 세포사멸율 변화, 대장암세포 DLD-1 의 레이저 타공 된 미세유체소자 유무에 따른 D: 세포생장, E: 세포사멸율 변화
도 6은 대조군(control) 대비 구멍이 없는(no pore) 미세유체소자를 적용한 미세유체소자를 이용한 대장암 세포 배양 결과이다.
대장암 세포 SW480의 A: 세포생장 및 B: 세포사멸율, 대장암 세포 DLD-1의 C: 세포생장 및 D: 세포사멸율 변화
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 3차원 세포 배양을 위한 미세유체소자(microfluidic device) 및 이를 이용한 3차원 세포 배양 방법에 관한 발명이다.
본 발명의 주입부, 복수개의 채널 및 복수개의 관통 구멍을 포함하는 고분자막이 복수개의 채널을 덮도록 형성된 미세유체소자를 준비하고, 미세유체소자의 고분자막 상부에서 세포를 배양하는 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 세포 배양 방법에 사용하는 미세유체소자는 주입부, 복수개의 채널 및 복수개의 채널을 덮도록 형성된 고분자막을 포함하고, 고분자막의 상부에서 세포를 배양하기 위한 미세유체소자로서 복수개의 채널 각각을 따라 고분자막에 복수개의 관통 구멍이 형성된 미세유체소자이다. 본 발명의 미세유체소자는 주입부, 복수개의 채널 및 관통 구멍이 형성된 고분자막을 포함한 미세유체소자라면 그 형태나 구조는 특별히 제한되지 않는다.
주입부는 세포 배양액과 같은 세포의 증식과 분화 등 생장에 필요한 다양한 성분을 포함한 물질을 주입하는 곳으로 주입부은 한쪽은 외부와 연결되거나 외부로 노출되어 있고, 주입부의 다른 한쪽은 복수개의 채널과 연결되어 있을 수 있다. 주입부로 주입된 세포 배양액과 같은 물질은 복수개의 채널을 따라 이동할 수 있게 된다. 주입부는 미세유체소자에 복수개로 존재할 수 있고, 복수개의 주입부 중 어느 한쪽에 배양액을 주입하게 되면 배양액은 채널을 따라 다른 주입부로 흐르게 되고, 다른 주입부에서 배양액이 배출될 수 있다. 편의에 따라 복수개의 주입부가 존재하는 경우 배양액을 주입하는 곳을 주입부 채널을 따라 흐른 배양액이 배출되는 다른 주입부를 배출부라고 지칭할 수도 있다.
본 발명의 미세유체소자에는 복수개의 채널을 덮도록 형성되고 복수의 관통 구멍을 포함하는 고분자막이 형성되어 있다. 상기 고분자막의 재질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 일예로 Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), polydimethylsiloxane (PDMS), Polyglycolide (PGA), Thermoplastic polyurethane (TPU), Polyglycolide-Polyhydroxyalkanoates (PGA-PHA) 및 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)　(pHEMA) 등에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)을 사용할 수 있다.
복수개의 채널을 덮도록 형성된 고분자막은 미세유체소자의 채널홈과 채널벽 모두에 밀착되어 접착된 형태가 아니라, 복수의 채널벽들에 맞닿아 접착되어 형성된 것을 의미한다.
복수개의 채널을 덮도록 형성된 고분자막에는 복수의 관통 구멍이 형성되어 있어 채널을 따라 배양액을 흘려보내는 과정에서 고분자막에 형성된 관통 구멍을 통해 배양액이 채널 외부로 흘러 나오게된다.
본 발명은 미세유체소자의 채널 내부에서 세포를 배양하는 것이 아니라, 미세유체소자에 형성된 고분자막의 상부에서 세포를 배양하는 방법이다. 이러한 세포 배양 방법은 세포 전체에 배양액을 모두 공급할 수 있어 세포 생장을 증가시키고 배양과정에서 발생하는 세포 사멸을 최소화 할 수 있다. 3차원 세포 배양의 경우에도 세포의 적어도 일부분은 세포 배양 기구나 세포 배양 지지체와 맞닿게 되고, 세포가 맞닿은 부분으로는 배양액이 원활하게 공급될 수 없다. 그러나 본 발명의 경우 세포가 맞닿는 부분인 미세유체소자의 고분자막에 관통 구멍을 형성함으로써 관통 구멍을 통해 세포 전체에 원활한 배양액 공급이 가능할 수 있고, 그 효과로 세포의 생장 증가와 세포 사멸 억제가 나타나게 된다. 즉, 본 발명의 세포 배양 방법은 세포 배양 과정에서 배양액에 노출되지 않는 세포 부분을 최소화하여 세포에 배양액을 최대로 공급할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 고분자막에 관통 구멍을 형성하는 대신 다공성 구조를 가지는 고분자막을 미세유체소자에 형성하여도 배양액이 다공성 구조를 원활하게 통과하지 못해 관통 구멍이 형성된 고분자막을 사용한 경우보다 세포 생장 및 사멸 억제 효과가 좋지 않을 수 있다.
본 발명의 미세유체소자에서 고분자막에 형성된 관통 구멍은 레이저 타공으로 형성하는 것이 바람직하며, 핀이나 니들과 같이 뾰족한 도구를 사용하여 직접 구멍을 형성하는 경우 배양액의 원활한 통과가 이루어지지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 니들로 직접 고분자막에 관통 구멍을 형성한 경우 배양액이 관통 구멍을 따라 원활하게 투과되어 배출되지 않을 수 있고, 세포의 생장 증식 및 사멸 억제 효과가 좋지 않을 수 있다.
본 발명의 미세유체소자에서 고분자막에 형성된 관통 구멍은 채널을 따라 형성된 것이 바람직하며 보다 자세하게는 채널의 채널홈을 따라 형성될 수 있다. 채널의 채널벽을 따라 관통 구멍이 형성되는 경우 채널벽은 고분자막과 직접 맞닿아 있기 때문에 배양액이 원활하게 통과하기 어려워 세포에 원활한 배양액 공급이 어려울 수 있고, 고분자막과 채널벽의 접착을 방해할 수도 있다.
본 발명의 미세유체소자에서 고분자막에 형성된 관통 구멍은 직경 5 내지 75㎛, 직경 5 내지 70㎛, 직경 5 내지 65㎛, 직경 5 내지 60㎛, 직경 10 내지 75㎛, 직경 10 내지 70㎛, 직경 10 내지 65㎛, 직경 10 내지 60㎛, 직경 15 내지 75㎛, 직경 15 내지 70㎛, 직경 15 내지 65㎛, 바람직하게는 직경 15 내지 60㎛이다. 보다 구체적으로 레이저 타공으로 고분자막에 관통 구멍을 형성하는 경우 고분자막에 형성된 관통 구멍의 상부 직경과 하부 직경이 서로 상이할 수 있다. 고분자막의 상부에서 레이저 타공을 수행하는 경우 상부 직경이 하부 직경에 비해 상대적으로 좁을 수 있다. 채널 쪽에 가까운 하부 직경이 채널과 상대적으로 먼 상부 직경에 비해 넓은 구조는 채널을 따라 흐르던 배양액이 고분자막의 관통 구멍을 통해 고분자막 상부로 올라오는 현상을 보다 효과적으로 이루어지게 할 수 있다. 이 때 상부 직경은 5 내지 60㎛이고 하부 직경은 25 내지 75㎛, 상부 직경은 10 내지 60㎛이고 하부 직경은 30 내지 70㎛, 바람직하게는 상부 직경은 15 내지 50㎛이고 하부 직경은 35 내지 65㎛, 보다 바림작하게는 상부 직경은 5 내지 60㎛이고 하부 직경은 35 내지 60㎛일 수 있다. 직경이 좁은 경우 배양액이 원활하게 고분자막의 관통 구멍을 통과하기 어려울 수 있고, 직경이 넓은 경우 세포가 고분자막의 관통 구멍을 통해 미세유체소자의 채널로 유입될 수 있어 본 발명에서 목적하는 세포 배양 효과를 달성하기 어려울 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 레이저 타공으로 형성된 고분자막의 관통 구멍에서 직경 20 내지 60㎛, 보다 구체적으로 상부 직경이 20 내지 45㎛이고 하부 직경이 35 내지 60㎛일 때 세포 배양액이 가장 원활하게 고분자막 관통 구멍을 통해 세포에 공급될 수 있다. 직경이 20㎛ 미만인 경우 세포 배양액이 원활하게 고분자막의 관통 구멍을 따라 통과하여 세포에 공급되지 않을 수 있고, 직경이 60㎛를 초과하는 경우 세포가 고분자막의 관통 구멍을 통과하여 채널에 유입될 수 있는 문제가 생길 수 있다.
본 발명의 미세유체소자를 이용한 세포 배양 방법은 하이드로겔 스캐폴드(hydrogel scaffold)를 이용한 세포 배양에 보다 적합할 수 있다. 미세유체소자의 고분자막 상부에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하고, 하이드로겔 스캐폴드를 형성시킨 후 미세유체소자를 세포 배양 배지에 침지시켜 세포를 배양할 수 있다. 이러한 세포 배양 방법의 경우 하이드로겔 스캐폴드 내부에서 세포들이 평면적으로 위치하지 않고 3차원적으로 위치하고 있어 세포 배양액이 하이드로겔 스캐폴드 전체에 원활하게 공급되게 되면 하이드로겔 스캐폴드 내부에 3차원적으로 위치한 세포 전체에 매우 효과적으로 배양액을 공급할 수 있다.
고분자막 상부에 적하된 세포를 포함한 하이드로겔은 가교결합을 통해 하이드로겔 스캐폴드를 형성하게 되고, 고분자막과 맞닿아 있는 하이드로겔 스캐폴드 부분에는 고분자막의 관통 구멍을 통해 배양액이 공급되게 된다. 결과적으로 하이드로겔 스캐폴드 전체에 세포 배양액이 공급되게 되고, 하이드로겔 스캐폴드 내부로 흡수된 세포 배양액은 하이드로겔 스캐폴드 내부에 위치한 세포에 3차원적으로 전범위에 걸쳐 원활하게 공급될 수 있다.
본 발명의 미세유체소자에서, 상기 하이드로겔에 포함된 세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 동물, 식물 또는 박테리아 등의 세포일 수 있으며, 일예로, 동물의 기관에서 유래한 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래 세포주일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 기관 유래 세포주일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 대장 세포주 중 대장암 세포주일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 세포주의 경우 본 발명의 미세유체소자에서 현저한 세포 생장의 증가 및 세포 사멸의 감소 효과를 얻을 수 있어 바람직하다.
이하에서 도면을 통해 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 세포 배양 방법에서 사용할 수 있는 미세유체소자의 일 예에 관한 것으로, 도 1a는 채널부를 확대한 모습으로 채널부에 포함된 복수의 채널 각각은 채널홈과 채널벽으로 구분할 수 있다. 채널홈은 배양액이 흐르는 유로이고, 채널벽은 고분자막이 맞닿아 접착되는 부분에 해당한다. 또한, 도 1b는 고분자막의 상부에 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드가 형성된 모습을 보여준다. 채널홈을 따라 흐르는 배양액은 고분자막의 관통 구멍을 통해 하이드로겔 스캐폴드와 고분자막이 맞닿는 부분에 공급될 수 있어, 하이드로겔 스캐폴드 전체에 빠짐없이 배양액이 원활하게 공급될 수 있다.
도 3은 고분자막의 상부에 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드가 형성된 모습을 보여준다. 채널홈을 따라 흐르는 배양액은 고분자막의 관통 구멍을 통해 하이드로겔 스캐폴드와 고분자막이 맞닿는 부분에 공급될 수 있어, 하이드로겔 스캐폴드 전체에 빠짐없이 배양액이 원활하게 공급될 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드는 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하여 형성할 수 있다.
하이드로겔은 점도를 가지고 있어 세포 배양 플레이트를 관통하여 형성된 배양액 유통로에 적하시 배양액 유통로를 빠져나가지 않고 배양액 유통로에 접착 및 유지되어 하이드로겔 스캐폴드를 형성할 수 있다. 하이드로겔을 배양액 유통로에 적하시 배양액 유통로를 가득 채울 수 있도록 충분한 양을 적하는 것이 바람직하다. 하이드로겔 스캐폴드의 특성에 의해 하이드로겔 스캐폴드는 배양액 유통로에서 세포 배양 기간 동안 일정한 형태를 유지할 수 있고, 배양액이 하이드로겔 스캐폴드에 유입되거나 하이드로겔 스캐폴드를 통과하여 흐를 수 있다.
본 발명에서 사용하는 하이드로겔은 크게 제한되지 않으며 알지네이트(alginate), 콜라겐, 키토산, 히알루론산, 젤라틴을 사용할 수 있고 바람직하게는 붉은 조류(red algae)로부터 유래된 아가(agar)를 포함하는 것이 바람직하다. 조류 베이스(base)의 하이드로겔을 사용하는 경우 아가함량을 적합하게 조절하여 다양한 세포의 공동 배양과정에서 하이드로겔 스캐폴드가 용해되지 않고 유지되게 하는 것이 바람직하다.
아가 하이드로겔은 조류로부터 유래된 아가를 포함하여 제조한 하이드로겔을 의미한다. 조류 베이스의 하이드로겔의 경우 아가의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 세포 및 하이드로겔 혼합물 대비 0.1 % 초과, 0.2 내지 1.5%, 바람직하게는 0.6 % 초과 1.0%(w/v)이하이다. 아가의 함량이 충분하지 못한 경우 구조체의 용해도가 증가하고, 아가의 함량이 높은 경우 세포들의 증식 및 생존율이 감소할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔에는 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 세포 및 하이드로겔 혼합물 대비 각각 0.5 내지 2.0%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드 형성을 세포를 포함한 하이드로겔 혼합물을 세포 배양 플레이트의 배양액 유동로에 채워 넣기 위해 하이드로겔 혼합물을 적하하거나 로딩하는 것은 주사기, 파이펫(pipette) 또는3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하기 위한 기계의 디스펜서를 통해 수행될 수 있다. 또는 하이드로겔 혼합물을 적당량 손으로 덜어 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 로딩할 수도 있다.
본 발명에서 하이드로겔 혼합물을 적하하거나 로딩하는데 사용하는 3차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)은 입체구조의 하이드로겔 스캐폴드를 생성하기 위해 사용되는 시스템이다. 3차원 세포-프린팅을 위해 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비하여 포함한 기계를 통해 수행될 수 있다. 본 발명에서 3차원 세포-프린팅 시스템을 통해 제조되는 하이드로겔 스캐폴드는 입체적인 구조로서 일반적으로 수행되는 배지에서의 세포 배양과 같은 이차원적 배양과 구분되는 3차원적 세포 배양이 가능하다. 하이드로겔 스캐폴드의 구조는 혼합물에 포함된 성분 및 농도, 프로그램을 통한 디자인, 세포-플로팅 시 압력 및 속도에 의해 적절하게 형성될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[시험예 1] 미세유체소자의 제작
도 1과 같은 미세유체소자를 아래 방법에 따라 제작하였다.
미세유체소자에서 고분자막으로는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)을 이용하였고, 레이저 타공을 이용한 관통 구멍은 실험군에 대해 20㎛ 및 45㎛의 크기로 각각 생성하였고, 대조군(control)으로는 니들로 약 100㎛ 크기의 관통 구멍을 형성한 미세유체소자를 제작하였다(표 1).
고분자막 구멍 크기(㎛) 구멍 생성 방법
실시예 1 PDMS 20 레이저
실시예 2 PDMS 45 레이저
비교예 1 PDMS 약 100 (랜덤 크기) 니들
배양액을 대신해 잉크를 제작한 미세유체소자에 주입하고 잉크가 고분자막의 관통 구멍을 통과하여 유출될 수 있는지 확인하였다. 0.1ml/min의 속도로 잉크를 밀어낸 결과 잉크를 주입한 주입부 챔버에 잉크가 가득차면서 잉크가 채널을 따라 흘렀고, 반대편 주입부 챔버에 잉크가 다시 가득차는 것을 확인할 수 있었다. 잉크가 흐르는 과정에서 고분자막의 관통 구멍을 통해 잉크가 방울형태로 올라오는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
대조군인 비교예 1의 관통 구멍을 형성한 미세유체소자는 0.1 mm미세한 두께의 니들로 직접 PDMS 고분자막에 불균일한 크기의 구멍을 형성하여 제작하였고, 상기 미세유체소자에서 배양액이 고분자막을 통과하여 유출될 수 있는지 확인하였다.
레이저 타공하지 않은 PDMS 고분자막을 형성한 미세유체소자에서는 배양액이 PDMS가 다공성 구조임에도 불구하고 배양액이 PDMS 고분자막을 투과하지 못하였다.
그 결과, 니들로 직접 PDMS 고분자막에 구멍을 형성한 미세유체소자에서는 하기 표 2 및 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 불균일한 100㎛의 관통 구멍이 형성된 PDMS 고분자막 채널로 배지가 흐르지 않는 것을 확인하였다.
불균일한 100㎛의 관통 구멍이 형성된
PDMS 고분자막
배지 용해
채널 1 X
채널 2 X
채널 3 X
채널 4 X
* 배지 주입 속도: 0.1 ml/분
배지 용해
불균일한 100㎛의 관통 구멍이 형성된 PDMS 고분자막 X
불균일한 50㎛의 관통 구멍이 형성된 PDMS 고분자막 X
[시험예 2] 미세유체소자를 이용한 대장암 세포 배양
하기 표 4와 같이 제작한 미세유체소자를 이용하여, 대장암 세포주 SW480 및 DLD-1을 RPMI-1640 배지에 배양하였다.
고분자막 구멍 크기(㎛) 구멍 생성 방법
실시예 1 PDMS 20 레이저
실시예 2 PDMS 45 레이저
비교예 2 (컨트롤) - - -
비교예 3 PDMS - 타공하지 않음
UV 조사를 통해 멸균시킨 미세유체소자를 6-웰(6-well) 세포배양 용기에 부착시켰다(도 3 A). 이후, 멸균된 18G 주사기를 연결시키고 그 위에 하이드로겔 상태의 0.8 % 아가 3 ml을 주입한 후, 4 ℃에서 30분, 추가적으로 37 ℃에서 15분간 응고시키고, 2 ml 의 1 *105 SW480, DLD-1을 포함하는 0.8 % 아가를 4 ℃에서 20분간 응고시켜 3차원 대장암 세포층을 형성시켰다.
이후 상기 세포층 위에 실험군으로 2 ml 의 세포배양액을 첨가하여 세포를 배양하였다.
상기 배양시, 미세유체소자를 포함한 세포배양에서는 0.1 ml/min 의 유속으로 0.5 ml 의 배양액을 24시간마다 미세유체로 주입하였고, 대조군의 경우 동일양의 배양액을 첨가하였다. 이 때, 세포배양액의 넘침 방지를 위해 첨가된 양만큼의 배양액을 주기적으로 교체하였다.
대조군으로 미세유체소자를 포함하지 않은 3차원 세포배양과 레이저 타공이 되어있지 않아 관통구멍이 형성 되어 있지 않은 미세유체소자를 포함한 3차원 세포배양을 설정하여 3일 (혹은 7일) 간 배양 후 대장암세포 의 생장 및 세포사멸율 변화를 비교하였다.
배양 결과, 본 발명의 실시예에 따라 PDMS 고분자막에 20㎛ 및 45㎛ 크기로 레이저 타공을 통해 관통 구멍을 형성한 미세유체소자의 경우 미세유체소자를 사용하지 않고 대장암 세포를 배양한 비교예 2의 컨트롤 대조군에 비해 40 % 이상 감소된 세포사멸율을 나타내었다. 세포사멸율의 감소는 세포생장의 증가와 간접적인 연관성을 가진다. 또한 세포 생장은 30% 이상 증가한 것을 확인하였다(도 5).
반면 타공이 되지 않은 비교예 3 대조군의 미세유체소자를 사용하여 세포를 배양한 경우, 미세유체소자를 사용하지 않고 대장암세포를 배양한 비교예 2의 대조군과 비교하였을 경우에 비해서도 세포 사멸 억제 및 세포 생장 증가에 있어 경우에 따라 미미한 효과가 있을 수 있음을 확인하였다(도 6).
상기로부터, 본 발명의 미세유체소자를 이용하여 세포를 배양하는 경우, 세포 사멸이 현저히 억제되고, 세포 생장이 현저히 증가하는, 새로운 효과가 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Claims (11)

  1. 주입부;
    복수개의 채널; 및
    복수개의 채널을 덮도록 형성되며, 상부에 배양을 위한 세포가 위치하도록 하는 고분자막을 포함하고,
    상기 고분자막의 상부에서 세포를 배양하기 위한 미세유체소자로서,
    상기 복수개의 채널 각각을 따라 고분자막에 레이저 타공으로 상부 직경이 20 내지 45㎛이고, 채널 쪽에 가까운 하부 직경이 35 내지 60㎛이며, 상부에서 하부로 직경이 증가하는 구조를 갖는 원뿔의 일부 형태의 복수개의 관통 구멍이 형성된 미세유체소자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    복수개의 관통 구멍은 복수개의 채널 각각을 따라 고분자막에 형성된 미세유체소자.
  5. 주입부, 복수개의 채널 및 레이저 타공으로 형성된 상부 직경이 20 내지 45㎛이고, 채널 쪽에 가까운 하부 직경이 35 내지 60㎛로 넓어지는 구조를 갖는 원뿔의 일부 형태의 복수개의 관통 구멍을 포함하는 고분자막이 복수개의 채널을 덮도록 형성된 미세유체소자를 준비하고,
    상기 미세유체소자의 고분자막 상부에서 세포를 배양하는 세포 배양 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    고분자막은 PDMS(polydimethylsiloxane)인 세포 배양 방법.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 미세유체소자의 고분자막 상부에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하고, 미세유체소자를 세포 배양 배지에 침지시켜 세포를 배양하는 세포 배양 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 미세유체소자의 주입부에 배지를 주입하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 하이드로겔에 포함된 세포는 인간 기관 유래 세포주인 세포 배양 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 둘 이상의 서로 다른 세포를 포함하는 세포 배양 방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100832592B1 (ko) 2006-08-17 2008-05-27 박현숙 폴리머 막을 이용한 줄기세포와 피더세포의 공배양방법
KR100928201B1 (ko) * 2007-12-06 2009-11-25 한국전자통신연구원 휴대용 소형 동물 세포 배양기 및 그 제조 방법
JP2010501171A (ja) 2006-08-22 2010-01-21 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 生体細胞の特性を定める方法およびシステム
KR101395203B1 (ko) 2012-07-10 2014-05-16 서울대학교산학협력단 미소 유체 세포배양장치와 그 제조방법, 그리고 그 세포배양장치를 이용한 세포 배양방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5415538B2 (ja) * 2008-07-16 2014-02-12 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション マイクロチャネルを有する臓器模倣装置ならびにその使用および製造方法
KR101957923B1 (ko) * 2011-02-28 2019-03-14 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 세포 배양 시스템
KR101877892B1 (ko) 2016-07-25 2018-07-12 주식회사 메디팹 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법
KR101847044B1 (ko) 2017-09-07 2018-04-09 한국기초과학지원연구원 3차원 세포배양 용기

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100832592B1 (ko) 2006-08-17 2008-05-27 박현숙 폴리머 막을 이용한 줄기세포와 피더세포의 공배양방법
JP2010501171A (ja) 2006-08-22 2010-01-21 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 生体細胞の特性を定める方法およびシステム
KR100928201B1 (ko) * 2007-12-06 2009-11-25 한국전자통신연구원 휴대용 소형 동물 세포 배양기 및 그 제조 방법
KR101395203B1 (ko) 2012-07-10 2014-05-16 서울대학교산학협력단 미소 유체 세포배양장치와 그 제조방법, 그리고 그 세포배양장치를 이용한 세포 배양방법

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