KR101877892B1 - 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법 - Google Patents

이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel)을 제조하는 단계; 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계; 및 상기 제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하고 젤화(gelation)하여 3차원 형상의 젤화된 구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법의 적용을 통해 이온 및 물리적 가교를 동시에 적용하는 원스텝 방식으로 하이드로젤의 젤화를 진행하므로 빠르고 간단하게 3차원 세포배양 지지체의 형성이 가능하며, 젤화의 진행 및 완료를 확인할 수 있고, 다양한 형태의 캐스팅 몰드 적용을 통해 맞춤형의 3차원 배양 플렛폼의 제조가 가능할 뿐아니라, 화학적 가교제를 사용하지 않아 생체 친화성이 우수하다.

Description

이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법{Preparing method of cell culturing scaffold with double crosslinking}
본 발명은 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 이온 및 물리적 가교를 동시에 적용하는 원스텝 방식으로 하이드로젤의 젤화를 진행하여 빠르고 간단하게 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
지난 100년 동안 과학자들은 평평한(flat) 2차원의 페트리 디쉬(Petri dish)를 사용하여 세포를 배양하였고, 수많은 실험실에서 상기 방법을 통해 배양한 세포를 이용하여 신호 전달, 또는 세포 분화 등 연구를 수행하였다.
다만, 상기 2차원의 페트리 디쉬를 통해 세포를 배양할 경우, 세포는 페트리 디쉬의 유리 바닥에 붙어 형태를 변화시키거나, 또는 세포 분열을 진행하지만 실제 생체 내에서 세포는 이러한 과정으로 자라지 않는 문제점이 있다.
세포는 생체 내와 유사한 3차원적 세포배양 환경에서 자랄 경우 페트리 디쉬에서 2차원적으로 배양할 때와 비교하여 유전자 발현이 많이 달라질 수 있으며, 이와 같은 연구는 동일한 연구를 수행 하더라도 세포배양 방법에 따라 실험 결과가 달라질 수 있기 때문에 세포를 이용한 실험 결과를 질병 치료에 응용할 시 많은 주의가 필요하다.
하이드로젤은 고분자 사슬이 3차원 구조를 이루는 친수성 망상구조 물질로서 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 가지고 있으며, 신체의 일부가 손상되거나 기능을 잃었을 때 조직이나 장기를 대체하기 위한 조직재생용 지지체로 사용 가능한 물질이다. 상기 하이드로젤은 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하여 팽윤하지만 가교구조에 의해 용해되지 않는 고유의 성질을 지니고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로젤이 만들어질 수 있다.
알지네이트와 젤라틴은 하이드로젤을 구성할 수 있는 고분자 중 하나로서, 알지네이트는 조직공학 등에서 상당히 오랜 기간 동안 널리 쓰이고 있는 하이드로젤 생체재료이다. 해조류에서 추출된 천연고분자로 B-D-마누론산(B-D-mannuronic acid)과 a-L-글루쿠론산(a-L-glucuronic acid)의 두 종류의 우론산(uronic acid)을 포함한다. 이러한 알지네이트를 증류수에 녹이면 점성을 가지는 액체가 되고 Ca2+, Sr2+ 또는 Ba2 + 같은 다가 금속을 첨가할 때 금속이온과 글루쿠론산의 Na+ 이온 사이의 이온결합에 의한 겔화(gelation) 및 가교화를 통해 입자가 형성된다.
상기 방법으로 제조된 알지네이트 비드는 기존의 2차원 세포배양기술의 한계를 벗어나 3차원 형상을 가지는 생체기관의 구조를 모사한 세포배양 방법으로 실제 생물체의 반응을 정확하게 재현하기 위한 새로운 형태의 배양기술로 각광받고 있다. 다만, 알지네이트 자체만으로는 생물학적으로 불활성이기 때문에 동물세포가 붙어 자라나고 이동하는 등의 용도로는 사용할 수 없다는 문제점이 있다.
또 다른 하이드로젤을 구성할 수 있는 고분자 중 하나인 젤라틴은 동물의 뼈, 연골, 또는 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 유도단백질로써, 생체 적합성이 높고 무독성의 생분해성 특성을 가지고 있어 음식, 제약, 포토그래픽, 또는 화장품 등의 다양한 산업에서 광범위하게 쓰이고 있는 고분자이다.
젤라틴은 비교적 낮은 온도와 농도에서도 점성을 부여하며, 젤라틴 용액은 냉각될 때 선명하고 탄력성 있는 열가역적 겔을 형성하지만, 수용액에서 쉽게 녹아버리기 때문에 수용액 상에서 안정성을 높여주기 위하여 포름알데하이드(formaldehyde) 또는 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 같은 화학물질과의 가교 방법이 이용되고 있다.
그러나 이들 화학적 가교제 성분이 내부에 미량이라도 잔류할 경우 이로 인하여 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라 체내 이식 후 이들로 인한 주변 장기에 대해 독성을 나타낼 수 있다. 따라서 가교제의 사용을 최소화하거나 가교제를 사용하지 않고도 지지체의 기계적 물성을 증가시키기 위한 연구 개발이 시급한 상황이다.
대한민국 등록특허 제0753116호
본 발명의 목적은 알지네이트와 젤라틴 혼합한 하이드로젤을 기본으로 제조하고, 다양한 3차원 형상의 구현이 가능한 캐스팅 몰드를 이용하여 이들의 이온감응형 및 온도감응형 젤화를 동시에 적용하여 빠르고 간단하게 원스텝방식으로 젤화를 가능하게 함으로써 맞춤형의 3차원 배양 플렛폼을 제조하기 위한 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel) 제조하는 단계; 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계; 및 상기 제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하여 3차원 형상의 이중가교로 젤화(gelation)된 구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 것으로서, 3차원 형상의 젤화된 구조체를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법의 적용을 통해 이온 및 물리적 가교를 동시에 적용하는 원스텝 방식으로 하이드로젤의 젤화를 진행하므로 빠르고 간단하게 3차원 세포배양 지지체의 형성이 가능하며, 젤화의 진행 및 완료를 확인할 수 있고, 다양한 3차원 형태의 캐스팅 몰드 적용을 통해 맞춤형의 3차원 배양 플렛폼의 제조가 가능할 뿐 아니라, 화학적 가교제를 사용하지 않아 생체 친화성이 우수하다.
도 1은 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold) 제작과정을 나타낸 도면이고,
도 2는 실시예 1 내지 실시예 3에 따른 젤 캐스팅(gel casting) 과정을 나타낸 도면이며,
도 3은 실시예 1 내지 실시예 3에 따른 젤 캐스팅(gel casting) 과정을 나타낸 도면이고,
도 4는 실시예 1에 따라 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 생체적합성(Biocompatibility) 평가를 나타낸 도면이며,
도 5는 실시예 2에 따라 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 생체적합성(Biocompatibility) 평가를 나타낸 도면이고,
도 6은 실시예 3에 따라 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 생체적합성(Biocompatibility) 평가를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명의 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 이온 및 물리적 가교를 동시에 적용하는 원스텝 방식으로 하이드로젤의 젤화를 진행하여 빠르고 간단하게 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 형성할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel)을 제조하는 단계; 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계; 및 상기 제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하여 이중가교로 젤화(gelation)된 3차원 형상의 구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법을 제공한다.
상기 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel) 제조하는 단계는, 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 혼합용액을 준비하는 단계, 상기 준비된 혼합용액을 여과하여 하이드로젤을 제조하는 단계, 및 상기 제조된 하이드로젤과 세포를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합용액은 아파타이트(Apatite), 셀룰로스(cellulose), 젤란 (Gellan), 아가로즈 (Agarose), 키토산(Chitosan), 케라틴(Keratin), 및 콜라겐(Collagen)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 상기 혼합용액에 아파타이트를 더 포함할 경우, 물리적인 물성 강화 및 골형성 세포주에 대한 친화성 증가의 효과를 기대할 수 있다.
또한, 상기 혼합용액은 형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 싸이토카인, 및 캐모카인 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포는 암세포, 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포 및 골세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암세포는 폐암세포주(BEAS2B cell), 위암세포주(AGS cell), 및 자궁경부암세포주(HeLa cell)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계는, 생분해성 고분자를 알긴산 수용액, 2가 양이온 수용액 또는 이들이 혼합된 용액에 용해시킨 후 pH 변화에 따라 색상이 변화되는 pH 지시제(pH indicator)을 첨가하여 캐스팅 젤 용액(casting gel solution)을 제조하는 단계, 및 상기 제조된 캐스팅 젤 용액을 캐스팅 트레이(casting tray)에 투입한 후 3차원 형상의 캐스팅 몰드(casting mold)를 캐스팅 트레이에 삽입하고 캐스팅 젤 용액을 굳힌 후 캐스팅 몰드를 제거하여 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생분해성 고분자는 아가로오스, 덱스트란, 실리카겔, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 2가 양이온 수용액은 염화칼슘(CaCl2), 황산칼슘(CaSO4), 및 탄산칼슘(CaCO3)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용액 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 pH 지시제는 페놀레드(phenol red), 브롬티몰블루(bromthymol blue), 및 페놀프탈레인(phenolphthalein)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 pH 지시제는 산성 조건에서 색상이 변화될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 3차원 형상의 캐스팅 몰드(casting mold)는 다면체, 원뿔, 원 기둥, 반구, 및 구 형상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 3차원 형상의 젤화된 구조체를 제조하는 단계는 제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하여 -4 내지 25℃에서 15 내지 25분 동안 젤화할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 젤화 조건에서, -4℃ 미만일 경우 세포의 생존능력이 급격히 저하되는 문제점이 발생할 수 있으며, 또한 25℃를 초과할 경우 젤라틴의 물리적 가교가 방해되는 문제점을 야기할 수 있는 바, 상기 젤화는 -4 내지 25℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 특히 세포를 포함하여 젤화를 유도한다는 점을 고려하였을 때 상기 젤화는 4℃에서 수행하는 것이 보다 바람직하다.
상기 3차원 형상의 캐스팅 젤몰드는 확산 작용을 이용한 이온가교 및 온도감응의 물리적 가교를 포함하는 이중가교를 동시에 진행하는 원스텝 방식의 젤화와 다양하고 복잡한 3차원 형상이 적용된 젤화를 가능하게 하며, 또한 젤화의 진행 및 완료를 캐스팅 젤몰드의 색변화로 확인 가능하다는 특징을 가진다.
또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제공한다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 제조
1. 재료 준비
아가로오스(agarose, Sigma Aldrich, 미국), 염화칼슘(CaCl2, Sigma Aldrich, 미국), 페놀레드 용액(phenol red, Sigma Aldrich, 미국), DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline; 이하 'DPBS', 웰진, 한국) 용액을 준비하였다.
젤라틴(type A from porcine skin)과 알지네이트 분말은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, 미국)로부터 구입하였다.
2. 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel) 제조
젤라틴 3 g을 DPBS 용액 100 ㎖에 첨가한 후 60℃로 유지하면서 자력가열교반기(대한과학, 한국)를 이용하여 완전히 용해시켜 젤라틴 용액을 제조하였다. 상기 제조한 젤라틴 용액에 알지네이트 분말 2 g을 첨가한 후 자력가열교반기를 이용하여 1시간 동안 완전히 용해시켜 알지네이트-젤라틴 혼합 용액을 제조하였다.
상기 알지네이트-젤라틴 혼합 용액을 0.45 ㎛의 시린지 필터(Macherey-Nagel, 독일)로 여과하여 하이드로젤을 제조하였고, 상기 제조된 하이드로젤을 멸균된 병(sterilized bottle)에 보관하여 사용하였다.
3차원 형상으로 젤화 하고자하는 하이드로젤을 37℃에서 프리-웜업(pre-warm up)한 후, 폐암세포주(이하 'BEARS2B cell', 한국세포주은행) 2×106 cell/㎖ 을 프리-웜업한 하이드로젤과 조심스럽게 혼합하여 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel)을 제조하였다.
3. 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold) 제작
0.5% 아가로오스를 300 mM CaCl2 용액에 녹인 후 페놀레드 용액을 5 mg/L 첨가하여 캐스팅 젤 용액(casting gel solution)을 제조하였다.
상기 캐스팅 젤 용액을 캐스팅 트레이(casting tray)에 투입한 후 3차원 반구 형상의 캐스팅 몰드를 캐스팅 트레이에 삽입하고 캐스팅 젤 용액을 완전히 굳힌 후 캐스팅 몰드를 조심스럽게 제거하여 3차원 반구 형상의 캐스팅 젤 몰드를 제작하였다.
4. 젤 캐스팅(gel casting)
상기 세포가 혼합된 하이드로젤을 캐스팅 젤 몰드에 40 ㎕을 분주하였고, 4℃ (또는 얼음통 안에 넣은 상태)에서 페놀레드 용액의 색이 붉은 색(염기성)에서 노란 색(산성)으로 변할 때 까지 젤화를 진행하였고, 3차원 반구 형상으로 젤화된 구조체를 포셉을 이용하여 틀에서 꺼내어 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제조하였다.
<실시예 2> 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 제조
폐암세포주 대신에 자궁경부암세포주(이하 'HeLa cell', 한국세포주은행)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제조하였다.
<실시예 3> 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 제조
트리칼슘 포스페이트(Tricalcium phosphate; 이하'TCP', Ca3(PO4)2, Sigma Aldrich, 미국) 2 중량%를 상기 실시예 1의 알지네이트-젤라틴 혼합 용액에 더 첨가하여 골아세포주(osteoblastic cell line: 이하 'MC3T3-E1', 한국세포주은행)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체를 제조하였다.
<실험예 1> pH 변화에 따른 젤화 평가
도 2 및 도 3을 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3에 따른 젤 캐스팅(gel casting) 단계에서, Ca2+가 틀에서 확산(diffuse)되어 알지네이트를 젤화시킴에 따라 틀의 pH가 산성으로 되고 이에 따라 pH 지시제인 페놀레드 용액에 의해 틀의 색상이 붉은 색(염기성)에서 노란 색(산성)으로 변화되었다. 상기 틀의 색상 변화를 통해 젤화가 일어남을 간편하게 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 생체적합성(Biocompatibility) 평가
상기 실시예 1 내지 실시예 3에 의해 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 생체적합성을 평가하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 3에 의해 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체에, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; 이하 'FBS 'Gibco, 미국)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium ; DMEM)/저 포도당(low glucese) 배지를 첨가하여 37℃에서 배양하였다.
각 배양 시간별로 배양된 3차원 지지체에 100 mM 시트르산 나트륨(sodium citrate) 용액 200 ㎕을 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 지지체의 형태를 분해 시킨 후, EZ-cytox(대일랩 서비스, 한국) 20 ㎕을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정(Molecular Device, 미국)하였다.
도 4 내지 도 6을 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3의 모든 세포주는 정상적으로 증식이 이루어졌으며, 대체로 5 내지 7일째에 가장 많은 증식을 나타내었는 바, 상기 실시예 1 내지 실시예 3에 의해 제조된 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체의 생체적합성을 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (14)

  1. 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel)을 제조하는 단계;
    3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계로서, 생분해성 고분자를 상기 세포가 혼합된 하이드로젤의 가교를 위한 알긴산 수용액, 2가 양이온 수용액 또는 이들이 혼합된 용액에 용해시켜 캐스팅 젤 용액(casting gel solution)을 제조하는 단계, 및
    상기 제조된 캐스팅 젤 용액을 캐스팅 트레이(casting tray)에 투입한 후 3차원 형상의 캐스팅 몰드(casting mold)를 캐스팅 트레이에 삽입하고 캐스팅 젤 용액을 굳힌 후 캐스팅 몰드를 제거하여 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드(casting gel mold)를 제작하는 단계를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 상기 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하고 젤화하여 3차원 형상으로 젤화된 구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포가 혼합된 하이드로젤(cell mixed hydrogel) 제조하는 단계는,
    젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 혼합용액을 준비하는 단계,
    상기 준비된 혼합용액을 여과하여 하이드로젤을 제조하는 단계, 및
    상기 제조된 하이드로젤과 세포를 혼합하는 단계를 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 혼합용액은,
    아파타이트(Apatite), 셀룰로스(cellulose), 젤란(Gellan), 아가로즈(Agarose), 키토산(Chitosan), 케라틴 (Keratin), 및 콜라겐(Collagen)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 더 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 혼합용액은,
    형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 싸이토카인, 및 캐모카인으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 더 포함하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 세포는,
    암세포, 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포 및 골세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 암세포는,
    폐암세포주(BEAS2B cell), 위암세포주(AGS cell), 및 자궁경부암세포주(HeLa cell)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 캐스팅 젤 용액은 pH 변화에 따라 색상이 변화되는 pH 지시제(pH indicator)를 더 포함하는 것인, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는,
    아가로오스, 덱스트란, 실리카겔, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 2가 양이온 수용액은,
    염화칼슘(CaCl2), 황산칼슘(CaSO4), 및 탄산칼슘(CaCO3)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용액인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 pH 지시제는,
    페놀레드(phenol red), 브롬티몰블루(bromthymol blue), 및 페놀프탈레인(phenolphthalein)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 pH 지시제는,
    산성 조건에서 색상이 변화되는 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 3차원 형상의 캐스팅 몰드(casting mold)는,
    다면체, 원뿔, 원 기둥, 반구 및 구 형상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 3차원 형상의 젤화된 구조체를 제조하는 단계는,
    제작된 3차원 형상의 캐스팅 젤 몰드에 세포가 혼합된 하이드로젤을 분주하고 -4 내지 25℃에서 15 내지 25분 동안 젤화하는 것을 특징으로 하는, 이중가교를 갖는 3차원 세포배양 지지체 제조방법.
  14. 삭제
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