KR102244760B1 - 혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체 및 제조방법 - Google Patents

혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

혈청유래 유도단백질을 포함하는 다공성 세포지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체에 의하면 세포를 안정적으로 및 지속적으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라 세포마다 세포의 특성에 맞는 배양 양상을 나타내어 실제 조직을 모사할 수 있고, 안정적 배양 및 높은 생체 내 생착률을 가져, 오가노이드를 이용한 약물 활성 및 독성 평가, 세포치료제, 또는 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체 및 제조방법{POROUS SCAFFOLD INCLUDING INDUCIBLE PROTEIN FROM SERUM AND MANUFACTURING METHOD OF THE SAME}
혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
다공성 지지체는 상처치유, 화상치유, 약물 전달 및 손상조직 재생을 위한 지지체로서 널리 응용되고 있다. 특히 손상된 조직의 재생을 위한 지지체는 소량의 조직편으로부터 추출, 분리한 세포를 충분한 양으로 배양하는데 적합한 구조와 안정성이 요구되며 체내 이식 후 부작용이 나타내지 않는 생체 적합성과 생분해성을 가지고 있어야 한다. 따라서 세포의 재생과 성장을 효과적으로 실현하기 위한 생분해성 지지체는 조직 세포가 지지체의 표면에 점착하여 3차원 구조의 조직을 형성할 수 있는 다공성 구조를 가져야 하며 수분과 세포 성장인자 등의 이동이 용이하고 세포의 부착과 성장에 적합하여야 한다. 또한 다공성 지지체는 체내에 이식된 후 주위 조직과 잘 융화되어야 하며 염증반응 등의 부작용이 없고, 조직이 재생된 후에는 스스로 생분해되어 이물질로 잔류하지 않아 높은 생체적합성을 갖고 있어야 한다. 따라서 생체 적합성, 생분해성, 그리고 기계적 물성이 우수한 다공성 지지체는 조직의 재생과 복원에 필수적이다.
세포배양 관련 생물 의약품 산업 시장은 2011년 이후 매년 두 자릿수 성장세를 보이고 있다. 특히 2014년에는 1천200억 달러 이상의 시장이 형성됐으나, 국내에는 3차원 세포배양 관련 전문 인력이 부족하여 외국기관에 의존하고 있는 실정이다. 3차원 세포배양 기술은 약물효능과 독성검색뿐만 아니라 인공장기 개발 등에도 활용되는 미래전망이 밝은 첨단 기술이며 BCC 리서치에 따르면 시장규모는 2016년에 60억 달러 정도로 추정된다. 매년 10% 이상 성장세를 유지해 2019년에는 80억 달러 규모까지 성장할 것으로 예측되고 있다. 또한, 조직공학 및 재생 관련 시장(세포기반 인공장기 포함)은 전 세계적으로 2016년 136억 달러 규모에서 2021년에는 608억 달러에 이를 것으로 예상되고 있고, 연 평균 34.9%의 높은 성장률이 기대되는 유망 분야이다.
따라서 높은 생착률과 보관성을 가지며 실제 인간조직과 유사하게 구현되는 세포 집합체를 생산하기 위한 다공성 세포지지체에 대한 연구가 요구되고 있다.
일 양상은 분리된 혈청 또는 혈장단백질 수용액에 가교제를 처리하여 혈청 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 교차 결합시킨 후, 환원제로 환원시켜 수득된 혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은, 다공성 세포지지체; 및 상기 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포를 포함하는 조직 수복 또는 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은, 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 3차원 세포집합체에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는 후보 물질의 약리학적 활성 또는 독성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은, 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 3차원 세포집합체의 배양물 또는 배양액으로부터 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은, 분리된 혈청 또는 혈장 단백질 수용액에 가교제를 처리하여 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 교차 결합시키는 단계; 교차 결합된 혈청 또는 혈장단백질 수용액 내 단백질을 환원제로 반응시켜 반응물을 수득하는 단계; 및 상기 반응물을 균질화하여 혈청 유래 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 혈청 유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 분리된 혈청 또는 혈장단백질 수용액에 가교제를 처리하여 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 교차 결합시킨 후, 환원제로 환원시켜 수득된 혈청유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체를 제공한다.
본 명세서에서 용어,"혈청유래 단백질"은 통상적으로 조직배양에 사용되는 우태혈청(fetal bovine serum: FBS), 우아혈청(bovine calf serum: BCS) 또는 다른 동물(예를 들면, 포유류 또는 인간)로부터 유래된 혈청에 가교제를 처리하여 혈청 내 단백질을 교차 결합시켜 수득된 단백질을 의미할 수 있다. 또한 혈청 내 단백질인 혈청알부민, 지질단백질, 햅토글로빈, 트랜스페린, 세룰로플라스민, 면역글로불린, 각종 보체, 피브리노겐, 프로트롬빈, 플라스미노겐, 키니노겐, 프레칼리크레인, 피브로넥틴, α2-HS-당단백질, 앤지오텐시노겐, 호르몬 등으로 혈액 중에 일시적으로 존재하는 단백질의 수용액 내 단백질을 교차 결합시켜 수득된 단백질을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 쓰이는 가교제는 덱스트란 다이알데하이드(dextran dialdehyde), 1-에틸 3-[3-디메틸마이노프로필]카보이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carboimide hydrochloride), 비닐아민(vinylamine), 2-아미노에틸 메타크릴레이트(2-aminoethyl methacrylate), 3-아미노프로필 메타크릴아마이드(3-aminopropyl methacrylamide), 에틸렌 디아민(ethylene diamine), 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(ethylene glycol dimethacrylate), 메틸메타크릴레이트(methyl methacrylate), N,N'-메틸렌-비스아크릴아마이드(N,N′-methylene-bisacrylamide), N,N'-메틸렌비스 메타크릴아마이드(N,N′-methylenebis-methacrylamide), 디알릴타르타르디아마이드(diallyltartardiamide), 알릴(메타)아크릴레이트(allyl(meth)acrylate), 저급 알킬렌 글라이콜 디(메타)아크릴레이트(lower alkylene glycol di(meth)acrylate), 저급 폴리 알킬렌 글라이콜 디(메타)아크릴레이트(poly lower alkylene glycol di(meth)acrylate), 저급 알킬렌 디(메타)아크릴레이트(lower alkylene di(meth)acrylate), 디비닐 에테르(divinyl ether), 디비닐 설폰(divinyl sulfone), 디비닐벤젠(divinylbenzene), 트리비닐벤젠 (trivinylbenzene), 트리메틸올프로판 트리(메타)아크릴레이트(trimethylolpropane tri(meth)acrylate), 펜타데리트리톨 테트라(메타)아크릴레이트(pentaerythritol tetra(meth)acrylate), 비스페놀 에이 디(메타)아크릴레이트(bisphenol A di(meth)acrylate), 메틸렌비스(메타)아크릴아마이드(methylenebis(meth)acrylamide), 트리알릴 프탈레이트(triallyl phthalate), 다이알릴 프탈레이트(diallyl phthalate), 알릴글리시딜 에테르(allyl glycidyl ether), 알킬 클로라이드(alkyl choloride),　트랜스글루타미네이즈(transglutaminase), 라이실 옥시데이즈(lysyl oxidase), 단백질 디설파이드-이소머레이즈(protein disulfide-isomerase), 단백질 디설파이드 리덕테이즈(protein-disulfide reductase), 설프히드리일 옥시데이즈(sulfhydryl oxidase), 리폭시제네이즈(lipoxygenase), 폴리페놀 옥시데이즈(polyphenol oxidase), 타이로시네이즈(tyrosinase), 퍼옥시데이즈(peroxidase), 락카아제(laccase), 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈(Horseradish peroxidase) 및 이들의 조합을 포함하며 이 외에도 단백질을 결합시키는 물질이라면 모두 적용 가능하다.
상기 가교제 중 효소 가교제는 임의의 미생물(예를 들면, Streptoverticillium mobaraense) 유래의 효소일 수 있다.
본 명세서 내 용어, "환원제"는 혈청 내 단백질의 이황화 결합을 환원시키는 물질을 의미한다. 본 명세서에서 쓰이는 환원제는 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), 다이싸이올쓰레이톨(ditiolthreitol: DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP)), 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione) 및 트리스하이드록시프로필 포스핀(Tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP))를 포함하며 이 외에도 단백질의 이황화결합을 환원시키는 물질이라면 모두 적용 가능하다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체의 기공 크기는 50 내지 600㎛, 100 내지 550㎛, 150 내지 500㎛, 200내지 450㎛, 250내지 400㎛, 300 내지 350㎛, 50 내지 300㎛, 100 내지 250㎛, 150 내지 200㎛, 300 내지 600㎛, 350 내지 550㎛, 400 내지 500㎛일 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체의 탄성율은 1 내지 10 kPa, 2 내지 8 kPa, 3 내지 8 kPa, 1 내지 5 kPa, 4 내지 10 kPa, 6 내지 10 kPa, 1 내지 3 kPa, 또는 4 내지 6kP일 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체의 공극률은 10 내지 80%, 20 내지 80%, 30 내지 70%, 40 내지 60%, 10 내지 40%, 10 내지 30%, 50 내지 80%, 또는 60 내지 80%일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 다공성 세포지지체는 고체, 또는 반고체로 가역적인 상전이가 일어날 수 있다. 또한, 상기 다공성 세포지지체는 불용성일 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체는 조직공학, 수복 또는 재생에 특히 적합하다. 공극율의 차이는　다공성 세포지지체의 적절한 부위로 상이한　세포　유형의 이동을 가능하게 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 공극율의 차이는 발달/수복/재생 조직의 적절한 구조화에 요구되는,　다공성 세포지지체를 포함하는　세포　유형 중에서 적절한　세포와　세포의 연결의 발달을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어,　세포　처리의 확장은　다공성 세포지지체성 물질의 다양한 공극율을 통해 더욱 적절하게 조절될 수 있다. 따라서,　다공성 세포지지체는 임의의 조직　세포를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체의 용도는 조직공학, 3D 세포 배양 또는 치료적 사용을 위한 세포 운반용을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 다공성 세포지지체는 세포가 분주된 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군을 포함할 수 있다.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포(in vitro), 이식된 세포(graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보(in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포(mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포는, 연골세포; 섬유연골세포; 골세포; 골아세포; 파골세포; 윤활막세포; 골수세포; 신경세포; 지방세포; 간엽세포; 상피세포, 간세포, 근육세포; 기질세포; 혈관세포; 줄기세포; 배아줄기세포; 중간엽줄기세포; 지방 조직으로부터 유래된 전구세포; 말초혈액 전구세포; 성체조직으로부터 단리된 줄기세포; 유도만능줄기세포(iPS　세포), 이들로부터 유래된 종양세포 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 다공성 세포지지체는 분주된 세포의 분화 또는 증식을 유도하기 위한 성장인자, 성장자극제, 생리활성 물질, 또는 세포결합 매개물질인 펩티드나 다당류 등을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 성장 인자 또는 성장 자극제는 세포　부착 매개체; 생물학적 활성 리간드; 인테그린 결합 시퀀스; 리간드; 다양한 성장 및/또는 분화 제제 (예컨대, 상피세포　성장인자, IGF-I, IGF-II, TGF-[베타], 성장 및 분화 인자, 기질 유래 인자 SDF-1; 혈관내피 성장인자, 섬유아세포　성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유래 성장인자 및 변형성 성장인자, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드, bFGF; 신경 성장인자(NGF) 또는 근육 형성인자(MMF); 헤파린 결합 성장인자(HBGF), 변형성 성장인자 알파 또는 베타, 알파 섬유아세포성 성장인자(FGF), 상피세포　성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), SDF-1; TGF[베타] 슈퍼패밀리 인자; BMP-2; BMP-4; BMP-6; BMP-12; 소닉 헤지호그; GDF5; GDF6; GDF8; PDGF); 특정 성장인자의 상향조절에 영향을 미치는 소분자; 테나신-C; 히알루론산; 콘드로이틴 설페이트; 피브로넥틴; 데코린; 트롬보플라스틴; 트롬빈 유래 펩티드; TNF 알파/베타; 매트릭스 메탈로프로티네이즈(MMP); 헤파린-결합 도메인; 헤파린; 헤파란 설페이트; DNA 절편, DNA 플라스미드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 형질감염체 또는 이의 임의의 혼합물이 포함될 수 있다.
또 다른 양상은, 분리된 혈청 또는 혈장 단백질 수용액에 가교제를 처리하여 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 교차 결합시키는 단계; 교차 결합된 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 환원제로 반응시켜 반응물을 수득하는 단계; 및 상기 반응물을 균질화하여 혈청 유래 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 혈청 유래 단백질을 포함하는 다공성 세포지지체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 분리된 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 에 가교제를 처리하는 단계에 있어서, 가교제의 특이 활성도는 대략 2 내지 100 unit/mg, 7 내지 95 unit/mg, 12 내지 90 unit/mg, 17 내지 85 unit/mg, 22 내지 80 unit/mg, 27 내지 75 unit/mg, 32 내지 70 unit/mg, 37 내지 65 unit/mg, 42 내지 60 unit/mg, 47 내지 55 unit/mg, 2 내지 50 unit/mg, 7 내지 45 unit/mg, 12 내지 40 unit/mg, 17 내지 35 unit/mg, 22 내지 30 unit/mg, 50 내지 100 unit/mg, 55 내지 95 unit/mg, 60 내지 90 unit/mg, 65 내지 85 unit/mg, 70 내지 80 unit/mg, 2 내지 30 unit/mg, 7 내지 25 unit/mg, 12 내지 20 unit/mg, 30 내지 60 unit/mg, 35 내지 55 unit/mg, 40 내지 50 unit/mg, 60 내지 100 unit/mg, 65 내지 95 unit/mg, 70 내지 90 unit/mg, 75 내지 85 unit/mg일 수 있다.
본 명세서에서 특이 활성도는 기질 단백질(본 명세서에서 혈청, 또는 혈청 내 단백질) 당 단위 유닛을 의미할 수 있다.
상기 혈청 또는 혈장 단백질 수용액 내 단백질을 환원제와 반응시키는 단계에 있어서, 환원제의 농도는 대략 5 내지 50 mM, 10 내지 45 mM, 15 내지 40 mM, 20 내지 35 mM, 25 내지 30mM, 5 내지 25 mM, 10 내지 20 mM, 25 내지 50 mM, 30 내지 45 mM, 35 내지 40 mM일 수 있다. 상기 환원제와의 반응은 20 내지 40 ℃에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 반응물을 균질화하여 혈청 유래 단백질을 수득하는 단계에 있어서, 상기 균질화는 조직 분쇄기(homogenizer)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 단계는 또한 균질화 시킨 후 원심 분리하여 혈청 유래 단백질의 현탁액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 혈청 유래 단백질을 숙성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 숙성하는 단계는 혈청 유래 단백질을 세척하는 단계; 및 상기 세척된 혈청 유래 단백질을 1 내지 15 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 숙성된 혈청 유래 단백질을 성형하고 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 성형은 목적하는 모양 및 크기의 캐스팅 몰드에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 동결 건조는 -40 ℃ 내지 - 240 ℃에서 1분 내지 3시간 동안 동결시킨 후, 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 건조된 혈청 유래 단백질을 수용액 또는 유기용매로 세척하여 단백질 이외의 불순물을 세척하는 단계; 또는 상기 세척된 혈청 유래 단백질을 보존액에 침지하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 세포를 안정적으로 및 지속적으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라 세포마다 세포의 특성에 맞는 배양 양상을 나타낼 수 있는 효과가 있다. 또한, 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 세포배양 디쉬 및 플레이트에서 배양하는 기존의 2D 배양 방법으로도 장기간 배양이 가능한 효과가 있다.
일 양상은, 다공성 세포지지체; 및 상기 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포를 포함하는 조직 수복 또는 재생용 조성물에 관한 것이다.
상기 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포는 3차원 배양된 3차원 세포집합체일 수 있다.
본 명세서 내 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FTA 규정)으로서, 세포 또는 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 세외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는," "도포하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 패치 또는 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 패치 또는 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
본 명세서 내 용어, "세포집합체"또는 "3차원 세포집합체"는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 다세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 다세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 기질 세포로부터 분화된 세포 유사-조직체를 포함할 수 있다.
본 명세서 내 용어, "3차원(three-dimensional)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들어, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있다. 3차원 세포집합체는 일반적인 세포집합체와 같이 세포의 단일 층으로 형성된 세포집합체가 아닌, 세포의 다층 또는 구형 등으로 형성된 것인 세포집합체를 의미할 수 있다.
상기 조직은 심장, 관절, 골, 혈관, 위, 간, 피부, 신장, 연골, 장, 신경, 또는 췌장일 수 있다. 통상의 기술자는 목적하는 조직 재건을 위해, 그에 맞는 체세포 또는 줄기세포를 상기 다공성 세포지지체 내에 분주할 수 있다. 또는 해당 조직에서 유래한 종양세포의 연구를 위해 동일한 방법을 적용할 수 있다.
일 구체예에 따른 다공성 세포지지체는 생체 내 이식시 높은 생착율을 갖고 3차원 세포집합체를 형성하거나 조직으로 분화될 수 있어 조직 수복 또는 재생에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다. 또한, 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체는 동결과 융해에도 안정한 세포배양능을 갖기 때문에, 세포 치료제의 제품화에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
상기 3차원 세포집합체는 육안으로 식별 가능한 크기의 구형 또는 시트일 수 있으며, 예를 들면, 직경이 대략 300 내지 2000 ㎛인 구형의 3차원 세포집합체일 수 있고, 일 구체예에 있어서, 300 내지 1000 ㎛ 일 수 있다. 상기 구형의 3차원 세포집합체의 직경은 일 구체예에 따른 배양 방법에 의해 통상의 당업자가 육안으로 식별 가능한 크기로 조절할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 구형의 3차원 세포집합체는 직경 400 ㎛ 내에 대략 3.0Х105 내지 1.0Х106 개의 세포를 포함할 수 있다. 또한 일 구체예에 있어서, 상기 3차원 세포집합체는 다양한 단백질 및 기능성 물질을 분비할 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체는 세포치료제 또는 생리활성물질의 공급 시에 세포원(source)로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이하, 상기 3차원 세포집합체의 용도는 다음과 같다.
상기한 바와 같이, 3차원 세포집합체는 상피세포성장인자, 다양한 단백질 및 기능성물질을 분비할 수 있기 때문에, 이를 필요로 하는 개체에 이식되어 세포공급원으로서의 역할을 수행함으로써 피부 재생, 또는 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 또한 조직 재생 또는 조직 신생을 촉진함으로써 심장, 위장, 간, 피부, 신장, 연골, 장, 신경, 또는 췌장 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에도 유용하게 이용될 수 있다.
상기 심장 관련 질환은 예를 들면, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 판막질환, 대동맥질환 및 부정맥을 포함하는 것일 수 있다. 상기 위장 관련 질환은 위염, 위궤양, 위암, 위선종, 헬리코박터 파일로리 감염 및 위 MALT 림프종을 포함하는 것일 수 있다. 상기 간 관련 질환은 간염, 유육종증, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변증, 임신 중독증, 비호지킨 림프종, 윌슨병, 라이 증후군, 기타 신생아 황달, 간흡충증, 간농양 및 간혈관종을 포함하는 것일 수 있다. 상기 피부 관련 질환은 습진성 피부질환, 홍반, 두드러기, 약발진, 구진인설질환, 곤충 및 기생충 매개 질환, 표재성 피부 진균증, 세균 감염 질환, 바이러스 질환, 성인성 질환, 자가면역 수포성 질환, 결체조직 질환, 색소이상증, 여드름, 주사 및 피부 종양을 포함하는 것일 수 있다. 상기 신장 관련 질환은 급성 콩팥 손상(급성 신부전), 만성 콩팥병(만성 신부전), 말기 만성 신부전, 만성 사구체신염, 급속 진행성 사구체신염, 급성 사구체신염, 급성 신장염, 급성 간질성 신염, 만성 간질성 신염, 혈뇨, 단백뇨, 무증상성 요이상, 신증후군, 급성 신우신염, 요세관 결손, 유전성 신질환, 신장 결석, 수신증, 신성 요붕증, 신세포암, 이행상피세포암, 혈관근지방종, 상염색체우성 다낭신종, 단순 낭종 및 신장 결핵을 포함하는 것일 수 있다. 상기 연골 관련 질환은 퇴행성 관절염, 외상 후 관절염, 박리성 골 연골염 및 골연화증을 포함하는 것일 수 있다. 상기 장 관련 질환은 궤양, 장염, 출혈, 종양, 장유착, 장폐쇄, 장마비, 대장암, 대장용종, 과민성장증후군, 궤양성대장염 및 크론병, 결핵성장염, 감염성 설사 및 대장염, 혈관성장질환 및 대장게실증을 포함하는 것일 수 있다. 상기 신경 관련 질환은 선천성 기형, 암, 감염, 외상, 출혈 및 자가면역질환을 포함하는 것일 수 있다. 상기 췌장 관련 질환은 당뇨병, 급성 췌장염, 만성 췌장염 및 췌장암을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 유효성분을 구성하는 3차원 세포집합체를 기준으로 대략 1.0Х 105 내지 1.0Х 108 세포/kg(체중), 또는 1.0Х 107 내지 1.0Х 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 및 기타 반려동물 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 세포집합체와 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조직 재건 또는 수복용 조성물, 세포치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약 학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 조직 재건 또는 수복용 조성물, 세포치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
또 다른 양상은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템을 제공한다.
또 다른 양상은, 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 3차원 세포집합체에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는 후보 물질의 약리학적 활성 또는 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
상기 후보 물질은, 예를 들면, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물(small molecule compound), 항체(Antibody), 안티센스 뉴클레오티드(Antisense nucleotide), 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 핵산(Nucleic acid), 단백질(Protein), 펩티드(Peptide), 기타 추출물(Extract) 또는 천연물(Nature product)을 포함할 수 있다.
상기 3차원 세포집합체는 생체 내 환경을 모방한 인위적인 세포 형태를 갖는 것으로서, 실제의 세포 형태 및 기능 연구, 또는 치료제(예를 들면, 상기의 피부 질환 또는 혈관 질환) 등에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 3차원 세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템은 의약품 또는 화장품 등의 질병 치료제 효능 테스트, 또는 염증 및 알레르기 테스트 등을 위한 실험에 있어서, 동물실험을 대체할 수 있다.
또 다른 양상은, 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 3차원 세포집합체의 배양물 또는 배양액으로부터 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 목적 물질은 목적 단백질일 수 있다.
상기 배양은 탄소원을 함유하는 배지에서 배양되는 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "탄소원"은 숙주 생물 또는　생산　세포주에 의해 대사될 수 있는 것 등의 미생물의 에너지원으로서 바람직한 발효가능한 탄소 기질, 일반적으로 공급원 탄수화물, 복합 영양 물질 등과 같이 특히 정제된 형태 또는 원료 물질로 제공되는, 단당류, 올리고당류, 다당류, 글리세롤을 포함한 알콜류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공급원을 의미한다. 탄소원은 단일 탄소원으로 또는 상이한 탄소원의 혼합물로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적　단백질(Product of interest, POI)"은 숙주　세포에서 재조합 기술에 의해　생산되는 폴리펩티드 또는　단백질을 지칭한다. 더욱 구체적으로는,　단백질은 숙주　세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드(즉, 이종성　단백질)일 수 있거나, 숙주　세포에 대해 천연적일 수 있지만(즉, 숙주　세포에 대해 상동성　단백질), 예를 들면, POI를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 자가 복제 벡터를 사용한 형질전환에 의해, 또는 숙주　세포의 게놈 내로 POI를 인코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 카피의 재조합 기술에 의한 통합으로, 또는, 예를 들면, 프로모터 서열의 POI를 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열의 재조합 변형에 의해　생산된다. 몇몇 경우, 본원에 사용된 용어 POI는 재조합에 의해 발현된　단백질에 의해 매개된 바와 같은 숙주　세포에 의한 임의의 대사 생성물을 지칭한다. 구체적으로, POI는 진핵　세포　단백질, 바람직하게는 포유동물　단백질이다. POI는 진핵　세포, 바람직하게는 효모　세포에서 분비된　단백질로서　생산되는 이종성 재조합 폴리펩티드 또는　단백질이다. 단백질의 예는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 아프로티닌, 조직 인자 경로 억제제 또는 기타 프로테아제 억제제, 및 인슐린 또는 인슐린 전구체, 인슐린 유사체, 성장 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화제, 형질전환 성장 인자 a 또는 b, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2(GLP-2), GRPP, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 XIII, 혈소판 유래된 성장 인자 1, 혈청 알부민, 효소, 예를 들면, 리파제 또는 프로테아제, 또는 천연　단백질과 유사한 기능을 갖는 기능적 유사체, 기능적 등가 변이체, 유도체 및 생물학적 활성 단편이다. POI는 천연　단백질과 구조적으로 유사할 수 있고, C- 및 N-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 또는 천연　단백질의 측쇄에 하나 이상의 아미노산의 부가, 천연 아미노산 서열 중의 하나 또는 다수의 상이한 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 천연　단백질의 하나 또는 두 말단에서 또는 아미노산 서열 중의 하나 또는 몇몇 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 천연　단백질로부터 유래할 수 있다. 이러한 변형은 상기 언급한 몇몇　단백질에 대해 공지되어 있다.
본 발명에 따라　생산된 POI는 다량체　단백질, 바람직하게는 이합체 또는 사량체일 수 있다. POI는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 치료학적　단백질, 효소 및 펩티드,　단백질　항생물질, 독소 융합　단백질, 탄수화물-단백질　접합체, 구조적　단백질, 조절　단백질, 백신 및 백신 유사　단백질　또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토킨 또는 POI의 대사물질로부터 선택된 재조합 또는 이종성　단백질이다. 특정 POI는 항체 등의 항원 결합 분자 또는 이의 단편이다. 특정 POI 중에는 모노클로날 항체(mAb), 면역글로불린(Ig) 또는 면역글로불린 부류 G(IgG), 중쇄 항체(HcAb') 또는 이들의 단편, 예를 들면, 단편-항원 결합(Fab), Fd, 일본쇄 가변 단편(scFv), 또는 이의 조작된 변이체, 예를 들면, Fv 이량체(디아바디), Fv 삼량체(트리아바디), Fv 사량체 또는 미니바디 및 VH 또는 VHH 또는 V-NAR 등의 단일-도메인 항체와 같은 항체이다.
POI는 이와 같이 수득된 형질전환체를 적절한 배지에서　배양하고, 발현된 생성물 또는 대사물질을　배양물로부터 단리하고, 이를 적합한　방법으로 임의로 정제함으로써 재조합 숙주　세포주를 사용하여　생산할 수 있다.
본 발명에 따르는 형질전환체는 이러한 벡터 DNA, 예를 들면, 플라스미드 DNA를 숙주 내로 도입하고, POI 또는 숙주　세포　대사물질을 고수율로 발현시키는 형질전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다. 숙주　세포는 전기 펄스법, 원형질체　방법, 리튬 아세테이트　방법, 칼슘 클로라이드 방법　및 이의 변형　방법　등과 같이 진핵　세포의 형질전환에 통상 사용되는　방법으로 외래 DNA를 도입할 수 있도록 처리된다.
본 발명에 따르는 바람직한 숙주　세포주는 본 발명에 따라 사용된 유전적 특성을 유지하고,　생산　수준은 높게, 예를 들면, 약 20 계대　배양, 적어도 30 계대 배양, 적어도 50 계대　배양　후에도 적어도 ㎍ 수준으로 유지된다.
본원에 개시된　방법은 분비된 형태로 또는　세포내 생성물로서 POI의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 재조합 숙주　세포를　배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 재조합에 의해　생산된 POI 또는 숙주　세포 대사 물질은　세포　배양　배지로부터 단리될 수 있고, 당업자에게 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명에 따라　생산된 POI는 통상적으로 당해 기술분야의 기술 상태를 사용하여 단리되고 정제될 수 있고, 이는　목적하는 POI 농도의 증가 및/또는 적어도 하나의 불순물 농도의 감소를 포함한다.
POI가　세포로부터 분비되는 경우, 이는 당해 기술분야의 기술 상태를 사용하여　세포　배지로부터 단리 및 정제될 수 있다. 숙주　세포로부터 재조합 발현 생성물의 분비는, 효모　세포가 파쇄되어　세포내　단백질을 방출하는 경우에 발생하는　단백질의 복잡한 혼합물이 아닌　배양　상층액으로부터 회수되기 때문에, 정제 공정의 촉진을 포함하는 이유에서 일반적으로 유리하다.
또한,　배양된 형질전환체　세포는 초음파 또는 기계적, 효소적 또는 화학적으로 파쇄되어, POI가 분리 및 정제되는,　목적하는 POI를 함유하는　세포　추출물을 수득할 수 있다.
재조합 폴리펩티드 또는　단백질　생성물을 수득하는 분리 및 정제　방법으로서는, 용해도 차이를 이용하는　방법(예를 들면, 염석(salting out) 및 용매 침전), 분자량 차이를 이용하는　방법(예를 들면, 초음파 및 겔 전기영동), 전하 차이를 이용하는　방법(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피), 특이적 친화성을 이용하는　방법(예를 들면, 친화성 크로마토그래피), 소수성 차이를 이용하는　방법(예를 들면, 역상 고성능 액체 크로마토그래피) 및 등전점 차이를 이용하는　방법(예를 들면, 등전점 전기영동) 등의　방법이 사용될 수 있다.
고도로 정제된 생성물은 오염　단백질을 본질적으로 함유하지 않고, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95% 또는 적어도 98%, 100% 이하의 순도를 갖는다. 정제된 생성물은　세포　파편으로부터　세포　배양　상층액 등의 정제에 의해 수득할 수 있다.
단리 및 정제　방법으로서는 하기 표준　방법이 바람직하다:　세포　파괴(POI가　세포내에서 수득되는 경우),　세포(파편) 분리 및 정밀여과 또는 접선 유동 필터(TFF)에 의한 세척 또는 원심분리, 침전 또는 열 처리에 의한 POI 정제, 효소적 소화에 의한 POI 활성화, 크로마토그래피, 예를 들면, 이온 교환(IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제(SEC) 또는 HPLC 크로마토그래피에 의한 POI 정제, 농축의 POI 침전 및 한외여과 단계에 의한 세척.
분리 및 정제된 POI는 통상의　방법, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅, HPLC, 활성 분석 또는 ELISA에 의해 동정될 수 있다.
일반적으로, 재조합 생성물을 발현하는 숙주　세포는 POI의 재조합 발현에 적합한 임의의 진핵　세포일 수 있다. 포유동물　세포의 예는 BHK, CHO(CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHO-K1, CHOK1SV, CHO-S), HeLa, HEK293, MDCK, NIH3T3, NS0, PER.C6, SP2/0 및 VERO　세포이다. 숙주　세포로서 사용된 효모의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 사카로마이세스 속(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애), 피키아 속(예를 들면, 피. 파스토리스 또는 피 메타노리카), 코마가타엘라 속(케이. 파스토리스, 케이. 슈도파스토리스 또는 케이. 파피이), 한세눌라 폴리모르파 또는 클루이베로마이세스 락티스를 포함한다.
일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 세포를 안정적으로 및 지속적으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라 세포마다 세포의 특성에 맞는 배양 양상을 나타내어 실제 조직을 모사할 수 있고, 안정적 배양 및 높은 생체 내 생착률을 가져, 오가노이드를 이용한 약물 활성 및 독성 평가, 세포치료제, 또는 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 SNU017 위암 세포주를 9일간 배양한 결과이다.
도 2는 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 SiHA 자궁경부암 세포주를 14일간 배양한 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 hACs(연골세포)를 7일간 배양한 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 장내분비세포를 13일 동안 배양한 결과이다.
도 5는 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용한 장내분비세포(Enteroendocrine Cell: EEC)의 3차원 세포집합체를 마우스의 신장막에 주입한 후 일주일의 경과다.
도 6은 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 간암세포를 12일간 배양 후 동결 융해 시험을 실시한 결과이다.
도 7은 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체를 이용해 배양된 간암세포와, 양성 대조군에서 배양된 간암세포의 알부민에 대해 ELISA 방법을 사용하여 발현량을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다공성 세포지지체의 제조
혈청 유래 단백질을 이용한 다공성 세포지지체는 아래와 같이 제조한다.
먼저, 가교제로 혈청 단백질을 교차결합 및 환원제로 환원시켰다. 구체적으로, Class 100이하의 클린 부스에서, 동량의 우태혈청이나 우아혈청을 1mg/ml 마이크로비얼 트랜스글루타미나아제(특이 활성 단위 20 U/mg, Sigma Aldrich)를 처리하였다. 이후에, 최종농도 15mM로 환원제인 다이싸이오쓰레이톨(Dithiothreitol:DTT, Sigma Aldrich)을 첨가하여 37 ℃에서 12시간 반응시켜 반응물을 제조하였다. 이후에, 상기 반응물에 워싱 버퍼(6M urea and 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0) 를 첨가하고 전동식 조직 분쇄기(Homogenizer D1000, Benchmark Scientific)로 균질화시킨 후 원심 분리하여 혈청 유래 단백질의 현탁액을 회수하였다. 상기 현탁액을 젖산으로 세척한 후 고속교반기(MaXtir?? 500S, DAIHAN-brand®)를 사용하여 10,000rpm으로 20분간 교반시키고, 4℃에서 8시간 숙성하였다. 상기 숙성된 혈청 유래 단백질을 원하는 모양으로 성형하기 위해 캐스팅 몰드로 옮기고 -80 ℃에서 1시간 동결시킨 후 24시간 동안 동결건조시켰다. 이후에, 건조된 혈청유래 단백질을 상온에서 100% 에탄올과 멸균된 3차 증류수로 각각 5회 수세하여 혈청유래 단백질 외의 불순물을 세척하여 혈청 유래 단백질의 다공성 세포지지체를 제조하였다. 이후의 실험에서는 상기 혈청 유래 단백질의 다공성 세포지지체를 보존액(1XPBS, cell culture media, DW 등)에 침지하여 사용하였다.
상기 제조한 세포 지지체의 특성은 아래 표 1과 같다.
기공크기 평균 직경 약 200㎛ (100 내지 400㎛)
pH PBS 또는 조직 배양 배지 현탁시 약 7.0 내지 7.4
보관 온도 상온
실험예 1. 다공성 세포지지체를 이용한 암세포의 3차원 배양
상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체를 이용하여 암세포를 배양하여 배양 안정성 및 지속성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 다공성 세포 지지체에서 보존액을 최대한 제거하기 위해 다공성 세포지지체가 충분히 잠기도록 1x PBS를 넣고 부드럽게 흔들어 헹궈낸 후, 1x PBS를 제거하였다. 이를 한번 더 반복하여 보존액을 제거하였다. 이후에, 다공성 세포지지체에 위암 세포주인 SNU017(KCLB) 및 자궁경부암 세포주인 SiHA(KCLB)를 5 x 105 cells의 수로 분주하였다. 이후에 상기 세포가 분주된 다공성 세포 지지체를 세포 배양액(RPMI, Gibco)에서 37℃, CO2 5%의 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다.
배양 9일차 및 배양 14일차에 파라핀블록을 형성하고 슬라이드로 제작하여 H&E 염색을 수행하여 조직 검사를 수행하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 상기 다공성 세포지지체를 이용해 SNU017 세포주를 9일간 배양한 결과, 실제 신체 내의 조직에 있을 때와 유사한 구 형태의 암 조직 구조를 형성하며 배양되었음을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 다공성 세포지지체를 이용해 SiHA 세포주를 14일간 배양한 결과, 실제 신체 내의 조직에 있을 때와 유사한 책상조직 형태의 암 조직 구조를 형성하며 배양되었음을 확인하였다.
실험예 2. 다공성 세포지지체를 이용한 연골세포의 3차원 배양
연골 세포는 일반적으로 체외 배양이 어렵다고 알려져 있는 세포이다. 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체를 이용하여 연골 세포를 배양하여 배양 안정성 및 지속성을 확인하였다.
구체적으로, 실제 환자로부터 채취한 연골세포(hACs)를 5 x 105 cells의 수로 분주한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 연골 세포를 3차원 배양하였다.
이후에, 배양 7일차에 3차원 배양된 연골 세포에 대해 Live and Dead Cell staining을 진행하였다. 이후에, 염색된 세포를 공초점 레이저 현미경(LSM880 with Airyscan, Zeiss)으로 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 녹색은 살아있는 세포를 의미하고, 적색은 죽은 세포를 나타낸다.
도 3의 Z1 내지 Z9는 세로축으로 높이 10㎛ 마다의 단면을 형광촬영한 것을 의미한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일주일간 빨간색으로 표시되는 죽은 세포가 관찰되지 않고 안정적으로 배양된 것을 관찰할 수 있다. 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체에서 배양된 환자유래 연골세포는 높은 생존율을 보였다.
실험예 3. 다공성 세포지지체를 이용한 장내분비세포의 3차원 배양
상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체를 이용하여 장내분비세포를 배양하여 배양 안정성 및 지속성을 확인하였다.
구체적으로, 마우스로부터 채취한 장내분비세포(Enteroendocrine Cell)를 5 x 105 cells의 수로 분주한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 장내분비세포를 3차원 배양하였다.
이후에, 배양 11일 차 및 13일차에 3차원 배양된 장내분비세포에 대해 DAPI와 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 수행하였다. 염색된 세포를 형광현미경 (Axiovert 200, Zeiss)으로 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 통상적으로 장내분비세포는 일주일 넘게 배양이 어려운데, 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체에서 배양된 장내분비세포의 3차원 세포집합체는 2주일 넘게 세포상태 저하 없이 안정적으로 배양되었음을 알 수 있었다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 세포를 안정적으로 및 지속적으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라 세포마다 세포의 특성에 맞는 배양 양상이 관찰됨을 알 수 있었다. 또한, 세포배양 디쉬 및 플레이트에서 배양하는 기존의 2D 배양 방법으로도 장기간 배양이 가능한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 다공성 세포지지체를 이용한 3차원 세포집합체의 생착률
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체를 조직 재생 치료에 적용하기 위해 장내분비세포의 3차원 세포집합체의 신장막에의 생착률을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서와 같은 세포를 같은 방법으로 배양한 후, 헤밀턴 실린지로 마우스의 신장막에 이식하였다. 이식 일주일 후, 마우스를 안락사 시킨 후, 신장을 분리, 해부하여 남은 양을 직접 관찰하였다. 후에 이식된 부분만 떼어 내 그 무게(wet weight)를 측정하고 생착된 세포수로 생착률을 확인하고, 파라핀블록을 형성하고 슬라이드로 제작하여 H&E 염색을 수행하여 조직 검사를 진행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 2주간 FBS free로 장내분비 세포를 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체에 배양하여 얻은 세포체를 마우스의 신장막에 이식하고, 1주일 동안 배양한 결과, 약 80%가 넘는 생존율을 확인하였다.
통상적으로 줄기세포를 주입하였을 때 생체 내 생착률이 5% 미만인 것을 고려하였을 때, 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 조직 재생을 위한 세포 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5. 다공성 세포지지체를 이용한 3차원 세포집합체의 동결 융해 시험
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체가 조직 재생 치료의 상용화에 실제적으로 사용되기 위해 제품화 및 운반이 용이한지 확인하기 위해, 동결 융해 실험을 수행하였다.
구체적으로, 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체에 폐암 세포주인 NCI-H28과 NCI-H2170(KCLB)를 5 x 105 cells의 수로 분주한 후, 28일 동안 배양하였다. 동결보관은 Deepfreezer -80 ℃에서 30일 동안 freezing solution(Media: FBS: DMSO, 5:4:1)에 보관 후, 융해하여 12일 동안 배양하였다. 이후에, 상기 지지체에서 배양된 세포에 H&E 염색을 수행하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체는 동결되거나 해동되어도, 세포의 재배양이 가능함을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체가 세포치료제로서의 제품화 및 운반에 유리한 효과를 가짐을 의미한다.
실험예 6. 다공성 세포지지체를 이용한 단백질 생산
상기 실시예 1에서 제조한 다공성 세포지지체를 이용하여 유용 물질(목적 단백질)을 생산할 수 있는지 분석하고자 간암세포의 3차원 세포집합체에 대한 단백질 생산 능력을 측정하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에서 HepG2 세포를 5 x 105 cells의 수로 분주한 후, 7일, 14일 및 21일 동안 MEM(10% FBS 첨가) 배지 배양하였다. 이후에, 세포 배양액에서 알부민의 농도를 Human ALB solid-phase sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)의 방법으로 측정하였다. 대조군으로는 통상적인 2차원 세포 배양 방법을 수행하였다. 2차원 세포 배양은 6well plate에서 수행하였다. 또한, 양성 대조군으로는 Matrigel®(Corning, 356231) 및 Alvetex™(ReproCell 社, Glasgow, UK)를 사용하였다. 구체적으로, 상기의 상업적으로 입수 가능한 3차원 세포 배양 지지체를 사용한 것만을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 세포를 배양하였다. 상기 대조군들의 세포 배양액에서 알부민의 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 다공성 세포지지체의 경우 양성 대조군인 Matrigel® 및 Alvetex™을 사용한 경우보다 간암세포의 활성화 정도를 나타내는 알부민의 발현량이 더 높게 나타났다. 이상의 결과는 일 구체예에 따른 다공성 세포 지지체가 목적 물질(단백질)의 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

Claims (26)

  1. 분리된 혈청에 트랜스글루타미네이즈(transglutaminase)를 처리하여 혈청 내 단백질을 교차 결합시킨 후, 혈청 내 단백질들의 이황화 결합을 환원시키는 환원제를 처리하여 수득된 반응 물을 균질화 시키고, 원심 분리하여 현탁액을 회수하고, 회수된 현탁액을 교반한 후, 상기 교반한 현탁액을 1 내지 15℃에서 방치하여, 수득된 혈청 유래 단백질 조성물을 포함하며,
    상기 환원제는 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), 다이싸이오쓰레이톨(ditiolthreitol: DTT), 트리스카복시에틸포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP)), 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione), 트리스하이드록시프로필 포스핀(Tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP)), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이고,
    상기 조성물 기공 크기는 150 내지 400㎛이고,
    상기 조성물의 탄성률은 1 내지 10kPa이며,
    상기 조성물의 공극률은 10 내지 80%인 것인,
    3차원 세포 배양을 통한 조직공학적 사용, 또는 치료적 사용을 위한 다공성 세포지지체.
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  9. 청구항 1에 있어서, 상기 혈청 유래 단백질 조성물은 고체, 또는 반고체 상태로 가역적인 상전이가 일어나고, 불용성인 것인 다공성 세포지지체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 혈청 내 단백질은 우태혈청 또는 우아혈청에서 유래된 것인 다공성 세포지지체.
  11. 청구항 1에 있어서, 세포가 상기 다공성 세포지지체 내에 분주된 것인 다공성 세포지지체.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다공성 세포지지체.
  13. 삭제
  14. 청구항 1의 다공성 세포지지체; 및 상기 다공성 세포지지체 내에 분주된 세포를 포함하는 조직 수복 또는 재생용 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 세포는 연골세포; 섬유연골세포; 골세포; 골아세포; 파골세포; 윤활막세포; 골수세포; 신경세포; 지방세포; 간엽세포; 상피세포, 간세포, 근육세포; 기질세포; 혈관세포; 줄기세포; 배아줄기세포; 중간엽줄기세포; 지방 조직으로부터 유래된 전구세포; 말초혈액 전구세포; 성체조직으로부터 단리된 줄기세포; 유도만능줄기세포(iPS　세포); 이들의 세포들에서 유래된 암세포; 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나인 것인 조직 수복 또는 재생용 조성물.
  16. 청구항 1의 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
    상기 3차원 세포집합체에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는 후보 물질의 약리학적 활성 또는 독성을 평가하는 방법.
  17. 청구항 1의 다공성 세포지지체에 세포를 분주하여 3차원 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
    상기 3차원 세포집합체의 배양물 또는 배양액으로부터 목적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 목적 물질을 생산하는 방법.
  18. 분리된 혈청에 트랜스글루타미네이즈(transglutaminase)를 처리하여 혈청 내 단백질을 교차 결합시키는 단계;
    교차 결합된 혈청 내 단백질을 환원제로 반응시켜 반응물을 수득하는 단계로서, 상기 환원제는 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), 다이싸이오쓰레이톨(ditiolthreitol: DTT), 트리스카복시에틸포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP)), 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione), 트리스하이드록시프로필 포스핀(Tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP)), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것인 단계;
    상기 반응물을 균질화시킨 후 원심 분리하여 현탁액을 회수하는 단계;
    회수된 현탁액을 교반하는 단계;
    상기 교반한 현탁액을 1 내지 15℃에서 방치하는 단계; 및 상기 방치된 현탁액으로부터 혈청 유래 단백질 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 혈청 유래 단백질 조성물을 포함하는 청구항 1의 3차원 세포 배양을 통한 조직공학적 사용, 또는 치료적 사용을 위한 다공성 세포지지체를 제조하는 방법.
  19. 삭제
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 방치된 혈청 유래 단백질 조성물을 성형하고 동결건조하는 단계를 포함하는 것인 다공성 세포지지체를 제조하는 방법.
  21. 삭제
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 트랜스글루타미네이즈는 2 unit/mg 내지 100 unit/mg의 특이 활성도로 처리되는 것인 다공성 세포지지체를 제조하는 방법.
  23. 삭제
  24. 청구항 18에 있어서, 상기 환원제는 5 mM 내지 50 mM의 농도로 처리되는 것인 다공성 세포지지체를 제조하는 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
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