KR20230080540A - 다공성 네트워크가 형성된 조직 구조체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

다공성 네트워크가 형성된 조직 구조체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 외주면에 혈관 내피세포가 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 적층되고, 적층된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 포함하는, 조직 구조체 및 이러한 조직 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 두께가 약 200μm 이상인 큰 인공 조직을 제조할 때, 인공 조직을 구성하는 각 세포들에게 산소 혹은 영양분의 공급이 원활하게 공급할 수 있도록, 구조 기공이 서로 연결된 다공성 기공 네트워크가 형성된 조직 구조체를 제공할 수 있다. 이렇게 제조된 구조 기공을 포함하는 다공성 네트워크를 통해 세포에 영양분을 쉽고 빠르게 공급할 수 있어, 향후 보다 큰 규모의 인공 조직 구조체를 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

다공성 네트워크가 형성된 조직 구조체 및 이의 제조 방법{Tissue structured material with porous network structure and preparation method thereof}
본 발명은 구조적으로 안정하고, 산소 혹은 양양소를 공급하는 기능을 수행할 수 있는 혈관과 유사한 기능을 갖는 다공성 네트워크가 형성된 조직 구조체 및 이의 제작 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개별적으로 내피 세포 혹은 상피 세포로 둘러싸인 복수의 세포 응집체(스페로이드, spheroid)들이 적층되어 다공성 네트워크가 내부에 형성된 조직 구조체 및 이를 형성하는 방법에 관한 것으로, 인공 조직 구체 내부에 존재하는 다공성 네트워크를 통해 형성되는 빈 공간(이하, 구조 기공, structural void)들이, 조직 구조체 내에서 (모세)혈관과 유사한 기능을 수행함으로써, 인공 조직 구조체 내부로 원활하게 영양분 및/또는 산소를 공급할 수 있는 새로운 구조의 인공 조직 구조체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다
최근 들어, 질환이나 사고 등의 이유로 상실되거나 기능이 저하된 장기나 조직에 대해 기능을 회복시키거나, 장기나 조직 그 자체를 재생하고자 하는 조직공학(티슈 엔지니어링)이 주목되고 있다. 특히 줄기세포나 미분화 세포를, 목적으로 하는 세포로 증식, 분화시키기 위한 배양조건이나 인자를 연구함으로써 바이오 인공장기로의 활용분야에 관심이 고조되고 있다.
이러한 조직공학에 있어서의 장기나 조직의 형태적 재구축을 위해, 세포 증식의 발판으로서, 폴리머 등의 화학 합성품이 사용되고 있고, 이를 스캐폴드라고도 한다. 목적의 세포를 이 스캐폴드 상에 파종하고, 이를 생체 외의 적당한 환경하에서 배양함으로써 요구되는 세포로 증식, 분화시키는 것이나, 재생시키고자 하는 장기나 조직의 결손부에 스캐폴드를 이식하고, 생체 내에 있어서 목적의 세포를 요구하는 세포로 증식, 분화시킴으로써, 세포를 3차원적 구조로 증식시켜, 목적하는 장기를 재생시키는 방법이 다수 보고되어 왔다.
그러나, 스캐폴드를 사용하여 바이오 인공장기를 구축하더라도, 장기의 기능을 충분히 발휘하지 못하거나, 스캐폴드의 유무에 상관없이 바이오 인공장기 혹은 인공 장기 구조체 그 자체의 구축이 곤란하다는 문제점이 여전히 존재한다.
한편, 인체 내에서 각 기관으로의 영양분은 주로 혈관을 통해서 공급된데, 일반적으로 세포들은 혈관에서 약 200μm 이상 떨어져 있는 경우, 혈관으로부터 원활하게 영양분을 공급받지 못하게 되어, 결국 세포 사멸이 발생하게 된다. 따라서, 인공 조직 구조체에서 혈관은 각 세포에 대한 영양분 공급 측면에서 매우 중요한 요소이다.
제조된 인공 조직 구조체의 내부 전체에 걸쳐 영양분 공급이 원활하지 못할 경우, 제조된 인공 조직 구조체를 구성하는 세포 및 조직은 괴사할 수 있다. 특히, 대사 활동이 활발하고 크기가 큰 심장 간 등의 장기들은 다른 장기보다 더 촘촘한 미세 혈관을 필요로 하므로, 인공 장기가 보다 더 많은 환자들에게 치료 효과를 거두려면 혈관 네트워크가 고도화된 인공 조직 구조체를 제작하는 것이 필수적이다.
혈관을 생성하기 위해 도출(extrusion) 또는 잉크젯(inkjet) 방식 등을 사용한 3D 바이오 프린팅 기술이나 organ on a chip과 같은 다양한 기술들이 활용되고 있지만, 인체 내의 다양한 직경을 갖는 혈관들을 동시에 모사하기에는 한계가 있다.
예를 들어 기존의 3D 바이오 프린팅 기술의 경우에는, 잉크가 토출되는 출구인 노즐(nozzle)의 크기가 작아질수록, 노즐에서 발생하는 전단력(shear force)이 상승하여, 잉크 내에 포함된 세포의 생존률이 떨어지는 문제점과 수 μm 단위의 미세한 모세혈관은 구현하기 곤란하며, 다수의 혈관을 제작하기 위한 다중 노즐 특허에도 불구하고, 한번에 제작할 수 있는 혈관의 수에 한계가 있다는 문제점이 존재한다.
등록특허 제10-1992625호 (2019년 6월 25일 등록공고)
이러한 기존의 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 세포 응집체(스페로이드, spheroid) 또는 세포 미세 조직(cell microtissue)의 외주면에 혈관내피세포 코팅층을 형성함으로써, 복수의 서로 다른 세포 응집체 또는 세포 미세 조직이 서로 합쳐져 하나의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 형성하지 않고, 각각의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 모양 또는 형태가 이 유지되도록 하였다.
이렇게 혈관 내피세포로 외주면이 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 적치함으로써, 이들 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 형성할 수 있다. 또한, 이러한 구조 기공들이 서로 연결된 구조인 다공성 네트워크를 형성함으로써, 다공성 네트워크가 산소와 영양분을 공급하는 통로로 기능할 수 있고, 이로 인해 세포의 사멸 현상이 현저하게 감소된 대조직을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 조직 구조체는, 외주면에 내피세포 또는 상피세포가 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 적층되고, 적층된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 포함한다.
상기 조직 구조체 내에 형성되는 복수의 구조 기공은, 서로 연결되어 다공성 기공 네트워크가 형성되며, 상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 구성하는 세포는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 내피세포 또는 상피세포가 코팅된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 직경은, 50~500 ㎛인 것이 바람직하고, 상기 내피 세포는 혈관 내피세포인 것이 더욱 바람직하다.
상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직은, 후술되는 미세유체(microfluidic)를 사용한 프리셋 토출법(preset extrusion)을 통해 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따른, 구조 기공이 형성된 조직 구조체를 제조하는 방법은, i) 구획부재를 제1 및 제2 바이오 잉크로 채우는 단계(S100); ii) 구획부재를 이중 축 노즐의 내부 노즐에 삽입하는 단계(S200); iii) 이중 축 노즐의 외부 노즐을 통해 소수성 용액을 연속적으로 토출하는 단계(S300); iv) 이중 축 노즐의 내부 노즐에 공압을 단속적으로 가하여, 구획 부재를 채운 제1 및 제2 바이오 잉크를 불연속적으로 토출하는 단계(S400); 및 v) 이중 축 노즐을 통해 토출되는 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 약 12~24 시간동안 배양 용기 내에서 정치 배양하는 단계(S500);를 포함할 수 있다.
상기 구획 부재는, 코어-쉘 구조를 갖고, 구획 부재의 코어 영역에는 제1 바이오 잉크가 채워지고, 쉘 영역에는 제2 바이오 잉크가 채워지며, 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크는 서로 상이하되, 상기 제2 바이오 잉크는, 내피세포 또는 상피세포를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 제1 바이오 잉크에는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상의 살아있는 세포가 포함되는 것이 바람직하다.
이때 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 지름 또는 유효 지름은, 약 50~500 ㎛인 것이 바람직하고, 상기 코팅층은, 상피 세포 또는 내피 세포가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태로는, 이러한 방법으로 제조된 조직 구조체를 들 수 있으며, 외주면에 내피세포 또는 상피세포가 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 적층되고, 적층된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 포함한다. 이때 사용되는 내피 세포는 혈관 내피 세포인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시 형태로, 이러한 조직 구조체를 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명은, 종래 기술의 문제점인 큰 인공 조직(예를 들어, 두께가 약 200μm 이상)을 제조할 때, 인공 조직을 구성하는 각 세포들에게 산소 혹은 영양분의 공급이 원활하지 않은 문제를 효과적으로 해결할 수 있다.
혈관 내피세포로 외주면이 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 소정의 공간 내에서 배양함으로써, 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 다양한 직경(마이크로 기공, 메조 기공, 매크로 기공 등)을 갖는 구조 기공을 형성함으로써, 생체 내와 유사한 다양한 크기의 혈관을 구현할 수 있다.
이렇게 제작된 구조 기공을 포함하는 다공성 네트워크를 통해 세포에 영양분을 쉽고 빠르게 공급할 수 있어, 향후 보다 큰 규모의 인공 조직 구조체 제작에 기여할 수 있을 것으로 여겨진다.
도 1은, 본 발명의 일 실시형태에 따른 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 2차원 단면을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명에 따른 구조 기공이 형성된 조직 구조체를 제조하는 장치를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 다른 실시 형태에 따른 구조 기공이 형성된 조직 구조체를 제조하는 과정을 나타낸 순서도이다.
도 4(a)와 4(b)는, 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 자기 조립(self-assemble)되어, 구조 기공을이 형성하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명에 따른 본 발명의 일 실시형태에 따른 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 3차원 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 실시 예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
어느 하나의 실시 예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성 요소는, 다른 실시 예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시 예에 기재한 설명은 다른 실시 예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 조직 구조체(1)는, 도 1에 제시되어 있듯이, 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세조직(10)들 각각의 외주면에 내피세포 또는 상피세포가 덮어 코팅층(20)을 형성하고, 이렇게 외주면이 내피세포 또는 상피세포로 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세조직들이 적층된 형태를 갖는다. 이렇게 3차원 형태로 적층된 구조를 갖도록 배양할 경우, 각각의 세포 응집체 또는 세포 미세조직들은 서로 직접 접촉하지 않고, 외주면에 형성된 내피세포 또는 상피세포 코팅층(20)이 서로 접촉하고, 세포 응집체 또는 세포 미세조직의 외주면을 따라 세포들이 성장하면서 코팅층(20)이 서로 연결된다.
이렇게 코팅층(20)이 세포 응집체 또는 세포 미세조직의 외주면을 따라 컨포멀(conformal)하게 연결됨으로써, 상기 도 1에서 확인되듯이, 컨포멀하게 연결된 코팅층의 사이에는 빈 공간(30)이 형성되는데, 이는 각형이 아닌 곡면 형태의 외주면을 갖는 세포 응집체 또는 세포 미세조직(10)의 구조적 형태와, 컨포멀하게 형성되는 내피세포 또는 상피세포 코팅층(20)의 구조적 배치 형태에 기인하는 기공 형태의 공간으로, 여기서는 구조 기공(30, structural void)라 부른다.
본 발명에 따른 조직 구조체(1) 내에 형성되는 이러한 구조 기공은, 어느 한쪽이 막히거나 폐쇄되지 않고, 서로 연결되어 다공성 기공 네트워크를 형성하게 되는데, 이는 조직 구조체(1)의 내부에 고르게 산소 혹은 영양분을 공급할 수 있는 혈관의 기능을 수행할 수 있다.
앞서 종래의 기술에서 살펴본 것 처럼, 조직 구조체를 이루는 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 크기가 증가함에 따라, 산소 혹은 영양소가 원활하게 조직 구조체 내부 구석 구석으로 공급되기 어려워지므로, 세포의 사멸이 발생하는 등의 문제점이 발생할 수 있는데, 이러한 조직 구조체(1) 내에 형성되는 구조 기공(30)이 존재하여, 산소 또는 영양분을 조직 구조체에 공급하는 혈관의 기능을 수행할 수 있다.
즉, 외주면이 내피 세포 혹은 상피 세포로 덮여지거나 코팅된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직이 배양 과정 중에서 자기 조립(self-assembly)되어 구조 기공을 형성하고, 이러한 구조 기공들이 서로 연결되는 네트워크 구조를 가짐으로써, 조직 구조체 내의 다양한 위치에 혈관을 형성할 수 있어, 향후 조직 구조체의 크기가 증가할 경우에도 생물학적으로 안정적인 조직 구조체를 유지할 수 있는 장점이 존재한다.
따라서, 대사 활동이 활발하고, 크기가 비교적 큰 심장, 간 등의 장기들의 모사체 제작에 유용하고, 보다 더 촘촘한 미세 혈관을 제공할 수 있어, 고도한 혈관 네트워크를 갖는 인공 조직을 제작하는데 적합한 장점이 있다.
또한, 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 외주면에 코팅층을 형성하는 내피 세포 층 혹은 상피 세포 층은 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 구조와 형태를 안정적으로 유지시킬 수 있어, 자기 조립된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 구조적으로 안정한 조직 구조체를 제공할 수 있다.
따라서, 상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 주위를 감싸도록 코팅되는 세포는 내피 세포 혹은 상피 세포인 것이 바람직하며, 상기 내피 세포는 혈관 내피 세포인 것이 더욱 바람직하다.
이러한 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 형성할 수 있는 세포로는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 적어도 하나 이상일 수 있다.
또한, 이러한 세포들이 형성하는 세포 응집체 또는 세포 미세 조직은 다각형이 아닌 구 혹은 구에 가까운 형태를 갖는 것이 바람직하며, 직경은 약 50 ~ 500㎛인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 다른 실시 형태로, 이러한 조직 구조체의 제조 방법을 들 수 있으며, 미세유체 디바이스(micro-fluidic device)를 사용한 프리셋 토출법(preset extrusion)을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 미세유체 디바이스(micro-fluidic device)를 사용한 프리셋 토출법(preset extrusion)을 도 2에 도식적으로 나타내었다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따른 조직 구조체의 제조 방법은, i) 구획부재를 제1 및 제2 바이오 잉크로 채우는 단계(S100); ii) 구획부재를 이중 축 노즐의 내부 노즐에 삽입하는 단계(S200); iii) 이중 축 노즐의 외부 노즐을 통해 소수성 용액을 연속적으로 토출하는 단계(S300); iv) 이중 축 노즐의 내부 노즐에 공압을 단속적으로 가하여, 구획 부재를 채운 제1 및 제2 바이오 잉크를 불연속적으로 토출하는 단계(S400); 및 v) 이중 축 노즐을 통해 토출되는 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 약 12~24 시간동안 배양 용기 내에서 정치 배양하는 단계(S500);를 포함한다(도 3의 순서도 참조).
상기 정치 배양하는 단계(S500)에서, 선택적으로 배양 용기를 진동을 적어도 1회 이상 가하여 정치 배양 과정 중에서 자기 조립을 유도하는 것도 가능하다.
상기 도 2에 제시되어 있듯이, 본 발명에 따른 조직 구조체를 제조하기 위하여, 코어=쉘 구조를 갖는 구획 부재(100)내에 각각 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 공급하여 채운 후, 제1 및 제2 바이오 잉크가 채워진 구획부재(100)를 시린지(130) 내로 위치시킨다.
상기 시린지(130)의 아래쪽 토출부는 이중축(co-axial) 노즐(140) 형태로 이 루어지거나, 별도의 이중축 노즐(140)이 결합되는 방식으로 구성될 수 있다.
이러한 구획 부재(100)의 중심부에 해당하는 코어 영역에는 제1 바이오 잉크가 채워지고, 외주부에 해당하는 쉘 영역에는 제2 바이오 잉크가 채워질 수 있다. 이때 상기 제1 바이오 잉크는, 앞서 살펴본 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 형성할 수 있는 세포를 포함하며, 상기 제2 바이오 잉크는 내피 세포 혹은 상피 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
이렇게 구획 부제(100)의 코어 영역과 셀 영역에 서로 다른 종류의 세포 혹은 세포 응집체를 포함하는 바이오 잉크를 채운 후, 상기 구획 부재(100)를 시린지(130)내로 이동시키고, 공압을 가하여 노즐 방향으로 바이오 잉크를 토출시키는 것이 바람직하다.
구획 구재(100)의 코어 영역을 채우고 있던 제1 바이오 잉크가, 쉘 영역을 채우고 있던 제2 바이오 잉크가 같이 동시에 토출됨으로써, 제1 바이오 잉크에 포함되어 있던, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell), 혹은 이들의 세포 응집체가 코어 영역을 형성하게 되고, 쉘 영역을 채우고 있던 내피 세포 또는 상피 세포가 상기 코어 영역의 외주부를 형성할 수 있다.
이때, 토출되는 바이오 잉크가 연속적으로 토출되지 않고, 간헐적으로 토출될 수 있도록 하기 위해 시린지(130)의 노즐 끝 부분은, 이중축(co-axial) 노즐(140) 형태로 구성되는 것이 바람직하다.
내부 노즐(160) 및 외부 노즐(170)을 포함하는, 이중축(co-axial) 노즐(140)을 사용함으로써, 외부 노즐을 통해 소수성 용액이 연속상으로 토출되고, 내부 노즐을 통해 친수성 용액이 분산상으로 토출되면서 구형 또는 구형에 가까운 라운드 형태의 외주면을 갖는 세포 응집체 또는 세포 미세 조직를 형성할 수 있다.
여기서, 연속상으로 토출된다는 것의 의미는 용액이 연속적으로 토출되는 것을 의미하고, 분상상으로 토출된다는 것의 의미는 용액이 간헐적으로 토출되는 것을 의미한다.
즉, 소수성 용액 및 친수성 용액의 비 혼합성을 이용하여, 소수성 용액을 외부 노즐(170)을 통해 연속상으로 토출하고, 친수성 용액을 내부 노즐(160)을 통해 분산상으로 토출함으로써 비교적 균일한 크기의 구형 또는 구형에 가까운 라운드 형태의 외주면을 갖는 세포 응집체 또는 세포 미세 조직를 형성시킬 수 있다.
상기 소수성 용액은 오일 및 계면활성제를 포함하는 것일 수 있는데, 바람직한 실시 형태에 따르면, 상기 오일은 미네랄 오일, 합성 오일, 식물성 오일 및 실리콘 오일로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 계면활성제는 소르비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate, SPAN 80), 세틸 PEG/PPG-10/1 디메치콘(cetyl PEG/PPG-10/1dimethicone, ABIL EM-90), 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate, ARLACEL 83), 폴리에틸렌 글리콜 및 디폴리히드록시 스테아레이트(polyethylene glycol, dipolyhydroxy stearate, ARLACEL P135)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 소수성 용액은, 오일과 계면활성제를 1 : 0.01 ~ 0.05의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있으며, 이러한 오일 및 계면활성제의 중량비를 벗어날 경우에는, 도출 속도가 저하되거나 친수성 용액과의 상호작용이 약해져 구형 또는 라운드 형태의 스페로이드 형성이 곤란하게 되므로, 바람직하지 않다.
한편, 일 실시형태에 따르면, 내부 노즐(160)을 통해 토출되는 친수성 용액은, 앞서 설명한 구획 부재(100)를 통해 미리 채워져 있던 제1 및 제2 바이오 잉크를 포함할 수 있다.
코어-쉘 구조를 갖는 구획 부재(100)의 중심 영역에 채워지는 제1 바이오 잉크는 하이드로겔 및 살아있는 세포를 포함할 수 있으며, 제1 바이오 잉크에 포함되는 살아있는 세포는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 살아있는 세포와 함께 제1 바이오 잉크에 포함되는 하이드로겔으로는, 콜라겐, 아가로스, 알지네이트, 피브리노겐, 피브린, 라미닌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 실리콘, 다당류, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리우레탄으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상이 포함될 수 있다.
바람직한 일 실시 형태로, 상기 제1 바이오 잉크에는, 하이드로겔이 pH 7 ~ 8의 범위로 유지되고, 살아있는 세포가 104 ~ 109cells/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 하이드로겔의 pH가 7.1 내지 7.5의 범위로 유지될 수 있는데, 이러한 하이드로겔의 pH 범위가 인체 내 pH와 유사하여 세포 응집체 또는 세포 미세 조직 내 세포의 생존율을 높일 수 있기 때문이다.
앞서 언급되었듯이, 본 발명에 따른 세포 응집체 또는 세포 미세 조직은, 외주면이 내피 세포 또는 상피 세포로 코팅되어야 하므로, 상기 구획 부재(100)의 안쪽 영역인 코어 영역에는 제1 바이오 잉크가 공급되어 채워지고, 구획 부재(100)의 바깥쪽 영역인 쉘 영역에는 내피 세포 또는 상피 세포가 포함된 제2 바이오 잉크가 공급되어 채워진다.
이렇게 코어-쉘 구조를 갖는 구획 부재(100)를 제1 및 제2 바이오 잉크로 채운 후, 구획 부재(100)를 시린지(130)에 넣고, 이중 축 노즐(140)의 내부 노즐(160)를 통해 공압을 사용하여 분산상으로 토출시키면서, 동시에 이중 축 노즐(140)의 외부 노즐(170)을 통해 소수성 용액을 연속상으로 토출함으로써, 제1 바이오 잉크에 포함된 세포들의 세포 응집체 형성을 유도하고, 동시에 세포 응집체의 외주면을 따라 제2 바이오 잉크에 포함된 내피 세포 또는 상피 세포의 코팅층을 형성시킬 수 있다. 즉, 도 2에 제시된 것처럼, 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직(40)을 제조할 수 있다.
이중축 노즐(140)을 통해 토출되는 세포 응집체들의 외주면 전체가 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성될 수 있으나(도 4(a) 참조), 반드시 외주면 전체에 코팅층이 형성되어야만 하는 것은 아니며, 도 4(b)와 같이 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 일부에 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성되는 것도 가능하며, 이후 후속되는 배양 과정 중에서 코팅층의 상피 세포 또는 내피 세포가 증식하거나 자라서 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 외주면 전체를 덮게 되는 것도 가능하다.
상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 직경 또는 유효 지름(effective diameter)는 약 50 ~ 500μm의 범위일 수 있으며, 이때 유효 지름은 비구형 구조의 표면적으로부터 환산되는 구의 지름을 의미한다.
상기 직경 또는 유효 지름의 크기는 이중 축 노즐(140)의 내부 노즐(160)의 직경과 외부 노즐(170)의 직경과 유량 등에 의해 결정될 수 있는데, 일 실시형태에 따르면, 외부 노즐의 내부 직경은 약 1.5 ~ 2.0 mm이고, 내부 노즐의 외부 직경은 약 0.5 ~ 1.0 mm이며, 내부 노즐의 내부 직경은 약 0.3 ~ 0.7 mm일 수 있다. 이와 같은 범위의 외부 노즐의 내부 직경, 상기 내부 노즐의 외부 직경 및 내부 직경의 범위는, 토출되는 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 크기를 보다 균일하게 제어할 수 있다.
또한, 상기 외부 노즐을 통해 배출되는 소수성 용액의 유량은, 500 ~ 1,000 μL/min의 유속로 토출될 수 있고, 구획 부재(100)에 채워져 있는 제1 및 제2 바이오 잉크를 포함하는 친수성 용액은, 300 ~ 1000 μL 부피로, 초(s)당 1 회 내지 5회 불연속적으로 토출되는 것이 바람직하다.
이때 가해지는 외부 노즐의 압력(공압 1)은 약 10 ~ 100 kPa이고, 내부 노즐에 가해지는 압력(공압 2)은 약 5 ~ 30 kPa의 범위인 것이 바람직한데, 이러한 소수성 용액 및 친수성 용액의 토출 속도, 외부 노즐 및 내부 노즐의 압력은, 50 ~ 500μm의 범위의 균일한 크기를 갖는 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 형성하기 위한 바람직한 조건 범위이다.
이렇게 이중 축 노즐(140)을 통해 토출되는, 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들은, 배양 용기 내에서 약 12 ~ 24 시간 정치되어 배양될 수 있으며, 이러한 배양 과정을 통해 각각의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들의 표면 전체 혹은 일부에 형성된 상피 세포 또는 내피 세포들이, 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 곡면 형태의 외주면에서 컨포멀하게 배양됨으로써, 구형 혹은 라운드 형태의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이의 구조 기공(structral void)이 형성될 수 있다.
상기 상피 세포 또는 내피 세포가 컨포멀하게 성장하여 서로 다른 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들을 연결하면서 동시에 구조 기공을 형성할 수 있도록 하기 위해서, 토출된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들을 적어도 12 ~ 24 시간 동안 정치하여 배양하는 것이 바람직한데, 토출된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 보다 더 가까이 위치할 수 있도록 선택적으로 배양 과정 중에 적어도 1회 이상 배양 용기를 흔들어 주는 진동을 가할 수 있다.
이러한 진동을 통해 배양 용기 내에 정치된 상피 세포 또는 내피 세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 보다 원활하게 자기 조립(self-assemble)되어, 구조 기공이 형성될 수 있다.
이러한 방법으로 제조된 본 발명에 따른 조직 구조체를 도 5에 도식적으로 나타내었으며, 조직 구조체 내에 형성되는 구조 기공(30)들이 서로 연결되어 다공성 구조 기공 네크워크가 형성된 예를 예시적으로 빗금으로 표시하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술되는 청구범위의 범위에 속한다.
1 : 조직 구조체 10 : 세포 응집체 또는 세포 미세 조직
20 : 내피세포 또는 상피세포 코팅층 30 : 구조 기공(structural void)
40 : 내피세포 또는 상피세포 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직
100 : 구획 부재 110 : 제1 바이오 잉크
120 : 제2 바이오 잉크 130 : 시린지
140 : 이중축 노즐 150 : 미네랄 오일
160 ; 내부 노즐 170 : 외부 노즐

Claims (13)

  1. 외주면에 내피세포 또는 상피세포가 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 적층되고,
    적층된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 포함하는, 조직 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조직 구조체 내에 형성되는 복수의 구조 기공은, 서로 연결되어 다공성 기공 네트워크를 형성하는 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직을 구성하는 세포는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 직경은, 50~500 ㎛인 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 내피 세포는, 혈관 내피세포인 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 응집체 또는 세포 미세 조직은, 미세유체(microfluidic)를 사용한 프리셋 토출법(preset extrusion)을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  7. 구조 기공이 형성된 조직 구조체를 제조하는 방법에 있어서,
    i) 구획부재를 제1 및 제2 바이오 잉크로 채우는 단계(S100);
    ii) 구획부재를 이중 축 노즐의 내부 노즐에 삽입하는 단계(S200);
    iii) 이중 축 노즐의 외부 노즐을 통해 소수성 용액을 연속적으로 토출하는 단계(S300);
    iv) 이중 축 노즐의 내부 노즐에 공압을 단속적으로 가하여, 구획 부재를 채운 제1 및 제2 바이오 잉크를 불연속적으로 토출하는 단계(S400); 및
    v) 이중 축 노즐을 통해 토출되는 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 약 12~24 시간동안 배양 용기 내에서 정치 배양하는 단계(S500);를 포함하는, 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 구획 부재는, 코어-쉘 구조를 갖고,
    구획 부재의 코어 영역에는 제1 바이오 잉크가 채워지고, 쉘 영역에는 제2 바이오 잉크가 채워지며,
    상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크는 서로 상이하되,
    상기 제2 바이오 잉크는, 내피세포 또는 상피세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 제조 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 바이오 잉크에는, 근아 세포, 섬유아 세포, 연골 세포, 간 세포, 골아 세포, 신장 세포, 지방 세포, 각막 상피세포, 심근 세포, 제대혈 세포, 신경 세포, 각질 세포, 식도 상피세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 골막유래 줄기세포, 혈관내피 전구세포, 배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상의 살아있는 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는, 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 제조 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 코팅층이 형성된 세포 응집체 또는 세포 미세 조직의 지름 또는 유효 지름은, 50~500 ㎛이고,
    상기 코팅층은, 상피 세포 또는 내피 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는, 구조 기공이 형성된 조직 구조체의 제조 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조되고,
    외주면에 내피세포 또는 상피세포가 코팅된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들이 적층되며,
    적층된 복수의 세포 응집체 또는 세포 미세 조직들 사이에 형성되는 구조 기공(structural void)를 포함하는, 조직 구조체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 내피 세포는, 혈관 내피세포인 것을 특징으로 하는, 조직 구조체.
  13. 제11항에 기재된 조직 구조체를 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법.
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