CN115851818B - 浮萍LtP1-L基因在调控浮萍荭草素、异荭草素表达中的应用 - Google Patents
浮萍LtP1-L基因在调控浮萍荭草素、异荭草素表达中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了浮萍LtP1‑L基因在调控浮萍荭草素和/或异荭草素表达中的应用，所述浮萍LtP1‑L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。具体地，将浮萍LtP1‑L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1‑L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的浮萍。本发明还公开了一种制备荭草素和/或异荭草素的方法：将浮萍LtP1‑L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1‑L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的转基因浮萍；培养该转基因浮萍，提取获得荭草素和/或异荭草素。本发明大大降低了荭草素和异荭草素的生产成本，具有广泛的应用前景和较高的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及浮萍LtP1-L基因在调控浮萍荭草素、异荭草素表达中的应用，具体涉及过表达浮萍LtP1-L基因在提高浮萍荭草素、异荭草素表达量中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
类黄酮化合物是一类天然的植物次生代谢产物，由于它具有抗氧化、抗增生、抗癌、抗病毒和消炎等功效，目前被广泛应用于制药、食品饮料、膳食补充剂和化妆品添加剂等领域，具有很高的经济和社会价值。随着我国经济的持续高速发展，国民生活、医疗和健康水平得到不断提升，市场对类黄酮化合物的需求量也在逐年攀升。类黄酮化合物广泛存在于各类植物中，包括芸香科、银杏科、豆科、唇形科和菊科植物等。目前，类黄酮化合物主要是依靠采集自然界中的植物资源进行提取获得，提取的方法主要有传统提取法、酶解提取法、超声辅助提取等各种方法，或者是通过有效的化学手段进行合成。以上方法各有优缺点，但都有提取或合成效率较低，成本较高，容易产生二次污染等不足之处。利用基因工程技术表达外源生产黄酮的研究尚未见报道。
荭草素具有抗菌抗病毒、抗炎镇痛、神经保护和心脏保护等作用，在临床上有广泛的应用。异荭草素是一种木犀草素糖苷类黄酮化合物，存在于多种药用植物中。异荭草素具有多种药理活性，如抗氧化、抑制炎症发展、改善胰岛素抵抗、弱化肝纤维化发展以及诱导肝癌细胞凋亡等。目前，市场上的类黄酮化合物荭草素和异荭草素主要是通过从植物中提取得到，生产成本较高，商业化的荭草素和异荭草素价格在800元/克。依靠采集自然界中的植物资源进行类黄酮化合物提取的方法，已无法满足日益增长的市场需求。因此，寻求易于规模化和自动化生产类黄酮化合物的方法是亟待解决的重要课题。
浮萍是一种以漂浮为生的高等水生被子植物，是世界上最小的开花被子植物，浮萍作为一种非粮水生植物，具有生长速度快，易繁殖，生产成本低等优势，并可以实现淀粉及蛋白含量的快速积累。浮萍中含有类黄酮物质荭草素和异荭草素，但其含量很低，荭草素含量为0.38mg/g干重，异荭草素含量为0.80mg/g干重。
发明内容
针对上述现有技术，为提高浮萍中类黄酮物质荭草素和异荭草素的含量，本发明通过研究，发现过表达浮萍LtP1-L基因，可以有效提高荭草素和异荭草素的表达量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
浮萍LtP1-L基因在调控浮萍荭草素和/或异荭草素表达中的应用，所述浮萍LtP1-L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
浮萍LtP1-L基因的核苷酸序列如下(SEQ ID No.1所示，方向为5’-3’)：
ATGGGGAGAGCGCCTTGCTGCGAGAAGGACGGGCTGAAGAAGGGGAGATGGACTGCGGAGGAAGACAAGATTCTGGCGAATTATATTCGAGTCAATGGAGAAGGTTCATGGAGATCGCTGCCGAAGAATGCAGGACTTCTTCGATGCGGGAAGAGTTGCAGGCTGAGATGGATAAACTACCTCAGATCTGACTTGAAGAGAGGCAACATTTCTCCGGAAGAGGAGGAGATGATCGTCCGGCTTCATACTTCTCTCGGAAACAGATGGTCTCTGATCGCCGCCCAGCTGCCTGGGAGGACGGATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACTCCCATCTGAGCCGTAGGATTCACCGGTTTAAGAGACTCGACGGGGGCGATGGCTCCACGGTGATCGTTGACCTGAGCAAGATCGTCGGAATTCCGTGCCGGCGGCGAGGAGGAAGAAAAAAGATTTCGCCAATCCAAAGCGTTGAGCCCGAGAGTAAAAAAGTCGACCACAAGGAGATGCTGATGGAGACGGCGACGAACGAGTTGCTGAGCCCGAGTTGGGAGAGCGGCGGGTCGATGAGCTCGTGTACGACGAGCGAGGAGAGGAAAGACGAGCCAGTTCCGTCAAAGGAAAAACAGCTCTACGCTCATGGAGAAGAGTGCAACAGCTCTGCAACAACGGAGGGAGAAATGCTTGACGTGGACTGGGAAGCCATGGCTACGAAGCTTTGGGATAATGACGAGATGGAGGAAATGTGGCCATGGCTCTGGGATAATAGCTCGCATGGATTCCAGCTCAAGTCTCATCTGCAGCCGCCGGAGGGTGGGCAAGAGGAGACAGATCTCGGGGAATGGATCCTCTGA。
进一步地，过表达浮萍LtP1-L基因在提高浮萍中荭草素和/或异荭草素的表达量中的应用。
更进一步地，具体应用方式为：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的浮萍。
更进一步地，所述导入，是通过农杆菌介导的方式侵染浮萍愈伤组织。具体地，包括以下步骤：
(1)将浮萍LtP1-L基因连接于植物表达载体上，构建含浮萍LtP1-L基因的植物过表达载体；
所述浮萍LtP1-L基因是通过PCR扩增得到的，模板可以是浮萍基因组DNA，也可以是cDNA(通过提取得到浮萍总RNA，然后反转录得到cDNA)；扩增所用的特异性引物可以如下：
正向引物P1：5’-ATGGGGAGAGCGCCTTGCTG-3’；如SEQ ID No.3所示；
反向引物P2：5’-TCAGAGGATCCATTCCCCGAGATCT-3’；如SEQ ID No.4所示；
(2)将含浮萍LtP1-L基因的植物过表达载体转化根癌农杆菌，再转染浮萍愈伤组织。
浮萍LtP1-L蛋白在调控浮萍荭草素和/或异荭草素表达中的应用，所述浮萍LtP1-L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
浮萍LtP1-L蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID No.2)：
MGRAPCCEKDGLKKGRWTAEEDKILANYIRVNGEGSWRSLPKNAGLLRCGKSCRLRWINYLRSDLKRGNISPEEEEMIVRLHTSLGNRWSLIAAQLPGRTDNEIKNYWNSHLSRRIHRFKRLDGGDGSTVIVDLSKIVGIPCRRRGGRKKISPIQSVEPESKKVDHKEMLMETATNELLSPSWESGGSMSSCTTSEERKDEPVPSKEKQLYAHGEECNSSATTEGEMLDVDWEAMATKLWDNDEMEEMWPWLWDNSSHGFQLKSHLQPPEGGQEETDLGEWIL。
一种高表达荭草素和/或异荭草素的转基因浮萍，通过以下方法获得：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的转基因浮萍(基因工程植株)。
进一步地，所述导入是通过农杆菌介导的方式侵染浮萍愈伤组织。
一种制备荭草素和/或异荭草素的方法：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的转基因浮萍；培养该转基因浮萍，提取获得荭草素和/或异荭草素。
进一步地，培养浮萍得浮萍培养液，从培养液中提取获得荭草素和/或异荭草素。
更进一步地，将浮萍从浮萍培养液中去除(捞出或过滤)，得培养水溶液，从培养水溶液中提取获得荭草素和/或异荭草素。
更进一步地，利用含蔗糖的水溶液培养浮萍。含蔗糖的水溶液中，蔗糖的浓度为1～％(重量体积比，单位g/ml)，优选2％。
更进一步地，培养条件为：光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。
本发明通过研究发现，过表达浮萍LtP1-L基因，可以提高浮萍中类黄酮物质荭草素和异荭草素的表达量，且这两种类黄酮物质可以在培养浮萍的水溶液中大量释放，培养的水溶液中荭草素和异荭草素含量显著升高，纯度较高，杂质少。基因工程浮萍或者其水培溶液经过简单处理后，即可运用到食品工业，保健品，化妆品、饲料生产等工业过程中。本发明的方法大大降低了荭草素和异荭草素的生产成本，具有广泛的应用前景和较高的经济价值。
附图说明
图1：不同植株中总黄酮含量对比示意图。
图2：不同植株中荭草素、异荭草素含量对比示意图。
图3：不同植株的水溶液中荭草素、异荭草素含量对比示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1浮萍LtP1-L基因的克隆
(1)浮萍培养：浮萍在人工气候室培养，生长条件为光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。
(2)浮萍叶片总RNA的提取：取100毫克左右幼嫩的浮萍叶片组织材，置于液氮中充分研磨至粉末状，按照植物总RNA提取试剂盒(全式金，北京)说明书的方法，提取叶片总RNA；将取3μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定总RNA的质量，然后在NanoDrop(ThermoFisher，美国)分光光度计上测定总RNA的浓度。
(3)基因的克隆：以提取的总RNA为模板(500ng)，按照反转录试剂盒PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连)说明书的方法，反转录生产第一链cDNA；通过设计的特异引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，特异引物序列如下：
正向引物P1：5’-ATGGGGAGAGCGCCTTGCTG-3’；
反向引物P2：5’-TCAGAGGATCCATTCCCCGAGATCT-3’。
PCR反应体系(总体积50μL)为：5μL 10×KOD缓冲液，5μL dNTPs，4μL MgSO4，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL cDNA模板，1μL KOD酶，ddH2O补齐至50μL。
PCR扩增条件为：预变性95℃，3min，35个循环：95℃，30sec；54℃，30sec；68℃，100sec，最后68℃延伸5min。
将PCR产物进行回收纯化。
通过上述方法，获得了浮萍LtP1-L基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，推导出编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2含浮萍LtP1-L基因的植物表达载体的构建
(1)植物表达载体pCAMBiaZmUBI1p经酶切进行线性化，再回收纯化。
(2)在50℃条件下，使用同源重组酶(诺唯赞，南京)反应30min后，将浮萍LtP1-L基因重组到植物表达载体pCAMBiaZmUBI1p上。
(3)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆PCR验证，最终获得包含有浮萍LtP1-L基因的pCAMBiaZmUBI1p-LtP1-L植物表达载体。
实施例3基因工程植株的获得
(1)将构建好的pCAMBiaZmUBI1p-LtP1-L植物表达载体通过电击的方式转入农杆菌，再经PCR验证获得阳性农杆菌菌株。
(2)过夜培养的农杆菌摇至OD600≈0.4，加入100μM的乙酰丁香酮，继续培养2h，离心收集菌体，用转化液重悬菌体至OD600≈0.4，将浮萍愈伤组织转入到菌液中，抽真空10min，超声5min，再抽真空10min。将愈伤组织取出，铺于滤纸上，避光暗培养3d后，再转移至分化培养基上，后经筛选得到基因工程浮萍株系。
具体操作如下：将浮萍叶片平铺于诱导培养基(含有4.52μM 2，4-D、0.45μM TDZ和3％蔗糖的MS培养基)上，24℃避光培养3～4周后，出现愈伤组织。而后将愈伤组织转移到新的诱导培养基上继续培养4～5周，用于转化。
将带有浮萍LtP1-L基因的植物过表达载体的根癌农菌的单个菌落转移到含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中。将培养物在28℃下振荡(200rpm)生长，直到OD600达到0.4。将新制备的100μM乙酰丁香酮(30，50二甲氧基-40-羟基苯酮，ACROSOrganics，Morris Plains，NJ，USA)加入培养物中，并将混合物继续振荡2小时。然后2400g、离心15分钟收集菌体，并重新悬浮在诱导培养基中。将重新悬浮的农杆菌的密度(OD600)调整为约0.4，用于侵染浮萍愈伤组织。
将愈伤组织浸入350mL组织培养瓶中的农杆菌悬浮液中。将瓶子置于真空室中并施加真空10分钟。然后，将瓶子置于浴式超声波仪(Branson超声波清洁器CPX2800，BransonUltrasonics Corp.，Danbury，CT，USA)中，然后在17℃下以40kHz的频率进行超声波处理5分钟。超声处理后，将瓶子再次真空渗透10分钟。释放真空后，将愈伤组织块和农杆菌轻轻摇动孵育30分钟。培养后，通过将感染的愈伤组织块转移到用诱导培养基润湿的滤纸上，并将其置于25℃黑暗中的空培养皿中进行共培养。共培养三天后，将感染的愈伤组织转移到再生培养基(Gamborg’s B5基础培养基，补充4.65μM激动素、2.57μM吲哚-3-乙酸、1％蔗糖、9.48μM潮霉素(PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS，USA)、600μMtimentin并用7.9g/L琼脂固化)上。在黑暗中的琼脂上培养1周后，在约50μmol/m2/s白光的16小时光周期下培养愈伤组织4周。将再生的浮萍叶片转移到保存培养基(含有0.6％蔗糖和300μM timentin的SH培养基，并用7.9g/L琼脂固化)上，等待浮萍生长增殖。
实施例4基因工程植株中荭草素和异荭草素含量的测定
收集实施例3中培养2周的基因工程植株(共得到2个株系，分别命名为LtP1-LOX-1和LtP1-LOX-2)，冻干后使用80％甲醇超声提取总黄酮，再经HPLC分析荭草素和异荭草素的含量。以培养未经转染的愈伤组织得到的浮萍(野生型)为对照。
结果：如图1、图2所示，对于总黄酮，野生型的含量为6.06％(总黄酮的重量占植物干重的百分比)，LtP1-LOX-1的含量为16.79％，LtP1-LOX-2的含量为18.93％。对于荭草素，野生型中的含量为0.04％(荭草素的重量占植物干重的百分比)，LtP1-LOX-1中的含量为0.29％、LtP1-LOX-2中的含量为0.37％。对于异荭草素，野生型中的含量为0.08％(异荭草素的重量占植物干重的百分比)，LtP1-LOX-1中的含量为0.53％、LtP1-LOX-2中的含量为0.73％。可见，基因工程株系中总黄酮、荭草素和异荭草素的含量与野生型相比，总黄酮含量提高了2.5～3倍，荭草素、异荭草素的含量提高了6～10倍，有显著提升。
实施例5基因工程植株培养液中荭草素和异荭草素含量的测定
将4克鲜重的野生型浮萍、LtP1-LOX-1和LtP1-LOX-2株系(各设置3组)放入20mL含有2％(重量体积比，单位g/ml)蔗糖的水溶液中培养，培养条件为光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。培养7d后，过滤去除浮萍，得培养水溶液。通过HPLC分析培养水溶液中荭草素和异荭草素的含量。
结果：如图3所示，野生型浮萍的培养水溶液中，荭草素的含量为0.84mg/L，异荭草素的含量为0.73mg/L；LtP1-LOX-1中荭草素的含量分别为16.83mg/，异荭草素的含量分别为24.89mg/L；LtP1-LOX-2中荭草素的含量分别为22.38mg/L，异荭草素的含量分别为30.54mg/L。可见，各株系的培养水溶液中荭草素和异荭草素的含量较高，可以直接从培养水溶液中提取得到荭草素和异荭草素，该发现为意外发现，相比从浮萍叶片中提取，大大简化了提取步骤，提取成本大幅度降低。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.浮萍LtP1-L基因在调控浮萍荭草素和/或异荭草素表达中的应用，所述浮萍LtP1-L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达浮萍LtP1-L基因在提高浮萍中荭草素和/或异荭草素的表达量中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的浮萍。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述导入是通过农杆菌介导的方式侵染浮萍愈伤组织。
5.浮萍LtP1-L蛋白在调控浮萍荭草素和/或异荭草素表达中的应用，所述浮萍LtP1-L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
6.一种获得高表达荭草素和/或异荭草素的转基因浮萍的方法，其特征在于：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的转基因浮萍；所述浮萍LtP1-L基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
7.一种制备荭草素和/或异荭草素的方法，其特征在于：将浮萍LtP1-L基因导入浮萍基因组中，使浮萍LtP1-L基因过表达，从而得到荭草素和/或异荭草素的表达量高于野生型植株的转基因浮萍；所述浮萍LtP1-L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；培养该转基因浮萍，提取获得荭草素和/或异荭草素。
8.根据权利要求7所述的制备荭草素和/或异荭草素的方法，其特征在于：培养浮萍得浮萍培养液，从培养液中提取获得荭草素和/或异荭草素；或：将浮萍从浮萍培养液中去除，得培养水溶液，从培养水溶液中提取获得荭草素和/或异荭草素。
9.根据权利要求7或8所述的制备荭草素和/或异荭草素的方法，其特征在于：利用含蔗糖的水溶液培养浮萍。
10.根据权利要求9所述的制备荭草素和/或异荭草素的方法，其特征在于：培养条件为：光周期：光亮16 h/黑暗8 h，25℃。
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