CN115161340A - 高效浮萍遗传转化方法及应用与利用浮萍表达细胞因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效浮萍遗传转化方法，包括浮萍愈伤组织的诱导培养、浮萍愈伤组织的继代培养、利用含目的基因的农杆菌侵染愈伤组织、含目的基因的农杆菌侵染后的愈伤组织的筛选培养以及含目的基因的愈伤组织的再生步骤。该方法通过对各步骤培养基及培养条件的筛选和优化，一个月即可实现转化与未转化的愈伤组织的筛选，同时仅需一个月即可将愈伤组织再生为完整的、形态正常的植株。相对于现有技术，本发明具有筛选和再生效率更高的特点。本发明还提供了该方法在生产外源蛋白中的应用，以及利用浮萍表达细胞因子的方法，解决了现有技术以烟草作为底盘植物来表达细胞因子存在的安全性问题和临床使用受限的问题。

Description

高效浮萍遗传转化方法及应用与利用浮萍表达细胞因子的 方法
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及一种高效浮萍遗传转化方法及应用与利用浮萍表达细胞因子的方法。
背景技术
生物制剂通常在细菌、真菌、哺乳动物、昆虫细胞以及植物中表达。相比较而言，植物生物反应器具有独特的优势，如培养条件简单、运输成本低、安全性高、具有蛋白的翻译后优势等。特别是在资源匮乏的环境中去大规模生产疫苗，如新冠疫苗，植物生物反应器提供了一个更便宜且能实际操作的策略。新型的基因工程亚单位疫苗通常面临着免疫原性差等问题，需要结合疫苗佐剂来提高免疫效果。免疫佐剂可增强机体对抗原的免疫应答，产生更强的免疫保护和更久的免疫记忆，有效提升疫苗效果。目前，大多数商业佐剂都是铝佐剂和油乳佐剂，它们的使用可能会导致炎症、发热等不良的局部反应，不利于动物福利。此外，铝佐剂对冷冻条件敏感，因此很难进行存储和运输。最近的研究对先天免疫受体和信号通路的新认识为合理设计新型佐剂提供了机会，一些新的佐剂获得了许可，例如，明矾、单磷酰脂质A(MPL)、AS04(同时含有明矾和MPL)和AS03(一种基于角鲨烯的佐剂)。
细胞因子和趋化因子与DNA疫苗联合使用，或者将细胞因子单独表达后与传统疫苗联合使用，可提高疫苗的免疫效果。利用植物表达体系生产细胞因子具有成本低、培养条件简单以及具有真核生物的蛋白后修饰等优点。目前，在植物中表达的大多数细胞因子都以烟草作为底盘植物，但烟草通常不被认为是安全的，这就限制了其在临床上的应用。因此，亟需安全和高效的底盘植物去满足市场需要。
浮萍是世界上生长最快、形态最小的开花植物，包括5个属和36个种，具有无性繁殖、“不与粮争地”、基因组小、培养条件简单及培养成本低等特点。转基因植株因容易逃逸到环境中而限制了其商业化应用，而浮萍的封闭培养模式可避免转基因对环境的污染。因此，浮萍是一种用于生产外源蛋白、研究生长发育机理以及基因编辑的理想模式载体。目前，利用浮萍作为生物反应器已成功表达了包括疫苗、抗体、酶、干扰素等在内的一些外源蛋白。
虽然浮萍作为生物反应器可用于生产一些外源蛋白，但是整体上还存在着转化效率不高、筛选及再生时间长、获得转基因阳性植物少等问题。浮萍愈伤组织的诱导决定着其分子生物学的发展，浮萍有36个种，但目前只有9个种建立了遗传转化体系。愈伤组织诱导依赖基因型的选择，同种不同株系的浮萍采用相同的愈伤组织诱导方案，会出现株系之间的诱导率差异大，甚至部分株系无法诱导出愈伤组织的问题。刘宇等报道了利用同一种诱导方法对100 个浮萍株系进行愈伤组织的诱导，结果表明仅有7个株系能被诱导出愈伤组织[Y.Liu,Y.Wang, S.Xu,X.Tang,J.Zhao,C.Yu,G.He,H.Xu,S.Wang,Y.Tang,C.Fu,Y.Ma,G.Zhou,Efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-mediated genomeediting in Lemna aequinoctialis.Plant biotechnology journal,(2019).]。杨贵利等报道了对绿萍种的三个不同Lemn.minor株系进行愈伤组织诱导，其中仅有一个株系能被诱导出愈伤组织，在此基础上进行遗传转化体系的构建，虽然愈伤组织诱导率和瞬时转染效率很高分别达到93％和80％，但再生阶段和稳定转化率低，分别仅为30％和4％[G.L.Yang,Y.Fang,Y.L.Xu,L.Tan,Q.Li,Y.Liu,F.Lai,Y.L.Jin,A. P.Du,K.Z.He,X.R.Ma,H.Zhao,Frond transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens for Lemnaminor.Plant Molecular Biology 98,319-331(2018).]。因此，愈伤组织的诱导是浮萍遗传转化体系的基础，建立更高效快速筛选和再生的浮萍表达体系去生产有价值的外源蛋白是十分必要的。此外，目前尚未见以浮萍作为底盘植物来生产细胞因子并作为疫苗佐剂及其免疫效果的报道。
发明内容
针对现有技术以浮萍愈伤组织作为遗传转化材料存在着转化率低、再生时间长、获得阳性转基因株系少等问题，以及现有技术尚无以浮萍作为底盘植物来生产细胞因子的不足，本发明提供了一种高效浮萍遗传转化方法以及该方法在生产外源蛋白中的应用，以缩短筛选培养和再生培养的时间、提高遗传转化效率，本发明还提供了一种利用浮萍表达细胞因子的方法，为细胞因子的生产提供新方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高效浮萍遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)浮萍愈伤组织的诱导培养
将浮萍叶状体接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织，诱导培养条件：光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加5～50μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.45～5μM噻苯隆、10～30g/L蔗糖、3～5g/L结冷胶的 MS基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～5.7；
(2)浮萍愈伤组织的继代培养
将愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，继代培养条件：光周期为(16～14)h: (8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，继代培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，继代培养基的pH值为5.5～5.7；
(3)利用含目的基因的农杆菌侵染愈伤组织
构建含目的基因的植物表达载体，将构建的含目的基因的植物表达载体转入农杆菌，用转入了目的基因的农杆菌侵染愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种至共培养培养基中，在黑暗条件下培养3～4天，共培养培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、80～120μM乙酰丁香酮、25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，共培养培养基的pH值为5.5～5.7；
(4)含目的基因的农杆菌侵染后的愈伤组织的筛选培养
将共培养后的愈伤组织转接至筛选培养基上进行筛选培养，筛选培养条件：光周期为 (16～14)h:(8～10)h，光照强度为20～60μmol/m2/s，筛选培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、80～120mg/L的筛选剂G418、200～250mg/L头孢、 25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，筛选培养基的pH值为5.5～5.7；
(5)含目的基因的愈伤组织的再生
将筛选得到的含目的基因的愈伤组织转接至再生培养基中进行再生培养，得到含目的基因的转基因浮萍(完整的转基因浮萍株系)；再生培养的条件：光周期为24h全光照，光照强度为80～180μmol/m2/s，再生培养时间为28～32天，再生培养基为添加4～6g/L蔗糖、80～120 mg/L筛选剂G418、200～250mg/L头孢、0.3～0.4g/L结冷胶的1/2SH培养基，再生培养基的 pH值为5.5～5.7。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案中，步骤(1)所采用的浮萍叶状体的获取方法如下：
挑取保存于种子资源库的浮萍叶状体，接种于预培养基中进行预培养，预培养条件：温度25±1℃，光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，预培养基为添加10～15g/L蔗糖的SH液体培养基，预培养基的pH值为5.6～5.7。预培养时，预培养至叶状体达到后续步骤所需要的量即可，具体可根据浮萍株系、浮萍叶状体的状态等因素进行确定；预培养结束后，选取生长状态良好的浮萍叶状体用于步骤(1)。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案的步骤(2)在继代培养时，优选每隔一个月更换一次继代培养基。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案的步骤(3)中，含目的基因的植物表达载体转入农杆菌之后，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中，在28±1℃振荡培养至OD600为0.6～0.8，然后收集菌体，用添加了6～6.5mM甘露醇、95～100μM乙酰丁香酮的MS基础培养基重新悬浮菌体至OD600为1～1.2，得到重悬菌液；用重悬菌液在28±1℃侵染愈伤组织 10～15min，即得到侵染后的愈伤组织。所采用的农杆菌优选为农杆菌GV3101。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案的步骤(4)中，筛选培养的时间优选为28～32 天，筛选培养过程中不用更换筛选培养基。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案的步骤(5)中，再生培养过程中不用更换再生培养基。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案中，优选将各步骤均在25±1℃的温度条件下进行培养。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案中，所述浮萍叶状体优选来源于绿萍，例如，浮萍叶状体可来源于绿萍M0157。
上述高效浮萍遗传转化方法的技术方案中，光周期为(16～14)h:(8～10)h是指一天之中，光照时间为16～14小时，相应地，黑暗时间为8～10小时。
本发明还提供了上述方法在生产外源蛋白中的应用。进一步地，在应用时，将利用上述高效浮萍遗传转化方法得到的含目的基因的转基因浮萍进行扩培，目的基因在转基因浮萍中表达目的蛋白，得到含目的外源蛋白的转基因浮萍。
更进一步地，上述应用中，对含目的基因的转基因浮萍进行扩培所采用的培养基为添加 5～10g/L蔗糖、80～120mg/L筛选剂G418、200mg/L头孢的SH培养基，所述培养基的pH 值为5.5～5.7。
本发明还提供了一种利用浮萍表达细胞因子的方法，该方法先利用上述高效浮萍遗传转化方法获得含目的基因的转基因浮萍，在获得含目的基因的转基因浮萍时，所采用的目的基因为编码细胞因子的基因，然后对获得的含目的基因的转基因浮萍进行扩培，即实现了利用浮萍表达细胞因子。
进一步地，上述利用浮萍表达细胞因子的方法的技术方案中，在对含目的基因的转基因浮萍进行扩培时，所采用的培养基为添加5～10g/L蔗糖、80～120mg/L筛选剂G418、200mg/L 头孢的SH培养基，所述培养基的pH值为5.5～5.7。
进一步地，上述利用浮萍表达细胞因子的方法的技术方案中，所述编码细胞因子的基因包括白介素基因，例如，一种可行的白介素基因为鸡白介素基因IL-17B，当然，编码细胞因子的基因并不仅仅包括鸡白介素基因IL-17B。
本发明通过动物实验证实，将利用本发明所述利用浮萍表达细胞因子的方法得到的含 IL-17B蛋白的转基因浮萍与鸡支气管炎疫苗H120组合使用，在注射疫苗H120的同时饲喂含IL-17B蛋白的转基因浮萍，可以增加黏膜抗体，增强对病毒防御能力，能够抑制病毒在组织中的增殖。以上实验结果说明，通过本发明的方法表达的细胞因子(IL-17B蛋白)是具有疫苗佐剂的活性的，本发明所述表达细胞因子的方法并不会造成细胞因子失活或活性低的问题。采用本发明所述方法获得的含IL-17B蛋白的转基因浮萍可以作为黏膜疫苗佐剂使用，当然，也可以将含IL-17B蛋白的转基因浮萍中的IL-17B蛋白分离纯化出来作为黏膜疫苗佐剂使用。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种高效浮萍遗传转化方法，该方法的愈伤组织诱导率高，得到的愈伤组织呈深绿色且为胚性愈伤组织，侵染效率高；在对愈伤组织进行筛选培养时，能够在一个月实现转化与未转化的愈伤组织的筛选；在对筛选出的愈伤组织进行再生培养时，仅需一个月即可将所有的愈伤组织再生为完整的、形态正常的植株。相对于现有技术，本发明具有筛选和再生效率更高的特点。
2.以本发明所述高效浮萍遗传转化方法为基础，本发明还提供了该方法在生产外源蛋白中的应用，为浮萍生物生物反应器生产外源蛋白提供了一定的方法基础。
3.以本发明所述高效浮萍遗传转化方法为基础，本发明还提供了利用浮萍表达细胞因子的方法，填补了现有技术尚无以浮萍作为底盘植物来生产细胞因子的空白，解决了现有技术以烟草作为底盘植物来表达细胞因子存在的安全性问题和临床使用受限的问题，可以更好地满足实际应用需求。
4.本发明通过动物实验证实，将利用本发明所述利用浮萍表达细胞因子的方法得到的含 IL-17B蛋白的转基因浮萍与鸡支气管炎疫苗H120组合使用，在注射疫苗H120的同时饲喂含 IL-17B蛋白的转基因浮萍，可以增加黏膜抗体，增强对病毒防御能力，能够抑制病毒在组织中的增殖。说明通过本发明的方法表达的细胞因子(IL-17B蛋白)是具有疫苗佐剂的活性的，本发明所述表达细胞因子的方法并不会造成细胞因子失活或活性低的问题。本发明为细胞因子的生产提供了更方便、更低成本和更安全的方法。
附图说明
图1是实施例1中的T-1～T-6实验组的愈伤组织诱导率。
图2是实施例1的T-3实验组和对比例1中诱导培养得到的愈伤组织的照片。
图3是实施例2在不同浓度的G418的条件下进行筛选培养得到的愈伤组织的照片。
图4是载体pCambia2301:GUS和载体pCambia2301:17B的构建示意图。
图5的(A)(B)两图分别是含报告基因和含目的基因的浮萍愈伤组织的筛选培养结果。
图6的(A)(B)两图分别是含报告基因和含目的基因的浮萍愈伤组织的再生培养结果。
图7是转基因IL-17B和报告基因gus浮萍的DNA水平鉴定结果。
图8是转基因IL-17B和报告基因gus浮萍的蛋白水平鉴定结果。
图9实施例9和对比例3中的血清中抗体效价测定结果。
图10实施例10和对比例4气管和肠道的黏膜抗体测定结果。
图11实施例11和对比例5组织中病毒载量测定结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的高效浮萍遗传转化方法及应用与利用浮萍表达细胞因子的方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
下述各实施例和对比例中，所使用的试验方法，如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法；所使用的试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；所采用的浮萍为绿萍 M0157，属于Lemnagibba，保存于中国科学院成都生物研究所种质资源库；所述SH、MS、B5和LB培养基均购于北京酷来博有限公司；所述2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、噻苯隆(化学名称为N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲，TDZ)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2-异戊烯腺嘌呤(2-IP)、 1-萘乙酸(NAA)均购于北京索莱宝科技有限公司；His抗体购置于北京全式金生物技术股份有限公司。农杆菌GV3101可以从北京天恩泽基因科技有限公司购买得到。
实施例1：不同诱导培养条件对浮萍愈伤组织的诱导效率比较
本实施例中，考察不同的诱导培养条件对浮萍愈伤组织诱导效率的影响，步骤如下：
(1)浮萍叶状体的预培养
挑取保存于种子资源库的浮萍叶状体，接种于预培养基中进行预培养，培养条件：温度 25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为100μmol/m2/s，预培养基为添加10g/L蔗糖的SH 液体培养基，预培养基的pH值为5.6。
(3)浮萍愈伤组织的诱导培养
将步骤(1)预培养至浮萍叶状体达到一定数量且生长状态良好的浮萍叶状体分别接种于多种愈伤组织诱导培养基中，在不同的条件下进行诱导培养，得到浮萍愈伤组织。该步骤一共分7个实验组(T-1～T-7实验组)同时进行，各组采用的愈伤组织诱导培养基和诱导培养条件如表1所示。
表1愈伤组织诱导培养条件
Figure BDA0003801671200000071
按照公式：愈伤组织诱导率＝诱导出的愈伤组织的叶片/总叶片，计算各组浮萍的愈伤组织诱导率，结果如图1所示。由图1可知，在不同诱导培养条件下，浮萍的愈伤组织诱导率差异显著，说明浮萍愈伤组织对某些浓度的激素和某些诱导培养基具有依赖性。其中，T-3 实验组的浮萍愈伤组织的诱导率高达83％，诱导培养得到的浮萍愈伤组织的照片如图2的左图所示。
对比例1：运用CN 110616182 A的方法诱导培养浮萍愈伤组织
采用CN 110616182 A中实施例1方法诱导培养浮萍愈伤组织，具体采用的培养基为Y3 培养基。诱导培养得到的浮萍愈伤组织的照片如图2的右图所示。
由图2可知，采用CN 110616182 A中实施例1的方法利用Y3培养基诱导培养得到的浮萍愈伤组织整体呈现黄色、形态更小且疏松；而采用本发明实施例1的方法由T-3组的诱导培养条件得到的浮萍愈伤组织呈绿色、组织更坚硬。二者的形态具有明显差异。进一步比较二者所采用的诱导培养基的成分与含量以及激素浓度的差异，如表2所示。
表2诱导培养基的成分与含量以及激素浓度比较
Figure BDA0003801671200000081
由表2可知，本发明的T-3实验组所用诱导培养基与CN 110616182 A所用诱导培养基的成分有明显差别，例如，大量元素的种类和用量有明显差异，微量元素和碳源的用量也有较大的差异，有机成分的含量也存在差异。同时，诱导培养基种的激素水平也存在显著的差异。正是这些差异的存在，使得二者诱导培养获得的浮萍愈伤组织的形态出现了明显差异。
实施例2：浮萍愈伤组织的筛选培养
(1)将实施例1的T-3实验组诱导培养得到的浮萍愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，继代培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为100μmol/m2/s，继代培养期间，一个月更换一次继代培养基；继代培养基为添加1μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2μM 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖、0.35g/L结冷胶的MS基础培养基，继代培养基的pH值为5.6。
(2)将继代培养获得的浮萍愈伤组织接种至筛选培养基上进行筛选培养，筛选培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为100μmol/m2/s。
该步骤中，共设置6个实验组，各实验组采用的筛选培养基中含有不同浓度的筛选剂 G418，各实验组的筛选培养基是在步骤(1)所述继代培养基的基础上添加0mg/L、10mg/L、 20mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L的G418得到的。
筛选结果如图3所示，当G418的浓度为20mg/L时，愈伤组织的生长较缓慢，颜色变黄，但没有出现变白的情况。当G418的浓度达到50mg/L时，愈伤组织逐渐变白，生长速度进一步变缓。当G418的浓度为100mg/L时，愈伤组织的生长受阻且开始白化。因此，在后续转基因筛选实验选取G418浓度为100mg/L的条件进行筛选，既能保证未转基因的愈伤组织大部分白化，又能筛选到转基因的愈伤组织。
实施例3：浮萍愈伤组织的快速再生
将实施例2在G418浓度为100mg/L的条件下筛选得到的浮萍愈伤组织转接至再生培养基中进行再生培养，再生培养条件：温度25±1℃，光周期为24h全光照，光照强度为100μmol/m2/s，再生期间不用更换再生培养基，再生培养基为添加5g/L蔗糖、0.35g/L结冷胶的1/2SH培养基，再生培养基的pH值为5.6。
筛选出的浮萍愈伤组织在再生培养15天时，能明显看见叶片和根从愈伤组织中分化出来，继续培养15天，所有的愈伤组织都再生出了完整的植株，并且再生出的叶片形状都正常，再生率高达94％。
对比例2：运用CN 110616182 A的方法进行再生
采用CN 110616182 A中的实施例6的方法进行再生培养，结果发现，采用该方法需要3 个月的时间才能再生得到完整的植株，并且再生率仅为30％。进一步比较本申请实施例3和 CN 110616182A的实施例6在进行再生培养时采用的再生培养基的差异。本发明在再生培养时所用的基础培养基为1/2SH培养基，CN 110616182 A在再生培养是所采用的基础培养基为 B5培养基，具体如表3所示。
表3再生培养基的成分与含量比较
Figure BDA0003801671200000091
Figure BDA0003801671200000101
由表3可知，本申请的实施例3和CN 110616182 A的实施例6在进行再生培养时采用的再生培养基中，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和碳源上都具有较为明显的差异。这些差异的存在使得二者再生时，在再生效率上出现了明显的差异，本申请可将CN110616182 A中的再生时间由3个月缩短至1个月，有效提高了再生效率。
实施例4：将含有目的基因或者报告基因转入到浮萍愈伤组织中
将含有报告基因的pCambia2301:GUS载体作为浮萍遗传转化体系的参照组，通过愈伤组织和转基因叶片GUS染色结果来衡量该体系的遗传转化效率。此外，将pCambia2301:GUS 中的gus基因替换为细胞因子—鸡白介素IL-17B，构建载体pCambia2301:17B。载体pCambia2301:GUS和载体pCambia2301:17B的构建示意图见图4。
将载体pCambia2301:GUS和载体pCambia2301:17B转入到农杆菌GV3101中，菌落PCR 验证正确后接种于LB培养基中，在28±1℃、转速150rpm培养至菌体OD600为0.6左右，收集菌体并用MS培养基(含有6mM甘露醇、100μM乙酰丁香酮，pH＝5.6)重悬菌体至 OD600达到1.2，在28±1℃放置1h，加入绿色状态的浮萍愈伤组织静止10min，去除菌液后将愈伤组织放入共培养培养基上黑暗放置3天。所述共培养的培养基为添加1μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2μM 6-苄氨基腺嘌呤、100μM乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和0.35g/L结冷胶的 MS基础培养基，共培养培养基的pH值为5.6。
实施例5：含目的基因或者报告基因的浮萍愈伤组织的筛选培养
将实施例4中侵染3天的浮萍愈伤组织转接至筛选培养基中进行筛选培养，筛选培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为40μmol/m2/s，筛选培养时间为1个月；筛选培养基为添加1μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2μM 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖、100mg/LG418、200mg/L头孢、0.35g/L结冷胶的MS基础培养基，筛选培养基的pH值为5.6。
筛选培养结果如图5所示，其中的(A)(B)两图分别是含报告基因和含目的基因的浮萍愈伤组织的筛选培养结果。由图5可知，本实施例在一个月即可达到很好的筛选效果，未转化的愈伤组织在G418浓度为100mg/L的条件下最终变白，而转化成功的愈伤组织在G418 浓度为100mg/L的条件下生长旺盛且颜色依然为绿色。
实施例6：含目的基因或者报告基因的愈伤组织的快速再生
将实施例5中筛选培养一个月得到的形态正常的愈伤组织转入再生培养基中进行再生培养，再生培养条件：温度25±1℃，光周期为24h全光照，光照强度为100μmol/m2/s，再生培养时间为1个月；再生培养基为添加5g/L蔗糖、100mg/L G418、200mg/L头孢、0.35g/L结冷胶的1/2SH培养基，再生培养的pH值为5.6。
再生培养结果如图6所示，其中的(A)(B)两图分别是含报告基因和含目的基因的浮萍愈伤组织的再生培养结果。由图6可知，再生培养一个月，所有的愈伤组织都能再生出完整的植株，且接近100％都耐受100mg/L的G418。
实施例7：再生转基因植株的DNA水平鉴定
将实施例6再生培养得到的转基因植株在液体培养基中进行扩培，扩培条件：温度25±1℃，光周期为24h全光照，光照强度为100μmol/m2/s；液体培养基为添加10g/L蔗糖、100mg/L筛选剂G418、200mg/L头孢的SH培养基，该培养基的pH值为5.6。从中挑取部分转基因植株进行DNA水平验证，具体操作如下：
液氮研磨转基因植株后放于1.5mL EP管中，加入200μL的DNA提取液buffer，将其放入恒温金属浴，条件为70℃，30min；在13500×g、4℃离心5min，去上清，沉淀加入 200μL的异戊醇，混匀后在-20℃放置10min，在13500×g、4℃离心5min，弃上清，加入 1mL的75％的乙醇重悬沉淀，在13500×g、4℃离心1min后弃上清，再重复加入75％乙醇洗涤，室温放置10min挥发乙醇，最后加入100μL水溶解DNA。将提取的DNA采用gus 的特异性引物和17B的特性性引物进行检测，并用琼脂凝胶电泳进行检测。结果如图7所示，由图7可知，gus基因和17B都成功转入到浮萍的基因组上。
实施例8：再生转基因植株的蛋白水平验证
对实施例7在液体培养基中扩培后得到的含报告基因gus的转基因浮萍进行蛋白水平鉴定，具体操作按gus染色试剂盒进行，取一定量的转基因浮萍叶片在5mL EP管中，加入配置好的含x-gal的底物，混匀后黑暗常温放置24h。弃掉染色液加入无水乙醇进行洗脱，直到将所有浮萍叶绿素洗脱干净为止。最后进行gus蛋白的显微镜观察，结果如图8所示。
称取含IL-17B蛋白的转基因浮萍1g鲜重加入液氮研磨，并用2倍体积的PBS缓冲液匀浆，冰上放置2h，在13500×g、4℃离心20min，收集上清液并测定其可溶性蛋白含量。用10％SDS-PAGE胶分离转基因植株中的可溶性蛋白，并在冰上将分离的蛋白转移至PVDF膜，转膜条件为95V，50min。转膜结束后加入5％脱脂牛奶封闭2h。封闭结束后加入稀释3000 倍的His-单克隆抗体过夜孵育。用洗脱液洗脱多余的一抗后加入稀释10000倍的二抗孵育1h，加入洗脱液洗脱二抗，最后加入化学荧光染色液在化学发光成像仪中获取结果，结果如图8所示。
实施例9：含IL-17B基因的转基因植株结合鸡传染性支气管炎病毒疫苗对鸡血清中抗体的影响
将实施例7在液体培养基中扩培后得到的含IL-17B蛋白的转基因浮萍真空冷冻干燥并粉粹。对7日龄的无病原菌的鸡接种鸡支气管炎疫苗H120，同时给每只鸡饲喂含IL-17B蛋白3 μg的PBS重悬的转基因浮萍粉末。对21日龄的小鸡按首免相同的接种条件接种加强疫苗 H120，并饲喂相同量的PBS重悬的转基因浮萍粉末。记作IL-17B-H120组。
首免后0d，7d，14d，21d，35d进行鸡翅下采血，分离血清，放置于-80℃。利用ELISA试剂盒检测血清中的IBV特异性抗体，其中二抗为IgG，结果如图9。由图9可知，在首免后21d，IL-17B-H120组的抗体效价达到了1200以上。
对比例3：浮萍野生型植株和PBS缓冲液结合鸡传染性支气管炎病毒疫苗对鸡血清中抗体的影响
本实施例中，共进行如下3个实验组：
将浮萍野生型M0157的植株真空冷冻干燥并粉粹。对7日龄的无病原菌的鸡接种鸡支气管炎疫苗H120，同时给每只鸡饲喂浮萍野生型M0157的PBS重悬的浮萍粉末，饲喂量与实施例9相同。对21日龄的鸡按首免相同的接种条件接种加强疫苗H120，并饲喂相同量的浮萍野生型M0157的PBS重悬的浮萍粉末。记作M0157-H120组。
将浮萍野生型M0157的植株真空冷冻干燥并粉粹。对7日龄的无病原菌的鸡接种鸡支气管炎疫苗H120，同时给每只鸡饲喂PBS缓冲液，饲喂量与实施例9相同。对21日龄的鸡按首免相同的接种条件接种加强疫苗H120，并饲喂相同量的PBS缓冲液。记作PBS-H120组。
直接对7日龄的无病原菌的鸡饲喂PBS缓冲液，饲喂量与实施例9相同。对21日龄的鸡饲喂相同量的PBS缓冲液。记作PBS组。
首免后0d，7d，14d，21d，28d进行鸡翅下采血，分离血清，放置于-80℃。利用ELISA试剂盒检测血清中的IBV特异性抗体，其中二抗为IgG，结果如图9所示。
由图9可知，在注射疫苗H120的同时饲喂含IL-17B蛋白的转基因浮萍的IL-17B-H120 组中，鸡血清中的IBV抗体的效价显著高于M0157-H120组和PBS-H120组。此外，未接种疫苗的PBS组的鸡血清中，未检测到IBV特异性抗体，表明鸡在免疫过程期间未感染IBV 病毒。
实施例10：含IL-17B基因的转基因植株结合鸡传染性支气管炎病毒疫苗对鸡气管和肠道中黏膜抗体的影响
将实施例9中首免后28d的鸡扑杀，分别取气管和肠道各8cm用PBS缓冲液灌洗三次，在13500×g、4℃离心5min，取上清。将实施例9中的二抗替换为sIgA抗体按同样的方法测定气管和肠道中黏膜抗体，结果如图10所示。
对比例4：浮萍野生型植株和PBS缓冲液对鸡传染性支气管炎病毒疫苗的免疫气管和肠道中黏膜抗体的影响
将对比例3中首免后28d的鸡扑杀，分别取气管和肠道8cm用PBS缓冲液灌洗三次后，在13500×g、4℃离心5min，取上清。将实施例9中的二抗替换为sIgA抗体按同样的方法测定气管和肠道中黏膜抗体，结果如图10所示。
由图10可知，在注射疫苗H120的同时饲喂含IL-17B蛋白实的转基因浮萍的IL-17B-H120 组中，鸡气管和肠道中的IBV黏膜抗体sIgA的水平显著高于M0157-H120组和PBS-H120组。结合图9和图10可知，本发明中转基因浮萍表达的IL-17B蛋白与鸡传染性支气管疫苗H120 组合使用可以增加黏膜抗体，增强对病毒防御能力。
实施例11：含IL-17B基因的转基因植株结合鸡传染性支气管炎病毒疫苗对鸡气管、肾和肺病毒载量的影响
对实施例9中首免后28d后的鸡进行攻毒，攻毒剂量为2MOI IBV SC-MY-19(GenBank Accession no.MT563407.1)，攻毒后十天解剖该组所有的鸡，并对鸡的气管、肾和肺中病毒载量分析。具体步骤为，以含有该病毒部分片段的质粒进行RT-PCR建立标准曲线，不同组织病毒载量根据标准曲线进行计算，结果如图11所示。
对比例5：浮萍野生型植株和PBS缓冲液结合鸡传染性支气管炎病毒疫苗对鸡气管、肾和肺病毒载量的影响
在对比例3中M0157-H120组、PBS-H120组和PBS组首免后28d后，对各组的鸡进行攻毒，攻毒剂量为2MOI IBV SC-MY-19(GenBank Accession no.MT563407.1)，攻毒后十天解剖各组所有的鸡，并对鸡的气管、肾和肺中病毒载量分析。具体步骤为，以含有该病毒部分片段的质粒进行RT-PCR建立标准曲线，不同组织病毒载量根据标准曲线进行计算，结果如图11所示。
由图11可知，在注射疫苗H120的同时饲喂含IL-17B蛋白实的转基因浮萍的IL-17B-H120 组中，鸡的气管、肾和肺的病毒载量显著低于M0157-H120组、PBS-H120组和PBS组。表明本发明中转基因浮萍表达的IL-17B蛋白与鸡传染性支气管疫苗H120组合使用能更有效地抑制病毒在组织中的增殖。

Claims (10)

1.一种高效浮萍遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)浮萍愈伤组织的诱导培养
将浮萍叶状体接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织，诱导培养条件：光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加5～50μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.45～5μM噻苯隆、10～30g/L蔗糖、3～5g/L结冷胶的MS基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～5.7；
(2)浮萍愈伤组织的继代培养
将愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，继代培养条件：光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，继代培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，继代培养基的pH值为5.5～5.7；
(3)利用含目的基因的农杆菌侵染愈伤组织
构建含目的基因的植物表达载体，将构建的含目的基因的植物表达载体转入农杆菌，用转入了目的基因的农杆菌侵染愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种至共培养培养基中，在黑暗条件下培养3～4天，共培养培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、80～120μM乙酰丁香酮、25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，共培养培养基的pH值为5.5～5.7；
(4)含目的基因的农杆菌侵染后的愈伤组织的筛选培养
将共培养后的愈伤组织转接至筛选培养基上进行筛选培养，筛选出含目的基因的愈伤组织，筛选培养条件：光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为20～60μmol/m2/s，筛选培养基为添加1～1.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.25μM 6-苄氨基腺嘌呤、80～120mg/L的筛选剂G418、200～250mg/L头孢、25～30g/L蔗糖、0.3～0.4g/L结冷胶的MS基础培养基，筛选培养基的pH值为5.5～5.7；
(5)含目的基因的愈伤组织的再生
将筛选得到的含目的基因的愈伤组织转接至再生培养基中进行再生培养，得到含目的基因的转基因浮萍；再生培养的条件：光周期为24h全光照，光照强度为80～180μmol/m2/s，再生培养时间为28～32天，再生培养基为添加4～6g/L蔗糖、80～120mg/L筛选剂G418、200～250mg/L头孢、0.3～0.4g/L结冷胶的1/2SH培养基，再生培养基的pH值为5.5～5.7。
2.根据权利要求1所述高效浮萍遗传转化方法，其特征在于步骤(1)所采用的浮萍叶状体的获取方法如下：
挑取保存于种子资源库的浮萍叶状体，接种于预培养基中进行预培养，预培养条件：温度25±1℃，光周期为(16～14)h:(8～10)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，预培养基为添加10～15g/L蔗糖的SH液体培养基，预培养基的pH值为5.6～5.7。
3.权利要求1所述高效浮萍遗传转化方法，其特征在于，各步骤均在25±1℃的温度条件下进行培养。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述高效浮萍遗传转化方法，其特征在于，所述浮萍叶状体来源于绿萍。
5.权利要求1至4中任一权利要求所述方法在生产外源蛋白中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，对含目的基因的转基因浮萍进行扩培，目的基因在转基因浮萍中表达目的蛋白，得到含目的外源蛋白的转基因浮萍。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对含目的基因的转基因浮萍进行扩培所采用的培养基为添加5～10g/L蔗糖、80～120mg/L筛选剂G418、200mg/L头孢的SH培养基，所述培养基的pH值为5.5～5.7。
8.一种利用浮萍表达细胞因子的方法，其特征在于，该方法先利用权利要求1至4中任一权利要求所述方法获得含目的基因的转基因浮萍，在获得含目的基因的转基因浮萍时，所采用的目的基因为编码细胞因子的基因，然后对获得的含目的基因的转基因浮萍进行扩培，即实现了利用浮萍表达细胞因子。
9.根据权利要求8所述利用浮萍表达细胞因子的方法，其特征在于，对含目的基因的转基因浮萍进行扩培所采用的培养基为添加5～10g/L蔗糖、80～120mg/L筛选剂G418、200mg/L头孢的SH培养基，所述培养基的pH值为5.5～5.7。
10.权利要求8或9所述利用浮萍表达细胞因子的方法，其特征在于，所述编码细胞因子的基因包括白介素基因。
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