CN117802116A - 一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用 - Google Patents
一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因重组及疫苗技术领域，公开了一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。本发明以PRV FJ01变异株的三基因缺失株为病毒载体，嵌合PCV2 Cap蛋白基因，获得PRV TK‑/gI‑/gE‑/2Cap+重组病毒，该重组病毒PRV TK‑/gI‑/gE‑/2Cap+毒力低，安全性高，能同时诱导宿主产生针对PRV和PCV2 Cap的两种中和抗体，且对PRV具有更强度保护力。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组及疫苗技术领域，具体涉及一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒2型（PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征，皮炎与肾病综合征的主要病原；其主要侵害2～8周龄的断奶仔猪，死亡率高达50%及以上，常给养猪业带来巨大的经济损失。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原蛋白，含有主要保护性抗原表位，是制备PCV2疫苗的理想靶抗原。
伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属。是一种双链DNA病毒，基因组大小约为150 kb。PRV基因组包含有许多非必需基因，其多个非必需基因可以被编码异源抗原的基因所取代，被异源基因取代后的病毒也能够正常复制，不会受到影响。因此，常以PRV作为重组毒株的病毒载体。
目前，多通过接种Bartha-k61疫苗来进行猪群伪狂犬病的防控，但是Bartha-k61疫苗在猪群体中的免疫力偏低，免疫过Bartha-k61疫苗的猪场仍常出现PRV严重感染的问题，因此Bartha-k61疫苗并不能为猪群提供完全有效的保护，仍需进一步研究改善。
临床上，PCV2和PRV常出现混合感染的情况，因此研发一种能同时且有效防控PCV2和PRV这两种病毒的疫苗变得尤为重要。
发明内容
为解决上述现有技术问题，本发明提供了一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用，以PRV FJ01为病毒载体构建了TK、gI、gE三基因缺失并嵌合表达PCV2Cap蛋白基因的重组病毒，该重组病毒可稳定遗传表达Cap蛋白，能同时诱导宿主产生针对PRV和PCV2 Cap的两种中和抗体。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
重组转移载体，所述重组转移载体包括：
转移载体pUC19-TK/Cap，所述pUC19-TK/Cap包括以伪狂犬变异株TK基因两端序列所作的同源臂和经人工修饰的Cap基因；
转移载体pUC19-gI/gE/Cap，所述pUC19-gI/gE/Cap包括以伪狂犬变异株gI基因上游序列和gE基因下游序列所作的同源臂和经人工修饰的Cap基因；
其中，经人工修饰的所述Cap基因的序列如SEQ ID NO.25所示。
如以上所述的重组转移载体的制备方法，包括所述pUC19-TK/Cap的制备方法和所述pUC19-gI/gE/Cap的制备方法；
（1）所述pUC19-TK/Cap的制备方法包括以下步骤：
步骤S101，以所述伪狂犬变异株TK基因两端序列作为同源臂，采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得TK-Right片段；
步骤S102，经酶切处理和同源重组酶处理，将所述TK-Right片段连接至pUC19载体上，获得pUC19-TKR载体；
步骤S103，以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行PCR扩增，获得TK-eGFP片段；
步骤S104，将所述TK-eGFP片段连接至所述pUC19-TKR载体上，获得pUC19-TKR-eGFP载体；
步骤S105，以所述伪狂犬变异株TK基因两端序列作为同源臂，采用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，获得TK-Left片段；
步骤S106，将所述TK-Left片段连接至所述pUC19-TKR-eGFP载体上，获得pUC19-TK/eGFP载体；
步骤S107，将所述pUC19-TK/eGFP载体进行双酶切处理，将荧光标签eGFP替换为人工修饰的所述Cap基因片段，构建出pUC19-TK/Cap转移载体；
（2）所述pUC19-gI/gE/Cap的制备方法包括以下步骤：
步骤S201，以所述伪狂犬变异株基因组为模板，分别采用如SEQ ID NO.7~8和SEQID NO.9~10所示的引物进行PCR扩增，分别获得gIgE-Left片段和gIgE-Right片段；
步骤S202，以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，获得gIgE-eGFP片段；
步骤S203，将所述gIgE-Left、gIgE-eGFP和gIgE-Right片段经overlap PCR依次连接，构成gIL-CMV-eGFP-gER片段；
步骤S204，将pUC19载体进行双酶切处理，与所述gIL-CMV-eGFP-gER片段进行连接，获得pUC19-gI/gE/eGFP载体；
步骤S205，将所述pUC19-gI/gE/eGFP载体进行双酶切处理，将荧光标签eGFP替换为人工修饰的所述Cap基因片段，构建出pUC19-gI/gE/Cap转移载体。
一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，所述重组伪狂犬病毒被命名为PRVTK-/gI-/gE-/2Cap+，所述PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+由以上任一项所述的转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap制备得到。
进一步地，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+以缺失TK、gI和gE三基因的伪狂犬变异株为病毒载体，所述伪狂犬变异株为PRV FJ01株。
进一步地，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，在所述PRV FJ01株的原TK基因位点处嵌合一个Cap基因，并在原gI和gE基因位点处嵌合一个Cap基因。
如以上任一项所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括以下步骤：
步骤S301，利用第一敲除质粒将所述伪狂犬变异株中的TK基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/eGFP+毒株；
步骤S302，利用第三敲除质粒和pUC19-TK/Cap转移载体，将所述PRV TK-/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRV TK-/Cap+毒株；
步骤S303，利用第二敲除质粒将所述PRV TK-/Cap+毒株中的gI、gE基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株；
步骤S304，利用第三敲除质粒和pUC19-gI/gE/Cap转移载体，将所述PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+重组病毒。
进一步地，还包括所述第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒的制备，包括以下步骤：
步骤S401，设计并合成针对TK基因的TK-SgRNA1和TK-SgRNA2序列，针对gI和gE基因的gIgE-SgRNA1和gIgE-SgRNA2序列，以及针对eGFP标签的eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列；
步骤S402，将所述TK-SgRNA1、TK-SgRNA2、gIgE-SgRNA1、gIgE-SgRNA2、eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列分别与pX459载体连接，获得第一敲除质粒pX495-TK-SgRNA1和pX495-TK-SgRNA2、第二敲除质粒pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2、第三敲除质粒pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2。
进一步地，所述TK-SgRNA1的正义链序列如SEQ ID NO.13所示，所述TK-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.14所示；
所述TK-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.15所示，所述TK-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.16所示；
所述gIgE-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.17所示，所述gIgE-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.18所示；
所述gIgE-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.19所示，所述gIgE-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.20所示；
所述eGFP-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.21所示，所述eGFP-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.22所示；
所述eGFP-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.23所示，所述eGFP-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.24所示。
一种疫苗组合物，包含如以上任一项所述的重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
进一步地，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的抗原含量为≥104.0TCID50/头份。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
本发明根据PCV2的ORF2基因（编码Cap蛋白的基因）进行优化设计获得了能在伪狂犬病毒载体中稳定、高效表达Cap蛋白的Cap基因，为获得更高免疫原性的重组伪狂犬病毒提供了基础；
分别以PRV的TK基因和gIgE基因为插入靶点设计转移载体pUC19-TK/Cap和转移载体pUC19-gI/gE/Cap，并设计敲除质粒，通过同源重组将TK基因和gIgE基因分别替换为Cap基因，获得重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+；该制备过程中针对靶点设计获得具有同源臂的转移载体及敲除质粒，使得重组过程靶点基因缺失良好，目标基因重组效率高、准确性好，易获得高产的重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+；该重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+具有良好的遗传稳定性，能稳定、高效的表达PCV2的Cap蛋白，并具有PRV免疫原性，能为伪狂犬变异株PRV FJ01提供很好保护，且安全性高；
将PRV的TK基因替换为Cap基因，虽未直接表达Cap蛋白，但剔除了毒力TK基因，降低了重组伪狂犬病毒的毒力，PRV没有发生缺失，提高了重组病毒结构的稳定性和免疫力，并能一定程度上促进gIgE基因处替换的Cap基因表达Cap蛋白；
该重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+可用于同时预防PRV毒株和PCV2毒株，具有较传统Bartha-k61疫苗更强的保护效力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pUC19-TK/eGFP和pUC19-TK/Cap载体的设计图谱。
图2为pUC19-gI/gE/eGFP和pUC19-gI/gE/Cap载体的设计图谱。
图3为构建转移载体pUC19-TK/Cap所需的片段扩增结果；1泳道为TK-Left片段，2泳道为TK-eGFP片段，3泳道为TK-Right片段，4为Cap基因片段。
图4为构建转移载体pUC19-gI/gE/Cap所需的片段扩增结果；1泳道为gIgE-Left片段，2泳道为gIgE-eGFP片段，3泳道为gIgE-Right片段，4为Cap基因片段。
图5为重组载体pUC19-TK/eGFP和pUC19-gI/gE/eGFP转染PK-15细胞后的荧光观察结果；A为重组载体pUC19-TK/eGFP的荧光观察结果，B为pUC19-gI/gE/eGFP的荧光观察结果。
图6为转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap真核表达Western blotting结果。
图7为敲除质粒构建PCR鉴定结果（SgRNA）；1、2、3、4泳道分别为pX459-TK-SgRNA1、pX459-TK-SgRNA2、pX459-gIgE-SgRNA1和pX459-gIgE-SgRNA2的SgRNA鉴定结果。
图8为敲除质粒中SgRNA的测序结果。
图9为PRV TK-/eGFP+的PCR鉴定结果；1、2泳道分别为PRV TK-/eGFP+、PRV FJ01的TK基因鉴定结果，3泳道为PRV TK-/eGFP+的eGFP的鉴定结果。
图10为PRV TK-/Cap+的PCR鉴定结果；1、2泳道分别为PRV TK-/Cap+的Cap、eGFP基因鉴定结果。
图11为PRV TK-/Cap+及PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的Western blotting结果；A为PRVTK-/Cap+的Cap蛋白检测结果，B为PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的Cap蛋白检测结果。
图12为PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+和PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的PCR鉴定结果；A中1、2泳道分别为毒株PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+、PRV TK-/Cap+的gIgE基因PCR鉴定结果，3泳道为PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+的eGFP基因PCR鉴定结果；B中1、2泳道分别为PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+和PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的eGFP基因PCR鉴定结果。
图13为重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的TK、gI、gE基因缺失PCR鉴定结果；1、2、3泳道分别为重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的Ig、TK、gE基因PCR检测结果，4、5、6泳道分别为PRV FJ01（阳性对照）的Ig、TK、gE基因的PCR检测结果。
图14为PRV FJ01和PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的生长曲线；其中，FJ01为PRVFJ01，ΔFJ01为重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
图15为小鼠的生存曲线；其中，ΔFJ01即为重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 转移载体和敲除质粒的构建
（1）构建转移载体pUC19-TK/Cap
如图1所示，选取伪狂犬变异株PRV FJ01株TK基因的左右两端各约1.5kb基因片段作为同源臂，采用序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，以及采用序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增；分别经琼脂糖凝胶电泳回收，获得TK-Right和TK-Left片段，扩增结果如图3中1泳道和3泳道所示。
该伪狂犬变异株PRV FJ01毒株公开于猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析[D].易可可，四川农业大学，2019。PRV FJ01毒株的基因序列如SEQ ID NO.26所示。
用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对pUC19载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，获得线性载体片段（2.6Kb）。
利用同源重组酶连接pUC19线性载体和TK-Right片段，同源重组酶连接体系为：5×CE Ⅱ Buffer 4µL，Exnase Ⅱ 2µL，线性载体0.03pmol，TK-Right片段0.06pmol，ddH2O补至20 μL，37℃连接30min。再将该连接液10µL转化至DH5α感受态细胞中，冰浴放置30min，42℃水浴热激1min，4℃冷激2min。加入0.6mL无菌的LB肉汤液体培养基，放置于37℃恒温摇床120 rpm震荡培养1 h。将菌液3000rpm离心5min后，弃去大部分培养基，保留100μL左右的培养基用于重悬菌体，均匀涂布到含千分之一Amp的LB肉汤固体培养基上，37℃温箱培养10~12h。挑取单个菌落扩大培养，测序鉴定获得构建成功的阳性质粒，命名为pUC19-TKR载体。
以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增包含CMV-eGFP表达盒的TK-eGFP片段，该PCR程序为：98℃变性10s，61℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，72℃彻底延伸3min，12℃保存。TK-eGFP片段的扩曾结果如图3中泳道2所示。
对载体pUC19-TKR及片段TK-eGFP进行Hind Ⅲ酶切，回收载体片段和目的片段并连接，连接体系：Solution Ⅰ 5μL，载体0.03 pmol，目的片段0.1 pmol，载体片段共5μL，16℃连接2h。将连接产物转化到DH5α感受态，挑取单克隆进行测序，构建出pUC19-TKR-eGFP载体。
同理对载体pUC19-TKR-eGFP进行Cla I单酶切并与上述的TK-Left片段同源重组连接，连接体系同载体pUC19-TKR，最终构建出载体pUC19-TK/eGFP。
将PCV2毒株的Cap基因根据猪源细胞密码子偏好性进行优化，获得经人工修饰的Cap基因，并由生工生物公司合成该Cap基因，经人工修饰后的Cap基因核酸序列如SEQ IDNO.25所示。Cap基因的扩增结果如图3中泳道4所示。
将pUC19-TK/eGFP载体经NheI、SpeI双酶切处理，胶回收载体片段pUC19-TKLR，将人工修饰的Cap基因片段与载体片段pUC19-TKLR进行连接，实现将荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出pUC19-TK/Cap转移载体。
（2）构建转移载体pUC19-gI/gE/Cap
如图2所示，以PRV FJ01病毒基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO.7~8所示的引物扩增gI基因上游序列，获得上游同源臂gIgE-Left片段；采用如SEQ ID NO.9~10所示的引物扩增gE基因下游序列，获得下游同源臂gIgE-Right片段。gIgE-Left片段和gIgE-Right片段的扩增结果验证如图4中1泳道和3泳道所示。
以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增并获得包含CMV-eGFP表达盒的gIgE-eGFP片段。gIgE-eGFP片段的扩增结果验证如图4中2泳道所示。
将获得的gIgE-Left、gIgE-eGFP和gIgE-Right片段经overlap PCR依次连接，构成gIL-CMV-eGFP-gER片段。
对pUC19载体进行EcoR I和Hind Ⅲ双酶切处理，回收获得线性载体片段，将该线性载体片段与gIL-CMV-eGFP-gER片段进行连接。连接体系如下：Solution I 5µL，pUC19线性载体0.03pmol，片段gIL-CMV-eGFP-gER 0.1pmol，载体与片段共5µL，16℃连接2h。连接后转化至DH5α感受态细胞，挑取单个菌落抽提质粒并测序验证，构建出载体pUC19-gI/gE/eGFP。
用Nhe I、Stu I对载体pUC19-gI/gE/eGFP进行双酶切，回收载体片段后与经人工修饰的Cap基因片段进行连接，将荧光标签eGFP替换为Cap基因。连接体系为：5×CE ⅡBuffer 4µL，Exnase Ⅱ 2µL，载体0.03pmol，片段0.06pmol，ddH2O补至20μL，37℃连接30min。将连接产物转化到DH5α感受态细胞，挑单菌落测序，获得构建成功的转移载体pUC19-gI/gE/Cap。
（3）重组转移载体验证
将载体pUC19-TK/eGFP和pUC19-gI/gE/eGFP各5μg与8µL Lipo2000共转染PK-15细胞，于转染后24h左右观察细胞内有无荧光，若出现荧光则说明载体构建成功。结果如图5所示，图5中A、B分别为载体pUC19-TK/eGFP、pUC19-gI/gE/eGFP质粒转染PK-15细胞后荧光观察结果，二者转染后均能观察到绿色荧光，说明pUC19-TK/eGFP、pUC19-gI/gE/eGFP重组载体均成功构建。
将转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap各5μg与8µL Lipo2000共转染PK-15细胞，于48h后连同细胞及培养液进行收冻，12000rpm离心3min收取上清。取含有蛋白的上清液80µL并加入20µL 的聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，沸水中水浴10min。将制备好的蛋白样品进行Western blotting检测Cap蛋白是否表达，若出现29kDa左右大小的条带，则说明构建成功。结果如图6所示，经Western blotting检测均出现29kDa的条带，成功表达Cap蛋白，说明转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap均成功构建。
（4）构建敲除质粒
针对TK、gI、gE基因上下游序列和荧光标签eGFP的序列设计获得SgRNA序列，并根据设计获得的SgRNA序列进行人工合成，分别获得针对TK基因上下游打靶位点的双链TK-SgRNA1和TK-SgRNA2，针对gIgE基因上下游打靶位点的双链gIgE-SgRNA1和gIgE-SgRNA2，及针对荧光标签eGFP序列中打靶位点的双链eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2。
其中，TK-SgRNA1、TK-SgRNA2、gIgE-SgRNA1、gIgE-SgRNA2、eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列均包括正义链和反义链。双链的TK-SgRNA1、TK-SgRNA2、gIgE-SgRNA1、gIgE-SgRNA2、eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2，分别由对应的正义链（SgRNA-F）和反义链（SgRNA-R）经上下游引物退火成双链而得，退火反应体系参见表1所示。
表1 SgRNA退火反应体系
其中，TK-SgRNA1的正义链序列如SEQ ID NO.13所示，TK-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.14所示；TK-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.15所示，TK-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.16所示；gIgE-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.17所示，gIgE-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.18所示；gIgE-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.19所示，gIgE-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.20所示；eGFP-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.21所示，eGFP-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.22所示；eGFP-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.23所示，eGFP-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.24所示。
用Bbs I酶对pX459载体进行酶切，37℃酶切1h，酶切体系如下：10×Buffer 5 µL，pX459载体1 µg，Bbs I 2 µL，ddH2O补至50 µL，琼脂糖凝胶电泳后回收pX459载体的线性片段（约9kb）。
用T4 DNA连接酶分别将双链的TK-SgRNA1、TK-SgRNA2、gIgE-SgRNA1、gIgE-SgRNA2、eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列与pX459载体的线性片段连接。连接体系为：T4连接酶5µL，pX459载体片段2µL（0.03 pmol），SgRNA片段3 µL（0.1 pmol），16℃连接2h。取10µL连接产物与100µL DH5α感受态细胞混合后进行转化，挑选单菌落进行质粒抽提，并进行PCR和测序鉴定。鉴定无误后，获得构建成功的三组敲除质粒。三组敲除质粒分别是：第一敲除质粒pX495-TK-SgRNA1和pX495-TK-SgRNA2、第二敲除质粒pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2、第三敲除质粒pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2。获得的上述敲除质粒针对各打靶位点敲除效率高，错配率低。
PCR鉴定结果如图7所示，pX495-TK-SgRNA1、pX495-TK-SgRNA2、pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2经各鉴定引物PCR扩增，成功扩增出260bp左右的目的条带（pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2的PCR鉴定结果未示出），表明连接成功。测序结果如图8所示，各SgRNA均在246bp至273bp位点正确插入，无突变位点，表明pX495-TK-SgRNA1、pX495-TK-SgRNA2、pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2均构建成功（pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2的测序结果未示出）。
实施例2 重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的构建
（1）PRV TK-/eGFP+的构建
利用第一敲除质粒（pX495-TK-SgRNA1和pX495-TK-SgRNA2）和上述获得的pUC19-TK/eGFP载体，将伪狂犬变异株（PRV FJ01）中的TK基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/eGFP+毒株。
具体地，将生长良好的PK-15细胞铺6孔板，培养14~16h，待细胞生长密度约占视野的70%后将细胞培养液弃去，用无菌的PBS清洗几遍再加入1mL无血清DMEM，备用。
将3μg PRV-FJ01基因组DNA及2μg pUC19-TK/eGFP、1μg pX459-TK-SgRNA1、1μgpX459-TK-SgRNA2质粒与12μL Lipo2000轻轻吹打混匀后室温放置5~10 min，再于37℃转染PK-15细胞，6h后弃去液体，加入1.5~2mL细胞维持液继续培养。约转染30h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的生长状态，若观测到带绿色荧光的病变则说明转染成功。将细胞培养板于超低温冰箱中反复冻融数次，同时收集孔中的细胞碎片和细胞培养液，将细胞悬液11000rpm离心4min去除破碎的细胞沉淀，取上清病毒液进行噬斑纯化。
噬斑纯化步骤为：
将PK-15细胞铺于12孔细胞培养板中，待细胞密度达视野的80%时备用。
配制1.6%低熔点琼脂糖溶液，高压灭菌后置于细胞培养箱备用。
将收集到的带有重组病毒的病毒悬液按10倍稀释至10-3、10-4、10-5，每个稀释度接种4个孔，每孔200μL，37℃孵育2 h后弃去。
将低熔点琼脂糖与37℃预热的细胞维持液（2%FBS）按1：1等体积混合，置于室温稍稍冷却再缓慢温柔的加入12孔板中，每孔1 mL。避免产生气泡，待其彻底冷却凝固后置于37℃二氧化碳培养箱培养。
约30h后观察细胞有无病变和绿色荧光，待观察到带有绿色荧光的病变时，用10μL的枪头垂直对准病变处，将病变处的细胞及琼脂糖凝胶一起吸入枪头，吹入200μL DMEM培养基中，反复吹打混匀后再次接种于12孔板培养。约30h后观察荧光，记录每孔细胞的病变和荧光情况。将细胞12孔板反复冻融三次，收集有荧光的阳性孔病毒上清液，重复噬斑纯化直至PCR鉴定TK基因成功缺失（鉴定引物信息见表2所示），即获得成功缺失的重组病毒株PRV TK-/eGFP+。
PCR鉴定结果如图9所示，PRV TK-/eGFP+毒株经TK引物扩增出1500bp左右的条带且无其他条带，表明eGFP成功替换了TK基因；且eGFP基因鉴定为阳性，表明PRV TK-/eGFP+毒株构建成功。
（2）PRV TK-/Cap+的构建
利用第三敲除质粒（pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2）和pUC19-TK/Cap转移载体，将上述获得的PRV TK-/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRVTK-/Cap+毒株。
具体地，利用同源重组原理，将2μg PRV TK-/eGFP+毒株基因组DNA及2μg pUC19-TK/Cap转移载体、1μg pX459-eGFP-SgRNA1、1μg pX459-eGFP-SgRNA2质粒与10μL Lipo2000轻轻吹打混匀，室温孵育10min后共转染PK-15细胞，于培养箱培养6h后弃去，加入新鲜维持液继续培养。利用荧光标签反向筛选，挑取无荧光的噬斑进行噬斑纯化，噬斑纯化步骤同上。通过PCR及测序鉴定eGFP是否被Cap替换（鉴定引物信息见表2所示），成功替换的重组病毒即为PRV TK-/Cap+毒株。PCR结果如图10所示，1、2泳道为PRV TK-/Cap+的Cap、eGFP基因结果，表明Cap基因为阳性，eGFP基因为阴性，表明eGFP成功替换为Cap基因；然后测序验证Cap基因成功插入TK基因位点，表明PRV TK-/Cap+毒株构建成功。
将重组病毒PRV TK-/Cap+接种于正常的PK-15细胞，培养至80%细胞出现病变收冻病毒液，制备蛋白样并通过Western blotting检测Cap蛋白是否成功表达。结果如图11所示，图10中A显示β-actin内参基因被成功检测说明实验成立，而重组病毒PRV TK-/Cap+接种细胞后未检测到Cap蛋白的表达，说明TK基因位点插入的Cap基因未表达。
（3）PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+的构建
利用第二敲除质粒（pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2）将PRV TK-/Cap+毒株中的gI、gE基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株。
具体地，将3μg PRV TK-/Cap+毒株基因组DNA及1μg质粒pX459-gIgE-SgRNA1、1μgpX459-gIgE-SgRNA2、2μg pUC19-gI/gE/eGFP与12 μL Lipo2000轻轻吹打混匀，室温放置5min，37℃共转染PK-15细胞6h，待出现带绿色荧光的病变后，收集病毒液进行噬斑纯化，PCR鉴定gI及gE基因是否成功缺失（鉴定引物信息见表2所示），成功缺失的重组病毒即为PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株。
PCR鉴定结果如图12所示，图12A中2泳道为PRV TK-/Cap+作为阳性对照鉴定gIgE的结果，其扩增条带为3100bp左右；PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+鉴定gIgE的结果对应的条带1500bp左右，结合测序验证表明gI、gE基因被成功替换为CMV-eGFP表达盒且无突变，PRVTK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株构建成功。
（4）PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的构建
利用第三敲除质粒（pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2）和上述的pUC19-gI/gE/Cap转移载体，将PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+重组病毒。
具体地，将2μg PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株基因组DNA、2μg pUC19-gI/gE/Cap转移载体与10μL Lipo2000混匀后共转染PK-15细胞，挑取无荧光的噬斑进行噬斑纯化直至PCR鉴定eGFP为阴性，最终得到重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。PCR鉴定结果如图12中B所示，PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+毒株的eGFP基因鉴定为阴性；结合测序结果表明PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+毒株的eGFP基因表达盒被成功替换为Cap基因表达盒，且启动子及密码子无任何突变，表明重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+构建成功。
进一步进行Cap蛋白的Western blotting检测，鉴定Cap蛋白在gI~gE位点（US7~US8区段）的表达情况。结果如图11中B所示，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+接种PK-15细胞后可检测到29kDa的Cap蛋白条带，表明Cap基因表达，且是位于gI、gE位点的Cap基因表达。
表2 鉴定引物信息表
注：*1—TK基因完整时对应条带为1134bp，若eGFP表达盒成功替换TK基因，条带大小为1504bp。
*2—gI及gE基因完整时对应条带为3175bp，若eGFP表达盒成功替换gI、gE基因，条带大小为1504bp。
（5）重组病毒纯度验证
如图13所示，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的gI、TK、gE基因经检测引物鉴定均无扩增，而PRV FJ01的gI、TK、gE基因均成功扩增出对应条带，表明重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的三基因（TK、gI和gE）缺失良好。
采用金诺诊断PRV-gB、PRV-gE抗体ELISA检测试剂盒测定小鼠免疫重组病毒PRVTK-/gI-/gE-/2Cap+后血清中gB、gE抗体水平，以验证重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的gE基因是否成功缺失。采用SPF级6周龄雌性昆明小鼠，试验组于0d接种0.2mL的PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒原液，对照组接种等量DMEM培养液，相同环境下隔离饲养，于第21d进行小鼠眼球采血，检测血清中gB、gE抗体水平。
实验结果如表3所示，在试验组小鼠免疫PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+接种21d后可以检测到PRV-gB抗体，说明重组病毒成功在小鼠机体内进行增殖并诱导宿主产生了针对PRV的抗体。而gE抗体为阴性，接种DMEM的对照组小鼠PRV-gB/gE抗体均为阴性，说明实验成立；因此，该结果可以说明重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+重组病毒的gE基因缺失彻底。
表3 小鼠PRV gB/gE抗体检测
注：（1）ΔFJ01即PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，NC为阴性对照，PC为阳性对照。
（2）gB结果成立条件：阴性对照OD450>0.7，阳性对照OD450/阴性对照OD450<0.3时结果成立；结果判定：样品OD450>阴性对照OD450×0.6时为阴性，反之则为阳性。即样本OD450大于0.548为阴性，反之为阳性。gE结果成立条件：阴性对照OD450>0.7，阳性对照OD450/阴性对照OD450<0.3时结果成立。结果判定：样品OD450>阴性对照OD450×0.7时为阴性，样品OD450/阴性对照OD450≤0.6为阳性。若介于0.6~0.7之间为可疑，需再次检测。即样本OD450大于0.615判定为阴性，小于等于0.527判定为阳性。
实施例3 PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+重组病毒免疫原性验证
（1）半数组织感染量（TCID50）测定
将PK-15细胞铺于96孔板中，待细胞丰度达80%时备用。将无血清的DMEM作为稀释液，对重组病毒进行10倍倍比稀释直至10-10浓度。弃去96孔板的培养液并用PBS清洗2次，用排枪将稀释好的PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒液或PRVFJ01病毒液按浓度由低至高依次加入96孔板中的一列（8孔），每孔100μL。最后2列作为正常细胞对照，每孔加入等体积的DMEM。将96孔板置于37℃二氧化碳培养箱中孵育2h，每隔15min摇匀。将96孔板取出，吸弃各列细胞培养孔中的病毒液。每孔加入200μL细胞维持液，在37℃含5% CO2的细胞培养箱中继续培养72h，观察并记录各个稀释度出现细胞病变效应（CPE）的细胞孔数。按照Reed-Muench法计算出每毫升病毒液的TCID50。
测定及计算结果：PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒液的TCID50为10-5.417/0.1mL，即接种其稀释105.417倍的病毒液100μL可使50%的细胞发生病变；同理测得亲本株PRV-FJ01的TCID50为10-6.643/0.1mL。
（2）病毒一步生长曲线测定
将PK-15细胞铺于12个细胞培养皿中，待细胞丰度达80%时，分别接种0.2mL 100TCID50的PRV FJ01和PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，37℃孵育2h后加入1.8mL的细胞维持液继续培养。分别于接毒后12h、24h、36h、48h、60h、72h冻融三次收取病毒悬液，12000rpm离心3min取上清，-80℃冰箱冻存。测定各时间点病毒液的TCID50，并绘制病毒生长曲线。
生长曲线如图14所示，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+和亲本株PRV FJ01生长趋势相似，均于36h左右进入平台期。二者均于48h测得最大病毒滴度，分别为106.433TCID50/mL、107.782TCID50/mL，但PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+相比亲本株平台期的病毒滴度更低。
（3）小鼠安全性实验
将30只SPF级雌性昆明小鼠适应饲养一周后，随机分为3组（n=10）。试验组小鼠腹腔注射PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒液106 TCID50（0.2mL/只）；阳性对照组小鼠注射0.2mL共104 TCID50的PRV FJ01病毒液；另取10只小鼠作为空白对照组，注射等体积DMEM培养基。试验组及对照组在同等条件下隔离饲养，观察一周，每天观察并记录小鼠临床症状及发病、死亡情况。
结果为：试验组小鼠经腹腔注射PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的病毒液饲养一周后，未出现死亡和发病情况。小鼠群体精神状态及食欲正常，未见瘙痒反应或应激现象。PRV FJ01对照组小鼠于注射后3天内全部死亡，小鼠瘙痒并抓挠注射部位附近皮肤，导致皮肤溃烂出血。空白对照组小鼠表现正常，未出现以上症状且无应激行为。结果表明重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+对小鼠安全。
（4）病毒中和试验和ELISA测定Cap蛋白抗体水平
挑选三只健康的家兔作为试验组，取1mL 共105TCID50的PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒液分点接种于大腿内侧肌肉、颈背部皮下；另取三只家兔作为阴性对照组，接种1mL DMEM培养基（所有兔子试验前经ELISA检测血清中PRV gB、gE抗体均为阴性）。各组分别于第0d、7d、14d、21d进行耳缘静脉采血5mL，血样凝集后4℃放置过夜，取上层血清并4℃ 2000rpm离心10min去除红细胞，分装冻存于-70℃备用。
按如下步骤操作测取中和抗体效价：将细胞浓度约为1×105个/mL的PK-15细胞悬液传代接种于96孔板中，每孔200μL置于37℃培养箱培养至单层；将待检血清于56℃水浴灭活30min，进行2倍梯度稀释，各梯度分别与100 TCID50的PRV FJ01病毒稀释液在无菌离心管内等体积混合，在37℃细胞培养箱中孵育1-2h；将病毒-待检血清混合液及对照组以每孔50μL接种于96孔板中。阳性对照为100 TCID50的PRV FJ01病毒液，阴性对照为含2%FBS的细胞维持液，另设置1列血清毒性对照孔。将96孔板放置在37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2h，最后每孔加入150μL维持液，置于培养箱中继续培养。连续7天观察记录各稀释度出现细胞病变效应（CPE）的情况，计算中和效价。
结果如表4所示，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+免疫家兔后第7d测得中和效价最高可达28，免疫后第14d家兔的中和抗体效价为211达到最高，第21d中和抗体效价依旧较高，可达210。
表4 PRV中和抗体效价测定结果
对免疫过重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的兔子分不同时间点进行采血，并采用试剂盒进行PCV2 Cap蛋白抗体水平的测定。
结果如表5所示，试验组与对照组ELISA结果以OD450的平均值加减标准差表示，由ELISA结果可知，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+免疫家兔后7d、14d、21d血清均为阳性，说明重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+可以诱导兔子产生针对PCV2 Cap的中和抗体。
表5 兔Cap蛋白抗体水平检测
注：（1）ΔFJ01即重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+；NC为阴性对照孔，PC为阳性对照孔；
（2）有效性判定：阴性对照OD450≤0.20，阳性对照OD450≥0.50时结果成立。结果判定：样本OD450≥阴性对照值×2.1判定为阳性，反之则为阴性（若阴性对照值小于0.08，按0.08计算）。
（5）小鼠保护性实验
将50只6周龄SPF级雌性昆明小鼠随机分为5组（n=10），随机选择三组小鼠于第0d分别腹腔注射0.2mL的共计103TCID50、104TCID50、105TCID50重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+病毒液。剩余两组小鼠分别注射0.2mL105TCID50 PRV Bartha-K61疫苗株及相同体积的DMEM培养基。各组小鼠于相同环境下隔离饲养，并于第21d对所有小鼠均腹腔注射0.2mL共计105TCID50的PRV FJ01病毒液，每日观察并统计各组小鼠发病死亡情况（免疫程序如表6所示）。
表6 小鼠免疫程序
注：ΔPRV FJ01即重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
实验结果如图15所示，免疫104TCID50、105TCID50重组病毒的小鼠在攻毒PRV FJ01后一周内未出现搔痒、精神沉郁、呼吸短促、发热及神经症状等临床表现，且存活率100%，说明104TCID50、105TCID50的PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+可为小鼠提供完全保护力。但免疫剂量为103TCID50重组病毒的小鼠最终的存活率仅50%，一半的小鼠在前5天出现搔痒、精神沉郁、食欲废绝以及高热和神经症状。105TCID50的Bartha-k61无法为小鼠提供完全保护力，攻毒后死亡率为20%。对照组小鼠在攻毒后前三天均死亡，小鼠抓挠注射部位处导致皮肤溃烂、皮毛脱落。结果表明，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+对亲本株PRV FJ01具有保护力。若将该重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+用于制备疫苗制剂时，优选控制该重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的抗原含量≥104.0TCID50/头份，可为免疫动物提供良好的抗PRVFJ01毒株感染能力。
综上，本申请以变异株PRV FJ01为亲本株构建了TK、gI、gE三基因缺失并嵌合PCV2Cap基因的重组病毒，得到了可稳定遗传表达PCV2 Cap蛋白的毒株PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。根据该重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+和亲本株PRV FJ01不同时间点的半数组织感染量及绘制的生长曲线可知，重组病毒在平台期的病毒毒力及生长动力学要低于亲本株，一定程度反映了重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的TK、gI、gE毒力基因缺失良好，使重组病毒毒力下降，更加安全；小鼠安全性试验结果也证实了这一点，由于TK、gI、gE基因编码的蛋白均与病毒的神经致病力有关，而重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+免疫小鼠后，小鼠无发烧、搔痒及神经症状，对小鼠安全性好。经细胞中和试验和ELISA试验验证，重组病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+免疫家兔后，能同时诱导宿主产生针对PRV和PCV2 Cap的两种中和抗体；可用于同时预防PRV和PCV2病毒感染，且具有良好的保护力。
Claims (10)
1.重组转移载体，其特征在于，所述重组转移载体包括：
转移载体pUC19-TK/Cap，所述pUC19-TK/Cap包括以伪狂犬变异株TK基因两端序列所作的同源臂和经人工修饰的Cap基因；
转移载体pUC19-gI/gE/Cap，所述pUC19-gI/gE/Cap包括以伪狂犬变异株gI基因上游序列和gE基因下游序列所作的同源臂和经人工修饰的Cap基因；
其中，经人工修饰的所述Cap基因的序列如SEQ ID NO.25所示。
2.如权利要求1所述的重组转移载体的制备方法，其特征在于，包括所述pUC19-TK/Cap的制备方法和所述pUC19-gI/gE/Cap的制备方法；
（1）所述pUC19-TK/Cap的制备方法包括以下步骤：
步骤S101，以所述伪狂犬变异株TK基因两端序列作为同源臂，采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得TK-Right片段；
步骤S102，经酶切处理和同源重组酶处理，将所述TK-Right片段连接至pUC19载体上，获得pUC19-TKR载体；
步骤S103，以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行PCR扩增，获得TK-eGFP片段；
步骤S104，将所述TK-eGFP片段连接至所述pUC19-TKR载体上，获得pUC19-TKR-eGFP载体；
步骤S105，以所述伪狂犬变异株TK基因两端序列作为同源臂，采用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，获得TK-Left片段；
步骤S106，将所述TK-Left片段连接至所述pUC19-TKR-eGFP载体上，获得pUC19-TK/eGFP载体；
步骤S107，将所述pUC19-TK/eGFP载体进行双酶切处理，将荧光标签eGFP替换为人工修饰的所述Cap基因片段，构建出pUC19-TK/Cap转移载体；
（2）所述pUC19-gI/gE/Cap的制备方法包括以下步骤：
步骤S201，以所述伪狂犬变异株基因组为模板，分别采用如SEQ ID NO.7~8和SEQ IDNO.9~10所示的引物进行PCR扩增，分别获得gIgE-Left片段和gIgE-Right片段；
步骤S202，以pEGFP-C3载体为模板，采用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，获得gIgE-eGFP片段；
步骤S203，将所述gIgE-Left、gIgE-eGFP和gIgE-Right片段经overlap PCR依次连接，构成gIL-CMV-eGFP-gER片段；
步骤S204，将pUC19载体进行双酶切处理，与所述gIL-CMV-eGFP-gER片段进行连接，获得pUC19-gI/gE/eGFP载体；
步骤S205，将所述pUC19-gI/gE/eGFP载体进行双酶切处理，将荧光标签eGFP替换为人工修饰的所述Cap基因片段，构建出pUC19-gI/gE/Cap转移载体。
3.一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒被命名为PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，所述PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+由权利要求1至2任一项所述的转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap制备得到。
4.根据权利要求3所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+以缺失TK、gI和gE三基因的伪狂犬变异株为病毒载体，所述伪狂犬变异株为PRV FJ01株。
5.根据权利要求4所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，在所述PRV FJ01株的原TK基因位点处嵌合一个Cap基因，并在原gI和gE基因位点处嵌合一个Cap基因。
6.如权利要求3至5任一项所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S301，利用第一敲除质粒将所述伪狂犬变异株中的TK基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/eGFP+毒株；
步骤S302，利用第三敲除质粒和pUC19-TK/Cap转移载体，将所述PRV TK-/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRV TK-/Cap+毒株；
步骤S303，利用第二敲除质粒将所述PRV TK-/Cap+毒株中的gI、gE基因敲除并替换为荧光标签eGFP，构建出PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株；
步骤S304，利用第三敲除质粒和pUC19-gI/gE/Cap转移载体，将所述PRV TK-/gI-/gE-/Cap+/eGFP+毒株中的荧光标签eGFP替换为Cap基因，构建出PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+重组病毒。
7.根据权利要求6所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于，还包括所述第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒的制备，包括以下步骤：
步骤S401，设计并合成针对TK基因的TK-SgRNA1和TK-SgRNA2序列，针对gI和gE基因的gIgE-SgRNA1和gIgE-SgRNA2序列，以及针对eGFP标签的eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列；
步骤S402，将所述TK-SgRNA1、TK-SgRNA2、gIgE-SgRNA1、gIgE-SgRNA2、eGFP-SgRNA1和eGFP-SgRNA2序列分别与pX459载体连接，获得第一敲除质粒pX495-TK-SgRNA1和pX495-TK-SgRNA2、第二敲除质粒pX495-gIgE-SgRNA1和pX495-gIgE-SgRNA2、第三敲除质粒pX495-eGFP-SgRNA1和pX495-eGFP-SgRNA2。
8.根据权利要求7所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于：
所述TK-SgRNA1的正义链序列如SEQ ID NO.13所示，所述TK-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.14所示；
所述TK-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.15所示，所述TK-SgRNA2的反义链序列如SEQ IDNO.16所示；
所述gIgE-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.17所示，所述gIgE-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.18所示；
所述gIgE-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.19所示，所述gIgE-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.20所示；
所述eGFP-SgRNA1的正义链如SEQ ID NO.21所示，所述eGFP-SgRNA1的反义链序列如SEQ ID NO.22所示；
所述eGFP-SgRNA2的正义链如SEQ ID NO.23所示，所述eGFP-SgRNA2的反义链序列如SEQ ID NO.24所示。
9.一种疫苗组合物，其特征在于，包含如权利要求3至8任一项所述的重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的抗原含量为≥104.0TCID50/头份。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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